專利名稱：一種編碼植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號(hào)因子的hrpN基因及其表達(dá)產(chǎn)物與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物基因工程領(lǐng)域，涉及一種編碼植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號(hào)因子的hrpN基因及其表達(dá)產(chǎn)物，以及該基因與其表達(dá)產(chǎn)物在改良植物品質(zhì)等方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
微生物蛋白農(nóng)藥是對(duì)多種農(nóng)作物具有很強(qiáng)生物活性的一類蛋白質(zhì)藥物。按作用機(jī)理不同又可分為傳統(tǒng)微生物蛋白農(nóng)藥和新型微生物蛋白農(nóng)藥。傳統(tǒng)微生物蛋白農(nóng)藥主要是來(lái)自蘇云金芽孢桿菌(Bt)的殺蟲(chóng)晶體蛋白(ICP)，新型微生物蛋白農(nóng)藥主要是蛋白激發(fā)子類物質(zhì)，它與傳統(tǒng)微生物蛋白農(nóng)藥最大的區(qū)別在于其不直接殺滅害蟲(chóng)和病原物，而是激發(fā)植物自身的抗病防蟲(chóng)基因的表達(dá)，并促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育。目前研究報(bào)道的具有代表性的新型微生物蛋白農(nóng)藥主要有過(guò)敏蛋白(Harpin)、隱地蛋白(Cryptogein)和激活蛋白(Activator)等，其中最受關(guān)注、最有應(yīng)用前景的是Harpin類蛋白激發(fā)子。
Harpin蛋白主要是由歐文氏桿菌屬(Erwinia)細(xì)菌產(chǎn)生的一類能激發(fā)植物過(guò)敏反應(yīng)的蛋白質(zhì)(30-40kda)，可誘導(dǎo)植物體內(nèi)一系列基因的表達(dá)，激活植物自身的生長(zhǎng)系統(tǒng)和防衛(wèi)系統(tǒng)，從而使植物能抵御多種病害的侵染和逆境的脅迫，并獲得促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育和提高增產(chǎn)的效果。1992年，美國(guó)康乃爾大學(xué)的韋忠民等首先從梨火疫歐文氏桿菌(E.amylovora)中克隆出這類過(guò)敏蛋白基因，并首次提出Harpin蛋白誘導(dǎo)植物的過(guò)敏反應(yīng)可能與其抗病性作用有關(guān)，由此推動(dòng)了新型微生物蛋白農(nóng)藥研究的興起。經(jīng)過(guò)約10年的努力，以此為背景的美國(guó)Eden生物科技公司成功開(kāi)發(fā)和研制出具有廣譜抗病防蟲(chóng)功能的新型微生物蛋白農(nóng)藥Messenger，該產(chǎn)品以其對(duì)大田作物和經(jīng)濟(jì)作物抗病增產(chǎn)方面良好的效果以及對(duì)綠色無(wú)公害農(nóng)業(yè)卓越的貢獻(xiàn)，曾兩度獲美國(guó)環(huán)境保護(hù)委員會(huì)頒發(fā)的總統(tǒng)綠色化學(xué)挑戰(zhàn)獎(jiǎng)。
現(xiàn)代分子植物病理學(xué)揭示，植物病原細(xì)菌既有其致病性，也有誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性和促進(jìn)生長(zhǎng)的能力，而決定這種能力的基因是植物病原細(xì)菌的hrp(hypersensitive response and pathogenicity)基因簇。hrp基因決定著植物病原細(xì)菌在非寄主植物上激發(fā)過(guò)敏反應(yīng)(hypersensitive response on non-host plants，HR)的能力和在寄主植物上的基本寄生性或致病性(parasitism or pathogenicity onhost plants)。HR是植物一種局部的、快速的細(xì)胞編程死亡形式，是植物主動(dòng)抗性的結(jié)果，其抗性作用不僅表現(xiàn)在對(duì)病原細(xì)菌侵染擴(kuò)展的限制，而且能進(jìn)一步誘導(dǎo)植物體內(nèi)產(chǎn)生類似免疫機(jī)制的系統(tǒng)獲得性抗性反應(yīng)。
繼韋忠民等(Wei ZM，et al.Science，1992，257(5066)85-88)成功克隆和表達(dá)hrpNEa基因之后，近10多年來(lái)人們又相繼從E.carotovora subsp carotovora、E.chrysanthemi、P.s.syringae、P.s.pv.glycinea、P.s.tomato、R.solanacearum中克隆到編碼Harpin類蛋白的基因，并成功表達(dá)了這些蛋白，如HarpinEcc，36kda(Mukherjee A.，Mol.Plant-Microbe Interact.1997，10462-471.)；HarpinEch，36kda(Bauer D.W.，Mol.Plant Microbe Interact，1995，8484 491)；HarpinPss，34.7kda；HarpinPsg，35.3kda；HarpinPst，36.5kda(Preston G，Mol Plant-Microbe Interact.，1995，8717)；HarpinXoo，15.3kda，HarpinXooc，15.6kda(聞偉剛，植物病理學(xué)，2001，31(4)295-300)等。
迄今為止，所有這些Harpin類蛋白差不多都具有以下分子特征(1)親水性；(2)對(duì)熱穩(wěn)定，100℃處理10分鐘不會(huì)失活；(3)對(duì)蛋白酶K和紫外線敏感；(4)富含甘氨酸而缺少半胱氨酸；(5)水溶性酸性蛋白；(6)無(wú)四級(jí)結(jié)構(gòu)。
最近的研究表明，Harpin類蛋白可能在植物的信號(hào)通路中起著重要作用。研究人員用Harpin處理擬南芥，發(fā)現(xiàn)擬南芥中Cl、Ca、K、H、Cu、Zn離子通道以及各種氧化酶被激活，這些氧化酶包括ACC合成酶、抗壞血酸氧化酶、Cu/Zn超氧化物歧化酶、Cu分子伴侶前體等等?，F(xiàn)在通常認(rèn)為，植物細(xì)胞壁中廣泛存在Harpin蛋白的受體，即Harpin結(jié)合蛋白(Harpin-binding proteins，HrBP)，Harpin可以通過(guò)與這些受體蛋白HrBP結(jié)合激活植物中的多條信號(hào)通路。這些信號(hào)通路大致可以分為以下三類(1)與植物抗病和驅(qū)蟲(chóng)相關(guān)的信號(hào)通路的激活，包括過(guò)敏反應(yīng)與細(xì)胞死亡、離子交換通道、水楊酸途徑、茉莉酸途徑、苯丙氨酸解氨酶介導(dǎo)的途徑以及其它一些抗性基因介導(dǎo)的途徑；(2)與促進(jìn)植物生長(zhǎng)相關(guān)的信號(hào)通路的激活，包括一般的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子、胚軸延伸轉(zhuǎn)錄因子、生長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄因子、乙烯反應(yīng)元件結(jié)合蛋白系以及蔗糖合成酶和其他胚胎形成酶等；(3)與植物抗逆相關(guān)的信號(hào)通路的激活，包括熱休克蛋白、COR基因和耐鹽鋅蛋白等。另外可能還存在一條比較特殊的不依賴于NPR1介導(dǎo)的植物對(duì)細(xì)菌抗性的信號(hào)通路。
Harpin蛋白雖然來(lái)源于病原菌，但作為一類非特異性的激發(fā)蛋白因子，卻能引起非寄主植物發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)，并誘導(dǎo)其抗病性、驅(qū)蟲(chóng)性和抗逆性的增加，以及促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育、提高產(chǎn)量等。更有趣的是，在轉(zhuǎn)hrpNEa基因的梨上，HarpinEa對(duì)產(chǎn)生梨火疫病的宿主寄生菌E.amylovora也表現(xiàn)出非常強(qiáng)的抗性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種編碼植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號(hào)因子的hrpN基因及其表達(dá)產(chǎn)物，以及該基因與其表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用。
本發(fā)明所提供的一種編碼植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號(hào)因子的hrpN基因，名稱為hrpNUSAW004，其基因編碼區(qū)共計(jì)有1212個(gè)核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID No.1，該基因來(lái)自蘋(píng)果火疫歐文氏桿菌(Erwinia amylovora)USAW004菌株，蘋(píng)果、梨等是該桿菌的寄主植物，該基因以hrpN基因簇形式存在于USAW004菌株的染色體DNA上。該基因可用于促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育；增強(qiáng)植物的廣譜抗病性，包括對(duì)多種細(xì)菌、真菌和病毒的抗性；增強(qiáng)植物的驅(qū)蟲(chóng)性；增強(qiáng)植物的抗逆性(植物對(duì)干旱、嚴(yán)寒、鹽堿等不良環(huán)境的耐受性)；延長(zhǎng)作物產(chǎn)品的儲(chǔ)存時(shí)間；對(duì)盆花、苗木的塑型作用。另外該基因還可以作為基因資源，在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育和防治病蟲(chóng)害有關(guān)的農(nóng)業(yè)生物技術(shù)育種、轉(zhuǎn)基因植物以及與其它有益基因重組構(gòu)建具有商業(yè)價(jià)值的遺傳重組體等方面有廣泛應(yīng)用前景。含有該基因的遺傳重組體，亦可應(yīng)用于調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育和防治病蟲(chóng)害有關(guān)的農(nóng)業(yè)生物技術(shù)育種、轉(zhuǎn)基因植物等方面。
一種編碼植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號(hào)因子的基因hrpNUSAW004所編碼的蛋白HarpinUSAW004，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2，共有403個(gè)氨基酸殘基，分子量為39.67kda，等電點(diǎn)pI4.59，富含甘氨酸Gly而缺乏半胱氨酸Cys，對(duì)溫度穩(wěn)定，在100℃沸水中耐受10-15分鐘仍有活性，沒(méi)有四級(jí)結(jié)構(gòu)，還具有Harpin類蛋白的基本分子屬性和生物學(xué)活性。該蛋白質(zhì)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育、增強(qiáng)植物的廣譜抗病性(包括對(duì)多種細(xì)菌、真菌和病毒的抗性)、增強(qiáng)植物的驅(qū)蟲(chóng)性、增強(qiáng)植物的抗逆性(植物對(duì)干旱、嚴(yán)寒、鹽堿等不良環(huán)境的耐受性)、延長(zhǎng)作物產(chǎn)品的儲(chǔ)存時(shí)間、對(duì)盆花和苗木的塑型作用方面有廣泛應(yīng)用前景。因此，該蛋白質(zhì)可以配制成生物制品，應(yīng)用到以上方面。
本發(fā)明關(guān)于一種編碼植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號(hào)因子的hrpN基因hrpNUSAW004及其表達(dá)產(chǎn)物HarpinUSAW004蛋白質(zhì)，將按以下內(nèi)容進(jìn)行具體表述1、hrpNUSAW004基因的來(lái)源hrpNUSAW004基因來(lái)自蘋(píng)果火疫歐文氏桿菌(Erwinia amylovora)USAW004菌株，蘋(píng)果、梨等是其寄主植物。該基因以hrpN基因簇形式存在于USAW004菌株的染色體DNA上。
2、hrpNUSAW004基因的克隆和測(cè)序(1)菌株首先在LB平板上篩選，并進(jìn)行胞外蛋白酶活性和HR檢測(cè)。(2)將選取的單克隆菌落，于28℃下在LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，離心收集菌體，用基因組DNA分離試劑盒分離、純化細(xì)菌染色體DNA。(3)細(xì)菌染色體DNA經(jīng)Sau3A部分消化，用質(zhì)粒載體pLARF5構(gòu)建蘋(píng)果火疫歐文氏桿菌(Erwinia amylovora)USAW004菌株的基因組文庫(kù)。(4)用梨火疫歐文氏桿菌(Erwinia amylovora)hrpNEa基因(Wei ZM，et al.Science，1992，257(5066)85-88)作分子探針，通過(guò)克隆雜交從USAW004基因組文庫(kù)中篩選鑒別hrpN+質(zhì)粒，獲得包括hrpN基因整個(gè)編碼區(qū)在內(nèi)的2.1kb DNAs片段，并進(jìn)一步將此片段亞克隆進(jìn)pBluescript載體中。(5)用通用引物T7進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，其中有一個(gè)1212bp的閱讀框(reading frame)即為hrpNUSAW004基因的編碼區(qū)，序列如SEQ ID No.1。
3、hrpNUSAW004基因的PCR擴(kuò)增與純化根據(jù)hrpNUSAW004基因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)一對(duì)PCR擴(kuò)增引物，即P15′-TGTAAGCTTATGAGTCTGAATACAAGTGGGCTG-3′和P25′-TGTCTCGAGCTTAAGCCGCGCCCAGCTTGCCAAG-3′。其中A/AGCTT為引入的限制酶HindIII的酶切位點(diǎn)，C/TCGAG為引入的限制酶Xho I的酶切位點(diǎn)。用純化的蘋(píng)果火疫歐文氏桿菌USAW004菌株的染色體DNA作模板，按如下擴(kuò)增參數(shù)進(jìn)行PCR反應(yīng)先95℃預(yù)變性5min，然后94℃/2min 1個(gè)循環(huán)；94℃/15sec+55℃/30sec+72℃/15sec 24個(gè)循環(huán)；94℃/1min+55℃/2min+72℃/3min1個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化。
4、hrpNUSAW004基因工程菌株的構(gòu)建hrpNUSAW004基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制酶HindIII和Xho I消化后，克隆進(jìn)高表達(dá)載體pET28a(+)的HindIII-Xho I位點(diǎn)。用pET28a(+)-hrpNUSAW004質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體菌E.coli JM109(DE3)，通過(guò)選擇壓篩選出含有pET28a(+)-hrpNUSAW004質(zhì)粒的陽(yáng)性表達(dá)工程菌株。
5、hrpNUSAW004基因的表達(dá)產(chǎn)物及其檢測(cè)hrpNUSAW004基因的表達(dá)產(chǎn)物為HarpinUSAW004蛋白質(zhì)。將含有hrpNUSAW004基因超表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-hrpNUSAW004的大腸桿菌工程菌株E.coli JM109(DE3)在加有50ml/L Km的LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)生長(zhǎng)，待OD600達(dá)到0.7(即細(xì)菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)后，再加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度1mM，繼續(xù)培養(yǎng)6個(gè)小時(shí)后，離心收集細(xì)菌細(xì)胞。細(xì)菌細(xì)胞經(jīng)超聲波破碎、離心、12％SDS-PAGE凝膠電泳，在電泳膠板的細(xì)菌樣品泳道上，會(huì)呈現(xiàn)一條顯著寬而濃的39.67kda條帶，它就是hrpNUSAW004基因的表達(dá)產(chǎn)物HarpinUSAW004蛋白質(zhì)，約占細(xì)菌蛋白總量的50％左右。將HarpinUSAW004蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離純化，并對(duì)HarpinUSAW004蛋白質(zhì)進(jìn)行Western blot分析和HR檢測(cè)。
根據(jù)hrpNUSAW004基因的核苷酸序列推測(cè)，HarpinUSAW004蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID No.2。該蛋白質(zhì)具有以下屬性(1)由403個(gè)氨基酸殘基組成；(2)分子量39.67kda；(3)等電點(diǎn)pI4.59；(4)富含甘氨酸Gly，缺乏半胱氨酸Cys；(5)對(duì)溫度特穩(wěn)定，在100℃沸水中耐受10-15分鐘仍有活性；(6)沒(méi)有四級(jí)結(jié)構(gòu)。
6、HarpinUSAW004蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性及其應(yīng)用目前公認(rèn)的Harpin類蛋白的生物活性檢測(cè)方法主要有(1)過(guò)敏反應(yīng)(hypersensitive response，HR)，通常以煙草作被試植物，這也是Harpin類蛋白生物活性檢測(cè)最快速、簡(jiǎn)便的方法；(2)血清學(xué)反應(yīng)，即用標(biāo)準(zhǔn)的Harpin蛋白純品制成血清抗體，然后用這種抗血清對(duì)未知樣品進(jìn)行Western blot分析，通過(guò)抗體-抗原識(shí)別反應(yīng)，可以準(zhǔn)確檢測(cè)出未知樣品中的Harpin類蛋白。
HarpinUSAW004蛋白質(zhì)具有以下主要生物學(xué)功能(1)促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育、提高產(chǎn)量；(2)增強(qiáng)植物的廣譜抗病性，包括對(duì)多種細(xì)菌、真菌和病毒的抗性；(3)使植物獲得對(duì)某些有害昆蟲(chóng)的驅(qū)蟲(chóng)性；(4)增強(qiáng)植物的抗逆性；(5)延長(zhǎng)植物產(chǎn)品的儲(chǔ)存時(shí)間；(6)對(duì)盆花、苗木還有良好的塑型作用。
由于HarpinUSAW004蛋白質(zhì)在增強(qiáng)植物抗病、驅(qū)蟲(chóng)、抗逆以及促進(jìn)生長(zhǎng)和提高產(chǎn)量方面的良好效果，加之對(duì)環(huán)境友好，在環(huán)境中容易分解、沒(méi)有殘留公害，對(duì)人畜鳥(niǎo)魚(yú)無(wú)毒性，而且不會(huì)引起病原物的抗藥性，也不會(huì)誘發(fā)植物遺傳結(jié)構(gòu)(基因組DNA)的改變，可望成為未來(lái)逐步替代高毒、高殘留化學(xué)農(nóng)藥和化學(xué)調(diào)節(jié)劑的優(yōu)良環(huán)保型生物產(chǎn)品的首選。目前正在就其對(duì)各種作物、蔬菜、水果、花卉以及各種經(jīng)濟(jì)植物包括煙草、茶葉等數(shù)十種植物的抗病驅(qū)蟲(chóng)和促長(zhǎng)增產(chǎn)效果進(jìn)行廣泛的試驗(yàn)和品比。已有試驗(yàn)結(jié)果顯示，HarpinUSAW004蛋白對(duì)黃瓜、西紅柿、土豆、辣椒、煙草、玉米、草莓等的抗病驅(qū)蟲(chóng)和促長(zhǎng)增產(chǎn)效果明顯，同時(shí)對(duì)提高某些植物如煙草、茶葉的品質(zhì)亦有很好的效果，而且在同類Harpin產(chǎn)品中對(duì)比效果也很顯著，HarpinUSAW004蛋白可直接應(yīng)用于植物的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)和病蟲(chóng)害防治，包括糧食作物、經(jīng)濟(jì)植物、蔬菜、水果、花卉以及園林和草場(chǎng)的養(yǎng)護(hù)等；其使用方法有浸種、拌種、蘸根、種子包衣、植株注射、葉面噴施、花果噴涂等；使用劑量因使用方法和品種而異，一般5μg/ml-80μg/ml均為有效濃度；施用后2-12小時(shí)內(nèi)即發(fā)生作用，藥效可持續(xù)20天左右，一個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)可用藥2-3次。
本發(fā)明中所使用的工程菌E.coli JM109(DE3)菌株及hrpNUSAW004基因的高效表達(dá)載體pET28a(+)質(zhì)粒在國(guó)內(nèi)外分子生物學(xué)研究及醫(yī)藥工業(yè)中已廣泛應(yīng)用，對(duì)環(huán)境安全可靠。
本發(fā)明中使用的縮略語(yǔ)LB(細(xì)菌培養(yǎng)基，酵母粉5g/L+蛋白胨10g/L+NaCl10g/L，pH7.0)；Km(卡那霉素)；IPTG(異丙基硫代-β-半乳糖苷)；PMSF(苯甲基磺酰氟)；Tris(三羥甲基氨基甲烷)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 hrpNUSAW004基因的克隆和測(cè)序(1)hrpNUSAW004基因來(lái)自蘋(píng)果火疫歐文氏桿菌(Erwinia amylovora)USAW004菌株，該基因以hrpN基因簇形式存在于USAW004菌株的染色體DNA上。把蘋(píng)果火疫歐文氏桿菌(Erwinia amylovora)USAW004菌株首先在LB平板上篩選，并進(jìn)行胞外蛋白酶活性和HR檢測(cè)。(2)將選取的單克隆菌落，于28℃下在LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，離心收集菌體，用基因組DNA分離試劑盒分離、純化細(xì)菌染色體DNA。(3)細(xì)菌染色體DNA經(jīng)Sau3A部分消化，用質(zhì)粒載體pLARF5構(gòu)建蘋(píng)果火疫歐文氏桿菌(Erwinia amylovora)USAW004菌株的基因組文庫(kù)。(4)用梨火疫歐文氏桿菌(Erwinia amylovora)hrpNEa基因(Wei ZM，et al.Science，1992，257(5066)85-88)作分子探針，通過(guò)克隆雜交從USAW004基因組文庫(kù)中篩選鑒別hrpN+質(zhì)粒，獲得包括hrpN基因整個(gè)編碼區(qū)在內(nèi)的2.1kb DNAs片段，并進(jìn)一步將此片段亞克隆進(jìn)pBluescript載體中。(5)用通用引物T7進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，其中有一個(gè)1212bp的閱讀框(reading frame)即為hrpNUSAW004基因的編碼區(qū)，序列如SEQ ID No.1。
實(shí)施例2 HarpinUSAW004蛋白質(zhì)的制備和純化菌種制備及大規(guī)模發(fā)酵(1)制備原種將帶有hrpNUSAW004基因高效表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)的工程菌E.coli JM109(DE3)菌株于甘油-LB+Km20μg/ml的斜面上劃線，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。(2)制備母種將原種斜面上生長(zhǎng)良好的單克隆菌落接種于加有100ml甘油-LB+Km20μg/ml的250ml搖瓶中，于37℃110rpm振蕩培養(yǎng)12h。(3)制備生產(chǎn)種將母種菌液按1％體積比接種于加有3L甘油-LB+Km25μg/ml的5L發(fā)酵罐中，37℃110rpm和0.5L/min通氣量條件下培養(yǎng)12h。(4)大規(guī)模發(fā)酵將50L以上的發(fā)酵罐加入70％體積的甘油-LB及終濃度40μg/ml的Km后，原位滅菌30min(120℃，1.1MPa)；然后按1％體積比接入生產(chǎn)種子菌，37℃200rpm和1L/min通氣量條件下發(fā)酵培養(yǎng)；待細(xì)菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600＝0.7)后，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和通氣量，以保證發(fā)酵環(huán)境有充足的供氧(DO＞30％)，并按特定程序進(jìn)行對(duì)數(shù)分期補(bǔ)料；在細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)束前1-2小時(shí)，通過(guò)微孔濾膜加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度1mM；繼續(xù)誘導(dǎo)發(fā)酵4-6小時(shí)，即可下罐。此法可實(shí)現(xiàn)工程菌的高密度或高效培養(yǎng)。
HarpinUSAW004蛋白質(zhì)的制備和純化HarpinUSAW004蛋白質(zhì)在大腸桿菌細(xì)胞中主要以包涵體(inclusion body)形式存在。工業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)HarpinUSAW004蛋白時(shí)，采用8M尿素破碎制備。實(shí)驗(yàn)室中為了得到更進(jìn)一步的HarpinUSAW004蛋白質(zhì)質(zhì)純品，可按下列程序操作離心(5,000rpm，10min)收集經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4-6小時(shí)的大腸桿菌細(xì)胞，以20mMTris緩沖液(pH9.0)充分懸浮后，加10μl/25ml的溶菌酶(100mg/ml)，冰浴10min，加0.5ml/25mlPMSF(20mg/ml)，超聲波(20KHz)破碎10min，再加0.5ml/25ml的PMSF，混勻后再超聲波破碎10min，10,000rpm離心10min，取上清液于100℃水浴10min，冷卻后12,000rpm離心10min，收集上清液。此上清液中即含有較高純度的HarpinUSAW004蛋白質(zhì)，濃度達(dá)3600μg/ml。
實(shí)施例3 HarpinUSAW004蛋白質(zhì)的使用方法HarpinUSAW004蛋白質(zhì)在使用上方法多樣，可因處理材料、處理部位、處理時(shí)間以及處理目的不同而有所差異。具體可按以下介紹的方法使用
(1)浸種首先用水將HarpinUSAW004蛋白質(zhì)配成30-60μg/ml的濃度，然后將種子浸于其中8-12小時(shí)。此法適宜作催芽的作物或蔬菜種子。浸種結(jié)束后，將種子從HarpinUSAW004蛋白質(zhì)浸種液中取出，即可催芽或播種。出苗一周后，苗高比對(duì)照增長(zhǎng)10％以上，生長(zhǎng)量也提高10％以上，而且苗期抗猝倒病的能力也明顯增強(qiáng)。
(2)拌種將種子稍加濕潤(rùn)，加入種子量0.1％的HarpinUSAW004蛋白質(zhì)制劑，充分拌勻后播種。出苗后苗齊苗壯，增強(qiáng)苗期抗猝倒病的能力。
(3)蘸根適于移栽定殖的作物，如瓜果、蔬菜、棉花、玉米等。首先將HarpinUSAW004蛋白質(zhì)制劑配成30μg/ml的水溶液，然后將被移栽作物幼苗的根浸在該溶液中1-2小時(shí)。移栽后，植株恢復(fù)生長(zhǎng)快，緩苗時(shí)間縮短，植株長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)勁。
(4)葉面噴霧作物的整個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)均可進(jìn)行噴施。將HarpinUSAW004蛋白質(zhì)制劑配成15-20μg/ml的水溶液，在作物的苗期、分蘗期、初花期、初果期或灌漿期進(jìn)行噴霧使用。作物生長(zhǎng)季節(jié)一般可噴霧2-3次。噴霧后，可提高作物營(yíng)養(yǎng)體生長(zhǎng)量15-30％，提高產(chǎn)量10-20％，而且整個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)可省掉80％以上的化學(xué)農(nóng)藥。某些作物如黃瓜可抗住60％的灰霉病、煙草可抗住60-80％的花葉病毒病。另外還有一定的抗逆(抗旱、抗寒、耐鹽堿等)和驅(qū)蟲(chóng)效果。
實(shí)施例4 hrpNUSAW004基因的相關(guān)應(yīng)用(1)用基因重組技術(shù)將hrpNUSAW004基因克隆進(jìn)抗卡那霉素的Ti質(zhì)粒載體中，形成hrpNUSAW004-Ti質(zhì)粒；(2)用hrpNUSAW004-Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌細(xì)胞，篩選含hrpNUSAW004-Ti質(zhì)粒的陽(yáng)性表達(dá)農(nóng)桿菌；(3)將處于再生壁時(shí)期的胡蘿卜原生質(zhì)體與含hrpNUSAW004-Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌一起共培養(yǎng)36-48小時(shí)，離心洗滌去菌后在含卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化的胡蘿卜細(xì)胞克??；(4)將轉(zhuǎn)化的胡蘿卜細(xì)胞克隆在分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)成再生植株，即獲得胡蘿卜hrpNUSAW004基因轉(zhuǎn)基因植株，該轉(zhuǎn)基因植株與未轉(zhuǎn)hrpNUSAW004基因的胡蘿卜再生植株相比，具有明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)和抗軟腐病特性。
實(shí)施例5 hrpNUSAW004基因相關(guān)遺傳重組體的應(yīng)用(1)用基因重組技術(shù)將hrpNUSAW004基因與hrpNEa基因融合，形成hrpNUSAW004-hrpNEa融合基因；(2)將hrpNUSAW004-hrpNEa融合基因克隆進(jìn)抗卡那霉素的高效表達(dá)質(zhì)粒載體pETa(+)中，形成hrpNUSAW004-hrpNEa-pETa(+)質(zhì)粒；(3)用hrpNUSAW004-hrpNEa-pETa(+)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化工程菌JM 109(DE3)，在加卡那霉素選擇壓下篩選含hrpNUSAW004-hrpNEa-pETa(+)質(zhì)粒的陽(yáng)性表達(dá)菌株；(4)用發(fā)酵法生產(chǎn)該融合基因表達(dá)的融合蛋白HarpinUSAW004-HarpinEa，并通過(guò)SDSPAGE檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)情況，從而獲得生物學(xué)活性更強(qiáng)和作用范圍更廣的HarpinUSAW004類融合蛋白激發(fā)子。
實(shí)施例6 HarpinUSAW004蛋白質(zhì)的應(yīng)用舉例目前已對(duì)數(shù)十種作物、蔬菜、水果、花卉作了HarpinUSAW004蛋白質(zhì)的施用效果試驗(yàn)，雖然在不同作物品種上表現(xiàn)程度有所不同，但HarpinUSAW004蛋白質(zhì)的促長(zhǎng)增產(chǎn)、抗病驅(qū)蟲(chóng)、提高抗逆性以及盆花、苗木塑型等方面的作用是顯著的。下面舉幾例加以說(shuō)明(1)玉米選取兩塊5分地大小的4葉期玉米苗田，分別用作對(duì)照和處理樣塊。處理塊分別在4葉期和6葉期用15-20μg/ml的HarpinUSAW004蛋白質(zhì)溶液作了葉面噴霧，此外不使用任何農(nóng)藥，其它方面的管理與對(duì)照塊一樣。在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，用藥后一周，處理塊平均株高比對(duì)照塊高出10-15cm，玉米大小斑病發(fā)病率也比對(duì)照塊低20-30％；同時(shí)處理塊開(kāi)花比對(duì)照塊提前5-10天，灌漿期雙苞率明顯高于對(duì)照。收獲后比較產(chǎn)量，處理塊比對(duì)照塊增產(chǎn)12％以上。
(2)黃瓜選取兩塊5分地大小的3葉期黃瓜苗田，分別用作對(duì)照、HarpinUSAW004蛋白質(zhì)處理的樣塊。蛋白處理液的濃度為20μg/ml。蛋白處理塊分別在3葉期、5葉期和7葉期進(jìn)行過(guò)葉面噴霧，其它管理同對(duì)照。試驗(yàn)結(jié)果表明HarpinUSAW004蛋白質(zhì)處理，開(kāi)花比對(duì)照提前8天；花葉病比對(duì)照減少65％；灰霉柄比對(duì)照減少30％；產(chǎn)量比對(duì)照增加23％以上。
(3)草莓選取約2分地大小的兩廂3葉期草莓苗棚，分別作對(duì)照和HarpinUSAW004蛋白質(zhì)處理。處理苗棚的HarpinUSAW004蛋白質(zhì)使用濃度為20μg/ml。3葉期開(kāi)始葉面噴霧，以后每間隔15天噴施一次，共計(jì)5次。結(jié)果顯示，處理棚比對(duì)照棚提早10左右開(kāi)花；單株花、果率平均比對(duì)照增加2-3個(gè)；灰霉病發(fā)生率明顯少于對(duì)照；鮮果呈色好、果型優(yōu)、畸形果率低，產(chǎn)量比對(duì)照增產(chǎn)25％以上。另外，通過(guò)對(duì)等量鮮果進(jìn)行烘干稱重，發(fā)現(xiàn)處理棚的干物質(zhì)積累也比對(duì)照增加1-2％。
(4)仙客來(lái) 仙客來(lái)是深受大眾喜歡的盆花品種，但是由細(xì)菌性軟腐病引起的死亡率很高，高溫時(shí)休眠，而且因病毒病造成的畸形葉、花嚴(yán)重影響了其觀賞價(jià)值和商業(yè)價(jià)值。我們選區(qū)了400盆3-4月齡仙客來(lái)作供試材料，隨機(jī)分成兩組，分別作對(duì)照和HarpinUSAW004蛋白質(zhì)處理。HarpinUSAW004蛋白質(zhì)的使用濃度為20μg/ml。處理方法為葉面噴霧，每間隔10-15天噴施一次。結(jié)果表明，用藥一周以后，處理組的葉色變深、有光澤，株型也明顯變得挺拔、緊湊、活脫，并能打破高溫休眠；用藥一個(gè)月以后，以前因病毒病而畸形卷曲的幼葉開(kāi)始逐漸伸展成正常形態(tài)，而對(duì)照組的幼葉則變得越來(lái)越畸形，連開(kāi)出的花瓣也呈畸形扭曲。另外，HarpinUSAW004蛋白質(zhì)對(duì)仙客來(lái)葉片上的白粉虱也有一定的驅(qū)趕作用。
(5)煙草為蚜蟲(chóng)易感植物。用25μg/ml濃度的HarpinUSAW004蛋白制劑在250℃條件下對(duì)煙草種子浸種24-48小時(shí)，并以pH6.5的5mM磷酸鉀緩沖液作對(duì)照浸種處理，然后分別播于三個(gè)培養(yǎng)盤(pán)中萌發(fā)，待出苗以后分組移栽于同一塊大田中，隨后每天觀察記錄感染蚜蟲(chóng)的數(shù)目。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照處理組第1、2、3、6、7、8、9、10天單株感染蚜蟲(chóng)的平均數(shù)分別為0、3、3、6、7、9、13、17；HarpinUSAW004蛋白處理組第1、2、3、6、7、8、9、10天單株感染蚜蟲(chóng)的平均數(shù)分別為0、0、0、1、0、0、2、2。
(6)非洲鳳仙花是一種常見(jiàn)觀賞草花。取10盆生長(zhǎng)勢(shì)基本一致的非洲鳳仙花，分作處理和對(duì)照2組，每組5盆，處理組和對(duì)照組分別用25μg/ml濃度的HarpinUSAW004蛋白制劑和水進(jìn)行葉面噴霧，共噴2次，每次間隔7天，其它管理?xiàng)l件一致。待15天以后，將2組材料停止水肥管理(即停止?jié)菜褪┓?，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，15天以后，對(duì)照組植株開(kāi)始出現(xiàn)枯黃凋零，花葉病毒病爆發(fā)，而處理組植株長(zhǎng)勢(shì)健康，未發(fā)生花葉病毒病。
(7)取剛采集的新鮮草莓100粒，按50粒1組分成處理和對(duì)照2組，處理組用30μg/ml HarpinUSAW004蛋白溶液浸10分鐘，對(duì)照組用純凈水浸10分鐘，然后分別裝在2個(gè)透氣小籃中，上面覆以紗布，室溫下放置1周，結(jié)果表明，對(duì)照組草莓90％以上已軟化，顏色暗褐，其中10％已嚴(yán)重霉?fàn)€，而處理組草莓90％以上顏色鮮亮，果粒脆嫩，只有少數(shù)幾粒顏色變深，果粒變軟。
序列表<110>成都派潤(rùn)生物科技有限公司<120>一種編碼植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號(hào)因子的hrpN基因及其表達(dá)產(chǎn)物與應(yīng)用<160>2<170>PatentIn Version 2.1<210>1<211>1212<212>DNA<213>蘋(píng)果火疫歐文氏桿菌(Erwinia amylovora)<221>1-1212<400>11 atgagtctga atacaagtgg gctgggagcg tcaacgatgc aaatttctat cggcggtgcg61 ggcggaaata acgggttgct gggtaccagt cgccagaatg ctgggctggg tggcaattct121 gcactggggc tgggcggcgg taatcaaaat gataccgtca atcagctggc tggcttactc181 accggcatga tgatgatgat gagcatgatg ggcggtggtg ggctgatggg cggtggctta241 ggcggtggct taggtaatgg cttgggtggc tcaggtggcc tgggcgaagg actgtcgaac301 gcgctgaacg atatgttagg cggttcgctg aacacgctgg gctcgaaagg cggcaacaat361 accacttcaa caacaaattc cccgctggac caggcgctgg gtattaactc aacgtcccaa421 aacgacgatt ccacctccgg cgcagattcc acctcagact ccagcgaccc gatgcagcag481 ctgctgaaga tgttcagcga gataatgcaa agcctgtttg gtgatgggca agatggcacc541 cagggcagtt cctctggggg caagcagccg accgaaggcg agcagaacgc ctataaaaaa601 ggagtcactg atgcgctgtc gggcctgatg ggtaatggtc tgagccagct ccttggcaac661 gggggactgg gaggtggtca gggcggtaat gctggcacgg gtcttgacgg ttcgtcgctg721 ggcggcaaag ggctgcaaaa cctgagcggg ccggtggact accagcagtt aggtaacgcc781 gtgggtaccg gtatcggtat gaaagcgggc attcaggcgc tgaatgatat cggtacgcac841 agcgacagtt caacccgttc tttcgtcaat aaaggcgatc gggcgatggc gaaggaaatc901 ggtcagttca tggaccagta tcctgaggtg tttggcaagc cgcagtacca gaaaggcccg961 ggtcaggagg tgaaaaccga tgacaaatca tgggcaaaag cactgagcaa gccagatgac1021 gacggaatga caccagccag tatggagcag ttcaacaaag ccaagggcat gatcaaaagc
1081 gccatggcgg gtgataccgg caacggcaac ctgcaggcac gcggtgccgg tggttcttcg1141 ctgggtattg atgccatgat ggccggtgat gccattaaca atatggcact tggcaagctg1201 ggcgcggctt aa<210>2<211>403<212>PRT<213>蘋(píng)果火疫歐文氏桿菌(Erwinia amylovora)<400>2Met Ser Leu Asn Thr Ser Gly Leu Gly Ala Ser Thr Met Gln Ile Ser1 5 10 15Ile Gly Gly Ala Gly Gly Asn Asn Gly Leu Leu Gly Thr Ser Arg Gln20 25 30Asn Ala Gly Leu Gly Gly Asn Ser Ala Leu Gly Leu Gly Gly Gly Asn35 40 45Gln Asn Asp Thr Val Asn Gln Leu Ala Gly Leu Leu Thr Gly Met Met50 55 60Met Met Met Ser Met Met Gly Gly Gly Gly Leu Met Gly Gly Gly Leu65 70 75 80Gly Gly Gly Leu Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Gly Gly Leu Gly Glu85 90 95Gly Leu Ser Asn Ala Leu Asn Asp Met Leu Gly Gly Ser Leu Asn Thr100 105 110Leu Gly Ser Lys Gly Gly Asn Asn Thr Thr Ser Thr Thr Asn Ser Pro115 120 125Leu Asp Gln Ala Leu Gly Ile Asn Ser Thr Ser Gln Asn Asp Asp Ser130 135 140Thr Ser Gly Ala Asp Ser Thr Ser Asp Ser Ser Asp Pro Met Gln Gln145 150 155 160Leu Leu Lys Met Phe Ser Glu Ile Met Gln Ser Leu Phe Gly Asp Gly165 170 175Gln Asp Gly Thr Gln Gly Ser Ser Ser Gly Gly Lys Gln Pro Thr Glu180 185 190Gly Glu Gln Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Val Thr Asp Ala Leu Ser Gly195 200 205Leu Met Gly Asn Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly210 215 220Gly Gly Gln Gly Gly Asn Ala Gly Thr Gly Leu Asp Gly Ser Ser Leu
225 230 235 240Gly Gly Lys Gly Leu Gln Asn Leu Ser Gly Pro Val Asp Tyr Gln Gln245 250 255Leu Gly Asn Ala Val Gly Thr Gly Ile Gly Met Lys Ala Gly Ile Gln260 265 270Ala Leu Asn Asp Ile Gly Thr His Ser Asp Ser Ser Thr Arg Ser Phe275 280 285Val Asn Lys Gly Asp Arg Ala Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln Phe Met290 295 300Asp Gln Tyr Pro Glu Val Phe Gly Lys Pro Gln Tyr Gln Lys Gly Pro305 310 315 320Gly Gln Glu Val Lys Thr Asp Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala Leu Ser325 330 335Lys Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Pro Ala Ser Met Glu Gln Phe Asn340 345 350Lys Ala Lys Gly Met Ile Lys Ser Ala Met Ala Gly Asp Thr Gly Asn355 360 365Gly Asn Leu Gln Ala Arg Gly Ala Gly Gly Ser Ser Leu Gly Ile Asp370 375 380Ala Met Met Ala Gly Asp Ala Ile Asn Asn Met Ala Leu Gly Lys Leu385 390 395 400Gly Ala Ala *
權(quán)利要求
1.一種編碼植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號(hào)因子的hrpN基因，其特征在于該基因的核苷酸序列是序列表中的SEQ ID No.1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的hrpN基因，其特征在于該基因自蘋(píng)果火疫歐文氏桿菌(Erwinia amylovora)菌株中獲得。
3.含有權(quán)利要求1或2所述的hrpN基因的遺傳重組體。
4.權(quán)利要求1或2所述的hrpN基因在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育和防治病蟲(chóng)害有關(guān)的農(nóng)業(yè)生物技術(shù)育種、轉(zhuǎn)基因植物方面的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的hrpN基因，在以下任一方面的應(yīng)用(1)促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育；(2)植物的廣譜抗病性，包括對(duì)多種細(xì)菌、真菌和病毒的抗性；(3)植物的驅(qū)蟲(chóng)性；(4)植物的抗逆性(植物對(duì)干旱、嚴(yán)寒、鹽堿等不良環(huán)境的耐受性)；(5)延長(zhǎng)作物產(chǎn)品的儲(chǔ)存時(shí)間；(6)對(duì)盆花、苗木的塑型作用。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的遺傳重組體在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育和防治病蟲(chóng)害有關(guān)的農(nóng)業(yè)生物技術(shù)育種、轉(zhuǎn)基因植物方面的應(yīng)用。
7.一種編碼植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號(hào)因子的hrpN基因編碼的Harpin蛋白質(zhì)，其特征在于該蛋白質(zhì)具有序列表中SEQ ID No.2的氨基酸序列，該蛋白質(zhì)具有以下屬性(1)共有403個(gè)氨基酸殘基，(2)分子量39.67kda，(3)等電點(diǎn)pI4.59，(4)富含甘氨酸Gly，缺乏半胱氨酸Cys，(5)在100℃沸水中耐受10-15分鐘仍有活性，(6)沒(méi)有四級(jí)結(jié)構(gòu)。
8.含有權(quán)利要求7所述的Harpin蛋白質(zhì)的生物制品。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的Harpin蛋白質(zhì)，在以下任一方面的應(yīng)用(1)促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育；(2)植物的廣譜抗病性，包括對(duì)多種細(xì)菌、真菌和病毒的抗性；(3)植物的驅(qū)蟲(chóng)性；(4)植物的抗逆性(植物對(duì)干旱、嚴(yán)寒、鹽堿等不良環(huán)境的耐受性)；(5)延長(zhǎng)作物產(chǎn)品的儲(chǔ)存時(shí)間；(6)對(duì)盆花、苗木的塑型作用。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的Harpin蛋白質(zhì)的生物制品，在以下任一方面的應(yīng)用(1)促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育；(2)植物的廣譜抗病性，包括對(duì)多種細(xì)菌、真菌和病毒的抗性；(3)植物的驅(qū)蟲(chóng)性；(4)植物的抗逆性(植物對(duì)干旱、嚴(yán)寒、鹽堿等不良環(huán)境的耐受性)；(5)延長(zhǎng)作物產(chǎn)品的儲(chǔ)存時(shí)間；(6)對(duì)盆花、苗木的塑型作用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種編碼植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號(hào)因子的hrpN基因及其表達(dá)產(chǎn)物與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的hrpN基因源自蘋(píng)果火疫歐文氏桿菌(Erwinia amylovora)菌株，經(jīng)克隆和測(cè)序，其核苷酸序列如SEQ ID No.1，該基因在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育和防治病蟲(chóng)害有關(guān)的農(nóng)業(yè)生物技術(shù)育種、轉(zhuǎn)基因植物方面有廣泛應(yīng)用。該基因的編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID No.2，該蛋白質(zhì)具有多種功能活性，能廣泛誘導(dǎo)植物產(chǎn)生廣譜抗病性、驅(qū)蟲(chóng)性和抗逆性，并促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育和提高產(chǎn)量。
文檔編號(hào)C12N15/29GK1858209SQ20051002081
公開(kāi)日2006年11月8日 申請(qǐng)日期2005年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月29日
發(fā)明者吳伯驥, 湯承, 曹茂林, 張玨, 崔亞亞 申請(qǐng)人:成都派潤(rùn)生物科技有限公司