專利名稱：一種編碼植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號因子的hrpN基因及其表達(dá)產(chǎn)物與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物基因工程領(lǐng)域，涉及一種編碼植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號因子的hrpN基因及其表達(dá)產(chǎn)物，以及該基因與其表達(dá)產(chǎn)物在改良植物品質(zhì)等方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
微生物蛋白農(nóng)藥是對多種農(nóng)作物具有很強(qiáng)生物活性的一類蛋白質(zhì)藥物。按作用機(jī)理不同又可分為傳統(tǒng)微生物蛋白農(nóng)藥和新型微生物蛋白農(nóng)藥。傳統(tǒng)微生物蛋白農(nóng)藥主要是來自蘇云金芽孢桿菌(Bt)的殺蟲晶體蛋白(ICP)，新型微生物蛋白農(nóng)藥主要是蛋白激發(fā)子類物質(zhì)，它與傳統(tǒng)微生物蛋白農(nóng)藥最大的區(qū)別在于其不直接殺滅害蟲和病原物，而是激發(fā)植物自身的抗病防蟲基因的表達(dá)，并促進(jìn)植物生長發(fā)育。目前研究報(bào)道的具有代表性的新型微生物蛋白農(nóng)藥主要有過敏蛋白(Harpin)、隱地蛋白(Cryptogein)和激活蛋白(Activator)等，其中最受關(guān)注、最有應(yīng)用前景的是Harpin類蛋白激發(fā)子。
Harpin蛋白主要是由歐文氏桿菌屬(Erwinia)細(xì)菌產(chǎn)生的一類能激發(fā)植物過敏反應(yīng)的蛋白質(zhì)(30-40kda)，可誘導(dǎo)植物體內(nèi)一系列基因的表達(dá)，激活植物自身的生長系統(tǒng)和防衛(wèi)系統(tǒng)，從而使植物能抵御多種病害的侵染和逆境的脅迫，并獲得促進(jìn)生長發(fā)育和提高增產(chǎn)的效果。1992年，美國康乃爾大學(xué)的韋忠民等首先從梨火疫歐文氏桿菌(E.amylovora)中克隆出這類過敏蛋白基因，并首次提出Harpin蛋白誘導(dǎo)植物的過敏反應(yīng)可能與其抗病性作用有關(guān)，由此推動了新型微生物蛋白農(nóng)藥研究的興起。經(jīng)過約10年的努力，以此為背景的美國Eden生物科技公司成功開發(fā)和研制出具有廣譜抗病防蟲功能的新型微生物蛋白農(nóng)藥Messenger，該產(chǎn)品以其對大田作物和經(jīng)濟(jì)作物抗病增產(chǎn)方面良好的效果以及對綠色無公害農(nóng)業(yè)卓越的貢獻(xiàn)，曾兩度獲美國環(huán)境保護(hù)委員會頒發(fā)的總統(tǒng)綠色化學(xué)挑戰(zhàn)獎(jiǎng)。
現(xiàn)代分子植物病理學(xué)揭示，植物病原細(xì)菌既有其致病性，也有誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性和促進(jìn)生長的能力，而決定這種能力的基因是植物病原細(xì)菌的hrp(hypersensitive response and pathogenicity)基因簇。hrp基因決定著植物病原細(xì)菌在非寄主植物上激發(fā)過敏反應(yīng)(hypersensitive response on non-host plants，HR)的能力和在寄主植物上的基本寄生性或致病性(parasitism or pathogenicity onhost plants)。HR是植物一種局部的、快速的細(xì)胞編程死亡形式，是植物主動抗性的結(jié)果，其抗性作用不僅表現(xiàn)在對病原細(xì)菌侵染擴(kuò)展的限制，而且能進(jìn)一步誘導(dǎo)植物體內(nèi)產(chǎn)生類似免疫機(jī)制的系統(tǒng)獲得性抗性反應(yīng)。
繼韋忠民等(Wei ZM，et al.Science，1992，257(5066)85-88)成功克隆和表達(dá)hrpNEa基因之后，近10多年來人們又相繼從E.carotovora subsp carotovora、E.chrysanthemi、P.s.syringae、P.s.pv.glycinea、P.s.tomato、R.solanacearum中克隆到編碼Harpin類蛋白的基因，并成功表達(dá)了這些蛋白，如HarpinEcc，36kda(Mukherjee A.，Mol.Plant-Microbe Interact.1997，10462-471.)；HarpinEch，36kda(Bauer D.W.，Mol.Plant Microbe Interact，1995，8484-491)；HarpinPss，34.7kda；HarpinPsg，35.3kda；HarpinPst，36.5kda(Preston G，Mol Plant-Microbe Interact.，1995，8717)；HarpinXoo，15.3kda，HarpinXooc，15.6kda(聞偉剛，植物病理學(xué)，2001，31(4)295-300)等。
迄今為止，所有這些Harpin類蛋白差不多都具有以下分子特征(1)親水性；(2)對熱穩(wěn)定，100℃處理10分鐘不會失活；(3)對蛋白酶K和紫外線敏感；(4)富含甘氨酸而缺少半胱氨酸；(5)水溶性酸性蛋白；(6)無四級結(jié)構(gòu)。
最近的研究表明，Harpin類蛋白可能在植物的信號通路中起著重要作用。研究人員用Harpin處理擬南芥，發(fā)現(xiàn)擬南芥中Cl、Ca、K、H、Cu、Zn離子通道以及各種氧化酶被激活，這些氧化酶包括ACC合成酶、抗壞血酸氧化酶、Cu/Zn超氧化物歧化酶、Cu分子伴侶前體等等?，F(xiàn)在通常認(rèn)為，植物細(xì)胞壁中廣泛存在Harpin蛋白的受體，即Harpin結(jié)合蛋白(Harpin-binding proteins，HrBP)，Harpin可以通過與這些受體蛋白HrBP結(jié)合激活植物中的多條信號通路。這些信號通路大致可以分為以下三類(1)與植物抗病和驅(qū)蟲相關(guān)的信號通路的激活，包括過敏反應(yīng)與細(xì)胞死亡、離子交換通道、水楊酸途徑、茉莉酸途徑、苯丙氨酸解氨酶介導(dǎo)的途徑以及其它一些抗性基因介導(dǎo)的途徑；(2)與促進(jìn)植物生長相關(guān)的信號通路的激活，包括一般的生長調(diào)節(jié)因子、胚軸延伸轉(zhuǎn)錄因子、生長轉(zhuǎn)錄因子、乙烯反應(yīng)元件結(jié)合蛋白系以及蔗糖合成酶和其他胚胎形成酶等；(3)與植物抗逆相關(guān)的信號通路的激活，包括熱休克蛋白、COR基因和耐鹽鋅蛋白等。另外可能還存在一條比較特殊的不依賴于NPR1介導(dǎo)的植物對細(xì)菌抗性的信號通路。
Harpin蛋白雖然來源于病原菌，但作為一類非特異性的激發(fā)蛋白因子，卻能引起非寄主植物發(fā)生過敏反應(yīng)，并誘導(dǎo)其抗病性、驅(qū)蟲性和抗逆性的增加，以及促進(jìn)生長發(fā)育、提高產(chǎn)量等。更有趣的是，在轉(zhuǎn)hrpNEa基因的梨上，HarpinEa對產(chǎn)生梨火疫病的宿主寄生菌E.amylovora也表現(xiàn)出非常強(qiáng)的抗性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種編碼植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號因子的hrpN基因及其表達(dá)產(chǎn)物，以及hrpN基因和其表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用。
本發(fā)明所提供的一種編碼植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號因子的hrpN基因，名稱為hrpNCSSY002，其基因編碼區(qū)共計(jì)有1071個(gè)核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID No.1，該基因來自胡蘿卜軟腐歐氏桿菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)CSSY002菌株，胡蘿卜、白菜、芹菜等是該桿菌的寄主植物，該基因以hrpN基因簇形式存在于CSSY002菌株的染色體DNA上。該基因可用于促進(jìn)植物生長發(fā)育；增強(qiáng)植物的廣譜抗病性，包括對多種細(xì)菌、真菌和病毒的抗性；增強(qiáng)植物的驅(qū)蟲性；增強(qiáng)植物的抗逆性(植物對干旱、嚴(yán)寒、鹽堿等不良環(huán)境的耐受性)；延長作物產(chǎn)品的儲存時(shí)間；對盆花、苗木的塑型作用。另外該基因還可以作為基因資源，在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和防治病蟲害有關(guān)的農(nóng)業(yè)生物技術(shù)育種、轉(zhuǎn)基因植物以及與其它有益基因重組構(gòu)建具有商業(yè)價(jià)值的遺傳重組體等方面有廣泛應(yīng)用前景。含有該基因的遺傳重組體，亦可應(yīng)用于調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和防治病蟲害有關(guān)的農(nóng)業(yè)生物技術(shù)育種、轉(zhuǎn)基因植物等方面。
一種編碼植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號因子的基因hrpNCSSY002所編碼的蛋白HarpinCSSY002，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2，共有356個(gè)氨基酸殘基，36.64kda，等電點(diǎn)pI5.9，富含甘氨酸(Gly)而缺乏半胱氨酸(Cys)，是水溶性酸性蛋白，無四級結(jié)構(gòu)，并且具有Harpin類蛋白的基本分子屬性和生物學(xué)活性。
HarpinCSSY002蛋白質(zhì)在促進(jìn)植物生長發(fā)育、增強(qiáng)植物的廣譜抗病性(包括對多種細(xì)菌、真菌和病毒的抗性)、增強(qiáng)植物的驅(qū)蟲性、增強(qiáng)植物的抗逆性(植物對干旱、嚴(yán)寒、鹽堿等不良環(huán)境的耐受性)、延長作物產(chǎn)品的儲存時(shí)間、對盆花和苗木的塑型作用方面有廣泛應(yīng)用前景。因此，該蛋白質(zhì)可以配制成生物制品，應(yīng)用到以上方面。
本發(fā)明關(guān)于一種編碼植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號因子的基因hrpNCSSY002及其表達(dá)產(chǎn)物HarpinCSSY002蛋白質(zhì)，將按以下內(nèi)容進(jìn)行具體表述1、hrpNCSSY002基因的來源 hrpNCSSY002基因來自基因來自胡蘿卜軟腐歐氏桿菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)CSSY002菌株，胡蘿卜、白菜、芹菜是其寄主植物。該基因以hrpN基因簇形式存在于CSSY002菌株的染色體DNA上。
2、hrpNCSSY002基因的克隆和測序 (1)菌株首先在LB平板上篩選，并進(jìn)行胞外蛋白酶活性和HR檢測。(2)將選取的單克隆菌落，于28℃下在LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，離心收集菌體，用基因組DNA分離試劑盒分離、純化細(xì)菌染色體DNA。(3)細(xì)菌染色體DNA經(jīng)Sau3A部分消化，用質(zhì)粒載體pLARF5構(gòu)建胡蘿卜軟腐歐氏桿菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)CSSY002菌株的基因組文庫。用胡蘿卜軟腐歐氏桿菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)ECC71菌株的hrpNEcc基因(Wei ZM，et al.Science，1992，257(5066)85-88)作分子探針，通過克隆雜交從CSSY002基因組文庫中篩選鑒別hrpN+質(zhì)粒，獲得包括hrpN基因整個(gè)編碼區(qū)在內(nèi)的1.9kb DNAs片段，并進(jìn)一步將此片段亞克隆進(jìn)pBluescript載體中。(5)用通用引物T7進(jìn)行核苷酸序列測定，其中有一個(gè)1071bp的閱讀框(reading frame)即為hrpNCSSY002基因的編碼區(qū)，序列如SEQ ID No.1。
3、hrpNCSSY002基因的PCR擴(kuò)增與純化 根據(jù)hrpNCSSY002基因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)一對PCR擴(kuò)增引物，即P15’-TGTGGATCCATGCTTAATTCTCTTGGTGGCGGAG-3’和P25’-TGTAAGCTTTAGCTGGAGAGCTTCTTCAACCC-3’。其中G/GATCC為引入的限制酶BamH I的酶切位點(diǎn)，A/AGCTT為引入的限制酶HindIII的酶切位點(diǎn)。用純化的CSSY002菌株的染色體DNA作模板，按如下擴(kuò)增參數(shù)進(jìn)行PCR反應(yīng)先95℃預(yù)變性5min，然后94℃/2min 1個(gè)循環(huán)；94℃/15sec+55℃/30sec+72℃/15sec 24個(gè)循環(huán)；94℃/1min+55℃/2min+72℃/3min1個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化。
4、hrpNCSSY002基因工程菌株的構(gòu)建 hrpNCSSY002基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制酶BamH I和HindIII消化后，克隆進(jìn)高表達(dá)載體pET28a(+)的BamH I-HindIII位點(diǎn)。用pET28a(+)-hrpNCSSY002質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體菌E.coli JM109(DE3)，通過選擇壓篩選出含有pET28a(+)-hrpNCSSY002質(zhì)粒的陽性表達(dá)工程菌株。
5、hrpNCSSY002基因的表達(dá)產(chǎn)物及其檢測 hrpNCSSY002基因的表達(dá)產(chǎn)物為HarpinCSSY002蛋白質(zhì)。將含有hrpNCSSY002基因超表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-hrpNCSSY002的大腸桿菌工程菌株E.coli JM109(DE3)在加有50ml/L Km的LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)生長，待OD600達(dá)到0.7(即細(xì)菌進(jìn)入對數(shù)生長期)后，再加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度1mM，繼續(xù)培養(yǎng)6個(gè)小時(shí)后，離心收集細(xì)菌細(xì)胞。細(xì)菌細(xì)胞經(jīng)超聲波破碎、離心、12％SDS-PAGE凝膠電泳，在電泳膠板的細(xì)菌樣品泳道上，會呈現(xiàn)一條顯著寬而濃的35.55kda條帶，它就是hrpNCSSY002基因的表達(dá)產(chǎn)物HarpinCSSY002蛋白質(zhì)，約占細(xì)菌蛋白總量的50％左右。將HarpinCSSY002蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離純化，并對HarpinCSSY002蛋白質(zhì)進(jìn)行Western blot分析和HR檢測。
根據(jù)hrpNCSSY002基因的核苷酸序列推測，HarpinCSSY002蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID.No2。該蛋白質(zhì)具有以下屬性(1)由356個(gè)氨基酸殘基組成；(2)分子量36.64kda；(3)等電點(diǎn)pI5.9；(4)富含甘氨酸Gly，缺乏半胱氨酸Cys；(5)對溫度特穩(wěn)定，在100℃沸水中耐受10-15分鐘仍有活性；(6)沒有四級結(jié)構(gòu)。
6、HarpinCSSY002蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性及其應(yīng)用 目前公認(rèn)的Harpin類蛋白的生物活性檢測方法主要有(1)過敏反應(yīng)(hypersensitive response，HR)，通常以煙草作被試植物，這也是Harpin類蛋白生物活性檢測最快速、簡便的方法；(2)血清學(xué)反應(yīng)，即用標(biāo)準(zhǔn)的Harpin蛋白純品制成血清抗體，然后用這種抗血清對未知樣品進(jìn)行Western blot分析，通過抗體-抗原識別反應(yīng)，可以準(zhǔn)確檢測出未知樣品中的Harpin類蛋白。
HarpinCSSY002蛋白質(zhì)具有以下主要生物學(xué)功能(1)促進(jìn)植物生長發(fā)育、提高產(chǎn)量；(2)增強(qiáng)植物的廣譜抗病性，包括對多種細(xì)菌、真菌和病毒的抗性；(3)使植物獲得對某些有害昆蟲的驅(qū)蟲性；(4)增強(qiáng)植物的抗逆性；(5)延長植物產(chǎn)品的儲存時(shí)間；(6)對盆花、苗木有良好的塑型作用。
HarpinCSSY002蛋白質(zhì)在增強(qiáng)植物抗病、驅(qū)蟲、抗逆以及促進(jìn)生長和提高產(chǎn)量方面的良好效果。HarpinCSSY002蛋白質(zhì)不會引起病原物的抗藥性，也不會誘發(fā)植物遺傳結(jié)構(gòu)(基因組DNA)的改變，且該蛋白質(zhì)屬天然有機(jī)蛋白質(zhì)，在自然界能很快被光分解或被微生物降解、沒有殘留公害，對人畜鳥魚無毒性，在使用過程中無須特殊防護(hù)措施，是未來替代高毒、高殘留化學(xué)農(nóng)藥和化學(xué)調(diào)節(jié)劑的理想的環(huán)保型生物產(chǎn)品。
目前正在就其對各種作物、蔬菜、水果、花卉以及各種經(jīng)濟(jì)植物包括煙草、茶葉等數(shù)十種植物的抗病驅(qū)蟲和促長增產(chǎn)效果進(jìn)行廣泛的試驗(yàn)和品比。已有試驗(yàn)結(jié)果顯示，HarpinCSSY002蛋白對黃瓜、西紅柿、土豆、辣椒、煙草、玉米、草莓等的抗病驅(qū)蟲和促長增產(chǎn)效果明顯，同時(shí)對提高某些植物如煙草、茶葉的品質(zhì)亦有很好的效果，而且在同類Harpin產(chǎn)品中對比效果也很顯著。HarpinCSSY002蛋白可直接應(yīng)用于植物的生長發(fā)育調(diào)節(jié)和病蟲害防治，包括糧食作物、經(jīng)濟(jì)植物、蔬菜、水果、花卉以及園林和草場的養(yǎng)護(hù)等；使用方法有浸種、拌種、蘸根、種子包衣、植株注射、葉面噴施、花果噴涂等；使用劑量因使用方法和品種而異，一般5μg/ml-80μg/ml均為有效濃度；施用后2-12小時(shí)內(nèi)即發(fā)生作用，藥效可持續(xù)20天左右，一個(gè)生長季節(jié)可用藥2-3次。
本發(fā)明中所使用的工程菌E.coli JM109(DE3)菌株及hrpNCSSY002基因的高效表達(dá)載體pET28a(+)質(zhì)粒在國內(nèi)外分子生物學(xué)研究及醫(yī)藥工業(yè)中已廣泛應(yīng)用，對環(huán)境安全可靠。
本發(fā)明中使用的縮略語LB(細(xì)菌培養(yǎng)基，酵母粉5g/L+蛋白胨10g/L+NaCl10g/L，pH7.0)；Km(卡那霉素)；IPTG(異丙基硫代-β-半乳糖苷)；PMSF(苯甲基磺酰氟)；Tris(三羥甲基氨基甲烷)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一 hrpNCSSY002基因的克隆和測序(1)hrpNCSSY002基因來自胡蘿卜軟腐歐氏桿菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)CSSY002菌株，該基因以hrpN基因簇形式存在于CSSY002菌株的染色體DNA上。把胡蘿卜軟腐歐氏桿菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)CSSY002菌株首先在LB平板上篩選，并進(jìn)行胞外蛋白酶活性和HR檢測。(2)將選取的單克隆菌落，于28℃下在LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，離心收集菌體，用基因組DNA分離試劑盒分離、純化細(xì)菌染色體DNA。(3)細(xì)菌染色體DNA經(jīng)Sau3A部分消化，用質(zhì)粒載體pLARF5構(gòu)建胡蘿卜軟腐歐氏桿菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)CSSY002菌株的基因組文庫。(4)用胡蘿卜軟腐歐氏桿菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)ECC71菌株的hrpNEcc基因(Wei ZM，et al.Science，1992，257(5066)85-88)作分子探針，通過克隆雜交從CSSY002基因組文庫中篩選鑒別hrpN+質(zhì)粒，獲得包括hrpN基因整個(gè)編碼區(qū)在內(nèi)的1.9kb DNAs片段，并進(jìn)一步將此片段亞克隆進(jìn)pBluescript載體中。(5)用通用引物T7進(jìn)行核苷酸序列測定，其中有一個(gè)1071bp的閱讀框(readingframe)即為hrpNCSSY002基因的編碼區(qū)，序列如SEQ ID No.1。
實(shí)施例二hrpNCSSY002基因的相關(guān)應(yīng)用(1)用基因重組技術(shù)將hrpNCSSY002基因克隆進(jìn)抗卡那霉素的Ti質(zhì)粒載體中，形成hrpNCSSY002-Ti質(zhì)粒；(2)用hrpNEccs1-Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌細(xì)胞，篩選含hrpNCSSY002-Ti質(zhì)粒的陽性表達(dá)農(nóng)桿菌；(3)將處于再生壁時(shí)期的胡蘿卜原生質(zhì)體與含hrpNCSSY002-Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌一起共培養(yǎng)36-48小時(shí)，離心洗滌去菌后在含卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化的胡蘿卜細(xì)胞克??；(4)將轉(zhuǎn)化的胡蘿卜細(xì)胞克隆在分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)成再生植株，即獲得胡蘿卜hrpNCSSY002基因轉(zhuǎn)基因植株，該轉(zhuǎn)基因植株與未轉(zhuǎn)hrpNCSSY002基因的胡蘿卜再生植株相比，具有明顯的生長優(yōu)勢和抗軟腐病特性。
實(shí)施例三hrpNCSSY002基因相關(guān)遺傳重組體的應(yīng)用(1)用基因重組技術(shù)將hrpNCSSY002基因與hrpNEa基因融合，形成hrpNCSSY002-hrp NEa融合基因；(2)將hrpNCSSY002-hrpNEa融合基因克隆進(jìn)抗卡那霉素的高效表達(dá)質(zhì)粒載體pETa(+)中，形成hrpNCSSY002-hrpNEa-pETa(+)質(zhì)粒；(3)用hrpNCSSY002-hrpNEa-pETa(+)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化工程菌JM 109(DE3)，在加卡那霉素選擇壓下篩選含hrpNCSSY002-hrpNEa-pETa(+)質(zhì)粒的陽性表達(dá)菌株；(4)用發(fā)酵法生產(chǎn)該融合基因表達(dá)的融合蛋白HarpinCSSY002-HarpinEa，并通過SDS PAGE檢測融合蛋白的表達(dá)情況，從而獲得生物學(xué)活性更強(qiáng)和作用范圍更廣的Harpin類融合蛋白激發(fā)子。
實(shí)施例四HarpinCSSY002蛋白質(zhì)的制備和純化1菌種制備及大規(guī)模發(fā)酵(1)制備原種將帶有hrpNCSSY002基因高效表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)的工程菌E.coli JM109(DE3)菌株于甘油-LB+Km20μg/ml的斜面上劃線，37℃培養(yǎng)過夜。
(2)制備母種將原種斜面上生長良好的單克隆菌落接種于加有100ml甘油-LB+Km20μg/ml的250ml搖瓶中，于37℃110rpm振蕩培養(yǎng)12h。(3)制備生產(chǎn)種將母種菌液按1％體積比接種于加有3L甘油-LB+Km25μg/ml的5L發(fā)酵罐中，37℃110rpm和0.5L/min通氣量條件下培養(yǎng)12h。(4)大規(guī)模發(fā)酵將50L以上的發(fā)酵罐加入70％體積的甘油-LB及終濃度40μg/ml的Km后，原位滅菌30min(120℃，1.1MPa)；然后按1％體積比接入生產(chǎn)種子菌，37℃200rpm和1L/min通氣量條件下發(fā)酵培養(yǎng)；待細(xì)菌進(jìn)入對數(shù)生長期(OD600＝0.7)后，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和通氣量，以保證發(fā)酵環(huán)境有充足的供氧(DO＞30％)，并按特定程序進(jìn)行對數(shù)分期補(bǔ)料；在細(xì)菌對數(shù)生長期結(jié)束前1-2小時(shí)，通過微孔濾膜加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度1mM；繼續(xù)誘導(dǎo)發(fā)酵4-6小時(shí)，即可下罐。此法可實(shí)現(xiàn)工程菌的高密度或高效培養(yǎng)。
2HarpinCSSY002蛋白質(zhì)的分離和純化HarpinCSSY002蛋白質(zhì)在大腸桿菌細(xì)胞中主要以包涵體(inclusion body)形式存在。工業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)HarpinCSSY002蛋白時(shí)，采用8M尿素破碎制備。實(shí)驗(yàn)室中為了得到更進(jìn)一步的HarpinCSSY002蛋白質(zhì)質(zhì)純品，可按下列程序操作離心(5,000rpm，10min)收集經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4-6小時(shí)的大腸桿菌細(xì)胞，以20mMTris緩沖液(pH9.0)充分懸浮后，加10μl/25ml的溶菌酶(100mg/ml)，冰浴10min，加0.5ml/25mlPMSF(20mg/ml)，超聲波(20KHz)破碎10min，再加0.5ml/25ml的PMSF，混勻后再超聲波破碎10min，10,000rpm離心10min，取上清液于100℃水浴10min，冷卻后12,000rpm離心10min，收集上清液。此上清液中即含有較高純度的HarpinCSSY002蛋白質(zhì)，濃度達(dá)3600μg/ml。
實(shí)施例五HarpinCSSY002蛋白質(zhì)的使用方法HarpinCSSY002蛋白質(zhì)在使用上方法多樣，可因處理材料、處理部位、處理時(shí)間以及處理目的不同而有所差異。具體可按以下介紹的方法使用(1)浸種首先用水將HarpinCSSY002蛋白質(zhì)配成30-60μg/ml的濃度，然后將種子浸于其中8-12小時(shí)。此法適宜作催芽的作物或蔬菜種子。浸種結(jié)束后，將種子從HarpinCSSY002蛋白質(zhì)浸種液中取出，即可催芽或播種。出苗一周后，苗高比對照增長10％以上，生長量也提高10％以上，而且苗期抗猝倒病的能力也明顯增強(qiáng)。
(2)拌種將種子稍加濕潤，加入種子量0.1％的HarpinCSSY002蛋白質(zhì)制劑，充分拌勻后播種。出苗后苗齊苗壯，增強(qiáng)苗期抗猝倒病的能力。
(3)蘸根適于移栽定殖的作物，如瓜果、蔬菜、棉花、玉米等。首先將HarpinCSSY002蛋白質(zhì)制劑配成30μg/ml的水溶液，然后將被移栽作物幼苗的根浸在該溶液中1-2小時(shí)。移栽后，植株恢復(fù)生長快，緩苗時(shí)間縮短，植株長勢強(qiáng)勁。
(4)葉面噴霧作物的整個(gè)生長季節(jié)均可進(jìn)行噴施。將HarpinCSSY002蛋白質(zhì)制劑配成15-20μg/ml的水溶液，在作物的苗期、分蘗期、初花期、初果期或灌漿期進(jìn)行噴霧使用。作物生長季節(jié)一般可噴霧2-3次。噴霧后，可提高作物營養(yǎng)體生長量15-30％，提高產(chǎn)量10-20％，而且整個(gè)生長季節(jié)可省掉80％以上的化學(xué)農(nóng)藥。某些作物如黃瓜可抗住60％的灰霉病、煙草可抗住60-80％的花葉病毒病。另外還有一定的抗逆(抗旱、抗寒、耐鹽堿等)和驅(qū)蟲效果。
實(shí)施例六HarpinCSSY002蛋白質(zhì)的應(yīng)用舉例目前已對數(shù)十種作物、蔬菜、水果、花卉作了HarpinCSSY002蛋白質(zhì)的施用效果試驗(yàn)，雖然在不同作物品種上表現(xiàn)程度有所不同，但HarpinCSSY002蛋白質(zhì)的促長增產(chǎn)、抗病驅(qū)蟲、提高抗逆性以及盆花、苗木塑型等方面的作用是顯著的。下面舉幾例加以說明(1)玉米選取兩塊5分地大小的4葉期玉米苗田，分別用作對照和處理樣塊。處理塊分別在4葉期和6葉期用15-20μg/ml的HarpinCSSY002蛋白質(zhì)溶液作了葉面噴霧，此外不使用任何農(nóng)藥，其它方面的管理與對照塊一樣。在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，用藥后一周，處理塊平均株高比對照塊高出10-15cm，玉米大小斑病發(fā)病率也比對照塊低20-30％；同時(shí)處理塊開花比對照塊提前5-10天，灌漿期雙苞率明顯高于對照。收獲后比較產(chǎn)量，處理塊比對照塊增產(chǎn)12％以上。
(2)黃瓜選取二塊5分地大小的3葉期黃瓜苗田，分別用作對照、HarpinCSSY002蛋白質(zhì)處理的樣塊。蛋白處理液的濃度為20μg/ml。處理塊分別在3葉期、5葉期和7葉期進(jìn)行過葉面噴霧，其它管理同對照。試驗(yàn)結(jié)果表明HarpinCSSY002蛋白質(zhì)處理，開花比對照提前8天；花葉病比對照減少65％；灰霉柄比對照減少30％；產(chǎn)量比對照增加23％以上。
(3)草莓選取約2分地大小的兩廂3葉期草莓苗棚，分別作對照和HarpinCSSY002蛋白質(zhì)處理。處理苗棚的HarpinCSSY002蛋白質(zhì)使用濃度為20μg/ml。3葉期開始葉面噴霧，以后每間隔15天噴施一次，共計(jì)5次。結(jié)果顯示，處理棚比對照棚提早10左右開花；單株花、果率平均比對照增加2-3個(gè)；灰霉病發(fā)生率明顯少于對照；鮮果呈色好、果型優(yōu)、畸形果率低，產(chǎn)量比對照增產(chǎn)25％以上。另外，通過對等量鮮果進(jìn)行烘干稱重，發(fā)現(xiàn)處理棚的干物質(zhì)積累也比對照增加1-2％。
(4)仙客來仙客來是深受大眾喜歡的盆花品種，但是由細(xì)菌性軟腐病引起的死亡率很高，高溫時(shí)休眠，而且因病毒病造成的畸形葉、花嚴(yán)重影響了其觀賞價(jià)值和商業(yè)價(jià)值。我們選取了400盆3-4月齡仙客來作供試材料，隨機(jī)分成兩組，分別作對照和HarpinCSSY002蛋白質(zhì)處理。HarpinCSSY002蛋白質(zhì)的使用濃度為20μg/ml。處理方法為葉面噴霧，每間隔10-15天噴施一次。結(jié)果表明，用藥一周以后，處理組的葉色變深、有光澤，株型也明顯變得挺拔、緊湊、活脫，并能打破高溫休眠；用藥一個(gè)月以后，以前因病毒病而畸形卷曲的幼葉開始逐漸伸展成正常形態(tài)，而對照組的幼葉則變得越來越畸形，連開出的花瓣也呈畸形扭曲。另外，HarpinCSSY002蛋白質(zhì)對仙客來葉片上的白粉虱也有一定的驅(qū)趕作用。
(5)煙草煙草為蚜蟲易感植物。用25μg/ml濃度的HarpinCSSY002蛋白制劑在25℃條件下對煙草種子浸種24-48小時(shí)，并以pH6.5的5mM磷酸鉀緩沖液作對照浸種處理，然后分別播于三個(gè)培養(yǎng)盤中萌發(fā)，待出苗以后分組移栽于同一塊大田中，隨后每天觀察記錄感染蚜蟲的數(shù)目。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照處理組第1、2、3、6、7、8、9、10天單株感染蚜蟲的平均數(shù)分別為0、3、3、6、7、9、13、17；HarpinCSSY002蛋白處理組第1、2、3、6、7、8、9、10天單株感染蚜蟲的平均數(shù)分別為0、0、0、1、0、0、2、2。
(6)非洲鳳仙花非洲鳳仙花是一種常見觀賞草花。取10盆生長勢基本一致的非洲鳳仙花，分作處理和對照2組，每組5盆，處理組和對照組分別用25μg/ml濃度的HarpinCSSY002蛋白制劑和水進(jìn)行葉面噴霧，共噴2次，每次間隔7天，其它管理?xiàng)l件一致。待15天以后，將2組材料停止水肥管理(即停止?jié)菜褪┓?，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，15天以后，對照組植株開始出現(xiàn)枯黃凋零，花葉病毒病爆發(fā)，而處理組植株長勢健康，未發(fā)生花葉病毒病。
(7)草莓果實(shí)保鮮取剛采集的新鮮草莓100粒，按50粒1組分成處理和對照2組，處理組用30μg/ml HarpinCSSY002蛋白溶液浸10分鐘，對照組用純凈水浸10分鐘，然后分別裝在2個(gè)透氣小籃中，上面覆以紗布，室溫下放置1周，結(jié)果表明，對照組草莓90％以上已軟化，顏色暗褐，其中10％已嚴(yán)重霉?fàn)€，而處理組草莓90％以上顏色鮮亮，果粒脆嫩，只有少數(shù)幾粒顏色變深，果粒變軟。
序列表<110>成都派潤生物科技有限公司<120>一種編碼植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號因子的hrpN基因及其表達(dá)產(chǎn)物與應(yīng)用<160>2<170>PatentIn Version 2.1<210>1<211>1071<212>DNA<213>胡蘿卜軟腐歐文氏桿菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)<221>1-1071<400>11atgcttaatt ctcttggtgg cggagcttct ctgcaaatca cgatcaaagc gggtggtaac61 ggcggtttat ttccatctca gtcttcacaa aatggcggat cgccatcgca gtcggcgttt121 ggtggccagc gtagcaacat cgcagaacag ctgtccgata tcatgacgac tatgatgttt181 atgggcagca tgatgggcgg cggcatgggc ggtgggctcg gtggtttagg cagtagcctg241 ggcggactcg gtggtggttt gctgggtggt ggcttgggtg gcggtctcgg cagtagcctt301 ggtagtggac tgggcagtgc gctcggcggc ggattaggcg gggtgctggg tgctggcatg361 aatgccatga atccatcggc catgatgggt agcctgctgt ttagcgcgct ggaagatctg421 ctgggcggtg gcatgtcgca gcagcagggt gggcttttcg gcaacaaaca gccgtcgtcg481 ccggaaattt ctgcctatac ccaaggcgtt aacgatgcgc tgtccgcaat tctgggcaac541 ggcctgagcc agacgaaagg gcaaacgtca ccgttgcaac tgggtaataa cggtctgcaa601 ggcttgagcg gtgcgggtgc gtttaatcaa ctgggtagca cgctggggat gagcgttggg661 caaaaagccg gtttgcagga gttgaacaac atcagcacgc acaatgatag cccgacgcgt721 tacttcgtgg ataaagaaga tcgggcgatg gcgaaagaaa ttggtcagtt tatggatcaa781 tatcctgaag tcttcggcaa ggcagaatac cagaaagata actggcagac ggcgaaacag841 gaggataaat cctgggctaa agcgctgagc aagccggatg acgacggcat gactaagggc901 agcatggata aattcatgaa ggcggtcggc atgatcaaga gtgcgatagc gggtgatact961 ggcaacacta acctgagcgc tcgtggcaac ggcggcgcat ctctgggcat tgatgcagcg1021 atgatcggcg accgtatcgt caatatgggg ttgaagaagc tctccagcta a
<210>2<211>356<212>PRT<213>胡蘿卜軟腐歐文氏桿菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)<400>2Met Leu Asn Ser Leu Gly Gly Gly Ala Ser Leu Gln Ile Thr Ile Lys15 10 15Ala Gly Gly Asn Gly Gly Leu Phe Pro Ser Gln Ser Ser Gln Asn Gly20 25 30Gly Ser Pro Ser Gln Ser Ala Phe Gly Gly Gln Arg Ser Asn Ile Ala35 40 45Glu Gln Leu Ser Asp Ile Met Thr Thr Met Met Phe Met Gly Ser Met50 55 60Met Gly Gly Gly Met Gly Gly Gly Leu Gly Gly Leu Gly Ser Ser Leu65 70 75 80Gly Gly Leu Gly Gly Gly Leu Leu Gly Gly Gly Leu Gly Gly Gly Leu85 90 95Gly Ser Ser Leu Gly Ser Gly Leu Gly Ser Ala Leu Gly Gly Gly Leu100 105 110Gly Gly Val Leu Gly Ala Gly Met Asn Ala Met Asn Pro Ser Ala Met115 120 125Met Gly Ser Leu Leu Phe Ser Ala Leu Glu Asp Leu Leu Gly Gly Gly130 135 140Met Ser Gln Gln Gln Gly Gly Leu Phe Gly Asn Lys Gln Pro Ser Ser145 150 155 160Pro Glu Ile Ser Ala Tyr Thr Gln Gly Val Asn Asp Ala Leu Ser Ala165 170 175Ile Leu Gly Asn Gly Leu Ser Gln Thr Lys Gly Gln Thr Ser Pro Leu180 185 190Gln Leu Gly Asn Asn Gly Leu Gln Gly Leu Ser Gly Ala Gly Ala Phe195 200 205Asn Gln Leu Gly Ser Thr Leu Gly Met Ser Val Gly Gln Lys Ala Gly210 215 220Leu Gln Glu Leu ASn Asn Ile Ser Thr His Asn Asp Ser Pro Thr Arg225 230 235 240Tyr Phe Val Asp Lys Glu Asp Arg Ala Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln245 250 255
Phe Met Asp Gln Tyr Pro Glu Val Phe Gly Lys Ala Glu Tyr Gln Lys260 265 270Asp Asn Trp Gln Thr Ala Lys Gln Glu Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala275 280 285Leu Ser Lys Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Lys Gly Ser Met Asp Lys290 295 300Phe Met Lys Ala Val Gly Met Ile Lys Ser Ala Ile Ala Gly Asp Thr305 310 315 320Gly Asn Thr Asn Leu Ser Ala Arg Gly Asn Gly Gly Ala Ser Leu Gly325 330 335Ile Asp Ala Ala Met Ile Gly Asp Arg Ile Val Asn Met Gly Leu Lys340 345 350Lys Leu Ser Ser *35權(quán)利要求
1.一種編碼植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號因子的hrpN基因，其特征在于該基因的核苷酸序列是序列表中的SEQ ID No.1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的hrpN基因，其特征在于該基因自胡蘿卜軟腐歐文氏桿菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)菌株中獲得。
3.權(quán)利要求1或2所述的hrpN基因在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和防治病蟲害有關(guān)的農(nóng)業(yè)生物技術(shù)育種、轉(zhuǎn)基因植物方面的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的hrpN基因，在以下任一方面的應(yīng)用(1)促進(jìn)植物生長發(fā)育；(2)植物的廣譜抗病性，包括對多種細(xì)菌、真菌和病毒的抗性；(3)植物的驅(qū)蟲性；(4)植物的抗逆性(植物對干旱、嚴(yán)寒、鹽堿等不良環(huán)境的耐受性)；(5)延長作物產(chǎn)品的儲存時(shí)間；(6)對盆花、苗木的塑型作用。
5.含有權(quán)利要求1或2所述的hrpN基因的遺傳重組體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的遺傳重組體在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和防治病蟲害有關(guān)的農(nóng)業(yè)生物技術(shù)育種、轉(zhuǎn)基因植物方面的應(yīng)用。
7.一種編碼植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號因子的hrpN基因編碼的Harpin蛋白質(zhì)，其特征在于該蛋白質(zhì)具有序列表中SEQ ID No.2的氨基酸序列，具有以下屬性(1)共有356個(gè)氨基酸殘基；(2)分子量36.64kda；(3)等電點(diǎn)pI5.9；(4)富含甘氨酸(Gly)，缺乏半胱氨酸(Cys)；(5)對溫度穩(wěn)定，在100℃沸水中耐受10-15分鐘仍有活性；(6)沒有四級結(jié)構(gòu)。
8.含有權(quán)利要求7所述的Harpin蛋白質(zhì)的生物制品。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的Harpin蛋白質(zhì)，在以下任一方面的應(yīng)用(1)促進(jìn)植物生長發(fā)育；(2)植物的廣譜抗病性，包括對多種細(xì)菌、真菌和病毒的抗性；(3)植物的驅(qū)蟲性；(4)植物的抗逆性(植物對干旱、嚴(yán)寒、鹽堿等不良環(huán)境的耐受性)；(5)延長作物產(chǎn)品的儲存時(shí)間；(6)對盆花、苗木的塑型作用。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的Harpin蛋白質(zhì)的生物制品，在以下任一方面的應(yīng)用(1)促進(jìn)植物生長發(fā)育；(2)植物的廣譜抗病性，包括對多種細(xì)菌、真菌和病毒的抗性；(3)植物的驅(qū)蟲性；(4)植物的抗逆性(植物對干旱、嚴(yán)寒、鹽堿等不良環(huán)境的耐受性)；(5)延長作物產(chǎn)品的儲存時(shí)間；(6)對盆花、苗木的塑型作用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種編碼植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號因子的hrpN基因及其表達(dá)產(chǎn)物與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的基因源自胡蘿卜軟腐歐氏桿菌(Erwiniacarotovora subsp.carotovora)菌株，其核苷酸序列如SEQ ID No.1，該基因在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和防治病蟲害有關(guān)的農(nóng)業(yè)生物技術(shù)育種、轉(zhuǎn)基因植物方面有廣泛應(yīng)用前景。該基因的編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID No.2，該蛋白質(zhì)具有多種功能活性，能廣泛誘導(dǎo)植物產(chǎn)生廣譜抗病性、驅(qū)蟲性和抗逆性，并促進(jìn)植物生長發(fā)育和提高產(chǎn)量，因而其相關(guān)制品可作為生物農(nóng)藥直接用于植物的生長發(fā)育調(diào)節(jié)和病蟲害防治。
文檔編號C12N15/82GK1858206SQ20051002081
公開日2006年11月8日 申請日期2005年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月29日
發(fā)明者吳伯驥, 湯承, 曹茂林, 張玨, 崔亞亞 申請人:成都派潤生物科技有限公司