專利名稱：一種真菌提取物的制備及在抗人類免疫缺陷病毒中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。具體地說涉及一種具有抗人類免疫缺陷病毒(HIV-1)的活性，能調(diào)節(jié)HIV-1基因表達(dá)的內(nèi)生真菌提取物的制備技術(shù)。
背景技術(shù)：
1981年美國(guó)疾病控制中心首次報(bào)道獲得性免疫缺陷綜合癥，又稱艾滋病(AIDS)。80年代中期，艾滋病已發(fā)展成為一個(gè)全球性的流行病，其病原也被確定為人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)。二十多年來，在艾滋病病理及治療領(lǐng)域的研究已經(jīng)取得了一定的成績(jī)，近幾年高效抗病毒治療使艾滋病的發(fā)病率和死亡率明顯降低。但是目前在艾滋病的治療方面存在以下問題一方面，HIV的高變異性導(dǎo)致其很容易產(chǎn)生耐藥性；另一方面，化療藥具有很強(qiáng)的毒副作用，且該類藥物大多價(jià)格昂貴，很多經(jīng)濟(jì)落后國(guó)家和地區(qū)的艾滋病病人負(fù)擔(dān)不起醫(yī)療費(fèi)用，因而得不到及時(shí)有效的治療。因此，尋找新的高效低毒的抗HIV藥物就成為醫(yī)藥學(xué)研究領(lǐng)域的緊迫任務(wù)。
HIV進(jìn)入人體后，主要通過與宿主細(xì)胞膜直接融合進(jìn)入細(xì)胞，HIV的復(fù)制周期主要包括吸附及穿入、逆轉(zhuǎn)錄與環(huán)化、整合、轉(zhuǎn)錄、翻譯、病毒顆粒裝配、病毒體成熟、出芽等階段?？笻IV物質(zhì)針對(duì)不同的作用位點(diǎn)發(fā)揮抗病毒作用，主要包括抑制吸附與進(jìn)入的物質(zhì)、抑制逆轉(zhuǎn)錄酶的物質(zhì)、抑制整合酶的物質(zhì)、抑制蛋白酶的物質(zhì)、調(diào)節(jié)基因表達(dá)的物質(zhì)、抑制病毒組裝或出芽的物質(zhì)。篩選抗HIV藥物主要通過以下手段一是計(jì)算機(jī)分子模擬設(shè)計(jì)，根據(jù)晶體衍射獲得HIV特異性酶的三維結(jié)構(gòu)模型，推測(cè)出酶的活性部位，計(jì)算機(jī)模擬設(shè)計(jì)出結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、合適立體構(gòu)象的底物類似物，以競(jìng)爭(zhēng)性抑制方式來抑制HIV的復(fù)制。臨床上抗HIV藥物中的蛋白酶抑制劑均是依此而合成的。二是組合化學(xué)手段，通過對(duì)已知結(jié)構(gòu)、具有抗HIV活性化合物的結(jié)構(gòu)修飾，可以提供豐富的抗HIV化合物來源。HIV吸附和融合抑制劑ISIS5320就是應(yīng)用組合化學(xué)而篩選出來的。三是從天然動(dòng)植物、微生物和海洋生物等的提取物中篩選抗HIV化合物。從天然資源中尋找新的抗HIV藥物或先導(dǎo)化合物的研究，是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外新藥研制的重要研究方向和非?；钴S的領(lǐng)域，這也應(yīng)該是我國(guó)新藥研究的優(yōu)勢(shì)所在，一旦發(fā)現(xiàn)活性，往往以該結(jié)構(gòu)為先導(dǎo)化合物，合成活性更強(qiáng)、可溶性好及毒性低的藥物。
從傳統(tǒng)中藥中尋找高效低毒的抗HIV藥物一直是國(guó)內(nèi)外新藥研制中非常活躍的領(lǐng)域，但是植物的大量采集可能導(dǎo)致植物資源的枯竭，從而造成植被和人類生存環(huán)境的破壞。植物內(nèi)生真菌是存在于健康植物中，形成不明顯侵染的一類真菌。植物與其內(nèi)生真菌的關(guān)系是互惠共生的。近年來一些研究表明，與藥用植物共生的內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生與宿主相同或相似的生理活性成分。從真菌代謝產(chǎn)物中尋找新的抗HIV藥物或先導(dǎo)化合物的研究，是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外治療艾滋病的新藥研制的重要研究方向和非?；钴S的領(lǐng)域，這也應(yīng)該是我國(guó)新藥研究的優(yōu)勢(shì)所在。已經(jīng)有研究表明，真菌代謝產(chǎn)物及提取物具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)作用；從食用菌中發(fā)現(xiàn)了具有抑制HIV-1蛋白酶的物質(zhì)；真菌產(chǎn)生的物質(zhì)和蛋白酶抑制劑具有協(xié)同抗HIV-1的作用。利用發(fā)酵法生產(chǎn)與植物相同或相似的次生代謝產(chǎn)物，具有可大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)和易于進(jìn)行質(zhì)量控制等優(yōu)點(diǎn)，并不會(huì)對(duì)自然資源造成破壞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供真菌液體發(fā)酵培養(yǎng)的方法和真菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物制備的方法，該方法工藝簡(jiǎn)單、生產(chǎn)周期短、成本低，可用于真菌的大規(guī)模工業(yè)化培養(yǎng)，并以真菌發(fā)酵物為原料工業(yè)化生產(chǎn)發(fā)酵物的提取物。
本發(fā)明的另一目的是提供上述發(fā)酵物的提取物用于抗HIV-1藥物中的研究和應(yīng)用。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)是真菌EF1(Epulorhiza sp.)液體發(fā)酵培養(yǎng)，得到菌絲體和發(fā)酵液兩部分材料，再用有機(jī)溶劑分別對(duì)菌絲體和發(fā)酵液部分進(jìn)行提取，回收溶劑，得到發(fā)酵物的提取物。本發(fā)明采用的真菌由野生石斛根中分離得到，經(jīng)培養(yǎng)鑒定為瘤菌根菌屬真菌EF1(Epulorhiza sp.)，該菌種于2005年6月22日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)保藏，保藏編號(hào)為CGMCC No.1395。保藏和存活證明見附件。
具體地說，本發(fā)明所述的技術(shù)步驟如下1.真菌的發(fā)酵培養(yǎng)將上述真菌自低溫保藏的斜面試管菌種活化后，轉(zhuǎn)接于含PDA培養(yǎng)基的平皿中，于25℃恒溫培養(yǎng)10-14天，分別在菌落邊緣打孔成菌片，并以小碎塊接入液體培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；真菌液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成為葡萄糖1.5-4％，KH2PO40.1-0.4％，MgSO40.1-0.3％；天然物為麥麩1-5％(煮汁)，以上組分均按重量百分含量計(jì)算，培養(yǎng)基pH5.0-6.5，三角瓶或其他容器振蕩培養(yǎng)真菌。容器裝量30-60％。高壓滅菌后接入上述真菌。培養(yǎng)條件振蕩轉(zhuǎn)速90-130轉(zhuǎn)/分鐘；22-26℃暗培養(yǎng)8-15天收獲。
2.真菌發(fā)酵培養(yǎng)物的獲得上述真菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)8-15天后，用80-120目尼龍網(wǎng)過濾，分為菌絲體和發(fā)酵液兩部分；菌絲體部分用水沖洗干凈，擠壓除去大部分水分，晾干，或50-65℃烘干；發(fā)酵液部分常壓加熱濃縮，或60-80℃減壓(真空度0.6-0.8)濃縮至原發(fā)酵液體積的10-20％。
3.真菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物的制備①干燥菌絲體用甲醇、95％乙醇或丙酮回流提取3次，每次提取時(shí)間分別為1-3小時(shí)、0.5-3小時(shí)和0.5-3小時(shí)，每次提取溶劑用量(V)分別為菌絲體重量(W)的10-15倍、8-12倍和8-12倍；或干燥菌絲體用乙酸乙酯、二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇、氯仿、氯仿-甲醇或甲醇超聲提取3次，每次提取20-60分鐘，每次提取溶劑用量(V)分別為菌絲體重量(W)的10-15倍、8-12倍和8-12倍；或干燥菌絲體用乙酸乙酯、二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇、氯仿、氯仿-甲醇或甲醇滲漉提取，溶劑用量(V)為菌絲體重量(W)的12-18倍。
②發(fā)酵液濃縮物加入95％乙醇或無水乙醇進(jìn)行醇沉，溶劑用量(V)為發(fā)酵液濃縮物體積(V)的3-5.5倍，震搖或劇烈攪拌后放置分層，收集上清液，沉淀部分加入75％-95％乙醇回流提取2次，每次提取時(shí)間分別為1-3小時(shí)和1-3小時(shí)，每次提取溶劑用量(V)分別為沉淀部分(V)體積的4-7倍。
③干燥菌絲體的提取液和發(fā)酵液濃縮物的提取液，分別于40-70℃減壓(真空度0.6-0.8)濃縮至浸膏密度為1.1-1.3(50℃)，得到菌絲體和發(fā)酵液的提取物。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1.真菌的發(fā)酵培養(yǎng)將瘤菌根菌屬(Epulorhiza sp.)真菌自低溫保藏的斜面試管菌種活化后，轉(zhuǎn)接于φ90mm含PDA培養(yǎng)基的平皿中，于25℃恒溫培養(yǎng)12天，分別在菌落邊緣打孔成菌片，并以小碎塊接入液體培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；真菌液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成為葡萄糖20克/升，KH2PO43克/升，MgSO41.5克/升；天然物為麥麩30克/升(煮汁)，培養(yǎng)基pH 5.5。500mL三角瓶裝培養(yǎng)基200mL，121℃滅菌30分鐘，接入瘤菌根菌屬真菌(Epulorhiza sp.)。培養(yǎng)條件搖床振蕩轉(zhuǎn)速110轉(zhuǎn)/分鐘；25℃暗培養(yǎng)10天收獲。
2.真菌發(fā)酵培養(yǎng)物的獲得瘤菌根菌屬(Epulorhiza sp.)真菌發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，用100目尼龍網(wǎng)過濾，分為菌絲體和發(fā)酵液兩部分；菌絲體部分用水沖洗干凈，擠壓除去大部分水分，55℃烘干；發(fā)酵液部分常壓加熱濃縮至原發(fā)酵液體積的15％。
3.真菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物的制備①干燥菌絲體用95％乙醇回流提取3次，每次提取時(shí)間分別為2小時(shí)、1.5小時(shí)和1.5小時(shí)，每次提取溶劑用量(V)分別為菌絲體重量(W)的12倍、10倍和8倍。合并3次提取液，60℃減壓(真空度0.6)濃縮至浸膏密度為1.15(50℃)，得到菌絲體的提取物。
②發(fā)酵液濃縮物加入95％乙醇進(jìn)行醇沉，溶劑用量(V)為發(fā)酵液濃縮物體積(V)的4倍，震搖或劇烈攪拌后放置分層，收集上清液，沉淀部分加入80％乙醇回流提取2次，每次提取時(shí)間均為1.5小時(shí)，每次提取溶劑用量(V)分別為沉淀部分(V)體積的5倍。合并醇沉上清液和2次提取液，60℃減壓(真空度0.6)濃縮至浸膏密度為1.15(50℃)，得到發(fā)酵液的提取物比較例1.真菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物對(duì)MT-4細(xì)胞的毒性作用EF1真菌(Epulorhiza sp.)接種到PDA培養(yǎng)基的平皿中，25℃恒溫培養(yǎng)12天，轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)10天收獲。分離菌絲體和發(fā)酵液。菌絲體用水沖洗干凈，55℃烘干。干燥菌絲體用甲醇回流提取3次，每次1.5小時(shí)。合并三次提取液，減壓濃縮至浸膏密度為1.2(50℃)，得到菌絲體的提取物。將菌絲體甲醇提取物做倍比稀釋，采用MTT法檢測(cè)其對(duì)MT-4細(xì)胞的毒性，共進(jìn)行了3次實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示菌絲體甲醇提取物在所測(cè)試濃度對(duì)MT-4細(xì)胞的毒性較低，其半數(shù)毒性濃度(TC50)＞1000μg/mL。菌絲體甲醇提取物濃度與MT-4細(xì)胞生存率的量效關(guān)系曲線基本呈直線關(guān)系。
表1 菌絲體甲醇提取物對(duì)MT-4細(xì)胞的毒性作用

2.真菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物對(duì)感染HIV-1的MT-4細(xì)胞的保護(hù)作用EF1真菌(Epulorhiza sp.)接種到PDA培養(yǎng)基的平皿中，25℃恒溫培養(yǎng)12天，轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)10天收獲。分離菌絲體和發(fā)酵液。菌絲體用水沖洗干凈，55℃烘干。干燥菌絲體用甲醇回流提取3次，每次1.5小時(shí)。合并三次提取液，減壓濃縮至浸膏密度為1.2(50℃)，得到菌絲體的提取物。將菌絲體甲醇提取物做倍比稀釋，采用MTT法檢測(cè)其對(duì)感染HIV-1的MT-4細(xì)胞的保護(hù)作用，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表2，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示菌絲體甲醇提取物在所測(cè)試濃度對(duì)感染HIV-1的MT-4細(xì)胞的保護(hù)作用隨濃度增加而增加，超過一定濃度，保護(hù)作用開始下降。菌絲體甲醇提取物對(duì)感染MT-4細(xì)胞的半數(shù)有效濃度(EC50)為108.60μg/mL。
表2 菌絲體甲醇提取物對(duì)感染HIV-1的MT-4細(xì)胞的保護(hù)作用

3.真菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物對(duì)p24抗原的抑制作用EF1真菌(Epulorhiza sp.)接種到PDA培養(yǎng)基的平皿中，25℃恒溫培養(yǎng)12天，轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)10天收獲。分離菌絲體和發(fā)酵液。菌絲體用水沖洗干凈，55℃烘干。干燥菌絲體用甲醇回流提取3次，每次1.5小時(shí)。合并三次提取液，減壓濃縮至浸膏密度為1.2(50℃)，得到菌絲體的提取物。將菌絲體甲醇提取物做倍比稀釋，采用MTT法測(cè)定MT-4細(xì)胞培養(yǎng)上清中p24抗原含量。MT-4細(xì)胞被病毒感染后，培養(yǎng)過程中會(huì)釋放病毒顆粒，測(cè)定培養(yǎng)上清中各種病毒蛋白可反映上清中病毒的含量。病毒核心結(jié)構(gòu)蛋白又稱p24Gag蛋白，是最常測(cè)定的一種抗原。共進(jìn)行了3次實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表3，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示菌絲體甲醇提取物在所測(cè)試濃度可以抑制MT-4細(xì)胞培養(yǎng)上清中p24抗原的表達(dá)，IC50＜31.25μg/mL。
表3 菌絲體甲醇提取物對(duì)p24抗原的抑制作用

4.真菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物抑制地塞米松誘導(dǎo)的MT-4細(xì)胞凋亡作用EF1真菌(Epulorhiza sp.)接種到PDA培養(yǎng)基的平皿中，25℃恒溫培養(yǎng)12天，轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)10天收獲。分離菌絲體和發(fā)酵液。菌絲體用水沖洗干凈，55℃烘干。干燥菌絲體用甲醇回流提取3次，每次1.5小時(shí)。合并三次提取液，減壓濃縮至浸膏密度為1.2(50℃)，得到菌絲體的提取物。用菌絲體甲醇提取物進(jìn)行細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)，共進(jìn)行了3次實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表4，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示菌絲體甲醇提取物可以顯著抑制地塞米松所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，增加細(xì)胞的存活率。
表4 菌絲體甲醇提取物對(duì)地塞米松誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的抑制作用

權(quán)利要求
1.一種制備真菌EF1(Epulorhiza sp.)發(fā)酵提取物的方法，包括步驟(1)真菌的發(fā)酵培養(yǎng)將瘤菌根菌屬真菌自低溫保藏的斜面試管菌種活化后，轉(zhuǎn)接于含PDA培養(yǎng)基的平皿中，于25℃恒溫培養(yǎng)10-14天，分別在菌落邊緣打孔成菌片，并以小碎塊接入液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；真菌液體培養(yǎng)培養(yǎng)基組成為葡萄糖、KH2PO4、MgSO4、麥麩；三角瓶或其他容器振蕩暗培養(yǎng)真菌；(2)真菌發(fā)酵培養(yǎng)物的獲得上述真菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后，用尼龍網(wǎng)過濾，分離菌絲體和發(fā)酵液；按下列方法分別處理菌絲體和發(fā)酵液部分；①菌絲體部分用水沖洗干凈，晾干或烘干；②發(fā)酵液部分常壓加熱濃縮或減壓濃縮至小體積；(3)真菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物的制備①菌絲體用甲醇、95％乙醇或丙酮等溶劑回流提取，或用乙酸乙酯、二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇、氯仿、氯仿-甲醇或甲醇等溶劑超聲提取、滲漉提??；②發(fā)酵液濃縮物經(jīng)乙醇多次沉淀，收集上清液；③上述兩種提取液，分別減壓濃縮，得到菌絲體和發(fā)酵液的提取物。
2.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其中所述的瘤菌根菌屬真菌為瘤菌根菌屬真菌EF1(Epulorhiza sp.)，保藏編號(hào)CGMCC No.1395。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于真菌液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基的組分按重量計(jì)為葡萄糖1.5-4％，KH2PO40.1-0.4％，MgSO40.1-0.3％；天然物為麥麩1-5％(煮汁)，培養(yǎng)基pH 5.0-6.5。
4.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于真菌液體培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為三角瓶或其他容器振蕩培養(yǎng)，容器裝量30-60％；滅菌后接入上述真菌，振蕩轉(zhuǎn)速90-130轉(zhuǎn)/分鐘；22-26℃暗培養(yǎng)8-15天收獲。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于液體培養(yǎng)8-15天的真菌，用80-120目尼龍網(wǎng)過濾，分為菌絲體和發(fā)酵液兩部分；菌絲體部分用水沖洗干凈，擠壓除去大部分水分，晾干，或50-65℃烘干；發(fā)酵液部分常壓加熱濃縮，或60-80℃減壓(真空度0.6-0.8)濃縮至原發(fā)酵液體積的10-20％。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于干燥菌絲體用甲醇、95％乙醇或丙酮回流提取3次，每次提取時(shí)間分別為1-3小時(shí)、0.5-3小時(shí)和0.5-3小時(shí)，每次提取溶劑用量(V)分別為菌絲體重量(W)的10-15倍、8-12倍和8-12倍；或干燥菌絲體用乙酸乙酯、二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇、氯仿、氯仿-甲醇或甲醇超聲提取3次，每次提取20-60分鐘，每次提取溶劑用量(V)分別為菌絲體重量(W)的10-15倍、8-12倍和8-12倍；或干燥菌絲體用乙酸乙酯、二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇、氯仿、氯仿-甲醇或甲醇滲漉提取，溶劑用量(V)為菌絲體重量(W)的12-18倍。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于發(fā)酵液濃縮物加入95％乙醇或無水乙醇進(jìn)行醇沉，溶劑用量(V)為發(fā)酵液濃縮物體積(V)的3-5.5倍，震搖或劇烈攪拌后放置分層，收集上清液，沉淀部分加入75％-95％乙醇回流提取2次，每次提取時(shí)間分別為1-3小時(shí)和1-3小時(shí)，每次提取溶劑用量(V)分別為沉淀部分(V)體積的4-7倍。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于干燥菌絲體的提取液和發(fā)酵液濃縮物的提取液，分別于40-70℃減壓(真空度0.6-0.8)濃縮至浸膏密度為1.1-1.3(50℃)，得到菌絲體和發(fā)酵液的提取物。
9.用于任一權(quán)利要求1-8所述方法的真菌為瘤菌根菌屬真菌EF1(Epulorhizasp.)保藏編號(hào)CGMCC No.1395。
全文摘要
一種植物內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物的提取物在抗人類免疫缺陷病毒(HIV)中的應(yīng)用，所用的真菌分離自蘭科藥用植物石斛根中，是瘤菌根菌屬真菌EF1(Epulorhiza sp.)；EF1經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)，制備發(fā)酵產(chǎn)物的提取物。該菌發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單，生長(zhǎng)周期短，可大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)；該菌發(fā)酵產(chǎn)物的提取物獲得容易，具有顯著抗HIV－1的活性，其對(duì)HIV－1感染的作用位點(diǎn)是在逆轉(zhuǎn)錄后到HIV RNA表達(dá)之前，具有調(diào)節(jié)HIV－1基因表達(dá)的作用；藥物聯(lián)合實(shí)驗(yàn)表明，該菌發(fā)酵產(chǎn)物和抗艾滋病藥物AZT聯(lián)合使用顯示出相加的抗HIV－1作用。該菌發(fā)酵產(chǎn)物的提取物在治療艾滋病新藥的開發(fā)方面具有重要價(jià)值，有望成為一種新的艾滋病治療藥物。
文檔編號(hào)C12N1/14GK1883517SQ20051007772
公開日2006年12月27日 申請(qǐng)日期2005年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月24日
發(fā)明者郭順星, 蔣巖, 相子春, 陳曉梅, 王春蘭, 肖培根 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所