專利名稱：利用鼠李糖乳桿菌生產(chǎn)胞外粘多糖的方法及產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是以一種乳酸菌微生物為出發(fā)菌，在發(fā)酵條件下能產(chǎn)生分泌于胞外粘性多糖(Lactobacillus rhamnosus EPS)的生產(chǎn)方法，本發(fā)明亦關(guān)于含有該粘性多糖在食品、飲料、膳食中應(yīng)用于人的功能食品與藥品的產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
多糖是存在于自然界的醛糖和(或)酮糖通過糖苷鍵連接在一起的聚合物。多糖是一切有生命的有機體必不可少的成分，它與維持生命的種種生理機能有著密切的聯(lián)系。多糖已作為有生物活性的天然產(chǎn)物中的一個重要類型出現(xiàn)，各種多糖所具有抗腫瘤、提高免疫、抗凝血、降血糖和抗病毒等活性已相繼被發(fā)現(xiàn)。
多糖的提取和分離大多數(shù)采取的是化學(xué)提取法，多糖通常用水作溶劑或有機溶劑，根據(jù)多糖的溶解性還可以用超濾離心分離法提取多糖，現(xiàn)今市場應(yīng)用的如香菇多糖、黃芪多糖、甘草多糖、海帶多糖、刺參粘多糖等等，還有用菌法提取多糖。如1983年兩位美國教授Sherwood Gorbach和BarryGoldin首次從健康人體中分離出了一株新的乳酸菌Lactobacillusrhamnosus(鼠李糖乳桿菌)。
(1)專利“包含鼠李糖乳桿菌的藥物制劑”申請?zhí)?8807017.0，描述了一種用于預(yù)防和治療人和動物中胃腸道疾病的藥物制劑，該制劑在至少一種藥學(xué)上可接受的載體培養(yǎng)基中包含鼠李糖乳桿菌菌株u321和/或其具有基本相似功能的一種或多種變體，其中微生物保持其存活。
(2)專利“上皮粘附性乳桿菌”申請?zhí)?6194086.7，涉及具有甘露糖特異性粘附素的植物乳桿菌在制備可抑制表達甘露糖特異性粘附素的致病菌對上皮細胞粘附的藥用組合物方面的應(yīng)用。用在本發(fā)明中的一種植物乳桿菌菌株可以與D一甘露糖包被的瓊脂糖珠結(jié)合，并且優(yōu)選根據(jù)REA與植物乳桿菌299有70％以上相似性的植物乳桿菌族。本發(fā)明還涉及上述菌株在制備用于預(yù)防和/或治療細菌易位、胃腸炎和其它由表達甘露糖特異性粘附素的致病菌所致疾病的藥用組合物方面的應(yīng)用。
(3)專利“鼠李糖乳酸桿菌菌株及其用途”申請?zhí)?0131759.8，本案揭露了一種新穎的鼠李糖乳酸桿菌菌株(以下稱為Tcell-1菌株)，其在種系上不同于該物種中已經(jīng)公開的所有菌株，且其能展現(xiàn)出優(yōu)越的益生性質(zhì)。本案亦揭露該菌株的藥學(xué)及營養(yǎng)用途。
(4)專利“增強免疫的乳酸菌”申請?zhí)?8805171.0，涉及如下新菌株鼠李糖乳桿菌HN001和HN067，嗜酸性乳桿菌HN017以及乳雙岐桿菌HN019，當(dāng)攝入時，每種菌株均具有免疫增強作用。
以上專利未涉及本發(fā)明專利技術(shù)內(nèi)容。我國目前還沒有關(guān)于鼠李糖乳桿菌胞外多糖的學(xué)術(shù)及產(chǎn)業(yè)化報道。
依據(jù)本發(fā)明，本案發(fā)明人已鑒定出一種以天津工業(yè)微生物研究所菌種保藏中心分離篩選的鼠李糖乳桿菌(L.R-008菌株)為出發(fā)菌種，在一定條件下經(jīng)進行發(fā)酵，同時在培養(yǎng)基中輔以微量元素、利用溫度刺激胞外分泌粘多糖而獲得成功。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于，提供一種以天津工業(yè)微生物研究所菌種保藏中心分離篩選的鼠李糖乳桿菌(L.R-008菌株)為出發(fā)菌種，該菌種也屬于鼠李糖乳桿菌中的一種，在國家保存庫中存放的類似菌種為干酪乳桿菌鼠李糖亞種(Lactobacillus casei subsp.Rhamnosus Hansen)編號為AS1.26。利用鼠李糖乳桿菌(L.R-008菌株)為出發(fā)菌種，在一定條件下經(jīng)發(fā)酵，同時在培養(yǎng)基中輔以微量元素、利用溫度變化刺激胞外分泌粘多糖的生產(chǎn)方法。
本發(fā)明的另一個目的在于，提供一種含有本發(fā)明粘多糖及適用賦形，可供制造食品、飲料或膳食補充劑的功能保健食品。
本發(fā)明還有一個目的在于，提供一種含有本發(fā)明粘多糖的藥物，用于預(yù)防和治療人體疾病。
本發(fā)明提供的利用鼠李糖乳桿菌生產(chǎn)胞外粘多糖的方法在于，采用鼠李糖乳桿菌為出發(fā)菌種，以葡萄糖、乳糖為碳源，經(jīng)配料、菌種擴培發(fā)酵、再經(jīng)分離、洗滌、脫水、干燥，得到胞外粘多糖產(chǎn)品，其中發(fā)酵原料的配比是，采用乳清粉50～10％、葡萄糖1～5％、檸檬酸氫二胺0.02～0.1％、MgSO4·7H2O 0.02～0.1％、MnSO4·H2O 0.01～0.1％、Tween-801～2ml，余量為水；發(fā)酵溫度維持在32℃～37℃、PH5.5～6.0之間、發(fā)酵時間在24～72小時之間、并以80～110r/min間歇攪拌方式。
一種上述方法生產(chǎn)的胞外粘多糖產(chǎn)品，其特征在于胞外粘多糖的組分為丙酮酸1份、D-葡萄糖2份、D-半乳糖1份、L-鼠李糖4份，(Lactobacillus rhamnosus EPS胞外粘多糖)無色無味的固體，分子量為3.0～6.0×107Da。
一種上述方法生產(chǎn)的胞外粘多糖產(chǎn)品的用途，其特征在于，含有經(jīng)鼠李糖乳桿菌，經(jīng)發(fā)酵法生產(chǎn)出的胞外粘多糖(EPS)，并配伍相應(yīng)的賦形劑應(yīng)用于人的功能食品和藥品，用于預(yù)防和治療人體疾病。


圖1是本發(fā)明工藝流程圖。
具體實施例方式本發(fā)明的具體實施方法步驟如下(1)工藝流程見附圖1。
(2)操作要點①菌種鼠李糖乳桿菌(L.R-008)經(jīng)斜面培養(yǎng)、三角瓶培養(yǎng)、種子罐擴培后，接入發(fā)酵罐進行發(fā)酵。
②發(fā)酵原料乳清粉、葡萄糖、檸檬酸氫二胺、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、Tween-80。
③配料發(fā)酵原料按一定比配料投入發(fā)酵罐。具體比例為乳清粉5％～10％、葡萄糖1％～5％、檸檬酸氫二胺0.1％～1％、MgSO4·7H2O0.02％～0.1％、MnSO4·H2O0.01％～0.1％、Tween-80 1ml/L～2ml/L，余量為水；④發(fā)酵以葡萄糖和乳糖為碳源，按1％～3％(v/v)接種量，維持pH5.5-6.0于32℃至37℃發(fā)酵24小時至72小時。發(fā)酵罐以100r/min間歇攪拌，不補充空氣。同時在培養(yǎng)基中輔以微量元素和變化發(fā)酵溫度以刺激胞外多糖分泌。最終發(fā)酵液中菌體生物量達2×109CFU/ml，L.rhamnosusEPS得率達950mg/L以上。
⑤分離采用乙醇沉淀法與膜過濾法分離多糖。
⑥洗滌采用無菌水對分離多糖進行洗滌。
⑦脫水采用膜過濾法脫去部分水分。
⑧干燥脫去部分水分的多糖進行常規(guī)噴霧干燥，成粉狀產(chǎn)品。
⑨包裝、成品粉狀多糖(鼠李糖乳桿菌胞外多糖)進行包裝成為成品。
有益效果鼠李糖乳桿菌胞外粘多糖和其它乳酸菌多糖相比較，發(fā)酵得率高；鼠李糖乳桿菌胞外粘多糖在食品、醫(yī)藥、造紙、保藏等領(lǐng)域及特殊場合有著廣泛的用途與非常高的應(yīng)用價值。
鼠李糖乳桿菌胞外粘多糖，在保健食品，生物制藥等方面，各種多糖所具有抗腫瘤、提高免疫、抗凝血、降血糖和抗病毒等生理活性是顯而易見的，是一種極具發(fā)展?jié)摿Φ亩嗵恰?br> 鼠李糖乳桿菌胞外多糖的生產(chǎn)原料價格相對低廉，而產(chǎn)品附加值極高，因此，鼠李糖乳桿菌胞外多糖的產(chǎn)業(yè)化的實施有著廣闊的市場前景和重要意義。
根據(jù)鼠李糖乳桿菌EPS各種物理特性，還可作為乳化穩(wěn)定劑廣泛應(yīng)用于各種發(fā)酵乳、干酪、化妝品。其粘液成膜性可作為果蔬保鮮和可食性食品薄膜；其絮凝特性可作為污水的凈化劑；其冰晶形成抑制能力可廣泛應(yīng)用于冷凍食品、醫(yī)藥及菌種保護劑。
因此可以看出，鼠李糖乳桿菌EPS作為一種新型、高效、安全的生理功能調(diào)節(jié)劑和食品添加劑，具有重大理論研究意義和實際應(yīng)用價值。
實施例下列實施例僅供說明，而不限制本發(fā)明的范圍。
實施例1.
操作要點工藝流程參見圖1①菌種擴大培養(yǎng)鼠李糖乳桿菌L.R-008斜面培養(yǎng)，三角瓶培養(yǎng)、繼續(xù)種子罐擴培后，接入發(fā)酵罐進行發(fā)酵。
②發(fā)酵原料乳清粉、葡萄糖、檸檬酸氫二胺、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O。Tween-80。
③配料發(fā)酵原料按一定比配料投入發(fā)酵罐。具體比例為乳清粉5％、葡萄糖1.5％、檸檬酸氫二胺0.2％、MgSO4·7H2O0.04％、MnSO4·H2O0.04％、Tween-80 1ml/L，余量為水；④發(fā)酵上述原料配好后，按3％(v/v)接種量，維持pH5.5-6.0于34℃至37℃發(fā)酵50小時。發(fā)酵罐以100r/min間歇攪拌，不補充空氣。同時在培養(yǎng)基中輔以微量元素和變化發(fā)酵溫度以刺激胞外多糖分泌。最終發(fā)酵液中菌體生物量達2×109CFU/ml。
⑤分離采用乙醇沉淀法與膜過濾法分離多糖。
⑥洗滌采用無菌水對分離多糖進行洗滌。
⑦脫水采用膜過濾法脫去部分水分。
⑧干燥脫去部分水分的多糖進行常規(guī)噴霧干燥，成粉狀產(chǎn)品。
L.rhamnosusEPS得率達964mg/L。
⑨包裝、成品粉狀多糖進行包裝成為成品。
其成品胞外粘多糖的組分為丙酮酸1份、D-葡萄糖2份、D-半乳糖1份、L-鼠李糖4份，(Lactobacillus rhamnosus EPS胞外粘多糖)無色無味的固體，分子量為3.0～6.0×107Da。
實施例2.
操作要點工藝流程參見圖1①菌種擴大培養(yǎng)鼠李糖乳桿菌L.R-008斜面培養(yǎng)，三角瓶培養(yǎng)、繼續(xù)種子罐擴培后，接入發(fā)酵罐進行發(fā)酵。
②發(fā)酵原料乳清粉、葡萄糖、檸檬酸氫二胺、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O。Tween-80。
③配料發(fā)酵原料按一定比配料投入發(fā)酵罐。具體比例為乳清粉8％、葡萄糖0.5％、檸檬酸氫二胺0.5％、MgSO4·7H2O0.06％、MnSO4·H2O0.02％、Tween-80 1.5ml/L，余量為水；④發(fā)酵上述原料配好后，按3％(v/v)接種量，維持pH5.5-6.0于32℃至35℃發(fā)酵68小時。發(fā)酵罐以100r/min間歇攪拌，不補充空氣。同時在培養(yǎng)基中輔以微量元素和變化發(fā)酵溫度以刺激胞外多糖分泌。最終發(fā)酵液中菌體生物量達2×109CFU/ml。
⑤分離采用乙醇沉淀法與膜過濾法分離多糖。
⑥洗滌采用無菌水對分離多糖進行洗滌。
⑦脫水采用膜過濾法脫去部分水分。
⑧干燥脫去部分水分的多糖進行常規(guī)噴霧干燥，成粉狀產(chǎn)品。
L.rhamnosusEPS得率達982mg/L。
⑨包裝、成品粉狀多糖進行包裝成為成品。
權(quán)利要求
1.一種利用鼠李糖乳桿菌生產(chǎn)胞外粘多糖的方法，其特征在于，采用鼠李糖乳桿菌為出發(fā)菌種，以葡萄糖、乳糖為碳源，經(jīng)配料、菌種擴培發(fā)酵、再經(jīng)分離、洗滌、脫水、干燥，得到胞外粘多糖產(chǎn)品，其中發(fā)酵原料的配比是，采用乳清粉50～10％、葡萄糖1～5％、檸檬酸氫二胺0.02～0.1％、MgSO4·7H2O 0.02～0.1％、MnSO4·H2O 0.01～0.1％、Tween-80 1～2ml，余量為水；發(fā)酵溫度維持在32℃～37℃、PH5.5～6.0之間、發(fā)酵時間在24～72小時之間、并以80～110r/min間歇攪拌方式。
2.一種權(quán)利要求1所述方法生產(chǎn)的胞外粘多糖產(chǎn)品，其特征在于胞外粘多糖的組分為丙酮酸1份、D-葡萄糖2份、D-半乳糖1份、L-鼠李糖4份，(Lactobacillus rhamnosus EPS胞外粘多糖)無色無味的固體，分子量為3.0～6.0×107Da。
全文摘要
利用鼠李糖乳桿菌生產(chǎn)胞外粘多糖的方法及產(chǎn)品。本發(fā)明采用鼠李糖乳桿菌為出發(fā)菌種，以葡萄糖、乳糖為碳源，經(jīng)配料、菌種擴培發(fā)酵、再經(jīng)分離、洗滌、脫水、干燥，而獲得胞外粘多糖的生產(chǎn)方法，其胞外粘多糖的組分為丙酮酸1份、D－葡萄糖2份、D－半乳糖1份、L－鼠李糖4份，(Lactobacillus rhamnosus EPS胞外粘多糖)無色無味的固體，分子量為3.0～6.0×10
文檔編號C12P19/00GK1781950SQ20051001506
公開日2006年6月7日 申請日期2005年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月9日
發(fā)明者張剛, 奚震, 葉櫻, 孫鳳雄 申請人:天津市工業(yè)微生物研究所