專利名稱：重組惡性瘧原蟲175kD紅細(xì)胞結(jié)合抗原功能區(qū)蛋白及其制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA重組技術(shù)和基因工程疫苗領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種含惡性瘧原蟲175kD紅細(xì)胞結(jié)合抗原功能區(qū)重組蛋白，編碼該重組蛋白的DNA序列，含該DNA序列的載體，含該載體的宿主細(xì)胞，用基因工程制備該重組蛋白的方法，以及該重組蛋白在作為藥物靶蛋白以及發(fā)展瘧疾疫苗方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
瘧疾是人類最古老的傳染病之一，目前仍嚴(yán)重影響人類的健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的最新調(diào)查，約世界人口的40％仍處在瘧疾威脅之中，分布于100多個國家。目前世界上每年有3至5億人罹患瘧疾，其中約300萬人死亡。更為嚴(yán)重的是，由于瘧原蟲及蚊媒抗藥性的產(chǎn)生和迅速擴(kuò)散，瘧疾不僅沒有得到有效控制，反而有卷土重來之勢。因此，開展全球遏制瘧疾計劃已成為WHO在新世紀(jì)兩個重點(diǎn)研究領(lǐng)域之一。
人們在瘧疾防治中依靠或期望獲得突破的主要有三個途徑抗瘧藥、瘧疾疫苗和蚊媒防制。但抗瘧藥及蚊媒防制面臨著巨大的困難和挑戰(zhàn)，這是因為瘧原蟲及蚊蟲抗藥性的產(chǎn)生和擴(kuò)散。盡管目前尚未有應(yīng)用價值的瘧疾疫苗問世，但普遍認(rèn)為發(fā)展瘧疾疫苗是人類控制乃至消滅瘧疾的重要途徑。
大量研究表明，瘧疾是可以通過研制有效的疫苗而實(shí)現(xiàn)預(yù)防的。如用滅活子孢子免疫的志愿者能完全保護(hù)后來的攻擊感染。再如用鼠瘧原蟲的重組抗原免疫小鼠，亦能完全保護(hù)后來同種瘧原蟲的攻擊感染。此外，瘧疾流行病學(xué)研究也顯示，死于瘧疾的主要是無瘧疾免疫力的人群，如在瘧區(qū)的兒童和非瘧區(qū)人群進(jìn)入瘧區(qū)，而在瘧區(qū)的成人很少因瘧疾而死亡。如給這些無免疫力的人群接種有效的疫苗，使其達(dá)到與瘧區(qū)成人同樣的免疫力，這樣就能實(shí)現(xiàn)預(yù)防瘧疾和降低瘧疾死亡率的目標(biāo)。因此，瘧疾疫苗研制已成為當(dāng)今世界性熱點(diǎn)課題。
在瘧疾疫苗研究中，有兩個候選疫苗的研究曾受到廣泛關(guān)注，一是抗子孢子疫苗。該疫苗能抑制子孢子入侵肝細(xì)胞。但在后來的臨床試驗中效果不佳。據(jù)分析，其主要原因是該疫苗只產(chǎn)生抗子孢子免疫力，這樣即使有極個別子孢子逃避該疫苗免疫攻擊而幸存下來，就能入侵并在肝細(xì)胞生長繁殖，產(chǎn)生足夠的裂殖子引起宿主致病。另一個是SPf.66多價合成肽疫苗。該疫苗是一個只有3個10肽表位通過疏水氨基酸相隔連接而成45肽的多聚物[Patarroyo，M.E.，et al，induction of protective immunity against experimental infection with malaria suingSynthetic peptides，Nature，328629，1987]。該疫苗在夜猴攻擊試驗中曾取得了較好的免疫保護(hù)效果，但后來在非洲、東南亞及南美洲的現(xiàn)場試驗中未能取得理想的臨床效果，沒有應(yīng)用價值。該疫苗失敗的原因可能是SPf.66只有45肽，而在如此短肽序列中，可能不會有足夠的T細(xì)胞表位能與多數(shù)個體MHC分子結(jié)合，導(dǎo)致抗原提呈受阻。
175kD紅細(xì)胞結(jié)合抗原(EBA-175)是惡性瘧原蟲在紅內(nèi)期裂體增殖時合成并在裂殖體破裂時釋放入血的一種可溶性蛋白。對EBA-175的研究表明，它在惡性瘧原蟲的生活史中可能是一個很重要的功能蛋白。然而，雖然曾有人在大腸桿菌中表達(dá)過175kD紅細(xì)胞結(jié)合抗原(EBA-175)，但是表達(dá)的EBA-175卻沒有免疫原性。另外，出于某種未知原因，雖然有人嘗試在酵母等真核細(xì)胞中表達(dá)EBA-175，但卻尚沒有成功地表達(dá)的175kD紅細(xì)胞結(jié)合抗原的報道。因此，人們一直認(rèn)為EBA-175無法作為抗瘧疾的免疫原實(shí)施應(yīng)用。
綜上所述，盡管以生物技術(shù)為基礎(chǔ)的瘧疾疫苗研究已進(jìn)行了近20年，但至今尚無有應(yīng)用價值的疫苗問世。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)抗瘧疾的有效免疫原和相關(guān)疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的就是提供一種新的可用于瘧疾疫苗的免疫原。所述免疫原是含惡性瘧原蟲175kD紅細(xì)胞結(jié)合抗原功能區(qū)(PfEBA175-IIF2)的重組蛋白。
本發(fā)明的一個目的是提供該免疫原的制法、用途以及含該免疫原的疫苗組合物。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種重組蛋白，它包含惡性瘧原蟲175kD紅細(xì)胞結(jié)合抗原功能區(qū)IIF2的氨基酸序列，并且具有唾液酸依賴的紅細(xì)胞結(jié)合功能。更佳地，所述的重組蛋白具有SEQ ID NO2中1-314位或1-320位所示的氨基酸序列。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離的DNA分子，它編碼本發(fā)明的上述重組蛋白。更佳地，所述的DNA分子包括SEQ ID NO1中所示的核苷酸序列(包括1-960位或1-963位)。
在本發(fā)明第三方面，提供了含有上述DNA分子的載體，以及含所述載體的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種產(chǎn)生本發(fā)明的重組蛋白的方法，它包括步驟在適合表達(dá)所述重組蛋白的條件下，培養(yǎng)上述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)出所述的重組蛋白；和分離所述的重組蛋白。
在本發(fā)明的第五方面，提供了一種組合物，它含有本發(fā)明所述的重組蛋白或其編碼DNA分子和藥學(xué)上可接受的載體。
在另一優(yōu)選例中，所述的組合物是疫苗組合物。
在本發(fā)明的第六方面，提供了一種抗體，它特異性地結(jié)合于本發(fā)明的重組蛋白。
在本發(fā)明的第七方面，提供了一種本發(fā)明重組蛋白或惡性瘧原蟲175kD紅細(xì)胞結(jié)合抗原功能區(qū)(PfEBA175-IIF2)的用途，它被用于制備預(yù)防瘧疾疫苗。


圖1顯示了PfEBA175-IIF2重組蛋白示意圖和合成示意圖。
其中，APfEBA175-IIF2重組蛋白示意圖。
圖中顯示PfEBA175-IIF2在全長PfEBA175分子中的位置。
SP信號肽；I～VI全長Pf EBA175分子的六個區(qū)；TM跨膜區(qū)；CYT胞質(zhì)區(qū)；B重組蛋白基因Pfeba175-IIf2的合成示意圖。
Pfeba175-IIf2基因的合成959bp Pfeba175-IIf2基因分成12個寡核苷酸片段，用不對稱PCR法分步進(jìn)行基因拼接?；?’和3’分別加上XhoI和EcoRI位點(diǎn)用于基因片段的克隆。各合成片段克隆在pBluscript載體進(jìn)行序列分析。
圖2全長Pfeba175-IIf2基因的瓊脂糖凝電泳圖。
電泳顯示Pfeba175合成基因條帶(泳道1)。
圖3免疫印跡法檢測PfEBA175-IIF2的表達(dá)的電泳圖及與紅細(xì)胞的結(jié)合反應(yīng)。
用瘧疾疫區(qū)現(xiàn)場人血清進(jìn)行檢測。其中，泳道1為誘導(dǎo)72小時后的上清。泳道2與大鼠紅細(xì)胞的結(jié)合反應(yīng)；泳道3與人紅細(xì)胞的結(jié)合反應(yīng)；泳道4與神經(jīng)胺酸酶處理的人紅細(xì)胞的結(jié)合反應(yīng)；泳道5與胰蛋白酶處理的人紅細(xì)胞的結(jié)合反應(yīng)；泳道6與兔紅細(xì)胞的結(jié)合反應(yīng)；泳道7與小鼠紅細(xì)胞的結(jié)合反應(yīng)；1.泳道8為誘導(dǎo)前的培養(yǎng)上清。
圖4是SDS-PAGE測定PfEBA175-IIF2的表達(dá)。
在誘導(dǎo)前0hr(泳道2)及誘導(dǎo)后12(泳道3)、24(泳道4)和48小時(泳道5)取培養(yǎng)上清15μl進(jìn)行SDS-PAGE分離和考馬斯亮藍(lán)染色。在35KD處出現(xiàn)一條目的蛋白。泳道1為分子量標(biāo)準(zhǔn)。
圖5是純化的PfEBA175-IIF2重組蛋白的SDS-PAGE電泳圖。
表達(dá)上清分離后，用Ni柱和HPLC上膠層析兩步純化，經(jīng)SPS-PAGE測定獲得目的蛋白純度大于95％。泳道17.5μg；泳道215μg。
圖6顯示了PfEBA175-IIF2與瘧疾疫區(qū)病人血清的結(jié)合反應(yīng)情況。
以PfEBA175-IIF2重組蛋白包被，以1∶200稀釋的瘧疾疫區(qū)病人血清為一抗，進(jìn)行ELISA檢測。結(jié)果顯示，83％的病人血清(65例)的OD值在cutoff值以上(0.084)。這表明，自然感染瘧原蟲的人群產(chǎn)生的針對天然PfEBA175-IIF2的抗體能夠很好地識別PfEBA175-IIF2重組蛋白，進(jìn)一步反應(yīng)了PfEBA175-IIF2重組蛋白與天然蛋白在構(gòu)象上很接近。
圖7顯示了用ELISA法測定免疫兔血清PfEBA175-IIF2特異IgG的水平。
圖8顯示了用ELISA法測定免疫鼠血清PfEBA175-IIF2特異IgG的水平。各組分別為◆IIF2單獨(dú)免疫；■IIF2聯(lián)合免疫；▲PfCP2.9單獨(dú)免疫；×PfCP2.9聯(lián)合免疫。
圖9顯示了免疫血清抑制瘧原蟲體外生長效率-1。
其中兩組分別是1 ISA720佐劑+Pf EBA175-IIF2和ISA720佐劑+Pf CSP陰性對照蛋白(均為15％血清濃度)。
圖10顯示了免疫血清抑制瘧原蟲體外生長效率-2。
其中各組分別是A.免疫猴抗血清中特異的IgG的體外抑制率B.免疫兔抗血清中特異的IgG的體外抑制率。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過深入而廣泛的研究，通過對175kD紅細(xì)胞結(jié)合抗原不同區(qū)段的改造以及對表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)化，首次成功地在酵母系統(tǒng)中制得了含175kD紅細(xì)胞結(jié)合抗原功能區(qū)IIF2且具有免疫原性的重組蛋白。測試表明，該重組蛋白可有效地引起免疫應(yīng)答，具有唾液酸依賴的紅細(xì)胞結(jié)合功能等生物學(xué)特性，在構(gòu)象上與175kD紅細(xì)胞結(jié)合抗原的天然構(gòu)象相似。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
175kD紅細(xì)胞結(jié)合抗原(EBA-175)是惡性瘧原蟲在紅內(nèi)期裂體增殖時合成并在裂殖體破裂時釋放入血的一種可溶性蛋白，由616個氨基酸殘基組成。
EBA-175是由Camus和Hardley在1985年首次報道的，該抗原是惡性瘧原蟲在紅內(nèi)期裂體增殖時合成并在裂殖體破裂時釋放入血的一種可溶性蛋白，該蛋白N-末端為信號肽序列，含有一個跨膜區(qū)以及C-末段的胞內(nèi)區(qū)，胞外區(qū)可分為6個區(qū)域，其中II區(qū)和VI區(qū)為富含半胱氨酸區(qū)，II區(qū)含兩個拷貝的富含半胱氨酸區(qū)(圖1A)。
研究表明，在六種不同的惡性瘧原蟲分離株中均發(fā)現(xiàn)EBA-175，而所有這些分離株與EBA-175肽4抗血清和SAR175抗血清(從感染CAMP分離株之夜猴中制備)產(chǎn)生非常一致的陽性反應(yīng)表明。這提示，也許不同株EBA-175分子之間存在細(xì)微差異，但主要功能域在蛋白結(jié)構(gòu)及構(gòu)象上是保守的，在生物化學(xué)及免疫學(xué)性質(zhì)上是極其相似的。
EBA-175抗原有兩個重要特征一是它能與人紅細(xì)胞血型糖蛋白的唾液酸特異結(jié)合，二是它能與裂殖子結(jié)合。在EBA-175中存在與紅細(xì)胞上受體結(jié)合的功能域。EBA-175的N端富含半胱氨酸的II區(qū)是EBA-175與紅細(xì)胞以唾液酸依賴的方式結(jié)合的功能區(qū)。II區(qū)由兩個重復(fù)片段F1和F2片段組成，F(xiàn)2片段是其與紅細(xì)胞結(jié)合的區(qū)域，它與紅細(xì)胞結(jié)合的方式與全長EBA-175蛋白相同。
如本文所用，術(shù)語“175kD紅細(xì)胞結(jié)合抗原功能區(qū)II區(qū)F2片段”、“175kD紅細(xì)胞結(jié)合抗原功能區(qū)IIF2”或“EBA-175IIF2”可互換使用，都指175kD紅細(xì)胞結(jié)合抗原功能區(qū)II區(qū)的F2片段。該片段的序列是已知的，例如GenBank登錄號U32207中的第447-760位氨基酸。
如本文所用，術(shù)語“175kD紅細(xì)胞結(jié)合抗原功能區(qū)的重組蛋白”、“EBA-175IIF2重組蛋白”等可互換使用，都是指由惡性瘧原蟲175kD紅細(xì)胞結(jié)合抗原功能區(qū)IIF2的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白。此外，175kD紅細(xì)胞結(jié)合抗原功能區(qū)的重組蛋白包括含有或不含有信號肽，以及含有或不含有起始甲硫氨酸的重組蛋白。
如本文所用，術(shù)語重組蛋白中“瘧原蟲175kD紅細(xì)胞結(jié)合抗原功能區(qū)IIF2的氨基酸序列”指在本發(fā)明重組蛋白中的氨基酸序列，該序列與天然的或變異的瘧原蟲EBA-175IIF2片段具有基本上相同的氨基酸序列，并且具有與天然瘧原蟲EBA-175基本上相同的抗原活性及唾液酸依賴的紅細(xì)胞結(jié)合功能等生物學(xué)特性。優(yōu)選的瘧原蟲EBA-175IIF2氨基酸序列包括(但并不限于)天然的EBA-175胞外區(qū)中II區(qū)的第二個富含半胱氨酸區(qū)的氨基酸序列，及其消除了糖基化位點(diǎn)的該氨基酸序列。
此外，在EBA-175IIF2重組蛋白的N端或C末端還可添加其他不影響EBA-175IIF2免疫原性和紅細(xì)胞結(jié)合功能等生物學(xué)特性的氨基酸序列。較佳地，這些添加的氨基酸序列有利于表達(dá)(如信號肽)，有利于純化(如6xHis序列、釀酒酵母α-因子信號肽切割位點(diǎn)(Glu-Lys-Arg))，或可促進(jìn)EBA-175IIF2重組蛋白的免疫原性(例如IL-2、GM-CSF等細(xì)胞因子的序列)。
編碼本發(fā)明重組蛋白的DNA序列，可以全部人工合成。也可用PCR擴(kuò)增或合成的方法獲得EBA-175IIF2的編碼DNA序列，形成編碼本發(fā)明重組蛋白的DNA序列。
為了提高宿主細(xì)胞的表達(dá)量，可以對EBA-175IIF2重組蛋白編碼序列進(jìn)行改造，例如采用宿主細(xì)胞偏好的密碼子，消除不利于基因轉(zhuǎn)錄及翻譯的序列。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，就采用酵母偏好的密碼子，對EBA-175IIF2重組蛋白基因進(jìn)行檢測，排除在基因中不利于基因轉(zhuǎn)錄及翻譯的序列，包括內(nèi)含子剪切位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄終止序列等，從而獲得了利于在酵母中表達(dá)的編碼序列。
在獲得了編碼本發(fā)明重組蛋白的DNA序列之后，將其連入合適的表達(dá)載體，再轉(zhuǎn)入合適的宿主細(xì)胞。最后，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的宿主細(xì)胞，通過分離純化得到本發(fā)明的新的重組蛋白。
如本文所用，術(shù)語“載體”包括質(zhì)粒、粘粒、表達(dá)載體、克隆載體、病毒載體等。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將編碼本發(fā)明新重組蛋白的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，可以形成蛋白表達(dá)載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰近，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞、和哺乳動物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，更佳地是酵母細(xì)胞。
在獲得轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞后，可在適合表達(dá)本發(fā)明重組蛋白的條件下培養(yǎng)該細(xì)胞，從而表達(dá)出重組蛋白。然后再分離出表達(dá)的重組蛋白。
另一方面，本發(fā)明還包括對EBA-175IIF2重組蛋白或其編碼DNA具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于EBA-175IIF2重組蛋白或片段。較佳地，指那些能與EBA-175IIF2重組蛋白或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的EBA-175IIF2重組蛋白結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的EBA-175IIF2重組蛋白或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)EBA-175IIF2重組蛋白或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。
多克隆抗體的生產(chǎn)可用EBA-175IIF2重組蛋白或多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于福氏佐劑等。
在本發(fā)明的另一方面，提供了含有本發(fā)明重組蛋白作為免疫原的組合物，尤其是疫苗組合物，所述的組合物含有0.001-99.9wt％所述的重組蛋白，(b)藥學(xué)上可接受的載體和(c)任選的佐劑，其中各組分之和為100wt％。本發(fā)明的疫苗可以是預(yù)防性的(即預(yù)防感染)或治療性的(即在感染后治療疾病)。
這些疫苗包含免疫性抗原或免疫原、免疫原性多肽、蛋白或蛋白片段、或核酸(如核糖核酸或脫氧核糖核酸)，通常與“藥學(xué)上可接受的載體”組合，這些載體包括本身不誘導(dǎo)產(chǎn)生對接受該組合物的個體有害的抗體的任何載體。合適的載體通常是大的、代謝緩慢的大分子，如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂質(zhì)凝集物(如油滴或脂質(zhì)體)以及無活性的病毒顆粒。這些載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。另外，這些載體可起免疫刺激劑(“佐劑”)作用。
增強(qiáng)組合物效果的較佳的佐劑包括但不局限于(1)鋁鹽(alum)，如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等；(2)ISA720佐劑；(3)福氏佐劑等。
疫苗組合物(包括抗原，藥學(xué)上可接受的載體和/或佐劑)，通常含有稀釋劑，如水，鹽水，甘油，乙醇等。另外，輔助性物質(zhì)，如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等可存在于這類運(yùn)載體中。此外，包括免疫原性組合物在內(nèi)的疫苗組合物可含有在藥學(xué)上可接受載體中的抗原、多肽、蛋白、蛋白片段或核酸。
更具體地，包括免疫原性組合物在內(nèi)的疫苗，包含免疫有效量的免疫原性多肽，以及上述其它所需的組分。“免疫有效量”指以單劑或連續(xù)劑一部分給予個體的量對治療或預(yù)防是有效的。該用量根據(jù)所治療個體的健康狀況和生理狀況、所治療個體的類別(如非人靈長類等)、個體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、所需的保護(hù)程度、疫苗的配制、治療醫(yī)師對醫(yī)療狀況的評估、及其它的相關(guān)因素而定。預(yù)計該用量將在相對較寬的范圍內(nèi)，可通過常規(guī)實(shí)驗來確定。
通常，可將疫苗組合物或免疫原性組合物制成可注射劑，例如液體溶液或懸液；還可制成在注射前適合配入溶液或懸液、液體賦形劑的固體形式。該制劑還可乳化或包封在脂質(zhì)體中，在上述藥學(xué)上可接受的載體下增強(qiáng)佐劑效果。
常規(guī)方法是從腸胃外(皮下或肌內(nèi))途徑通過注射給予免疫原性組合物。適合其它給藥方式的其它配方包括口服、栓劑和透皮應(yīng)用等。治療劑量可以是單劑方案或多劑方案。疫苗可以結(jié)合其它免疫調(diào)節(jié)劑一起給予。
一種疫苗方式是DNA疫苗，即含有編碼本發(fā)明重組蛋白的編碼序列的DNA疫苗。
在本發(fā)明的一個實(shí)例中，全合成了惡性瘧原蟲175kD紅細(xì)胞結(jié)合抗原功能區(qū)基因，并在畢氏酵母中分泌表達(dá)該抗原，經(jīng)分析其構(gòu)象非常接近天然構(gòu)象。該抗原的免疫血清能有效抑制瘧原蟲生長，且具有唾液酸依賴的紅細(xì)胞結(jié)合功能等生物學(xué)特性。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)本發(fā)明的EBA-175IIF2重組蛋白，其構(gòu)象非常接近天然蛋白構(gòu)象，并具有唾液酸依賴的紅細(xì)胞結(jié)合功能等良好的生物學(xué)特性。
(2)EBA-175IIF2重組蛋白的表達(dá)產(chǎn)物能分泌到胞外，并進(jìn)入無蛋白培養(yǎng)上清，便于分離純化，純度可達(dá)95％以上。
(3)EBA-175IIF2重組蛋白的表達(dá)水平高。搖瓶表達(dá)量為20mg/L，而15L發(fā)酵表達(dá)產(chǎn)量可達(dá)300mg/L。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989或中國專利申請CN01105292.9)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1PfEBA-175IIF2基因的合成1.1.Pfeba-175IIf2全合成基因的設(shè)計重組EBA-175IIF2蛋白的序列來自惡性瘧原蟲3D7株175kD紅細(xì)胞結(jié)合抗原功能區(qū)EBA-175IIF2的氨基酸序列。選用畢氏酵母密碼子使用頻率，將該序列進(jìn)行重新設(shè)計。采用計算機(jī)軟件“DNA Star”、Omiga等分析并排除在該基因序列中存在的可能不利于基因轉(zhuǎn)錄及翻譯的任何序列，如轉(zhuǎn)錄終止序列、內(nèi)含子剪接位點(diǎn)序列、長的反向重復(fù)序列等。此外，在新設(shè)計的eba-175IIf2基因的5′和3′端分別增設(shè)XhoI和EcoRI酶切位點(diǎn)，以便能與表達(dá)載體連接。鑒定出該抗原序列中一個潛在糖基化位點(diǎn)，并通過將糖基化位點(diǎn)氨基酸Asn轉(zhuǎn)為Gln(見SEQ ID NO2)，從而排除這一個糖基化位點(diǎn)。
EKREHIDLDD FSKFGCDKNS VDTNTKVWEC KKPYKLSTKD VCVPPRRQEL50CLGNIDRIYD KNLLMIKEHI LAIAIYESRI LKRKYKNKDD KEVCKIIQKT100
FADIRDIIGG TDYWNDLSNR KLVGKINTNS NYVHRNKQND KLFRDEWWKV150IKKDVWNVIS WVFKDKTVCK EDDIENIPQF FRWFSEWGDD YCQDKTKMIE200TLKVECKEKP CEDDNCKRKC NSYKEWISKK KEEYNKQAKQ YQEYQKGNNY250KMYSEFKSIK PEVYLKKYSE KCSNLNFEDE FKEELHSDYK NKCTMCPEVK300DVPISIIRNN EQTSHHHHHH 320(SEQ ID NO2)同時在該基因的5′端加上釀酒酵母α-因子信號肽前導(dǎo)序列的部分序列，包括信號肽切割識別氨基酸Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala的密碼子序列(核苷酸序列為aaa aga gag gct gaa gct)，使之能分泌表達(dá)，并在3′端增設(shè)編碼6個組氨酸的序列，以便使用Ni-NTA柱純化。由此產(chǎn)生的DNA序列由959bp組成，并定名為eba-175IIf2。這樣，EBA-175IIF2重組蛋白由320個氨基酸組成。圖1顯示合成基因示意圖。
1.2.Pfeba-175IIf2全合成基因的的合成參見圖1B。將eba-175IIf2合成基因序列分成12條寡核苷酸鏈，從5′到3′依次命為eba-175IIf2-1至eba-175IIf2-12，相鄰兩個寡核苷酸鏈之間有約16至20堿基的重疊部分。采用基因軟件Oligo 4.0分析相鄰寡核苷酸鏈間重疊部分序列，以排除不利于寡核苷酸鏈拼接的序列，如發(fā)夾結(jié)構(gòu)等。
用PCR方法將12條鏈拼接成雙鏈DNA分子。PCR擴(kuò)增條件為95℃10秒(變性)、55℃30秒(退火)和72℃1分30秒(延伸)，每次25個循環(huán)，產(chǎn)生959bp全長eba-175IIf2合成基因。PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖膠分離，并用QIAGEN DNA回收試劑盒分離目的基因(圖2)。用XhoI和EcoRI雙酶切目的基因片段，酶切條件為在20μl反應(yīng)體系中含有2μg目的基因片段，1×酶切緩沖液，XhoI及EcoRI酶各5單位，37℃反應(yīng)1小時。酶切片段與經(jīng)同樣酶切的pBluscript載體連接，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α大腸桿菌。抽提氨卞青霉素抗性菌落的質(zhì)粒DNA，經(jīng)雙酶切鑒定為正確插入后進(jìn)行DNA序列分析。以排除合成時的錯誤堿基。
將含全長無錯誤的合成基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，經(jīng)反復(fù)接種培養(yǎng)后，回收該質(zhì)粒并進(jìn)行序列分析，結(jié)果在eba-175IIf2基因中無發(fā)現(xiàn)堿基突變。表明該合成基因能穩(wěn)定存在大腸桿菌中。
測序后的Pfeba-175IIf2序列如SEQ ID NO1所示。
為使Pfeba-175IIf2基因能在畢氏酵母中分泌表達(dá)，將該基因5′端進(jìn)行修飾，即在該基因的5′端加上釀酒酵母α-因子信號肽前導(dǎo)序列的部分序列，包括信號肽切割識別氨基酸Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala的密碼子序列(核苷酸序列為aaa agagag gct gaa gct)。在Pfeba-175IIf2基因的5′及3′端分別含有XhoI及EcoRI位點(diǎn)用于該基因克隆入表達(dá)載體。
實(shí)施例2Pfeba-175IIf2基因在畢氏酵母中分泌表達(dá)2.1表達(dá)載體的構(gòu)建Pfeba-175IIf2基因通過XhoI和EcoRI位點(diǎn)插入到pPIC9酵母表達(dá)質(zhì)粒(購于lnvitrogen公司)。這樣，PfEBA-175IIF2的N端與該載體上釀酒酵母α-因子信號肽C末端融合。由于PfEBA-175IIF2分子N端含有該信號肽切點(diǎn)三個特異氨基酸Glu-lys-Arg序列。故分泌表達(dá)釋放的目的蛋白不含信號肽序列。
pPIC9K載體的基本元件與pPIC9相同，但它帶有卡那霉素抗性基因，可用G418進(jìn)行高拷貝插入子的篩選。這樣，用BamHI和SalI將含Pfeba-175IIf2片段切出并插入pPIC9K表達(dá)質(zhì)粒(購于lnvitrogen公司)的相應(yīng)位點(diǎn)中，構(gòu)建成pPIC9K/Pfeba-175IIf2。
2.2轉(zhuǎn)化畢氏酵母SMD1168用SalI將pPIC9K/Pfeba-175IIf2質(zhì)粒線性化，10μg線性化表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化SMD1168畢氏酵母。轉(zhuǎn)化菌先用組氨酸缺陷平板篩選His+轉(zhuǎn)化子，然后用不同濃度G418平板篩選多拷貝插入的轉(zhuǎn)化子。抽提不同轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，用一對目的基因內(nèi)部引物PCR加以鑒定，表明表達(dá)質(zhì)粒插入酵母染色體。經(jīng)鑒定有插入的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行以下表達(dá)研究。
2.3PfEBA-175IIF2表達(dá)轉(zhuǎn)化子先接種在以甘油為碳源的培養(yǎng)基中，生長24小時后，轉(zhuǎn)接到的以甲醇為碳源的培養(yǎng)基中。進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。每24小時取樣、檢測表達(dá)產(chǎn)物上清和細(xì)胞沉淀。SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)檢測結(jié)果顯示在35kD處有明顯的PfEBA-175IIF2表達(dá)條帶，該表達(dá)帶只在甲醇誘導(dǎo)后出現(xiàn)，并隨表達(dá)時間延長，其表達(dá)產(chǎn)物明顯增加(圖4)。用中國瘧區(qū)瘧疾病人血清進(jìn)行免疫印跡法檢測表達(dá)產(chǎn)物，結(jié)果可見35kD目的蛋白印跡。
實(shí)施例3.
PfEBA-175IIF2發(fā)酵與純化經(jīng)對表達(dá)條件的優(yōu)化研究，搖瓶表達(dá)水平可達(dá)20mg/L。用15L罐進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)。在整個發(fā)酵周期中，前期的細(xì)胞呈指數(shù)生長上升，細(xì)胞密度達(dá)OD600＝100。到甘油添加生長期，細(xì)胞生長呈直線上升，細(xì)胞密度達(dá)到OD600＝560。但到了甲醇誘導(dǎo)表達(dá)階段，細(xì)胞總密度基本保持不變，而目的蛋白表達(dá)是在甲醇加入后3-7hr開始，并隨時間延長，表達(dá)產(chǎn)率迅速提高，并不斷分泌到發(fā)酵液中，最高表達(dá)量可達(dá)300mg/L。
PfEBA-175IIF2表達(dá)產(chǎn)物的純化分兩步進(jìn)行第一步是用Ni-NTA柱純化。由于PfEBA-175IIF2C末端含有6×His序列，故表達(dá)產(chǎn)物可結(jié)合到Ni-NTA親和柱上，并用250mM咪唑洗脫目的蛋白。第二步是用凝膠過濾液相法純化。經(jīng)兩步純化的蛋白純度可達(dá)95％(圖5)。
實(shí)施例4用PfEBA-175IIF2免疫動物在該實(shí)施例中，先用純化的PfEBA-175IIF2為抗原，用ISA720為免疫佐劑免疫家兔，實(shí)驗分為7組，第一組為ISA720+PfEBA-175IIF2；第二組為ISA720+PfCP-2；第三組為ISA720+PfCSP；第四組為ISA720+PfEBA-175IIF2+PfCP-2；第五組為ISA720+PfEBA-175IIF2+PfCP-2+PfCSP；第六組為ISA720+變性PfEBA-175IIF2；第七組為ISA720佐劑對照。免疫分4次進(jìn)行，每次免疫分別在第0、20、40、和61天進(jìn)行。每次免疫前及免疫結(jié)束后兩周左右取血測定特異抗體水平(圖7)。具體方法如下PfEBA-175IIF2抗原與ISA720佐劑按3∶7混合，用注射器抽吸乳化至均勻。PfEBA-175IIF2抗原變性處理按以下方法進(jìn)行抗原溶液與固體尿素混合，使終濃度為8M，置50℃水浴60min，加入DTT使其終濃度為20mM，置50℃水浴6hr；再加入碘乙酸鈉使其終濃度為60mM，置室溫60min，畢后用0.1M pH7.5硼酸緩沖液(100mM硼酸、137mM NaCl，調(diào)pH至7.5)透析過夜。免疫劑量為每只家兔200μg，為1ml體積。采用皮下多點(diǎn)注射。四次免疫注射時間分別在D0、D20、D40和D61。在首次免疫后D33和D54、D75取血測定抗體ELISA及IFA滴度ELISA按以下程序進(jìn)行采用表達(dá)PfEBA-175IIF2或惡性瘧原蟲全蟲蛋白為抗原，每孔包被量為0.1μg，加入不同稀釋度的抗血清100μl，每份稀釋血清樣本重復(fù)三孔，經(jīng)37℃反應(yīng)1hr和洗滌后，加入酶標(biāo)二抗，用TMD底物顯色，并讀取450mM OD值。用免疫前血清確定陽性閾值，大于該值的稀釋度為抗血清陽性最終滴度。
ELISA結(jié)果顯示，佐劑對照組沒有產(chǎn)生特異性抗體，其余6組均產(chǎn)生明顯的特異性抗體(圖7)。最高抗體滴度為1∶1,389,224；而用變性的重組PfEBA-175IIF2蛋白免疫家兔抗血清的抗體滴度只有1∶3,228。
另外，在用純化的PfEBA-175IIF2為抗原，用ISA720為免疫佐劑免疫恒河猴和BALB/c小鼠亦產(chǎn)生明顯的特異性抗體(圖8)。最高抗體滴度為1∶41,026(恒河猴)、1∶61,435(BALB/c小鼠)。
上述結(jié)果表明，該重組蛋白在小鼠、家兔、恒河猴免疫實(shí)驗中顯示出極高免疫原性，遠(yuǎn)高于變性的PfEBA-175IIF2蛋白。
實(shí)施例5PfEBA-175IIF2對瘧原蟲的體外抑制試驗用于本實(shí)驗的惡性瘧原蟲FCC1/HN株取自海南省。培養(yǎng)按國際上通用的Trager氏蠟燭缸法進(jìn)行，并按以下公式計算抑制原蟲生長率(抑制率) 具體方法如下惡性瘧原蟲FCC1/HN株按Trager和Jansen氏方法進(jìn)行體外培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)液，每四天添加紅細(xì)胞。用于抑制試驗的原蟲需經(jīng)過同步處理，即在實(shí)驗前24小時，含有各期的瘧原蟲與5％山梨醇混合，置室溫30min。經(jīng)此處理的原蟲主要只含環(huán)狀體時期的原蟲。再繼續(xù)培養(yǎng)24小時，絕大部分已發(fā)育到裂殖體。將此時的原蟲配制成2％細(xì)胞壓積和0.5％的原蟲感染率。按實(shí)驗需要加入不同量抗血清，配制成不同抗血清濃度的起始培養(yǎng)物。以每孔200μl將該培養(yǎng)物置96孔平板中，培養(yǎng)24hr或72小時后，制作薄血膜、吉氏染色，用顯微鏡計數(shù)原蟲率。
抗血清制備用滅菌注射器從免疫家兔心臟取血，置滅菌離心管中，待血液凝固，血凝塊逐漸縮小溢出血清后，離心回收血清，分離的血清經(jīng)56℃30min滅活及過濾除菌后用于上述抑制試驗。
除去IgG抗血清的制備用蛋白A吸附法除去抗血清中的抗體。裝填一支蛋白A-Agarose層折柱，按廠家說明書對該柱進(jìn)行預(yù)處理。加抗血清于柱上，收集濾過液，反復(fù)過柱直至在SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染膠上未能見到IgG條帶。同時洗脫結(jié)合在柱上的IgG。體外抑制試驗結(jié)果(圖9)ISA720佐劑與PfEBA-175IIF2抗原的免疫血清經(jīng)6.7倍稀釋后能抑制85％(恒河猴血清)及82％(家兔血清)以上原蟲的生長，且這種作用是依賴于PfEBA-175IIF2正確的空間構(gòu)象。
結(jié)果如下(1)用ISA720佐劑+PfEBA-175IIF2免疫的兔血清能抑制82％原蟲生長，而只用PfCSP陰性對照組無明顯抑制作用(IR0％)。(圖9)(2)用8M尿素和DTT變性PfEBA-175IIF2蛋白，再用烷化劑進(jìn)行烷化處理。經(jīng)此變性處理的PfEBA-175IIF2與ISA720免疫產(chǎn)生的抗血清完全失去抑制瘧原蟲生長作用(IR0％)。
(4)用蛋白A柱除去各兔免疫血清中IgG，并測定這種無IgG的免疫血清的抑制惡性瘧原蟲體外生長作用。結(jié)果顯示ISA720佐劑+PfEBA-175IIF2組的免疫血清，在去除IgG后失去原有的抑制作用，其抑制率從原來的82％降為0％。
以上抑制試驗結(jié)果表明(1)PfEBA-175IIF2產(chǎn)生的免疫血清經(jīng)6.7倍(15％血清含量)稀釋后能有效抑制瘧原蟲體外生長(＞80％的抑制率)，且這種抑制作用是抗體介導(dǎo)的，因為去除抗體的免疫血清失去原有的抑制作用，且這種抑制作用是IgG濃度依賴的；(2)ISA720佐劑是由法國賽比克公司研制的新型佐劑，現(xiàn)已批準(zhǔn)人體應(yīng)用。本結(jié)果顯示，ISA720和PfEBA-175IIF2聯(lián)合免疫產(chǎn)生很高的抗體水平。這為PfEBA-175IIF2作為疫苗進(jìn)行臨床試驗尋找到了合適的佐劑；(3)PfEBA-175IIF2的免疫保護(hù)作用是依賴于該抗原正確的構(gòu)象，經(jīng)變性處理的抗原不能誘導(dǎo)保護(hù)性抗體。這樣，有效的PfEBA-175IIF2重組疫苗需要產(chǎn)生具有天然構(gòu)象的表達(dá)產(chǎn)物。
另外，重組PfEBA175-IIF2和PfCP-2.9聯(lián)合免疫后，針對兩個重組蛋白的ELISA抗體滴度不低于兩個蛋白單獨(dú)免疫的滴度針對兩個重組蛋白的抗血清和特異性IgG在體外抑制惡性瘧原蟲生長的能力并不應(yīng)聯(lián)合免疫而減弱(圖7、8)。如前所述，由于瘧原蟲生活史復(fù)雜，抗原具有種、株、期特異性，且存在嚴(yán)重的抗原變異，單價疫苗很難達(dá)到100％的有效率。因此，一個有效瘧疾疫苗需有多個抗原的摻入，而本發(fā)明中涉及到的PfEBA175-IIF2與已進(jìn)入I期臨床試驗的瘧疾疫苗候選抗原PfCP-2.9進(jìn)行聯(lián)合免疫所獲得的良好的實(shí)驗結(jié)果，應(yīng)為這種多個抗原摻入的疫苗研制模式帶來曙光。
實(shí)施例6重組PfEBA-175IIF2與紅細(xì)胞的結(jié)合反應(yīng)用無血清的RPMI1640培養(yǎng)液在4℃對含有重組PfEBA-175IIF2蛋白的發(fā)酵培養(yǎng)上清進(jìn)行徹底透析。透析過的發(fā)酵培養(yǎng)上清液在室溫下分別與人完整的紅細(xì)胞、經(jīng)過神經(jīng)胺酸酶或胰蛋白酶處理的人紅細(xì)胞、小鼠、大鼠、兔的紅細(xì)胞充分混勻60分鐘。再用1M NaCl將結(jié)合在紅細(xì)胞上的蛋白洗脫下來。用SDS-PAGE和Western blot的方法來驗證重組PfEBA-175IIF2與紅細(xì)胞的結(jié)合情況。
結(jié)果如圖3所示。表明重組EBA175-IIF2可以與完整的紅細(xì)胞結(jié)合卻不能與神經(jīng)氨酸酶或胰蛋白酶處理的紅細(xì)胞結(jié)合?？梢娭亟MEBA175-IIF2具有與天然蛋白極其相似的唾液酸依賴的紅細(xì)胞結(jié)合功能的生物學(xué)特性。
實(shí)施例7重組PfEBA-175IIF2與瘧疾疫區(qū)病人血清的結(jié)合反應(yīng)以PfEBA175-IIF2重組蛋白包被，以1∶200稀釋的瘧疾疫區(qū)病人血清為一抗，進(jìn)行ELISA檢測。
結(jié)果如圖6所示。結(jié)果顯示，83％的病人血清(65例)的OD值在cutoff值以上(0.084)。這表明，自然感染瘧原蟲的人群產(chǎn)生的針對天然PfEBA175-IIF2的抗體能夠很好地識別PfEBA175-IIF2重組蛋白，進(jìn)一步反應(yīng)了PfEBA175-IIF2重組蛋白與天然蛋白在構(gòu)象上很接近。
討論瘧疾目前仍然嚴(yán)重威脅著人類的健康，瘧原蟲抗藥性的產(chǎn)生和迅速擴(kuò)散及抗殺蟲劑蚊媒的出現(xiàn)和蔓延，使得瘧疾的藥物防治陷入了困境，故研制有效的瘧疾疫苗以控制瘧疾流行已成為當(dāng)務(wù)之急。瘧原蟲生活史復(fù)雜，抗原具有種、株、期特異性，且存在嚴(yán)重的抗原變異，這給疫苗研制帶來困難，因而瘧疾疫苗研制的難度比人們當(dāng)初想象的要高得多。在瘧原蟲生活史中，只有紅內(nèi)期原蟲使人致病甚至致命，因此研制有效的紅內(nèi)期瘧疾疫苗可降低瘧疾的發(fā)病率和病死率，對瘧疾的防治具有重要意義；而入侵紅細(xì)胞對惡性瘧原蟲的生存又至關(guān)重要，瘧原蟲只有入侵宿主紅細(xì)胞才能生存，因此這一過程應(yīng)該是瘧原蟲紅內(nèi)期生活史中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而瘧原蟲入侵紅細(xì)胞是個復(fù)雜的過程，大致可分為瘧原蟲與紅細(xì)胞的吸附、瘧原蟲與紅細(xì)胞結(jié)合部位的識別與重新定向、瘧原蟲對紅細(xì)胞的攻擊、入侵等幾個階段。干擾或者阻斷這種結(jié)合就能阻斷瘧原蟲裂殖子入侵，阻斷瘧原蟲入侵紅細(xì)胞就應(yīng)該能阻止紅內(nèi)期原蟲的生長，應(yīng)是瘧疾疫苗發(fā)展的一個重要方面。已有的實(shí)驗證據(jù)表明，瘧原蟲入侵宿主紅細(xì)胞的過程是受體和配體介導(dǎo)的，且涉及到多對受體配體的相互作用，因此，對不同瘧原蟲配體蛋白的研究是瘧疾疫苗研制所必需。
總而言之，瘧原蟲生活史及抗原的復(fù)雜性使宿主免疫系統(tǒng)對瘧原蟲的應(yīng)答反應(yīng)亦十分復(fù)雜，也增加了瘧疾疫苗研制的難度，因此在疫苗候選抗原的選擇上更應(yīng)該從瘧原蟲生活史中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)入手，選擇與這樣的生活史環(huán)節(jié)關(guān)系密切的瘧原蟲蛋白對瘧疾疫苗的研制具有更重要的意義。
入侵紅細(xì)胞對惡性瘧原蟲的生存至關(guān)重要，而具有紅細(xì)胞結(jié)合功能的EBA175-IIF2蛋白勢必參與惡性瘧原蟲入侵這一重要的生命活動。研究提示，該蛋白亦具有較強(qiáng)的免疫原性，其免疫血清可在體外抑制瘧原蟲的生長。近年發(fā)現(xiàn)EBA-175抗原在紅細(xì)胞前期瘧原蟲階段也表達(dá)，使得這一瘧疾疫苗候選抗原備受研究者關(guān)注。
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，從DNA水平全合成惡性瘧原蟲175kD紅細(xì)胞結(jié)合抗原功能區(qū)蛋白基因及表達(dá)該重組蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該重組蛋白可有效地引起免疫應(yīng)答，且具有唾液酸依賴的紅細(xì)胞結(jié)合功能等生物學(xué)特性。
另外，由于瘧原蟲生活史復(fù)雜，抗原具有種、株、期特異性，且存在嚴(yán)重的抗原變異，單價疫苗很難達(dá)到100％的有效率。因此，一個有效瘧疾疫苗需有多個抗原的摻入，而本發(fā)明中涉及到的PfEBA175-IIF2與已進(jìn)入I期臨床試驗的瘧疾疫苗候選抗原PfCP-2.9進(jìn)行聯(lián)合免疫所獲得的良好的實(shí)驗結(jié)果，為開發(fā)多價疫苗帶來曙光。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)<120>重組惡性瘧原蟲175kD紅細(xì)胞結(jié)合抗原功能區(qū)蛋白及其制法和用途<130>054501<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>963<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(963)<223>175kD紅細(xì)胞結(jié)合抗原功能區(qū)IIF2重組蛋白的編碼序列<400>1gaaaagagag agcatattga tttggacgat ttttctaaat tcggttgtga caagaactcc 60gttgatacta atacgaaagt ctgggaatgc aagaaaccat acaagttgtc taccaaagac 120gtttgtgtcc ctccaagacg tcaagaattg tgtcttggca acattgatag aatctacgac 180aagaacttgc tgatgattaa agagcacatc ttggctattg ccatctatga atctaggatt 240cttaagcgta aatacaagaa caaagatgac aaggaggttt gtaaaatcat tcaaaagact 300tttgctgata tcagagacat tatcggtgga acagattact ggaacgactt gtctaatcgt 360aaactggttg gtaagattaa cactaattcc aactacgtcc atagaaataa acaaaacgat 20aagttgttta gggacgaatg gtggaaagtt attaagaaag atgtctggaa cgttatctct 80tgggtgttca aggacaaaac tgtttgtaag gaggatgaca ttgaaaacat cccacaattt 540ttcagatggt tttccgagtg gggtgatgac tactgtcagg ataaaactaa gatgattgaa 600accttgaaag ttgagtgcaa ggaaaaacca tgtgaggacg ataactgcaa gagaaaatgt 660aattcttaca aggaatggat ttccaaaaag aaagaggaat ataacaagca agcaaaacag 720taccaagagt atcagaaggg taataactac aaaatgtatt ctgaatttaa gtcaattaaa 780ccagaggttt acttgaagaa atattctgaa aagtgttcca atcttaactt cgaggatgaa 840tttaaggagg aattgcattc tgactacaag aacaaatgta ctatgtgccc agaggttaag 900gatgtcccta tttcaatcat tagaaataac gaacaaacat ctcaccatca ccatcaccat 960taa 963<210>2<211>320<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(320)<223>175kD紅細(xì)胞結(jié)合抗原功能區(qū)IIF2重組蛋白<400>2Glu Lys Arg Glu His Ile Asp Leu Asp Asp Phe Ser Lys Phe Gly Cys1 5 10 15Asp Lys Asn Ser Val Asp Thr Asn Thr Lys Val Trp Glu Cys Lys Lys20 25 30Pro Tyr Lys Leu Ser Thr Lys Asp Val Cys Val Pro Pro Arg Arg Gln35 40 45Glu Leu Cys Leu Gly Asn Ile Asp Arg Ile Tyr Asp Lys Asn Leu Leu50 55 60Met Ile Lys Glu His Ile Leu Ala Ile Ala Ile Tyr Glu Ser Arg Ile65 70 75 80Leu Lys Arg Lys Tyr Lys Asn Lys Asp Asp Lys Glu Val Cys Lys Ile85 90 95Ile Gln Lys Thr Phe Ala Asp Ile Arg Asp Ile Ile Gly Gly Thr Asp100 105 110Tyr Trp Asn Asp Leu Ser Asn Arg Lys Leu Val Gly Lys Ile Asn Thr115120 125Asn Ser Asn Tyr Val His Arg Asn Lys Gln Asn Asp Lys Leu Phe Arg130135 140Asp Glu Trp Trp Lys Val Ile Lys Lys Asp Val Trp Asn Val Ile Ser145 150155 160Trp Val Phe Lys Asp Lys Thr Val Cys Lys Glu Asp Asp Ile Glu Asn165170 175Ile Pro Gln Phe Phe Arg Trp Phe Ser Glu Trp Gly Asp Asp Tyr Cys180185 190Gln Asp Lys Thr Lys Met Ile Glu Thr Leu Lys Val Glu Cys Lys Glu195200 205Lys Pro Cys Glu Asp Asp Asn Cys Lys Arg Lys Cys Asn Ser Tyr Lys210215 220Glu Trp Ile Ser Lys Lys Lys Glu Glu Tyr Asn Lys Gln Ala Lys Gln225230 235 240Tyr Gln Glu Tyr Gln Lys Gly Asn Asn Tyr Lys Met Tyr Ser Glu Phe245250 255Lys Ser Ile Lys Pro Glu Val Tyr Leu Lys Lys Tyr Ser Glu Lys Cys260265 270Ser Asn Leu Asn Phe Glu Asp Glu Phe Lys Glu Glu Leu His Ser Asp275280 285Tyr Lys Asn Lys Cys Thr Met Cys Pro Glu Val Lys Asp Val Pro Ile290295 300Ser Ile Ile Arg Asn Asn Glu Gln Thr Ser His His His His His His305310 315 320
權(quán)利要求
1.一種重組蛋白，其特征在于，它包含惡性瘧原蟲175kD紅細(xì)胞結(jié)合抗原功能區(qū)IIF2的氨基酸序列，并且具有唾液酸依賴的紅細(xì)胞結(jié)合功能。
2.如權(quán)利要求1所述的重組蛋白，其特征在于，所述的重組蛋白具有SEQ IDNO2中1-314位或1-320位所示的氨基酸序列。
3.一種分離的DNA分子，其特征在于，它編碼權(quán)利要求1所述的重組蛋白。
4.如權(quán)利要求3所述的DNA分子，其特征在于，它具有SEQ ID NO1中所示的核苷酸序列。
5.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的DNA分子。
6.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求5所述的載體。
7.一種產(chǎn)生權(quán)利要求1所述的重組蛋白的方法，其特征在于，包括步驟在適合表達(dá)所述重組蛋白的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)出所述的重組蛋白；分離所述的重組蛋白。
9.一種組合物，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的重組蛋白或權(quán)利要求3所述的DNA分子和藥學(xué)上可接受的載體。
10.如權(quán)利要求9所述的組合物，其特征在于，所述的組合物是疫苗組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種惡性瘧原蟲175kD紅細(xì)胞結(jié)合抗原功能區(qū)的重組蛋白(PfEBA175－IIF2)，編碼該重組蛋白的DNA序列，含該DNA序列的載體，含該載體的宿主細(xì)胞，用基因工程制備該重組蛋白的方法，以及該重組蛋白在制備抗瘧疾疫苗、瘧原蟲入侵機(jī)制基礎(chǔ)研究方面的應(yīng)用。本發(fā)明的PfEBA175－IIF2重組蛋白具有優(yōu)異的免疫原性和良好的生物學(xué)特性，可在免疫個體中引發(fā)有效的抗瘧原蟲的免疫應(yīng)答，且具有唾液酸依賴的紅細(xì)胞結(jié)合功能。
文檔編號C12N15/30GK1887907SQ20051002723
公開日2007年1月3日 申請日期2005年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月29日
發(fā)明者潘衛(wèi)慶, 張冬梅 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)