專利名稱：PVA－SbQ的合成及對乙酰膽堿酯酶的固定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及光交聯(lián)樹脂PVA-SbQ的合成及對乙酰膽堿酯酶的固定化技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前已有多種技術(shù)被應用到乙酰膽堿酯酶的固定化中，主要有吸附法、包埋法、和交聯(lián)法等。吸附法的最大優(yōu)點是不需試劑，只需很小的活化和清洗步驟，而且對酶的損壞要比其他化學方法小。但這種方法對pH改變、溫度、離子強度和底物有很大的敏感性，因此使用這種方法要求的條件比較高，而且使用此法酶容易浸出因而酶層的活性下降較快。交聯(lián)法雖然可將乙酰膽堿酯酶固定的較牢固，但是由于此法需使用雙功能試劑，最常用的如戊二醛，它本身可使酶變性失去活性，所以導致酶的活力回收一般都比較低。
聚乙烯醇苯乙烯吡啶(PVA-SbQ)作為一種優(yōu)良的酶固定化試劑目前在國外得到較廣泛的應用，尤其在檢測農(nóng)藥殘留的生物傳感技術(shù)中它作為乙酰膽堿酯酶的固定化試劑倍受推崇。光交聯(lián)樹脂聚乙烯醇苯乙烯吡啶(PVA-SbQ)在紫外光的照射下可迅速聚合，并且聚合過程中不會對乙酰膽堿酯酶造成傷害，所以此法的酶活力回收率較高而且酶的固定牢固。但是目前國內(nèi)外應用的PVA-SbQ大多是日本公司(TOYO GOSEI CO.LTD)提供的，目前國內(nèi)尚未見到該產(chǎn)品。我們通過反復試驗研究探索出一條簡便、易行且產(chǎn)率較高的合成PVA-SbQ的方法，并把合成出的產(chǎn)品應用于乙酰膽堿酯酶的固定取得了良好的效果。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是合成出光交聯(lián)樹脂PVA-SbQ，并將其應用到乙酰膽堿酯酶的固定化中，解決現(xiàn)有技術(shù)存在乙酰膽堿酯酶的活力回收率低、活性保持期短的問題。提供了PVA-SbQ的合成方法和一種利用PVA-SbQ法在96孔酶標板上固定乙酰膽堿酯酶的技術(shù)。專利要求保護的內(nèi)容為PVA-SbQ的合成路線，及對乙酰膽堿酯酶進行固定時PVA-SbQ的使用濃度。
本發(fā)明提供的光交聯(lián)樹脂PVA-SbQ的合成方法包括(以下試劑未經(jīng)特殊說明均為分析純)——分別取0.2～0.4M對苯二甲醛、0.1～0.2M γ-甲基吡啶、25～30mL醋酸酐、10～12mL醋酸混合均勻，沸水浴加熱回流6～8小時。
——向上述溶液中加入300～400mL 1.0M HCl靜置1～2小時，過濾除去沉淀物；——濾液加熱至30～40℃，用苯萃取，棄去苯溶液，用NaOH將濾液調(diào)至中性；——過濾收集黃色沉淀即得到對甲酰苯乙烯吡啶，水洗涼干后溶于80～90℃乙酸乙酯中，不溶物過濾除去。
——加入硫酸二甲酯50mL，放置隔夜，過濾；——收集濾渣即得到1-甲基-2-(對甲酰苯乙烯基)吡啶甲硫酸鹽(SbQ)，分別用甲醇和丙酮洗滌，P2O5干燥后避光保存；——取4～5g SbQ和6～8mL85％濃磷酸，加入聚乙烯醇(PVA)溶液中(50gPVA溶于600mL蒸餾水中配制而成)；——室溫避光攪拌24h后，緩慢傾入丙酮中，過濾收集黃色沉淀；——甲醇洗滌，經(jīng)干燥后即得PVA-SbQ。
本發(fā)明提供的PVA-SbQ法在96孔酶標板上固定乙酰膽堿酯酶技術(shù)包括——以pH＝8.0的0.1M磷酸緩沖液5mL為介質(zhì)。
——加入300～400mg的PVA-SbQ，在60～70℃的水浴中加熱溶解作為乙酰膽堿酯酶固定液。
——吸取上述固定液1mL加入0.3U的乙酰膽堿酯酶粉，緩慢混合均勻。吸取20μL于96孔酶標板的板孔中，在20瓦紫外燈下照射聚合30分鐘后將酶標板移入4℃冰箱中放置隔夜待孔中緩沖液干燥后即可將酶牢固的固定住。
本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果本法提供的PVA-SbQ合成路線簡便易行不需復雜設備，而且產(chǎn)率較高。在乙酰膽堿酯酶的固定方面與其它方法相比，此法簡單易行，經(jīng)固定化以后的乙酰膽堿酯酶不易滲出、酶的活性保存期可被延長至半年以上，而且與其它方法相比酶的活力回收率有較大提高。
具體實施方式實施例1PVA-SbQ的合成分別向圓底燒瓶中加入26.8g對苯二甲醛、9.3g γ-甲基吡啶、26mL醋酸酐和11.5mL醋酸，在沸水浴中加熱回流6h。向圓底燒瓶中加入300mL 1.0MHCl靜置1小時，過濾除去沉淀物收集濾液，將濾液加熱至40℃，用苯萃取兩次(40mL×2)，棄去上層苯溶液，下層濾液用NaOH調(diào)至中性，在此過程中會有黃色沉淀析出，過濾收集此沉淀并用50mL蒸餾水分3次洗滌濾渣涼干后即得到對甲酰苯乙烯吡啶。將濾渣溶于80～90℃的乙酸乙酯中，過濾除去不溶物，向濾液中加入50mL硫酸二甲酯放置隔夜，過濾，所得濾渣即為1-甲基-2-(對甲酰苯乙烯基)吡啶甲硫酸鹽(SbQ)，用20mL甲醇和丙酮各洗滌2次，P2O5干燥避光保存。
稱取50gPVA于600mL蒸餾水中，在水浴鍋上緩慢加熱至90℃保溫2小時，待溶解后過28目不銹鋼篩除去雜質(zhì)。取4gSbQ及6mL85％濃磷酸加入上述PVA溶液中。避光攪拌24h，緩慢傾入500mL丙酮中過濾收集黃色沉淀，用50mL甲醇分3次進行洗滌即得PVA-SbQ，干燥后避光保存?zhèn)溆谩?br> 實施例2乙酰膽堿酯酶的固定向5mL0.1MpH＝8.0的磷酸緩沖液中加入300mgPVA-SbQ，在60～70℃的水浴中加熱溶解作為乙酰膽堿酯酶固定液。吸取上述PVA-SbQ溶液1mL，加入0.3U的乙酰膽堿酯酶粉，用單道移液器緩慢混合均勻。吸取此酶溶液20μL于96孔酶標板的板孔中，在20瓦紫外燈下照射聚合30分鐘后將酶標板移入4℃冰箱中放置隔夜，待孔中緩沖液干燥后即可將酶牢固的固定住。
權(quán)利要求
1.一種光交聯(lián)樹脂PVA-SbQ的合成方法，其特征是該方法包括——分別取0.2～0.4M對苯二甲醛、0.1～0.2M γ-甲基吡啶、25～30mL醋酸酐、10～12mL冰醋酸混合均勻，沸水浴加熱回流6～8小時；——向上述溶液中加入300mL 1.0M HCl靜置1～2小時，過濾除去沉淀物；——濾液加熱至30～40℃，用苯萃取，棄去苯溶液，用NaOH將濾液調(diào)至中性；——過濾收集黃色沉淀，水洗涼干即得到對甲酰苯乙烯吡啶，濾渣溶于80～90℃乙酸乙酯中，不溶物過濾除去。——加入硫酸二甲酯50mL，放置隔夜，過濾；——收集濾渣即得1-甲基-2-(對甲酰苯乙烯基)吡啶甲硫酸鹽(SbQ)，分別用甲醇和丙酮洗滌，P2O5干燥后避光保存；——取4～5g SbQ和6～8mL85％磷酸，加入聚乙烯醇(PVA)溶液中(50gPVA溶于600mL蒸餾水中配制而成)；——室溫避光攪拌24h后，緩慢傾入丙酮中，過濾收集黃色沉淀；——甲醇洗滌，經(jīng)干燥后即得PVA-SbQ。
2.一種PVA-SbQ法在96孔酶標板上固定乙酰膽堿酯酶技術(shù)，其特征是該法包括——以pH＝8.0的0.1M磷酸緩沖液為介質(zhì)；——每5mL磷酸緩沖液加入300～400mg的PVA-SbQ，在60～70℃的水浴中加熱溶解作為乙酰膽堿酯酶固定液；——吸取上述固定液1mL加入0.3U的乙酰膽堿酯酶粉緩慢混合均勻；吸取20μL于96孔酶標板的板孔中，在20瓦紫外燈下照射聚合30分鐘后將酶標板移入4℃冰箱中放置隔夜，待孔中緩沖液干燥后即可將酶牢固的固定住。
全文摘要
一種PVA－SbQ的合成及對乙酰膽堿酯酶的固定。解決現(xiàn)有技術(shù)存在乙酰膽堿酯酶的活力回收率低、活性保持期短的問題。PVA－SbQ的合成是以對苯二甲醛、γ－甲基吡啶為原料經(jīng)沸水浴回流后，加酸除去剩余對苯二甲醛并將濾液調(diào)至中性收集黃色沉淀，與硫酸二甲酯反應后得到SbQ，與PVA溶液混合在微酸性條件下攪拌得PVA－SbQ。對乙酰膽堿酯酶的固定是以PVA－SbQ的磷酸緩沖液為固定液，加入乙酰膽堿酯酶粉混合均勻；吸取20μL于96孔酶標板的板孔中，紫外燈下聚合后將酶標板移入4℃冰箱中放置隔夜，待孔中緩沖液干燥后即可將酶固定住。與其它方法相比，本發(fā)明簡單易行，經(jīng)固定化以后的乙酰膽堿酯酶不易滲出、酶的活性保存期可被延長至半年以上，而且酶的活力回收率與其它方法相比有較大提高。
文檔編號C12N11/04GK1766102SQ20051001492
公開日2006年5月3日 申請日期2005年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月31日
發(fā)明者黃永春, 劉紅梅, 傅學起 申請人:農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所