專利名稱：使用最適化的低鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)Thraustochytriales屬微生物的方法
專利說明使用最適化的低鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)Thraustochytriales屬微生物的方法 各種不同的PUFAs(多不飽和脂肪酸)，特別是ω-3脂肪酸(n-3脂肪酸)是人類營養(yǎng)的必需成分。
然而，已知在大多數(shù)工業(yè)化國家中，n-3脂肪酸的供給是不足的。與此相反，飲食中的總脂肪比例，以及飽和脂肪酸和n-6脂肪酸的攝入太高。這是由于我們的飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生的變化，特別是在最近的大約150年間發(fā)生的變化所引起的，并與各種不同的文明化所帶來的慢性病，例如工業(yè)化國家主要的死亡原因——心血管疾病的出現(xiàn)相關聯(lián)(Simopoulos，A.P.，1999，Am.J.Clin.Nutr.70，560-569)。同時，大量的研究顯示，通過定向地增加n-3脂肪酸，特別是二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)的攝入，有可能顯著降低心血管病的風險(GISSI-Prevenzione研究人員(Gruppo Italiano per lo Studio dellaSopravvivenza nell′Infarto miocardico)，1999，在心肌梗塞后通過飲食補充n-3多不飽和脂肪酸和維生素EGISSI-prevenzione試驗的結(jié)果，Lancet354，447-455；Burr等，1989，脂肪、魚類和纖維攝取量的變化對死亡和心肌梗塞的影響飲食和再次梗塞試驗(DART)，Lancet 2，757-761)。因此，許多不同的組織(WHO、FAO、AHA、ISSFAL、不列顛營養(yǎng)基金會等)推薦大量增加n-3脂肪酸的攝入量(Kris-Eherton等，魚類消費量、魚油、ω-3脂肪酸和心血管疾病，Circulation 2002，2747-2757)。
生產(chǎn)PUFAs以及特別是n-3脂肪酸的源泉為上述所有的海洋冷水魚類以及從它們中提取的油，此外還為海洋微生物，這些海洋微生物與魚類相比的優(yōu)勢在于，它們可在成本效應和受控條件下進行發(fā)酵以生產(chǎn)PUFAs。發(fā)酵生產(chǎn)不存在任何污染的危險，而對于魚類或從其中提取的魚油來說卻經(jīng)常被描述發(fā)生這樣的問題(Olsen SF.Int J Epidemiol.20011279-80)。此外，提取的魚油的成分必然會受到對魚的種類和培養(yǎng)條件的選擇的影響，而不易受到季節(jié)變化的影響，正如對于魚類和魚產(chǎn)品所描述的那樣(Gamez-Meza et al.Lipids 1999639-42)。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多適合于生產(chǎn)n-3PUFA的微生物，例如弧菌(Vibrio)屬的細菌(例如海產(chǎn)弧菌(Vibrio marinus))或甲藻(Dinophyta)，特別是隱甲藻(Crypthecodinium)屬中的微生物例如寇氏隱甲藻(C.cohnii)，或原生藻菌例如Pinguiophyceae中的微生物例如Glossomastix、Phaeomonas、Pinguiochrysis、Pinguiococcus和Polydochrysis。優(yōu)選的用于發(fā)酵生產(chǎn)PUFA的微生物屬于Stramenopiles(或Labyrinthulomycota)，特別是Thraustochytriales目(Thraustchytriidea)中的微生物，又特別是Japonochytrium、裂壺菌(Schizochytrium)、破囊壺菌(Thraustochytrium)、Althornia、Labyrinthuloides、Aplanochytrium和Ulkenia屬中的微生物。
已經(jīng)知道一些上面提到的微生物可以用于工業(yè)化生產(chǎn)脂肪酸，相應的工藝方法已經(jīng)被描述。因此，國際專利申請WO 91/07498 A1公開了使用破囊壺菌和裂壺菌屬的生物體來生產(chǎn)PUFAs。WO 91/11918 A1公開了使用寇氏隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)生產(chǎn)PUFAs，WO96/33263 A1和相應的歐洲專利申請EP 0 823 475 A1描述了使用裂壺菌屬的微生物生產(chǎn)PUFAs，而專利申請WO 98/03671公開了使用Ulkenia屬的微生物生產(chǎn)PUFAs。
上面描述的微生物特別是網(wǎng)粘菌門(Labyrinthulomycota)的自然棲息地是海洋棲息地。因此，這些微生物通常培養(yǎng)在含鹽的培養(yǎng)基中，對本發(fā)明來說，海水的鹽濃度被定義為32-35g/L，和90-95％含量的鈉和氯。用于培養(yǎng)海洋微生物例如破囊壺菌或裂壺菌的典型培養(yǎng)基是基于海水(例如ATCC(美國典型培養(yǎng)物保藏中心)的790 By+培養(yǎng)基[酵母提取物1.0g，蛋白胨1.0g，D+葡萄糖5.0g，海水1L])。但是，也已經(jīng)知道Thraustochytriales目的微生物可以在具有非常低鹽度的培養(yǎng)基中存活。但是，當鹽含量低于7.5-15g/L的限度，對應于鹽度7.5-15‰時，它的生長被描述為只是非常低，在低鹽度范圍內(nèi)沒有中間最大值。最適生長速度只在高于上面提到的鹽度限度時才能獲得(Fan等，BotanicaMarina 45，2002，50-57頁)。
然而對于廣鹽性微生物的商業(yè)化發(fā)酵來說，已經(jīng)描述了使用大約50-60％低鹽含量的海水。按照Henderson的“生物學術語字典”，廣鹽性生物是指那些能夠調(diào)整自身適應廣范圍鹽含量的生物(Henderson W.D.，Lawrence，E.，Henderson生物學術語字典(Henderson’s dictionary ofbiological terms)，第十版，1992，173頁)。
已經(jīng)描述了屬于原生藻菌(Stramenopiles)(或Labyrinthulomycota)的廣鹽性微生物可以在含有低量鈉離子(60％的海水)的發(fā)酵培養(yǎng)基中生產(chǎn)較大量的PUFA(美國專利No.6,451,567)。此外也描述了低氯含量培養(yǎng)基的使用，其目的是為了降低氯對發(fā)酵設備的腐蝕作用(美國專利No 6,410,281)。有報道對于例如破囊壺菌和裂壺菌屬的微生物來說，使用了所含氯濃度低于3g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基(美國專利Pat.No 5,340,742，美國專利No 6,451,567，美國專利No 6,410,281)。也已經(jīng)知道培養(yǎng)也可能在與鹽水相比鹽含量較低的條件下進行。具體的參考文獻參見專利文件WO 98/03671 A1、EP 0 823 475 A1、美國專利No 6,451,567、美國專利No 6,410,281。
此外還知道對于裂壺菌屬的微生物(Schizochytrium sp.S31；ATCC20888)的發(fā)酵來說，脂肪酸相對產(chǎn)量的最大值在氯化鈉濃度為1.75g/L時獲得。其中使用的鹽的總量不到海水鹽含量的10％，但是主要包含鈉和氯離子(EP 0 512 997 B1和美國專利No 5,518,918)。
但是，到目前為止所有描述的方法都有缺點。發(fā)酵工藝的效率特別受到可達到的生物質(zhì)和單位生物質(zhì)的產(chǎn)物含量的限制。此外，產(chǎn)生的油可能部分以不一定對應于所需產(chǎn)物的脂肪酸形式存在，而必須首先對工藝進行修飾。某種程度上在單位生物質(zhì)的產(chǎn)物含量低的情況下，加工通常是復雜的，因為為了獲得相對少量的產(chǎn)物必須對相對大量的生物質(zhì)進行加工。此外，上面描述的所有方法都在培養(yǎng)基中包含了相對高的總鹽含量。這不僅會在產(chǎn)品處理過程中導致大量的問題，而且表現(xiàn)出極端的環(huán)境劣勢，因為不僅產(chǎn)生了大量的生物質(zhì)，而且產(chǎn)生了含有大量鹽的廢水，它們必須被處理。
因此，根據(jù)本技術領域的現(xiàn)狀，本發(fā)明的一個目的是提供新的、簡單和經(jīng)濟的使用含有低鹽含量的培養(yǎng)基培養(yǎng)Thraustochytriales的方法。除了成本效應之外，本方法還應該易于實施，并能夠高產(chǎn)高純度的PUFAs或含有PUFA的產(chǎn)品。
該任務以及其它雖沒有明確地描述但可以從引言所討論的關系中毫不費力地得出或推演出的任務，可以通過在本發(fā)明的權利要求中限定的目標來實現(xiàn)。
權利要求1中限定的方法提供了一種有優(yōu)勢的培養(yǎng)Thraustochytriales的方法。該方法包括將Thraustochytriales目的微生物在不添加固體或溶液形式的鈉或氯離子的低鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基的總鹽含量與海水相比少于10％，即總鹽含量少于大約3.5g/L。
本發(fā)明還包括了生產(chǎn)高純度PUFAs的方法。
按照本發(fā)明，優(yōu)選的PUFAs是DHA、DPA和EPA。
具體來說，通過上述方法培養(yǎng)的微生物表現(xiàn)出大于10％，優(yōu)選情況下大于14％，更優(yōu)選情況下大于18％DHA/干生物質(zhì)的產(chǎn)量。
具體來說，通過上述方法培養(yǎng)的微生物表現(xiàn)出大于5％，優(yōu)選情況下大于7％，更優(yōu)選情況下大于10％DPA/干生物質(zhì)的產(chǎn)量。
通過在培養(yǎng)后從微生物(生物質(zhì))和/或培養(yǎng)基中分離PUFAs，可以獲得高產(chǎn)量和高純度的PUFAs。
此外，本發(fā)明提供了生產(chǎn)生物質(zhì)的方法，其中生物質(zhì)是通過本發(fā)明的培養(yǎng)方法提供的。
該生物質(zhì)可以以所有可以想象得到的方式使用。具體來說，該生物質(zhì)可以以例如干燥的形式(干生物質(zhì))使用，直接作為食品或動物飼料使用。
此外，本發(fā)明還包括油狀的形式，它是通過實施本發(fā)明的培養(yǎng)方法，然后從微生物(生物質(zhì))和/或培養(yǎng)基中分離該油狀物而獲得的。
具體來說，這是除了許多其它優(yōu)選應用之外，可以方便地用于人類營養(yǎng)的油狀物。
在本發(fā)明的條件下，微生物每單位重量干生物質(zhì)表現(xiàn)出大于30wt％，優(yōu)選情況下大于35wt％油狀物的產(chǎn)量。
根據(jù)本發(fā)明，油狀物被理解為含有至少70％中性脂和至少2％磷脂，與本領域的專業(yè)人員所熟知的正常Thraustochytriales脂肪酸形式相一致。其中的中性脂含有至少80％的甘油三酯和其它化合物例如二酰基甘油、甾醇等。此外，甘油三酯的重量分數(shù)包括大約95％脂肪酸和5％甘油。在相當于不到10％典型海水鹽含量的如此低鹽濃度下發(fā)酵海洋微生物的可能性，特別是可完全免除添加在海水中占支配地位、一般來說占海水中可用離子的大約90％的Na+和Cl-離子這個事實，是絕對令人吃驚的。
令人吃驚的是，不僅發(fā)酵本身是可能的，而且當使用本發(fā)明的低鹽培養(yǎng)基時，生物質(zhì)中的PUFA比例顯著提高了。更令人吃驚的是，這種效應不僅補償而且超出了生物質(zhì)產(chǎn)量的輕微降低(實施例2)。與在培養(yǎng)基1(50％海水鹽含量)中進行的對比發(fā)酵相比，單位干生物質(zhì)的主要PUFA——DHA的比例增加了10％以上。較高的產(chǎn)物濃度和較低的鹽污染使得產(chǎn)品的加工簡化，所有這些在總體上提高了空間-時間產(chǎn)量。
在本發(fā)明以前，沒有已知的發(fā)酵工藝可用于在Thraustochytriales目的微生物中使用如此低鹽濃度并且不添加鈉和氯的培養(yǎng)基來生產(chǎn)n-3脂肪酸。
PUFAs是多不飽和長鏈脂肪酸，鏈長大于C12，含有至少兩個雙鍵?？梢园凑毡景l(fā)明的方法生產(chǎn)的PUFAs具體來說是n-3脂肪酸和n-6脂肪酸。
在本發(fā)明中，n-3脂肪酸(ω-3脂肪酸)被理解為多不飽和長鏈脂肪酸，鏈長大于C12，含有至少兩個或以上雙鍵，其中第一個雙鍵位于從烷基末端開始的C3和C4碳原子之間。因此，對于n-6脂肪酸來說，第一個雙鍵位于從烷基末端開始的C6和C7碳原子之間。
屬于Labyrinthulomycota組的微生物被考慮用于按照本發(fā)明的方法生產(chǎn)PUFAs。Thraustochytriales(Thraustchytriidea)目的微生物是優(yōu)選的(Lewis，T.E.，Nichols，P.D.，McMeekin，T.A.，Thraustochytrids的生物技術潛力，海洋生物技術，1999，580-587頁；和Porter，D，原生生物手冊中的網(wǎng)粘菌門動物、植物和真菌之外的真核微生物及其后裔的結(jié)構(gòu)、培養(yǎng)、棲息地和生活史藻類、纖毛蟲、有孔蟲、sprorozoa、水霉和其它原生生物指南。Margulis，L，Corliss，J.O.，Melkonian，M.和Chapman，D.J.主編，McKhann，H.I.協(xié)編，Jones and Bartlett Publishers，ISBN 0-86720-052-91990，388-398頁)。特別優(yōu)選的是Japonochytrium、Labyrinthuloides、Aplanochytrium Althornia、裂壺菌、破囊壺菌和Ulkenia屬的微生物。其中，裂壺菌、破囊壺菌和Ulkenia是最特別優(yōu)選的。特別優(yōu)選的是Japonochytrium sp.ATCC 28207，Thraustochytrium aureum(特別是ATCC 28211和ATCC 34304)，Thraustochytrium roseum ATCC 28210，Thraustochytrium sp.ATCC 20890、ATCC 20891、ATCC 20892和ATCC26185，Schizochytrium aggregatum ATCC 28209，Schizochytrium sp.ATCC20888和ATCC 20889，Schizochytrium SR21，以及Ulkenia sp.SAM 2179和SAM 2180。
適合用于本發(fā)明的方法的微生物可以是野生型的，也可以是突變體和從它們衍生的菌株以及相應生物的重組菌株。本發(fā)明特別包括了用于提高PUFA產(chǎn)量的突變或重組菌株。
本發(fā)明的微生物通過用這些生物體的預培養(yǎng)物接種液體或固體培養(yǎng)基來進行培養(yǎng)。
適合于Thraustochytriales目的微生物的培養(yǎng)技術對本技術領域的專業(yè)技術人員來說是眾所周知的。一般但不是絕對地來說，培養(yǎng)是通過在相應的容器中進行含水發(fā)酵來完成的。用于這種類型發(fā)酵的典型容器的例子包括搖瓶或生物反應器，例如STRs(攪拌釜式反應器)或泡罩塔。培養(yǎng)一般在溫度為10℃到40℃之間，優(yōu)選為20℃到35℃之間，特別優(yōu)選為25℃到30℃之間，更特別優(yōu)選為27℃和29℃之間進行，特別是在28℃下進行。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，低鹽培養(yǎng)基含有的總鹽少于1.5g/L。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，低鹽培養(yǎng)基的總鹽含量相當于海水鹽含量值的15％以下，優(yōu)選情況下相當于12％以下，更優(yōu)選情況下相當于10％以下。非常特別優(yōu)選的是總鹽含量為海水鹽含量的8％以下。
在低鹽培養(yǎng)基中不添加鈉鹽。在本發(fā)明的低鹽培養(yǎng)基中也不添加氯化物鹽類。
按照本發(fā)明，添加意味著以溶解和固體的形式加入。例如，按照本發(fā)明，加入海水，即使是最少量的海水，也屬于加入了鈉和氯鹽。在本發(fā)明的培養(yǎng)基中加入不常用的培養(yǎng)基成分，如果這些不常用的培養(yǎng)基成分中含有相應的鈉或氯離子，也被理解為加入了這些鹽。然而，對于本技術領域的專業(yè)人員來說很明顯的是，常用的(以及最需要的，即必需的)培養(yǎng)基成分水(自來水)、酵母提取物、玉米漿或類似物含有非常少量的、無法避免的鈉和氯。因此根據(jù)本發(fā)明，加入這樣的常用培養(yǎng)基成分不被理解為加入了鈉和氯鹽。
例如，酵母提取物含有少于2wt％的NaCl。因此，如果以常用量即10到20g/L之間，在培養(yǎng)基中加入酵母提取物，NaCl含量的增加少于0.2g/L。根據(jù)本發(fā)明這不被當作添加了NaCl。
在具體的優(yōu)選實施方案中，因此該培養(yǎng)基無鈉和/或氯鹽的添加。
低鹽培養(yǎng)基的總鈉含量在優(yōu)選情況下少于2g/L，在優(yōu)選情況下少于500mg/L，和非常特別優(yōu)選情況下少于150mg/L。低鹽培養(yǎng)基的總氯含量在優(yōu)選情況下少于2g/L，在優(yōu)選情況下少于500mg/L，和非常特別優(yōu)選情況下少于250mg/L。
Na離子和Cl離子的重量分數(shù)總和在特別優(yōu)選情況下少于1.75g/L。
此外，低鹽培養(yǎng)基優(yōu)選含有一種或多種碳源，以及一種或多種氮源。對于本技術領域的專業(yè)技術人員來說，可用做培養(yǎng)Thraustochytriales目的微生物的碳源和氮源的物質(zhì)是眾所周知的。
可以使用的碳源例如碳水化合物例如葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麥芽糖、可溶淀粉、巖藻糖、葡萄糖胺、葡聚糖、谷氨酸、糖蜜、甘油或甘露醇、或脂肪和油類或植物水解產(chǎn)物。
可以使用的天然氮源例如蛋白胨、酵母提取物、麥芽提取物、牛肉提取物、酪蛋白氨基酸、玉米漿或大豆，可以使用的有機氮源例如谷氨酸和尿素，無機氮源例如乙酸銨、碳酸氫銨、硫酸銨或硝酸銨也可以被用做氮源。
低鹽培養(yǎng)基可以含有本領域的專業(yè)技術人員所熟知的能夠協(xié)助Thraustochytriales目的微生物培養(yǎng)的所有其它成分，特別是例如Ca、Mg、K、Fe、Ni、Co、Cu、Mn、Mo或Zn的無機鹽?？梢粤信e的例子有磷酸鹽例如磷酸氫鉀，或碳酸鹽例如碳酸鈣，硫酸鹽例如硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鐵或硫酸銅。其它可以使用的無機鹽例如鹵化物，例如溴化鉀或碘化鉀。
在適合的情況下，培養(yǎng)基可以含有添加的大量或微量營養(yǎng)素，例如氨基酸、嘌呤、嘧啶、玉米漿、蛋白水解物、(水溶性和/或水不溶性的)維生素，以及其它本領域的專業(yè)技術人員所熟知的培養(yǎng)基成分。如果需要也可以加入消泡劑。培養(yǎng)基可以含有復雜成分，也可以是化學上確定的。
每種成分的量可以變化，只要對微生物的生長或生產(chǎn)率沒有負面影響就行。本領域的專業(yè)技術人員可以根據(jù)微生物的需要容易地確定每種情況下所需的成分。一般來說，碳源的添加濃度是50到300g/L，氮源的添加濃度為1到30g/L。在優(yōu)選情況下，氮的含量依賴于培養(yǎng)基中碳的含量來進行調(diào)整。
當情況允許的時候，特別優(yōu)選的低鹽培養(yǎng)基除了其它成分例如營養(yǎng)性成分之外，還含有至少一種鹽類，該鹽從含有硫酸鎂、碳酸鈣和磷酸鉀的組中選擇，其中每種鹽的添加濃度優(yōu)選不超過3g/L，特別優(yōu)選每種不超過1g/L，并且不超過本發(fā)明的總鹽含量。當硫酸鎂、碳酸鈣和磷酸鉀被添加到培養(yǎng)基中時，這是特別優(yōu)選的。
優(yōu)選的營養(yǎng)性成分是常用量的葡萄糖、酵母提取物和/或玉米漿以及其它本領域的專業(yè)技術人員所熟知的常用營養(yǎng)性成分。
培養(yǎng)基的pH值通過加入相應的酸或堿被設定在3到10的范圍內(nèi)，優(yōu)選為4到8，特別優(yōu)選為5到7，非常特別優(yōu)選為6。
然后將培養(yǎng)基進行滅菌。對培養(yǎng)基進行滅菌的技術對本領域的專業(yè)技術人員來說是熟知的，可以舉出的例子包括高壓滅菌和除菌過濾。
正如本領域的專業(yè)技術人員所通常了解的那樣，培養(yǎng)可以以分批培養(yǎng)、補料分批培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)的方式進行。
分批培養(yǎng)或補料分批培養(yǎng)進行的時間通常為1到12天，優(yōu)選為2到10天，特別優(yōu)選為3到9天。
培養(yǎng)基成分可以單獨地或作為混合物加入到低鹽培養(yǎng)基中，事先制備的混合物也能夠使用。培養(yǎng)基成分，特別是碳源和氮源或特別的培養(yǎng)基添加物可以在培養(yǎng)前或培養(yǎng)過程中加入。成分的加入可以重復一次或幾次，也可以連續(xù)地進行。
生產(chǎn)出的PUFA一般為中性脂肪的形式例如三酰甘油，或極性脂的形式例如磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺或磷脂酰肌醇。
但是對于本發(fā)明來說，術語PUFA、n-3脂肪酸或n-3活性物質(zhì)被理解為其中可以存在相應脂肪酸的所有可能的形式，即游離脂肪酸以及酯、甘油三酯、磷脂或其它衍生物。所有這些物質(zhì)都在下文中進行了概述，使用的術語具有同樣的意義。此外，在從培養(yǎng)物中分離之前或之后，PUFAs可以通過化學的或生物催化的轉(zhuǎn)酯反應方式進行轉(zhuǎn)化和濃縮，例如在適當?shù)拿?脂酶)的幫助下。
從發(fā)酵的微生物或培養(yǎng)基中分離PUFAs以及對脂肪酸形式的分析可以使用本領域的專業(yè)技術人員所熟知的常用方法來進行[Wanasundara，U.N.，Wanasundara，J.，Shahidi，F(xiàn).，ω-3脂肪酸濃縮物生產(chǎn)技術綜述，海洋食品—質(zhì)量、技術和營養(yǎng)藥物應用，2002，157-174頁]。


圖1顯示了DHA的生產(chǎn)與鹽濃度的依賴關系。在本發(fā)明的范圍內(nèi)的最大值可以被清楚地看見(數(shù)據(jù)來自實施例1)。
圖2顯示了生物質(zhì)和DHA含量與鹽濃度的依賴關系。在這種情況下在本發(fā)明的范圍內(nèi)的最大值也可以被清楚地看見(數(shù)據(jù)來自實施例1)。
構(gòu)成了本發(fā)明方法的基礎的發(fā)酵培養(yǎng)基在下文中以一些實施例的方式進行描述。然而，發(fā)酵培養(yǎng)基以及本發(fā)明并不限于這些實施例。
實施例1培養(yǎng)基中不同的鹽量對Ulkenia sp.SAM 2179生產(chǎn)PUFA的影響 SAM 2179菌株(Ulkenia sp.BP-5601；WO9803671)被培養(yǎng)在含有50ml培養(yǎng)基的300ml帶有擋板的錐形燒瓶中(溫度28℃，轉(zhuǎn)速150rpm)。
培養(yǎng)基1DH1培養(yǎng)基 單水葡萄糖(g/L)56.25 酵母提取物(g/L)12.5[Difco] Tropic Marin海鹽(g/L)16.65[Dr.Biener GmbH，Wartenberg，Germany] 用HCl將pH值調(diào)整到6.0 培養(yǎng)基2DH2培養(yǎng)基(不含鹽) 單水葡萄糖(g/L)56.25 酵母提取物(g/L)12.5[Difco] 用HCl將pH值調(diào)整到6.0 培養(yǎng)基1中的鹽(Tropic Marin)以下述的濃度使用1X(培養(yǎng)基1)，0.75X(培養(yǎng)基1.1)，0.5X(培養(yǎng)基1.2)，0.25X(培養(yǎng)基1.3)以及0.1X(培養(yǎng)基1.4)。
在培養(yǎng)48小時后通過離心收獲細胞。然后將細胞冷凍干燥并確定干生物質(zhì)。通過在10％甲醇鹽酸中于60℃熱處理2小時(同時攪拌)來進行細胞裂解和脂肪酸測定。酯通過氣相色譜進行分析以測定脂肪酸成分(Wanasundara，U.N.，Wanasundara，J.，Shahidi，F(xiàn).，ω-3脂肪酸濃縮物生產(chǎn)技術綜述，海洋食品-質(zhì)量、技術和營養(yǎng)藥物應用，2002，157-174頁)。
表1不同的鹽含量對發(fā)酵參數(shù)的影響
*)分別兩次實驗的平均值。
DBM干生物質(zhì)；DHA/DBM單位重量DBM中DHA(二十二碳六烯酸)的重量百分比；g/Lxd以每天每升的克數(shù)表示的空間-時間產(chǎn)率；h小時；CE對比例 表2不同的鹽含量對脂肪酸形式的影響
*)分別兩次實驗的平均值。
14:0肉豆蔻酸；15:0十五烷酸；16:0棕櫚酸；DPAω6二十二碳五烯酸(ω6)；DHAω3二十二碳六烯酸(ω3) 從大約50％到0％的海水鹽含量開始，對不同濃度的Tropic Marin海鹽而言，Ulkenia sp.SAM 2179菌株的發(fā)酵顯示出隨著培養(yǎng)基中鹽含量的減少，生物質(zhì)有減少的趨勢。但是，在大約5％海水的低鹽含量下進行的發(fā)酵，令人吃驚地表現(xiàn)出明顯的例外。在這里，生物質(zhì)的產(chǎn)生趨勢令人吃驚地表現(xiàn)出中間最大值，再次獲得了較高的值。此外，占優(yōu)勢的脂肪酸DHA在干生物質(zhì)中的比例隨著鹽酸濃度的降低而增加，并且也在5％海水鹽含量時獲得最大值，而更低鹽含量時又再次降低。對于主要的PUFA-DHA的空間-時間產(chǎn)率而言，這導致在大約5％海水鹽含量時獲得最大值(參見表1)。該最大值使得DHA的空間-時間產(chǎn)率增加了15％以上。DHA在總脂肪酸中的比例，在大約5％海水鹽含量的情況下略微低于較高或較低鹽含量的情況(參見表2)，但是DHA和脂肪酸或統(tǒng)稱的油的總產(chǎn)率正是在這一點處達到其最高水平(參見表1)?；谶@些令人吃驚的結(jié)果開發(fā)了作為本發(fā)明目的的低鹽培養(yǎng)基。
實施例2使用Ulkenia sp.SAM 2179在不同的發(fā)酵培養(yǎng)基中生產(chǎn)PUFA SAM 2179菌株被培養(yǎng)在含有50ml培養(yǎng)基的300ml帶有擋板的錐形燒瓶中(溫度28℃，轉(zhuǎn)速150rpm)。
培養(yǎng)基1DH1培養(yǎng)基 單水葡萄糖(g/L) 56.25 酵母提取物(g/L) 12.5[Difco] Tropic Marin海鹽(g/L) 16.65[Dr.Biener GmbH，Wartenberg，Germany] 用HCl將pH值調(diào)整到6.0 培養(yǎng)基2DH2培養(yǎng)基(不含鹽) 單水葡萄糖(g/L) 56.25 酵母提取物(g/L) 12.5[Difco] 用HCl將pH值調(diào)整到6.0 培養(yǎng)基3DH3培養(yǎng)基(含有鹽類補充物，無需添加鈉和氯) 單水葡萄糖(g/L) 56.25 酵母提取物(g/L) 12.5[Difco] 硫酸鎂(g/L) 1 碳酸鈣(g/L) 1 磷酸鉀(g/L) 1 用H2SO4將pH值調(diào)整到6.0 在培養(yǎng)48小時后通過離心收獲細胞。然后將細胞冷凍干燥并確定干生物質(zhì)。通過在10％甲醇鹽酸中于60℃熱處理2小時(同時攪拌)來進行細胞裂解和脂肪酸測定。酯通過氣相色譜進行分析以測定脂肪酸成分。
表3不同的鹽含量對發(fā)酵參數(shù)的影響 *)分別兩次實驗的平均值。**)分別三次實驗的平均值。
本發(fā)明的無鈉和氯添加的低鹽培養(yǎng)基首先被用于濃度大約為10％海水鹽含量的發(fā)酵中(培養(yǎng)基3)。從其獲得的生物質(zhì)與使用50％海水鹽含量的發(fā)酵相比略微降低，但是每干生物質(zhì)的DHA含量較高，從而令人吃驚地導致總體來說相等或甚至增加的空間-時間產(chǎn)率(參見表3)。這對于后面的加工生物質(zhì)獲得DHA的工藝來說相當有優(yōu)勢。因此，這令人吃驚地顯示出可在發(fā)酵中方便地完全省略掉鈉和/或氯(海水中的主要鹽類)的加入。
實施例3沒有添加鈉和氯的培養(yǎng)基中不同的鹽量對Ulkenia sp.SAM 2179生產(chǎn)PUFA的影響 SAM 2179菌株被培養(yǎng)在含有50ml培養(yǎng)基的300ml帶有擋板的錐形燒瓶中(溫度28℃，轉(zhuǎn)速150rpm)。
培養(yǎng)基3DH3培養(yǎng)基(含有不添加鈉和氯的鹽類補充物) 單水葡萄糖(g/L)56.25 酵母提取物(g/L)12.5[Difco]
用H2SO4將pH值調(diào)整到6.0 培養(yǎng)基3中的鹽以下述濃度使用10X含有每種10g/L，2X含有每種2g/L，1X含有每種1g/L，0.5X含有每種0.5g/L，或0.25X含有每種0.25g/L。
在培養(yǎng)48小時后通過離心收獲細胞。然后將細胞冷凍干燥并確定干生物質(zhì)。通過在10％甲醇鹽酸中于60℃熱處理2小時(同時攪拌)來進行細胞裂解和脂肪酸測定。酯通過氣相色譜進行分析以測定脂肪酸成分。
表4不同的鹽含量對發(fā)酵參數(shù)的影響 **)分別三次實驗的平均值。
通過在上述的含有不同鹽濃度的培養(yǎng)基中發(fā)酵微生物Ulkenia sp.2179菌株確定了不添加鈉和氯的發(fā)酵培養(yǎng)基的最適鹽濃度。在這種情況下，每干生物質(zhì)的DHA含量又是在5％海水鹽含量的情況下最高(也參見實施例1)。表示為空間-時間產(chǎn)率的生產(chǎn)率也在該鹽含量下獲得最適值(參見表4)。
實施例4使用Schizochytrium SR21菌株(Schizochytrium sp.，MYA-1381；EP0823475)在不同的發(fā)酵培養(yǎng)基中生產(chǎn)PUFA Schizochytrium SR21菌株被培養(yǎng)在含有50ml培養(yǎng)基的300ml帶有擋板的錐形燒瓶中(溫度28℃，轉(zhuǎn)速150rpm)。
培養(yǎng)基1DH1培養(yǎng)基 單水葡萄糖(g/L)56.25 酵母提取物(g/L)12.5[Difco] Tropic Marin海鹽(g/L)16.65[Dr.Biener GmbH，Wartenberg，Germany] 用HCl將pH值調(diào)整到6.0 培養(yǎng)基2DH2培養(yǎng)基(不含鹽) 單水葡萄糖(g/L)56.25 酵母提取物(g/L)12.5[Difco] 用HCl將pH值調(diào)整到6.0 培養(yǎng)基3DH3培養(yǎng)基(含有鹽補充物，無需添加鈉和氯) 單水葡萄糖(g/L)56.25 酵母提取物(g/L)12.5[Difco] 硫酸鎂(g/L) 1 碳酸鈣(g/L) 1 磷酸鉀(g/L) 1 用H2SO4將pH值調(diào)整到6.0 在培養(yǎng)48小時后通過離心收獲細胞。然后將細胞冷凍干燥并確定干生物質(zhì)。通過在10％甲醇鹽酸中于60℃熱處理2小時(同時攪拌)來進行細胞裂解和脂肪酸測定。酯通過氣相色譜進行分析以測定脂肪酸成分。
表5不同的鹽含量對發(fā)酵參數(shù)的影響 表6不同的鹽含量對脂肪酸形式的影響 本發(fā)明中描述的低鹽培養(yǎng)基在屬于Labyrinthulomycota的其它生物體中也導致了PUFA生產(chǎn)的最適化。因此，在不添加鈉和氯的低鹽培養(yǎng)基中發(fā)酵微生物Schizochytrium sp.SR21菌株是可能的。在這種情況下，相對于干生物質(zhì)的DHA含量在10％海水鹽含量時也有最適值。而且，此時出現(xiàn)了甚至更強的對DHA的空間-時間產(chǎn)率的影響，以及對發(fā)酵生產(chǎn)率的影響。在這種情況下，DHA相對于總脂肪酸的含量也略微減少了(參見表6)，盡管并沒有影響到驚人高的空間-時間DHA產(chǎn)率(參見表5)。構(gòu)成本發(fā)明基礎的低鹽培養(yǎng)基對于Labyrinthulomycota的不同成員引起了普遍的PUFAs生產(chǎn)的增加。
權利要求
1.一種培養(yǎng)Thraustochytriales屬微生物的方法，其中將微生物培養(yǎng)在不添加鈉鹽和氯鹽并且總鹽含量少于3.5g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基中。
2.權利要求1的方法，其中的微生物每單位重量干生物質(zhì)產(chǎn)生多于30wt％的油，在優(yōu)選情況下每單位重量干生物質(zhì)產(chǎn)生多于35wt％的油。
3.權利要求1或2的方法，其中向培養(yǎng)基中加入最多3g/L CaCO3，優(yōu)選加入1g/L。
4.前述權利要求任何一個的方法，其中的微生物每干生物質(zhì)產(chǎn)生多于10％，優(yōu)選情況下多于14％，及非常特別優(yōu)選情況下多于18％的DHA。
5.前述權利要求任何一個的方法，其中的微生物每干生物質(zhì)產(chǎn)生多于5％，優(yōu)選情況下多于7％，及非常特別優(yōu)選情況下多于10％的DPA。
6.前述權利要求任何一個的方法，其特征為使用低鹽培養(yǎng)基，其總鹽含量在小于海水鹽含量的15％，優(yōu)選情況下小于12％，特別優(yōu)選情況下小于10％，及非常特別優(yōu)選情況下小于8％的范圍內(nèi)。
7.前述權利要求任何一個的方法，其特征為低鹽培養(yǎng)基中包含的Na+和Cl-離子的重量分數(shù)之和少于1.75g/L。
8.前述權利要求任何一個的方法，其特征為低鹽培養(yǎng)基的總鈉含量少于150mg/L。
9.前述權利要求任何一個的方法，其特征為低鹽培養(yǎng)基的總氯含量少于250mg/L。
10.前述權利要求任何一個的方法，其特征為低鹽培養(yǎng)基含有葡萄糖、酵母提取物、硫酸鎂、碳酸鈣和磷酸鉀。
11.權利要求1到9的方法，其特征為低鹽培養(yǎng)基中含有葡萄糖、玉米漿、硫酸鎂、碳酸鈣和磷酸鉀。
12.權利要求10或11的方法，其特征為低鹽培養(yǎng)基中含有的硫酸鎂、碳酸鈣和磷酸鉀每種少于3g/L，特別優(yōu)選情況下每種少于1g/L。
13.前述權利要求任何一個的方法，其特征為低鹽培養(yǎng)基的pH值在3到10之間，優(yōu)選情況下在5到7之間。
14.前述權利要求任何一個的方法，其特征為培養(yǎng)在10℃和40℃之間進行，優(yōu)選情況下在25℃和35℃之間進行。
15.前述權利要求任何一個的方法，其特征為培養(yǎng)進行1到10天，優(yōu)選情況下進行3到9天。
16.前述權利要求任何一個的方法，其特征為微生物屬于裂壺菌(Schizochytrium)、破囊壺菌(Thraustochytrium)或Ulkenia屬。
17.前述權利要求任何一個的方法，其特征為微生物是Ulkenia sp.SAM 2179。
18.前述權利要求任何一個的方法，其特征為微生物是Schizochytrium sp.SR 21。
19.含有至少10％DHA的油，其使用權利要求1到18任何一個的方法生產(chǎn)，并隨后從培養(yǎng)液和/或其中獲得的生物質(zhì)中分離油。
20.含有至少5％DHA的油，其使用權利要求1到18任何一個的方法生產(chǎn)，并隨后從培養(yǎng)液和/或其中獲得的生物質(zhì)中分離油。
21.純度至少為90％的DHA，其使用權利要求1到18任何一個的方法生產(chǎn)，并隨后從培養(yǎng)液和/或其中獲得的生物質(zhì)中分離DHA。
22.純度至少為90％的DPA，其使用權利要求1到18任何一個的方法生產(chǎn)，并隨后從培養(yǎng)液和/或其中獲得的生物質(zhì)中分離DPA。
23.通過權利要求1到18任何一個的方法生產(chǎn)，并隨后從培養(yǎng)液中分離的生物質(zhì)。
24.含有權利要求23的生物質(zhì)的動物飼料。
25.含有權利要求23的生物質(zhì)的人類營養(yǎng)食品。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于培養(yǎng)Thraustochytriales屬微生物的最適化方法，按照該方法將微生物培養(yǎng)在不添加鈉鹽和氯鹽并且總鹽含量少于3.5g/L(相當于少于海水鹽含量的10％)的低鹽培養(yǎng)基中，隨后從微生物和/或培養(yǎng)基中分離PUFAs。本發(fā)明特別涉及具有大大降低的總鹽含量，尤其是特別降低的NaCl含量的新的最適化培養(yǎng)基。通過使用不同鹽類的新的組合物作為培養(yǎng)基的成分，可以極大地增加并顯著簡化PUFAs的生產(chǎn)，而這種培養(yǎng)基中離子的總重量比率不超過1.75g/L。此外，在優(yōu)選情況下該培養(yǎng)基中完全不添加鈉鹽和氯鹽，這有助于防止由含有鹽的廢水所引起的環(huán)境破壞。
文檔編號C12N1/12GK1977038SQ20048003583
公開日2007年6月6日 申請日期2004年11月10日 優(yōu)先權日2003年11月10日
發(fā)明者馬西亞斯·魯辛, 馬爾庫什·盧伊 申請人:努特諾瓦營養(yǎng)產(chǎn)品及食品成分有限公司