專利名稱：間質(zhì)干細(xì)胞與造血干細(xì)胞聯(lián)合移植促進(jìn)造血重建和免疫重建的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于干細(xì)胞與免疫學(xué)領(lǐng)域，涉及干細(xì)胞的新用途及應(yīng)用方法，尤其是涉及間質(zhì)干細(xì)胞與造血干細(xì)胞聯(lián)合移植的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
造血干細(xì)胞移植后存在著復(fù)雜的矛盾，例如(1)同種移植后免疫重建困難而引起嚴(yán)重感染；(2)供體細(xì)胞植入同時(shí)卻誘發(fā)移植物抗宿主病(graft versushost disease，GVHD)，為了降低GVHD，通常采用去除T細(xì)胞的造血細(xì)胞移植，但不利于免疫重建，更容易發(fā)生移植后感染。由于上述問題相互交織，至今也難于找到各方面均可兼顧的綜合處理方案，因此嚴(yán)重影響了同種造血干細(xì)胞移植的治療效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供間質(zhì)干細(xì)胞與造血干細(xì)胞聯(lián)合移植促進(jìn)造血重建和免疫重建的應(yīng)用，此應(yīng)用不僅可促進(jìn)BMT后造血重建和免疫重建，也可降低GVHD的發(fā)生率及其嚴(yán)重程度，從而為造血干細(xì)胞移植后的復(fù)雜矛盾提供了新的途徑。
基于間質(zhì)干細(xì)胞(mesenchvmal stell cells，MSC)對造血重建的促進(jìn)作用以及特有的免疫學(xué)特征，發(fā)明人探討出間質(zhì)干細(xì)胞與造血干細(xì)胞聯(lián)合移植促進(jìn)造血重建和免疫重建的應(yīng)用方法，當(dāng)用于大鼠的造血重建和免疫重建時(shí)，包括以下步驟A.間質(zhì)干細(xì)胞的分離、鑒定與傳代擴(kuò)增移植前，取同種異體健康骨髓，收獲單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，借助間質(zhì)干細(xì)胞的貼壁特性，反復(fù)換液、棄懸浮細(xì)胞，逐步獲得純的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞；通過形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞術(shù)分析、向成骨、成脂、神經(jīng)樣細(xì)胞分化的多向分化潛能鑒定，證實(shí)分離到的細(xì)胞為間質(zhì)干細(xì)胞，并不斷傳代擴(kuò)增，備用；B.間質(zhì)干細(xì)胞與同種異體造血干細(xì)胞聯(lián)合移植移植前處理造血干細(xì)胞的準(zhǔn)備同常規(guī)骨髓移植方案；按步驟A備用的間質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞活度檢測＞95％，在常規(guī)骨髓移植的基礎(chǔ)上加入間質(zhì)干細(xì)胞，同時(shí)經(jīng)靜脈輸入受體，輸入劑量為2.5×107細(xì)胞/Kg體重。
當(dāng)用于病人的造血重建和免疫重建時(shí)，包括以下步驟A.間質(zhì)干細(xì)胞的分離、鑒定與傳代擴(kuò)增移植前，取同種異體健康骨髓，收獲單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，借助間質(zhì)干細(xì)胞的貼壁特性，反復(fù)換液、棄懸浮細(xì)胞，逐步獲得純的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞；通過形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞術(shù)分析、向成骨、成脂、神經(jīng)樣細(xì)胞分化的多向分化潛能鑒定，證實(shí)分離到的細(xì)胞為間質(zhì)干細(xì)胞，并不斷傳代擴(kuò)增，備用；B.間質(zhì)干細(xì)胞與同種異體造血干細(xì)胞聯(lián)合移植移植前處理造血干細(xì)胞的準(zhǔn)備同常規(guī)骨髓移植方案；按步驟A備用的間質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞活度檢測＞95％，在常規(guī)骨髓移植的基礎(chǔ)上加入間質(zhì)干細(xì)胞，同時(shí)經(jīng)靜脈輸入受體，輸入劑量為2～8×106細(xì)胞/Kg體重。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于間質(zhì)干細(xì)胞與造血干細(xì)胞聯(lián)合移植不僅明顯促進(jìn)骨髓移植(BMT)后造血重建和免疫重建；也可降低GVHD的發(fā)生率及其嚴(yán)重程度，從而極大地提高造血干細(xì)胞移植的治療效果。


圖1為骨髓組織切片HE染色圖，左列為100×，右列為400×。第一排為A組，骨髓對照組；第二排為B組，BM組；第三排為C組，BM+MSC組。
具體實(shí)施例方式
(一)間質(zhì)干細(xì)胞的分離、鑒定與傳代擴(kuò)增移植前，取同種異體健康骨髓，收獲單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，借助MSC的貼壁特性，反復(fù)換液、棄懸浮細(xì)胞，逐步獲得純的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞。通過形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞術(shù)分析、向成骨、成脂、神經(jīng)樣細(xì)胞分化的多向分化潛能鑒定，證實(shí)分離到的細(xì)胞為間質(zhì)干細(xì)胞，并不斷傳代擴(kuò)增，備用。
(二)間質(zhì)干細(xì)胞與同種異體造血干細(xì)胞聯(lián)合移植移植前處理造血干細(xì)胞的準(zhǔn)備同常規(guī)骨髓移植方案；按步驟A備用的間質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞活度檢測＞95％，在常規(guī)骨髓移植的基礎(chǔ)上加入間質(zhì)干細(xì)胞，同時(shí)經(jīng)靜脈輸入受體，輸入劑量為2.5×107細(xì)胞/Kg體重。實(shí)驗(yàn)動物分為單純骨髓移植組、造血干細(xì)胞與間質(zhì)干細(xì)胞共移植組、單純照射組。
(三)移植后造血重建、免疫重建及GVHD的檢測(1)一般情況觀察；(2)外周血象恢復(fù)檢測；(3)骨髓穿刺病理檢測及流式分析；(4)免疫功能分析；(5)GVHD(移植物抗宿主病)發(fā)生情況。
(四)效果評價(jià)(1)一般情況觀察照射后10小時(shí)大鼠出現(xiàn)被毛凌亂、蓬松，次日出現(xiàn)消瘦、弓背、反應(yīng)遲鈍，少動拒食。約7至10天后，體重開始恢復(fù)，毛發(fā)變?nèi)犴?，活動增加，反?yīng)靈敏，進(jìn)食及飲水量增加。
(2)骨髓穿刺病理檢測及流式分析骨髓病理顯示共移植組骨髓恢復(fù)較好，可見三系各期幼稚細(xì)胞；骨髓單純移植組造血恢復(fù)欠佳，骨髓顯示較多脂肪組織，骨髓髓系、紅系、巨核系細(xì)胞均減少。骨髓組織切片H E染色如圖1所示，分別為100×，400×。A組(骨衰對照組)致死量照射(8.5Gy)后13天，造血細(xì)胞消失，被脂肪組織取代；B組(BM組)雖有造血細(xì)胞植入，但骨髓髓系、紅系、巨核系細(xì)胞均減少；C組(BM+MSC組)骨髓象基本恢復(fù)正常，可見三系各期幼稚細(xì)胞。
FACS進(jìn)一步顯示MSC共移植可明顯促進(jìn)造血干細(xì)胞向B淋巴細(xì)胞系、巨核細(xì)胞系分化。見表1。
(3)外周血象恢復(fù)檢測單純骨髓移植組、骨髓與MSC共移植組的血紅蛋白均恢復(fù)較快，+30天時(shí)即恢復(fù)正常。在同一檢測時(shí)間點(diǎn)比較，共移植組的淋巴細(xì)胞、血小板數(shù)均高于單純骨髓移植組。+30天時(shí)，共移植組的血小板恢復(fù)已正常。詳見表2。
(4)免疫功能分析移植后30天，共移植組的受體脾細(xì)胞、單純骨髓移植組脾細(xì)胞分別與供體來源的脾細(xì)胞、受體來源的脾細(xì)胞共培養(yǎng)，二組均顯示耐受狀態(tài)。而共移植組的受體脾細(xì)胞分別經(jīng)ConA、LPS、第三體來源的脾細(xì)胞刺激后，較對照組顯示更高的刺激率，p值均＜0.05，見表3。這表明共移植組的T、B淋巴細(xì)胞功能均較對照組恢復(fù)早。
(5)GVHD發(fā)生情況移植后30天，BM組皮膚有2只出現(xiàn)中度GVHD損傷，MSC與BM共移植組僅有一只顯示輕度GVHD。
表1骨髓穿刺流式分析結(jié)果

注*與骨髓移植組相應(yīng)類別對比，P值均＜0.05表2移植后外周血象的動態(tài)變化

注*與骨髓移植組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)、相應(yīng)類別相比較，P值均＜0.05；#與正常組相應(yīng)類別相比較，P值均＜0.05。
表3移植后30天，大鼠脾細(xì)胞對ConA、LPS誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)(x±s)

注*與BM組相比，P值均＜0.05；
權(quán)利要求
1.間質(zhì)干細(xì)胞與造血干細(xì)胞聯(lián)合移植促進(jìn)造血重建和免疫重建的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，當(dāng)用于大鼠的造血重建和免疫重建時(shí)，包括以下步驟A.間質(zhì)干細(xì)胞的分離、鑒定與傳代擴(kuò)增移植前，取同種異體健康骨髓，收獲單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，借助間質(zhì)干細(xì)胞的貼壁特性，反復(fù)換液、棄懸浮細(xì)胞，逐步獲得純的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞；通過形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞術(shù)分析、向成骨、成脂、神經(jīng)樣細(xì)胞分化的多向分化潛能鑒定，證實(shí)分離到的細(xì)胞為間質(zhì)干細(xì)胞，并不斷傳代擴(kuò)增，備用；B.間質(zhì)干細(xì)胞與同種異體造血干細(xì)胞聯(lián)合移植移植前處理造血干細(xì)胞的準(zhǔn)備同常規(guī)骨髓移植方案；按步驟A備用的間質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞活度檢測＞95％，在常規(guī)骨髓移植的基礎(chǔ)上加入間質(zhì)干細(xì)胞，同時(shí)經(jīng)靜脈輸入受體，輸入劑量為2.5×107細(xì)胞/Kg體重。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，當(dāng)用于病人的造血重建和免疫重建時(shí)，包括以下步驟A.間質(zhì)干細(xì)胞的分離、鑒定與傳代擴(kuò)增移植前，取同種異體健康骨髓，收獲單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，借助間質(zhì)干細(xì)胞的貼壁特性，反復(fù)換液、棄懸浮細(xì)胞，逐步獲得純的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞；通過形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞術(shù)分析、向成骨、成脂、神經(jīng)樣細(xì)胞分化的多向分化潛能鑒定，證實(shí)分離到的細(xì)胞為間質(zhì)干細(xì)胞，并不斷傳代擴(kuò)增，備用；B.間質(zhì)干細(xì)胞與同種異體造血干細(xì)胞聯(lián)合移植移植前處理造血干細(xì)胞的準(zhǔn)備同常規(guī)骨髓移植方案；按步驟A備用的間質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞活度檢測＞95％，在常規(guī)骨髓移植的基礎(chǔ)上加入間質(zhì)干細(xì)胞，同時(shí)經(jīng)靜脈輸入受體，輸入劑量為2～8×106細(xì)胞/Kg體重。
全文摘要
本發(fā)明屬于干細(xì)胞與免疫學(xué)領(lǐng)域，涉及間質(zhì)干細(xì)胞與造血干細(xì)胞聯(lián)合移植促進(jìn)造血重建和免疫重建的應(yīng)用。本發(fā)明可用于大鼠和病人的造血重建和免疫重建時(shí)，包括以下步驟A、間質(zhì)干細(xì)胞的分離、鑒定與傳代擴(kuò)增；B、間質(zhì)干細(xì)胞與同種異體造血干細(xì)胞聯(lián)合移植；C、移植后造血重建、免疫重建及GVHD的檢測。本發(fā)明不僅明顯促進(jìn)骨髓移植(BMT)后造血重建和免疫重建；也可降低GVHD的發(fā)生率及其嚴(yán)重程度，從而極大地提高造血干細(xì)胞移植的治療效果。
文檔編號C12N5/08GK1804027SQ200510032738
公開日2006年7月19日 申請日期2005年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月13日
發(fā)明者項(xiàng)鵬, 李樹濃, 雷俊霞 申請人:中山大學(xué)