專利名稱：均相多重篩選分析方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及體外均相多重分析方法，尤其包括均相擴增分析方法，以篩選生物樣品中大量核酸序列中的任何一種的存在。
背景技術(shù)：
現(xiàn)在已經(jīng)有多種分析技術(shù)可以用于測定各種不同來源的生物樣品中核酸序列的存在，其中上述核酸序列的存在指示著如特定的細(xì)菌、病毒或其它病原體，包括特定株系或變種的存在。上述分析也可以用于測定樣品中測試對象自身基因組DNA的核酸序列的存在，該核酸序列的存在指示著例如某種或其它疾病-相關(guān)基因的突變的存在。分析包括帶有可檢測標(biāo)記，例如P32或熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針?？梢灾苯犹綔y到樣品中的核酸，即DNA或RNA?？蛇x擇的，分析可以包括使用幾種擴增技術(shù)的任意一種擴增靶序列，例如，PCR，NASBA或TMA。可以應(yīng)用嵌入染料，如SYBR綠，或熒光標(biāo)記的探針，如5’核酸酶探針(Livak，K.J.等，1995，Oligonucleotides with fluorescent Dyesat Opposite Ends Provide a Quenched Probe System Useful forDetecting PCR Product and Nucleic Acie Hybridization，PCRMeth.Appl.4357-362)、二元FRET探針(Espy，M.J.等，2002，Detection of Vaccinia Virus，Herpes SimplexVirus，Varicella-Zoster Virus，and Bacillus anthracis byLightCycler Polymerase Chain Reaction afterAutoclavingImplications for Biosafety of BioterrorismAgents，Mayo Clin.Proc.77624-628)、或分子信標(biāo)(beacon)探針(Tyagi，S.和Kramer，F(xiàn).R.，1996，Molecular BeaconsProbes thatFluoresce upon Hybridization，Nature Biotechnol.14303-308；Tyagi，S.等，1998，Multicolor Molecular Beacons for AlleleDiscrimination，Nature Biotechnol.1649-53)。已經(jīng)使用TaqMan二元-標(biāo)記的線性探針和5’核酸酶檢測方法，以及可選擇的，使用PCR擴增和分子信標(biāo)探針證明了用PCR擴增的實時多重分析，參見Tyagi.S等，1998，如上所述；Vet，J.A.等，1999，Multiplex Detection ofFour Pathogenic Retroviruses Using MolecularBeacons，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 966394-6399；El-Hajj，H.等，2001，Detection of Rifampin Resistance in Mycobacteriumtuberculosis in a Single Tube with MolecularBeacons，J.Clin.Microbiol.394131-4137?，F(xiàn)在所使用的基于熒光的多重分析僅限于每個樣品中大約8種靶序列，只有這樣才能避免熒光團(tuán)發(fā)射光譜的交疊，因此上述方法不能用于高度多重篩選分析。
高度多重分析依賴于靶的空間分隔，以便于分辨信號。空間分隔使得能夠應(yīng)用將不同顏色熒光團(tuán)進(jìn)行組合(組合編碼)、將每種熒光團(tuán)按不同量進(jìn)行組合(比率編碼)、和兩者結(jié)合的編碼方案。利用空間分隔的一種分析方法的實例是熒光原位雜交、或用于染色體分析的FISH。例如Speicher等，1996，Karyotyping Human Chromosomes byCombinatorial Multi-fluor FISH，Nature Genet.12368-375，報道了一種用于染色體分布分析的方法，其中使用了27個由六個不同熒光團(tuán)的組進(jìn)行組合標(biāo)記的探針。類似的，細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄位點的分隔同樣使得能夠應(yīng)用組合編碼以及比率編碼，其中對于每個位點可以使用多重、單一標(biāo)記的探針。Singer，R.H.，國際(PCT)專利申請WO 00/65094；Levsky，J.M.等，2002，Single-Cell Gene ExpressionProfiling，Science 297836-840。另外一種空間-分隔探針技術(shù)是使用多重探針陣列，包括DNA芯片上的陣列。Schena，M.等，1995，Quantitative Monitoring of Gene Expression Patternswith aComplementary DNA Microarray，Science 20467-470；Gingeras，T.R.等，1998，Simultaneous Genotyping and SpeciesIdentification Using Hybridization Pattern RecognitionAnalysis of Generic Mycobacterium DNA Arrays.Genet.Res.8435-448；Han等，2001，Quantum-Dot-TaggedMicrobeads for Multiplexed Optical Coding ofBiomolecules，Nature Biotechnol.19，631-635。另外一種空間分隔技術(shù)是通過電泳將不同長度的連接探針對進(jìn)行分離。Tong，A.K.等，2001，Combinatorial Fluorescence Energy Transfer Tags forMultiplex Biological Assays，Nature Biotechnol.19756-759。在上述方法中，使用了寡核苷酸連接分析(“OLA”)的變化形式，用于SNP檢測，過程是將帶有不同標(biāo)記的探針連接到捕獲核酸靶的探針上，將雜交分子固定、洗滌、釋放，并通過電泳使其彼此分離，然后讀取每個探針的熒光代碼，其是顏色和比例的組合。陣列方法和電泳方法在技術(shù)上是復(fù)雜的，需要許多單獨的步驟，包括擴增、雜交、洗滌和分析。
雖然需要這樣一種適用于高度多重篩選分析的技術(shù)，但是迄今為止還沒有這樣的均相熒光雜交分析技術(shù)。例如，在使用蛋白酶抑制劑抑制HIV-1病毒的過程中，隨著處理時間的推移，可能增生出大約30種的突變，并且需要改變療法。Hirsch，M.S.等(1998)，Antiretroviral Drug Resistance testing in Adults withHIV Infection，JAMA 2791984-1991。在缺少高度多重篩選分析技術(shù)的情況下，現(xiàn)在的做法是隨著患者的病毒負(fù)荷增加，對不同的病毒樣本進(jìn)行測序。但是因為所發(fā)生的突變不僅僅是存在的等位基因，因此通過測序進(jìn)行分析是很困難。另外在對某個帶有特定癥狀如發(fā)熱的患者的最初診斷過程中，現(xiàn)在還沒有可以利用的高度多重均相分析方法，以篩選出導(dǎo)致患者上述癥狀的多種可能的感染因素之一的早期指標(biāo)。
本發(fā)明的一個方面是提供高度多重均相分析方法，用于篩選樣品中核酸靶序列的存在，其中所述樣品中存在至少10種和60種之多或更多的核酸靶序列，在所述的分析方法中可以使用常規(guī)的熒光檢測儀器和技術(shù)，以及熒光標(biāo)記的雜交探針。
本發(fā)明的另外一個方面是提供如下的篩選分析方法，其中應(yīng)用靶擴增、任選應(yīng)用實時檢測，該篩選分析方法能夠檢測原本無菌的樣品如血液中所存在的少量的病原體。
本發(fā)明的另外一個方面是提供用于實施本發(fā)明特定篩選分析的試劑盒和寡核苷酸組。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明的分析方法是適用于篩選的高度多重分析方法。術(shù)語“高度多重”是指一種分析，其能夠檢測至少6種，優(yōu)選至少10種，和在某些實施方案中30-60種，甚至更多種的靶序列。
根據(jù)本發(fā)明的分析方法是熒光標(biāo)記的均相體外核酸分析方法，其中使用雜交探針。術(shù)語“均相”是指在溶液中實施對核酸靶的檢測，不需要將核酸靶進(jìn)行空間分隔，同時不需要洗去未結(jié)合的雜交探針。從反應(yīng)混合物自身接受熒光信號。優(yōu)選的實施方案包括靶擴增，通過例如PCR或NASBA，從而使之能夠檢測樣品中的少量病原體。在擴增過程中，需要將反應(yīng)容器如微量離心管進(jìn)行熱密封，以防止與其它同時測定的樣品、未測定的樣品、裝置和工作者的相互污染。
在根據(jù)本發(fā)明的分析中，檢測采用的是熒光標(biāo)記的核酸雜交探針。熒光標(biāo)記，當(dāng)被激發(fā)時，能夠發(fā)射出電磁波譜的可見、紫外或近紅外部分。每種探針均特異于所篩選中的多個靶中的一個。如果分析和設(shè)計的目的是區(qū)分細(xì)菌物種，則可以設(shè)計針對細(xì)菌物種的探針，例如針對結(jié)核分枝桿菌保守區(qū)的探針，或設(shè)計雜交到同一細(xì)菌物種多個株的不相同序列的探針。另一方面，如果檢測的目的是區(qū)分株系或突變等位基因，則可以設(shè)計針對可變區(qū)的探針，以提供必要的區(qū)別特征并使探針對株特異。本發(fā)明優(yōu)選使用的探針是分子信標(biāo)探針，這樣可以根據(jù)分析的需要，使上述探針具有錯配耐受性或錯配不耐受性。正如本領(lǐng)域所公知的，在探針設(shè)計和選擇靶序列上要尋求平衡，將假陽性和假陰性降至最小。
多重能力的取得依靠的是組合編碼，加入或優(yōu)選不加入比率編碼，其中使用一組不同的熒光團(tuán)。在組合代碼中，每種代碼元件通過自身不同標(biāo)記的獨特模式而加以鑒別，在本申請中是顏色。在組合代碼中，一種代碼元件可以包括每個代碼元件最多四種不同的熒光團(tuán)。上述不同的熒光團(tuán)來源于具有至少四個不同熒光團(tuán)的組，更優(yōu)選的具有4-8個不同熒光團(tuán)的組。組合代碼可以是二元編碼，其中代碼元件包含兩種顏色，任選地，其可以被由其中一種顏色組成的其它代碼元件放大。組合代碼可以是三元編碼，其中代碼元件包含三種顏色，任選地，其可以被由其中兩種顏色組成的其它代碼元件放大(即三元代碼與二元代碼的組合)，同時任選地，其可以被由其中一種顏色組成的代碼元件放大。組合代碼可以是四元編碼，其中代碼元件包含四種顏色，任選地，其可以被由其中三種顏色、二種顏色或一種顏色或其任意組合后形成的其它代碼元件放大。
并非用多種顏色標(biāo)記單個探針以使探針具有作為代碼元件的模式，而是將每個探針細(xì)分為所需數(shù)目的部分，每一部分均經(jīng)過標(biāo)記以發(fā)射出不同的顏色信號。然后將上述各部分混合在一起形成一個探針，當(dāng)該探針與靶雜交時，將會包括該代碼元件所具有的獨特的顏色模式。
對于最優(yōu)選的淬滅探針，如分子信標(biāo)探針，每部分均能夠發(fā)射單色。對于較不優(yōu)選的用兩種不同的相互作用熒光團(tuán)標(biāo)記的探針，如5’-核酸酶探針，其中一種選擇是利用一種共有的短波熒光團(tuán)(在本申請中稱為“接受”熒光團(tuán))，來改變長波熒光團(tuán)(在本申請中稱為“發(fā)射”熒光團(tuán))，并且檢測后者的信號變化。在這種情況下，每一部分將發(fā)射出不同顏色的信號。另外一種選擇正好相反，也就是說，利用共有的發(fā)射熒光團(tuán)來改變接受熒光團(tuán)，并且檢測后者的信號變化。在這種情況下，每一部分也是發(fā)射出不同顏色的信號，但是對于編碼目的來說，它是變成被檢測的發(fā)射基團(tuán)的接受基團(tuán)。但是，第三種選擇是同時改變上述兩種熒光團(tuán)，檢測兩者發(fā)射的變化比率，因此第一部分的信號可能是比率a/b，第二部分的比率可能是c/d，第三部分的比率可能是e/f，其中a，b，c，d，e和f是可以辨別的熒光團(tuán)。在上述情況下，長波熒光團(tuán)被改變，同時可以認(rèn)為這種改變是從任意給定探針部分獲得的信號的表征。為了便于理解，本申請和附圖中的組合代碼的描述大體描述了一些實施方案，其中人們可以檢測每一探針部分所發(fā)射出的特定顏色，其中該特定顏色是發(fā)射熒光團(tuán)的表征。應(yīng)當(dāng)理解的是，該教導(dǎo)同樣適用于利用比率的實施方案，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)⑦@些教導(dǎo)用于那些實施方案。
例如，如果由8種不同的熒光團(tuán)的組開始，并且選擇將每個探針細(xì)分為四部分，對四個部分用不同的顏色標(biāo)記，則代碼簿包括多至70種不同的組合；如果以相同大小的熒光團(tuán)組開始，但將探針細(xì)分為三部分，對三個部分用不同的顏色標(biāo)記，則包括多至56種不同的組合；如果以相同大小的熒光團(tuán)組開始，但將探針細(xì)分為兩部分，對兩部分用不同的顏色標(biāo)記，則包括多至28種不同的組合。由四種顏色、三種顏色和兩種顏色組成的代碼可以彼此組合使用，同時也可以與一種顏色的代碼組合使用，但是，本發(fā)明最優(yōu)選的實施方案不包括這樣的組合。在比率編碼中，用區(qū)分量的相同標(biāo)記進(jìn)行區(qū)別。本發(fā)明的組合代碼可以用比率代碼增強，比率代碼優(yōu)選是整數(shù)比率代碼也就是如2∶1、3∶1、4∶1或5∶1的整數(shù)比率，反之亦然。優(yōu)選的，分子信標(biāo)探針的各個部分用非-熒光淬滅劑和單信號-顏色熒光團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記，最優(yōu)選的，不加入比率編碼，其中的原因?qū)⒃谙旅娼o予解釋。
如上所述，本發(fā)明的分析方法是均相檢測分析方法。不需要將靶進(jìn)行分隔。也不需要將未結(jié)合探針與結(jié)合靶的探針進(jìn)行分離。因此在本發(fā)明的分析方法中，必須要有可檢測的信號變化，這種變化指示著探針與靶的雜交。優(yōu)選的分子信標(biāo)探針，在測定方法中的檢測溫度下自由漂浮時是高度淬滅的，但是當(dāng)與各自的靶雜交時卻能夠改變構(gòu)象并發(fā)出熒光。另外還有一類探針，其熒光通過與其靶的雜交恢復(fù)，這種探針通常適用于本發(fā)明的分析，這種探針稱為“陰-陽”探針，這是一種生物分子探針，在靶互補鏈上用熒光團(tuán)標(biāo)記，同時在競爭鏈上存在淬滅劑。Li，Q.等(2002)，A New Class of Homogeneous NucleicAcid Probes Based on Specific Displacement Hybridization，Nucleic Acids Res.30e5。其它探針分析方案，導(dǎo)致熒光信號的改變，指示探針與靶雜交。在5’-核酸酶檢測方法中，用兩種不同的熒光團(tuán)對線性(或隨意盤繞)探針進(jìn)行末端標(biāo)記，在自由漂浮狀態(tài)下，兩種熒光團(tuán)通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)而相互作用，但是在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增過程中，在引物延伸中被切斷，從而導(dǎo)致信號改變(較短波長的熒光團(tuán)發(fā)射量增大，較長波長的熒光團(tuán)發(fā)射量降低，因此兩者的比率發(fā)生變化)。Livak，K.J.等(1995)，如上所述。另外一種體系，稱為LightCycler探針，其工作模式正相反。每種探針是一對熒光標(biāo)記的線性寡核苷酸，在靶上的雜交是鄰近的，可以通過FRET而相互作用，由此產(chǎn)生信號變化(較短波長的熒光團(tuán)發(fā)射量降低，而較長波長的熒光團(tuán)發(fā)射量增加，因此兩者的比率發(fā)生變化)。Espy，M.J.等(2001)，如上所述。對于FRET體系，申請人將較短波長的熒光團(tuán)稱作“接受者”，將較長波長的熒光團(tuán)稱作“發(fā)射者”。然而，由于FRET淬滅過程所導(dǎo)致的背景信號顯著高于接觸-介導(dǎo)的淬滅過程(在使用分子信標(biāo)探針和陰-陽探針時通常會采用接觸-介導(dǎo)的淬滅過程)(Tyagi等，1998，如上所述；Marras，S.A.E.等，2002，Efficiencies ofFluorescence Resonance Energy Transfer and Contact-MediatedQuenching in Oligonucleotide Probes，Nucleic AcidsRes.30e122)，因此本發(fā)明的篩選分析并不優(yōu)選上述FRET淬滅過程。本發(fā)明的分析優(yōu)選采用通過接觸-介導(dǎo)淬滅過程進(jìn)行淬滅的探針，如分子信標(biāo)探針或陰-陽探針。本發(fā)明最優(yōu)選的探針是包括非-熒光淬滅劑的分子信標(biāo)探針。這些探針是最優(yōu)選的，這不僅僅是因為其具有較低的背景信號，還因為它們對于應(yīng)用到多元體系來說，在設(shè)計上是容易的。Bonnet，G.等(1998)，Thermodynamic Basis of the EnhancedSpecificity of Structured DNA Probes，Proc.Natl.Acad.Sci.USA966171-6176。
本發(fā)明的分析方法包括但不限于應(yīng)用了靶擴增的實施方案。有幾種指數(shù)擴增技術(shù)是公知的。其中之一是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，其包括熱循環(huán)、和等溫擴增方案，如基于核酸序列的擴增(NASBA)、鏈-置換擴增(SDA)、轉(zhuǎn)錄-介導(dǎo)的擴增(TMA)、滾環(huán)擴增(RCA)和分枝擴增方法(RAM)。擴增分析的實施方案可以利用終點檢測或?qū)崟r檢測。優(yōu)選在如密封管的密封環(huán)境下和存在雜交探針的條件下實施擴增，以減少樣品間交叉污染的可能性，一般在敞開的樣品管中進(jìn)行擴增會導(dǎo)致交叉污染。
雖然不限制樣品來源，但根據(jù)本發(fā)明的分析方法優(yōu)先使用人或動物樣品，有時是指無菌的樣品，如血液、組織或腦脊液。與如唾液、糞便或環(huán)境樣品相比，上述樣品具有一定的優(yōu)點，因為上述樣品所包含的可能潛在干擾擴增和檢測的無關(guān)DNA序列更少。已知在患者血液中可以發(fā)現(xiàn)至少小量的一些病原體，即使在由于細(xì)菌感染導(dǎo)致的膿毒綜合征中也是如此。在具體的篩選分析方法可以允許選擇的情況下，優(yōu)選使用正常的無菌來源，而不優(yōu)選非-無菌來源。
根據(jù)本發(fā)明的某些擴增分析方法，有利地使用引物來擴增所有或一部分所要篩選的核酸靶。當(dāng)篩選突變時，在特定的感興趣的可變核酸序列內(nèi)可能存在多個可能突變，使用位于該區(qū)域側(cè)翼的一對引物可以擴增所有可能的突變。這些所謂的“通用引物”中的一些能夠與多個物種的保守區(qū)結(jié)合，并且用于擴增多個靶，例如不同細(xì)菌的某些基因。參見如，Kox，L.F.F.等(1995)，PCR Assay Based on DNA Codingfor 16S rRNA for Detection and Identification of Mycobacteriain Clinical Samples.J.Clin.Microbiol.333225-3233；Iwen，P.C.等(1995)，Evaluation of Nucleic Acid-Based Test(PACE 2C)forSimultaneous detection of Chlamydia trachomatis and Neisseriagonorrhoeae in Endocervical Specimens，J.Clin.Microbiol.332587-2591；Yang，S.等(2002)，QuantitativeMultiprobe PCR Assay for Simultaneous Detection andIdentification to Species Level of BacterialPathogens，J.Clin.Microbiol.403449-3454；Schonhuber，W.等(2001)，Utilization of mRNA Sequences for BacterialIdentification，BMC Microbiol.12；Wong，R.S.和Chow，A.W.(2002)，Identification of Enteric Pathogens by HeatShock Protein 60kDa(HSP 60)Gene Sequences，F(xiàn)EMSMicrobiol.Lett.206107-113。對于具體篩選分析，一對，更可能兩對或三對引物是足夠的。
本發(fā)明還包括用于實施本發(fā)明的特定多重篩選分析的分析試劑盒。試劑盒至少包括檢測探針的互補序列。我們將寡核苷酸的集合稱為“寡核苷酸組”。當(dāng)分析是擴增分析，如PCR分析時，寡核苷酸組優(yōu)選還包括擴增所需的引物。還可以包括任意的可擴增對照序列。試劑盒可以包括其它的分析試劑，如酶、擴增緩沖液和如果需要，包括用于分離核酸的樣品制備試劑；也就是說，直至包括所有的實施上述分析，從樣品制備一直到檢測所需的試劑。
本發(fā)明的基于熒光的篩選分析一般要與檢測儀器相適應(yīng)，檢測儀器有可能具有熱循環(huán)能力。儀器可以使用單波長光源或多波長光源，例如白光與可選擇濾光器的組合、多激光光源或多光發(fā)射二極管光源。檢測儀器在區(qū)分多熒光團(tuán)的發(fā)射光的能力方面是不同的，在選擇用于具體分析的熒光團(tuán)足時要充分考慮。在本發(fā)明分析方法的優(yōu)選實施方案中，每個探針的熒光團(tuán)的發(fā)射在強度上是平衡的，這樣細(xì)分部分的強度是接近的，這樣有利于鑒別。不同的熒光團(tuán)在強度上是不同，不同的靶序列對于探針雜交的可接近性是不同的，儀器對不同波長的反應(yīng)可能也是不同的?？梢愿淖兏鞑糠值南鄬α恳垣@得平衡。如果可能，優(yōu)選探針的所有所有部分均是平衡的，以便于鑒別。上述分析的結(jié)果可以由計算機程序?qū)崟r進(jìn)行自動解碼和編譯，以保證分析的高度精確，并以臨床診斷設(shè)置，以自動化、高通量方式進(jìn)行。
結(jié)合附圖和下面的說明書對本發(fā)明的一個或多個實施方案的詳細(xì)內(nèi)容進(jìn)行說明。根據(jù)說明書和附圖以及權(quán)利要求書，人們可以很清楚了解本發(fā)明所具有的其它的特征、目的和優(yōu)點。


圖1是一個表，顯示每個探針使用兩種或三種顏色和一組4-8種可區(qū)分的熒光團(tuán)所得到的可區(qū)分組合的數(shù)目。
圖2顯示實時擴增分析的熒光發(fā)射結(jié)果，其中表明在測試樣品中存在單一靶序列(是所設(shè)計的分析中要檢測的多個可能的靶序列中的一種)，和一種探針(用熒光強度相同的三種不同的顏色標(biāo)記)，其是試驗混合物中與擴增的靶序列結(jié)合的多個探針中的一種。
圖3顯示實時擴增分析的熒光發(fā)射結(jié)果，其中表明在測試樣品中存在兩種濃度不同的靶序列，以及兩種與擴增靶的序列結(jié)合的探針(每一種探針是用熒光強度相同的三種不同顏色的不同組合進(jìn)行標(biāo)記的，兩種探針沒有相同的顏色)。
圖4顯示實時擴增分析的熒光發(fā)射結(jié)果，其中表明在測試樣品中存在兩種濃度不同的靶序列，以及兩種與擴增靶的序列結(jié)合的探針(每一種探針是用熒光強度相同的三種不同顏色的不同組合進(jìn)行標(biāo)記的，兩種探針具有一種相同的顏色)。
圖5顯示實時擴增分析的熒光發(fā)射結(jié)果，其中表明在測試樣品中存在濃度相同的兩種不同靶序列，兩種探針(按照圖6a所示的第一種三色代碼簿進(jìn)行標(biāo)記)具有兩種相同的顏色，導(dǎo)致結(jié)果的明確解釋。
圖6a和6b包含表，顯示用于檢測樣品中十種不同的可能靶的可供選擇的探針編碼方案的影響，其中所采用的每一探針均是用熒光強度相同的三種不同的顏色進(jìn)行標(biāo)記的，選自五種不同的熒光團(tuán)，所述影響是針對在測試樣品中存在相同濃度的兩種不同靶的情況下，45種組合中的每一種所獲得的結(jié)果。
圖7顯示實時擴增分析的熒光發(fā)射結(jié)果，其中表明在測試樣品中存在濃度相同的兩種不同的靶序列，兩種探針(按照圖6a所示的第一種三色代碼簿進(jìn)行標(biāo)記)具有一種相同的顏色，得到明確的結(jié)果。
圖8顯示實時擴增分析的熒光發(fā)射，其中利用按照圖6b所示的第二種三色代碼簿標(biāo)記的探針重新檢測圖7所示分析中使用的相同樣品，提供了利用替代性編碼方案的第二種測定如何能夠分辨明確的結(jié)果的例子。
發(fā)明詳述圖1的表顯示本發(fā)明所使用的某些組合編碼方案。表的上部表示從4、5、6、7、或8種熒光團(tuán)的組中選擇兩種不同的熒光團(tuán)對每種探針進(jìn)行不同的標(biāo)記，所得到的代碼數(shù)量。如果該組包括8種熒光團(tuán)，則有28種可能的代碼。表的下部表示從上述5、6、7或8熒光團(tuán)的組中選擇三種不同的熒光團(tuán)對每種探針進(jìn)行不同的標(biāo)記，所得到的代碼數(shù)量。如果該組包括8種熒光團(tuán)，有56種可能性。根據(jù)本發(fā)明的分析，每種探針帶有兩種或三種(有時四種)不同標(biāo)記的部分，并且一組熒光團(tuán)的數(shù)目足以得到至少6種不同編碼的探針。可以通過如下的實施方案實現(xiàn)，例如，將表的兩部分組合起來，也就是同時使用兩種顏色的代碼和三種顏色的代碼。例如，如表底部所列出的，可以將探針細(xì)分成三部分，用于五種熒光團(tuán)的組，提供最多十種不同編碼的探針，并且可以將另外的探針細(xì)分成兩部分，用于五種熒光團(tuán)的組，提供最多十種另外的不同編碼的探針。通過上述方式，在同一分析混合物中組合了20種不同編碼的探針。
根據(jù)本發(fā)明的分析對于一種靶采用一種探針(探針可以是單分子探針，如分子信標(biāo)探針或TaqMan探針，或雙分子探針，如陰-陽探針或LightCycler探針對)。除由單顏色表示的代碼元件外，將探針細(xì)分成各部分，然后根據(jù)來自至少4種，優(yōu)選5-8種可區(qū)分的熒光團(tuán)組的組合代碼或組合-加-比率代碼，對上述各部分進(jìn)行標(biāo)記，從而完成編碼。為了示例，使用我們優(yōu)選的分子信標(biāo)探針，探針的每一部分均設(shè)計為具有不同的顏色標(biāo)志。某些探針也可以是波長-轉(zhuǎn)換探針，也就是探針的一個臂標(biāo)記有淬滅基團(tuán)，而另外一個臂標(biāo)記有FRET對，其中FRET對包含“接受”熒光團(tuán)和“發(fā)射”熒光團(tuán)，其中的“接受”熒光團(tuán)吸收來自激發(fā)光源的能量并將能量轉(zhuǎn)移給“發(fā)射”熒光團(tuán)，當(dāng)探針處于其開放構(gòu)型時，“發(fā)射”熒光團(tuán)在其自身的更長的特征性波長光譜強烈發(fā)射熒光。我們使用波長-轉(zhuǎn)換探針時，所使用的儀器帶有單波長光源，該光源不被發(fā)射更長波長的可見熒光的熒光團(tuán)，例如德克薩斯紅(Texas Red)高度吸收。參見Tyagi，S.等(2000)，Wavelength-Shifting Molecular Beacons，NatureBiotechnol.18:1191-1196；E1-Hajj，H.等(2001)，如上所述。另外也可以通過接觸-介導(dǎo)的淬滅過程，利用一種熒光團(tuán)淬滅另外一種熒光團(tuán)。存在兩種另外的可能性。第一種，在使用的體系中具有相對低的發(fā)射的熒光團(tuán)可以被放置在每個臂上，以便當(dāng)探針關(guān)閉時，熒光團(tuán)彼此淬滅，但當(dāng)探針雜交到靶上并且開放時，兩者發(fā)射同樣顏色的熒光，增加其強度。這項技術(shù)可以用于添加比率代碼到組合代碼中。第二種，在探針的兩個臂上放置不同的熒光團(tuán)，使探針的一部分?jǐn)y帶兩種代碼元件(顏色)，這樣當(dāng)探針關(guān)閉時，熒光團(tuán)彼此淬滅，但當(dāng)探針雜交到靶上并且開放時，每一熒光團(tuán)均發(fā)射出具有自身的特征性發(fā)射光譜的熒光。這可以用于將兩部分組合為一部分，由此可以減少兩種顏色、三種顏色或四種顏色代碼元件所需的不同部分的數(shù)量。這相當(dāng)于具有分離的部分。因為非-熒光淬滅劑的淬滅過程比熒光團(tuán)的淬滅過程更加有效，還因為在同一分子中如果存在兩種發(fā)射熒光團(tuán)，則由于相對濃度的問題而無法實現(xiàn)強度平衡，因此，在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，在分子信標(biāo)探針的一個臂上采用非-熒光淬滅劑。Dabcyl是一種優(yōu)選的淬滅劑，代碼為Black Hole Quencher No.2。
本發(fā)明的“代碼簿”采用每個探針?biāo)姆N顏色，每個探針三種顏色，每個探針兩種顏色，或每個探針?biāo)姆N、三種或兩種顏色的組合，采用或不采用單-顏色探針。優(yōu)選的代碼簿是每個探針僅四種顏色，每個探針僅三種顏色或每個探針僅兩種顏色。優(yōu)選這些方案的理由是，在特定PCR循環(huán)中產(chǎn)生的一種顏色的表現(xiàn)，表明在分析制備物中存在一種錯誤。如果使用單-顏色探針，這樣的錯誤就不明顯。在本發(fā)明的一些實施方案中，可以用比率編碼補充組合編碼，以提高代碼元件的數(shù)量或可能性。優(yōu)選的比率是整數(shù)，從5∶1到1∶5，優(yōu)選從3∶1到1∶3。比率編碼最適用于以下篩選分析，其中極有可能只存在一種靶。原因是，當(dāng)代碼是嚴(yán)格意義上的組合代碼并且存在兩種或多種靶的情況下，強度水平的變化有助于解決在分析發(fā)射光譜過程中所存在的不確定性。因此，在不太可能只存在一種靶的優(yōu)選分析中，使用嚴(yán)格意義上的組合代碼。
在熒光團(tuán)組中可以包括多種不同的熒光團(tuán)。某些熒光團(tuán)具有相對窄的發(fā)射光譜，例如，Vic，Alexa 488和量子點(quantum dots)(Gao等，2002，Quantum-Dot Nanocrystals for UltrasensitiveBiological Labelling and Multicolor OpticalEncoding，J.Biomed.Opt.7，523-537)，它們非常適用于采用六種以上熒光團(tuán)的組的高度多重分析。
寡核苷酸探針，包括分子信標(biāo)探針，可以通過固相DNA合成技術(shù)很容易地制備得到，例如，在Applied Biosystems 394 DNA/RNA合成儀上制備?？梢允褂肈NA核苷酸或RNA核苷酸，包括修飾的核苷酸，如2’-O-甲基核糖核苷酸，由它所形成的鏈具有切割抗性。本發(fā)明合成分子信標(biāo)的優(yōu)選方法是從含有淬滅劑dabcyl的帶有控制的孔的玻璃柱開始的，用于將dabcyl摻入到探針的3’末端?？梢詮腂iosearchTechnologies(Novato，California，USA)購買上述柱子。在探針5’末端摻入熒光團(tuán)的優(yōu)選方法是利用硫醇修飾劑亞磷酰胺或氨基修飾劑亞磷酰胺，這樣可以使碘乙酰化的熒光團(tuán)衍生物偶聯(lián)到5’-巰基上，使熒光團(tuán)的琥珀酰亞胺酯偶聯(lián)到5’-氨基上。對于四氯熒光素，我們的做法是直接摻入四氯熒光素亞磷酰胺。對于波長-轉(zhuǎn)換探針，需要非-末端熒光團(tuán)。出于上述目的，我們使用了熒光素亞磷酰胺，以摻入內(nèi)部熒光素部分。我們的分子信標(biāo)探針合成方法中包括探針純化過程，該過程使用通過NAP-5 Sephadex柱的凝膠排阻層析，之后進(jìn)行通過反相柱，如購買自Waters的C-18柱的HPLC。最后用乙醇沉淀探針，然后溶解在100μl的Tris-EDTA緩沖液中。分子信標(biāo)探針?biāo)哂械男盘?噪音比至少為25，優(yōu)選接近100，需要記住，例如，對于三元代碼來說，每種熒光團(tuán)對于30-60％的探針是共有的。
正如上述所提到的，將探針細(xì)分為兩部分、三部分或四部分，用于標(biāo)記和使用。分析中一種探針的各個不同部分，如果可能，所有部分有利地產(chǎn)生大致相同的信號強度。因此，我們的優(yōu)選的分析方法和試劑盒中，具有為此目的“平衡的”部分。術(shù)語“平衡的”是指由不同部分發(fā)出的熒光信號強度，彼此之間的差別一般在20％以內(nèi)，最優(yōu)選在5％以內(nèi)。由具體探針部分，如分子信標(biāo)探針部分產(chǎn)生的熒光強度，依賴于其發(fā)射熒光團(tuán)所具有的固有特性(另外，如果是波長-轉(zhuǎn)換分子信標(biāo)探針，還依賴于它所具有的接受熒光團(tuán)的固有特性)，以及靶的性質(zhì)，因為有些靶比其它靶容易接受探針，并且在用于檢測的儀器上非?？赡芙邮芴结?。通過測試在所使用儀器上進(jìn)行的分析中針對靶的探針，可以調(diào)節(jié)各部分之間的相對量，以產(chǎn)生平衡的信號。申請人進(jìn)一步優(yōu)選所有組合標(biāo)記探針的所有部分均是平衡的。將每一探針的各個部分平衡之后，調(diào)節(jié)探針彼此間的相對量，以產(chǎn)生平衡的信號。不調(diào)節(jié)每個探針各部分的量，而是通過調(diào)節(jié)檢測儀器以調(diào)節(jié)信號閱讀，進(jìn)而解決熒光團(tuán)和儀器所存在的差異也是可行的。例如，如果具有標(biāo)記為a、b、c的三部分的探針，等體積的每一部分分別產(chǎn)生1.0、1.5和3.0的相對強度，則可以將儀器程序化為“a”部分的讀數(shù)乘3，“b”部分的讀數(shù)乘2，c”部分的讀數(shù)乘1。那么僅僅是探針的相對量需要平衡。然而，我優(yōu)先調(diào)節(jié)部分量，而不是儀器。采用平衡的發(fā)射，可以使觀察者顯著更容易解釋，因為可以立即看出例如三種顏色是否表明特定的代碼元件。
根據(jù)本發(fā)明的分析方法是高度多重的。雖然不限定樣品來源，但是本分析方法特別適用于來自人類或其它動物部位的，被認(rèn)為是無菌的樣品，如血液、組織和腦脊液。非-無菌樣品，如痰或糞便，有可能含有多種來源的核酸，因而更難篩選。通常病原體以非常小的程度感染血流。但是對于核酸擴增分析來說，只要樣品中存在極少量的靶序列就可以。例如，Kane等，采用“通用”細(xì)菌引物比較了血培養(yǎng)與PCR分析，以診斷嚴(yán)重患病的手術(shù)患者的細(xì)菌感染。Kane，T.D.等(1998)，The Detection of Microbial DNA in Blooda Sensitive Methodfor Diagnosing Bacteremia and/or Bacterial Translocation inSurgical Patients.Ann.Surg.2271-9。盡管只有14％的樣品是血培養(yǎng)陽性的，PCR分析中64％為陽性。
對于采用擴增，如PCR或NASBA的實施方案，均需要各種靶的引物。引物設(shè)計在本領(lǐng)域是已知的。引物之間可以相互測試，然后用探針進(jìn)行測試，以驗證是否會發(fā)生不必要的相互反應(yīng)。引物，以及探針(在更小的程度上)在多重反應(yīng)中不發(fā)生相互作用是非常重要的。本發(fā)明所使用的一種具有高度特異性的引物已經(jīng)公開在公開的國際專利申請WO00/71562中。上述引物形成發(fā)夾莖結(jié)構(gòu)，可以顯著減少不必要的雜交。我們通過利用上述高特異性的引物而減少了引物間的相互反應(yīng)，注意保證莖的解鏈溫度(Tm)比本分析所使用的引物退火溫度高大約6℃。本發(fā)明構(gòu)建了兩對通用引物，共同擴增多個細(xì)菌物種所具有的16s核糖體RNA基因的片段。一對引物包括5’-TGACGACAACCATGCACC-3’(SEQ ID NO.1)和5’-ATGTGGTTTAATTCGAAGCAA-3’(SEQ ID NO.2)，擴增炭疽芽孢桿菌和相關(guān)革蘭氏陽性細(xì)菌的靶區(qū)域。另外一對引物包括5’-GTGGACTTAGATACCCTGGTAGTCCAC-3’(SEQ ID NO.3)和5’-GCGTTGCATCGAATTAA-3’(SEQ ID NO.4)，擴增幾種重要的革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌的靶區(qū)域。第三個鑒別探針中帶有下劃線的序列是形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列，加入該序列可以減少不希望的引物的雜交反應(yīng)。
可以在多種儀器上進(jìn)行具有實時檢測的擴增分析，該儀器利用不同的技術(shù)激發(fā)熒光團(tuán)并檢測發(fā)射。激發(fā)可以通過激光、帶有濾光器的白光、或發(fā)光二極管。另外，分析儀器可以采用同步掃描模式，其中連續(xù)改變窄的激發(fā)和發(fā)射波長，而兩者之間保持固定的波長差異。Lee等(1999)，Seven-Color，Homogeneous Detection of Six PCRProducts，Biotechniques 27，342-349。儀器的選擇可能會影響到組中所包括的不同熒光團(tuán)的數(shù)目。
本發(fā)明的篩選分析方法，包括但不限于，實時擴增分析，在靶可以由其獨特的標(biāo)志，優(yōu)選其獨特的顏色標(biāo)志，但也可能由信號-加強度標(biāo)志得到鑒定的情況下，可以是信號靶陽性的。有時在樣品中存在兩種或兩種以上的靶。
在這樣的情況下，譯解光譜可以利用以下事實，即雖然探針的絕對熒光依賴于靶濃度，與同一靶雜交的兩個探針部分的熒光比率卻不依賴于靶的濃度。如果嚴(yán)格組合編碼利用三色代碼(其中各部分的強度得到平衡)，假定存在兩種靶。如果靶沒有相同的顏色，則得到六種顏色。然而，因為在樣品中兩種靶的濃度極不可能是相同的，因此對樣品直接探測可能產(chǎn)生第一種強度的三種顏色和第二種強度的三種顏色，并由此鑒定出兩種靶。另一方面，如果分析是實時擴增分析，在信號升高至高于背景時，例如PCR反應(yīng)的閾循環(huán)(CT)期間，有可能是存在區(qū)別的，這樣會產(chǎn)生兩組的三種顏色，兩組之間信號升高的時間不同，由此鑒定出兩種靶。
如果賦予兩種靶的探針的代碼具有相同的顏色，則在直接探測樣品中核酸的分析中，上述顏色的熒光強度則與其它顏色的熒光強度不相匹配。相當(dāng)于是兩種靶的組合，因此將不同于其它顏色的水平，由此可鑒定出這種顏色是共有顏色。另一方面，如果分析是實時擴增分析，三種顏色會疊加到一起，作為更充足的靶的信號。當(dāng)達(dá)到較不充足的靶的第二閾值，兩種顏色會疊加到一起，共有顏色的強度曲線斜率將發(fā)生改變到達(dá)更高的值，由此鑒別出這種顏色即為共有顏色。
考慮還使用比率編碼的情況，假定兩種靶共有一種顏色，但是更充足的靶與該靶的其它部分相比的強度比率是2∶1。在實時擴增分析中，當(dāng)達(dá)到第一個閾值時，三種顏色的信號將會升高于背景信號以上，但其中一種顏色(共有顏色)比其它兩種顏色將會具有更高的斜率。然而，當(dāng)?shù)竭_(dá)第二個閾值時，共有顏色的強度曲線斜率將會發(fā)生改變到達(dá)更高的值，這意味著上述顏色即為共有顏色。
當(dāng)樣品中存在兩種濃度相同的靶時，編碼每一探針的顏色將會同時出現(xiàn)。在這種情況下，有時不太可能對每種代碼都做到明確的鑒別。在上述情況下，可以采用替代編碼方案對上述靶進(jìn)行重復(fù)分析，在幾乎所有情況下都能解決不確定的問題。
實施例1在該實施例中，從懷疑受到細(xì)菌感染的正常情況下無菌的血液樣品中分離DNA，并對上述DNA進(jìn)行了實時PCR擴增分析。反應(yīng)混合物中存在引物組，其能夠擴增出所有懷疑可能存在于血液樣品中的細(xì)菌物種的16S核糖體RNA基因的片段。分析中存在多種分子信標(biāo)探針，每一種均與每種懷疑的細(xì)菌靶物種相對應(yīng)。每種不同的分子信標(biāo)具有一個通用的淬滅部分(dabcyl)，共價連接在其3’末端。根據(jù)本發(fā)明，用三種不同顏色的熒光團(tuán)的獨特組對上述每種不同的物種-特異性的分子信標(biāo)探針進(jìn)行組合標(biāo)記。這些熒光團(tuán)共價連接到每一寡核苷酸的5’末端。對于每種存在于分析混合物中的物種-特異性探針來說，在進(jìn)行分析前調(diào)節(jié)共同組成物種-特異性探針的三個分別帶有不同顏色的寡核苷酸的量，以使得在用于進(jìn)行上述分析的分析儀器所檢測到的探針三種顏色的熒光強度大致相同。圖2是進(jìn)行上述分析所得到的結(jié)果的作圖。“x”軸表示到進(jìn)行每次熒光測定時進(jìn)行的擴增循環(huán)數(shù)。該測定可以通過分析儀器進(jìn)行自動測定，其測定方式允許測定用于標(biāo)記探針的每一不同顏色熒光團(tuán)的熒光強度?！皔”軸表示特定顏色熒光團(tuán)的熒光強度。在每一擴增循環(huán)的退火階段進(jìn)行測定。在擴增過程中每個擴增循環(huán)中進(jìn)行實時測定。將用于標(biāo)記探針的每一不同顏色熒光團(tuán)的熒光強度作圖為完成的擴增循環(huán)數(shù)量的函數(shù)。
在圖2所顯示的試驗中，在進(jìn)行了特定數(shù)量的擴增循環(huán)后，即出現(xiàn)了高于背景熒光并且其強度足以使之得到檢測的信號。發(fā)生這一現(xiàn)象時的擴增循環(huán)即是已知的“閾循環(huán)”，一般縮寫為“CT”。閾循環(huán)之后所出現(xiàn)的信號由三種不同顏色組成(a、b和c)。隨著完成了更多的擴增循環(huán)，該信號以線性方式增加。一起組合出現(xiàn)的三種信號的組鑒定出血液樣品中存在那個細(xì)菌物種。根據(jù)出現(xiàn)信號時的閾循環(huán)，確定樣品中細(xì)菌物種的含量。閾循環(huán)與樣品中靶分子數(shù)量的對數(shù)呈反比。
實施例2在該實施例中，所進(jìn)行的分析方式以及分析目的與實施例1相同。該試驗所得到的結(jié)果顯示在圖3中。產(chǎn)生了兩種不同的信號，一種(由a、b和c三種顏色組成)在反應(yīng)中出現(xiàn)較早，另外一種(由d、e和f三種顏色組成)在反應(yīng)中出現(xiàn)較晚。結(jié)果表明樣品中存在兩種不同的細(xì)菌物種，一種含量相對較高(由顏色a、b和c確定)，另外一種含量相對較少(由顏色d、e和f確定)，含量較少的細(xì)菌物種需要進(jìn)行更多的擴增循環(huán)，這樣才能得到足夠多的擴增產(chǎn)物，這樣與物種-特異性探針雜交時才能檢測到高于背景熒光的熒光信號。兩種信號中每種信號中的獨特顏色組明確鑒定出了樣品中所存在的兩種細(xì)菌物種中的每一種。
實施例3在該實施例中，所進(jìn)行的分析方式以及分析目的與實施例1相同。該試驗所得到的結(jié)果顯示在圖4中。產(chǎn)生了兩種不同的信號，一種(由a、b和c三種顏色組成)在反應(yīng)中出現(xiàn)較早，另外一種(由d和e兩種顏色組成)在反應(yīng)中出現(xiàn)較晚。另外，在閾循環(huán)之后，表示顏色“c”的熒光強度的曲線斜率增大，此時出現(xiàn)較晚的信號(由顏色d和e組成)。結(jié)果表明樣品中存在兩種不同的細(xì)菌物種，一種含量相對較高(由顏色a、b和c確定)，另外一種含量相對較少并且出現(xiàn)較晚(由顏色c、d和e確定)。表明顏色“c”的熒光強度的曲線斜率增大，是由于探針結(jié)合于來自于較少細(xì)菌物種的擴增DNA片段產(chǎn)生的“c”熒光加上探針結(jié)合于來自于較多細(xì)菌物種的擴增DNA片段產(chǎn)生的“c”熒光的貢獻(xiàn)。盡管用于鑒定樣品中兩種細(xì)菌物種中每一種的三色代碼具有一種相同的顏色，但是兩個細(xì)菌物種在樣品中含量不同，這使得來自一個物種的信號可以與另一個物種的信號相區(qū)分。一般來說，當(dāng)臨床樣品中同時存在兩種(或甚至三種)細(xì)菌物種，每種細(xì)菌的濃度是不同的，則由于每一種細(xì)菌物種的存在產(chǎn)生的編碼的信號可以與由于樣品中其它物種的存在產(chǎn)生的信號相區(qū)分。
實施例4該實施例表明即使樣品中存在濃度大致相同的兩種不同物種，如何獲得明確的結(jié)果。在該實施例中，所進(jìn)行的分析方式以及分析目的與實施例1相同。在該試驗中，存在于分析混合物中的探針是設(shè)計用來檢測十種不同細(xì)菌物種(命名為物種0、1、2、3、4、5、6、7、8和9)。使用三色代碼標(biāo)記上述十種探針的每一種，來自由五種不同顏色的熒光團(tuán)組成的組(命名為a、b、c、d和e)。對于存在于分析混合物中的每種物種-特異性探針來說，在進(jìn)行分析前調(diào)節(jié)共同組成物種-特異性探針的三個分別帶有不同顏色的寡核苷酸的量，以使得在用于進(jìn)行上述分析的分析儀器所檢測到的探針三種顏色的熒光強度大致相同。在該分析中，使用了如下的編碼方案(在本申請中被稱為“第一種三色代碼簿”)。
物種0的探針abc物種1的探針abd物種2的探針abe物種3的探針acd物種4的探針ace物種5的探針ade物種6的探針bcd物種7的探針bce物種8的探針bde物種9的探針cde使用根據(jù)上述代碼簿標(biāo)記的探針實施該試驗所得到的結(jié)果顯示在圖5中。在同一個閾循環(huán)時產(chǎn)生由四種不同顏色組成的信號(a、b、c和d)。其中兩種顏色(a和b)的曲線斜率是另外兩種顏色(c和d)的曲線斜率的兩倍。上述結(jié)果表明在樣品中存在兩種濃度大致相同的不同的細(xì)菌物種，并且它們各自探針的三色代碼共有兩種相同的顏色。因為顏色“a”和“b”的曲線斜率大約是顏色“c”和“e”的曲線斜率的兩倍，因此顏色“a”和“b”是樣品中所存在的兩種細(xì)菌物種的代碼都具有的成分。從上述結(jié)果可以得到如下的結(jié)論，即其中一種結(jié)合擴增的靶序列的探針的代碼是“abc”，而另外一種結(jié)合擴增的靶序列的探針的代碼是“abd”。將上述結(jié)果與第一個三色代碼簿(如上所示)所示的編碼方案相對照，“abc”是細(xì)菌物種“0”的代碼，“abd”是細(xì)菌物種“1”的代碼。因此，上述結(jié)果很明確地表明樣品中含有物種“0”和物種“1”，它們具有大致相同的濃度。
實施例5該實施例表明當(dāng)樣品中存在濃度大致相同的兩種不同物種時，有時也會得到不太明確的結(jié)果。本實施例所描述的分析的實施方式和分析目的與實施例4相同。在本分析中所使用的探針同樣使用第一種三色代碼簿(實施例4所示)標(biāo)記。
圖6a的表包括兩部分(基于第一種三色代碼簿)，該表顯示當(dāng)樣品中存在相同濃度的兩種不同物種時，可能發(fā)生兩個物種的45種組合時得到的結(jié)果。在上述組合的其中30種組合中，出現(xiàn)了四種顏色，其中兩種的熒光強度增加速度較快(以帶有下劃線的字母示出)，兩種的熒光強度增加速度較慢(以不帶下劃線的字母示出)。上述30種組合在表中是獨特的，從而所提供的結(jié)果是明確的。
然而，從圖6a可以看出，在以相同濃度存在于樣品中的兩種不同物種的45種可能組合中，有15種出現(xiàn)了5種顏色信號，其中一種顏色的熒光強度增加速度較快(以帶有下劃線的字母示出)，另外四種顏色的熒光強度增加速度較慢(以不帶下劃線的字母示出)。然而這些組合不是獨特的。例如，代碼“abcde”在上表中出現(xiàn)三次第一次是物種“2”和“9”的組合，第二次是物種“4”和“8”的組合，第三次是物種“5”和“7”的組合。圖7給出了一個產(chǎn)生上述模糊結(jié)果的試驗實例。在上述分析中，結(jié)果顯示在同一閾循環(huán)內(nèi)出現(xiàn)了五種顏色(a、b、c、d和e)，其中一種顏色(e)熒光強度的升高速度是另外四種顏色的兩倍。
實施例7可以采用替代編碼方案編碼的相同探針，重復(fù)上述分析過程，從而消除圖7中所示結(jié)果固有的不確定。例如，用獲得圖7所示結(jié)果的相同的樣品進(jìn)行分析，產(chǎn)生圖8的結(jié)果，區(qū)別在于采用如下的替代編碼方案(在本申請中稱為“第二種三色代碼簿”)對探針進(jìn)行編碼物種0的探針cde物種1的探針bde物種2的探針bce
物種3的探針bcd物種4的探針ade物種5的探針ace物種6的探針acd物種7的探針abe物種8的探針abd物種9的探針abc圖8顯示了用圖7試驗中使用的相同的樣品進(jìn)行分析所獲得的結(jié)果，區(qū)別在于探針是根據(jù)第二種三色代碼簿進(jìn)行編碼的。在同一閾循環(huán)時出現(xiàn)了由四種不同顏色(a、b、c和d)組成的信號。其中兩種顏色(b和c)的曲線斜率是另外兩種顏色(a和e)的曲線斜率的兩倍。因為顏色“b”和“c”的曲線斜率大約是顏色“a”和“e”的曲線斜率的兩倍，因此顏色“b”和“c”是存在于樣品中的兩種細(xì)菌物種的代碼所共有的。從上述結(jié)果可以得出如下的結(jié)論，即其中一種與擴增的靶序列結(jié)合的探針的代碼是“abc”，而另外一種與擴增的靶序列結(jié)合的探針的代碼是“bce”。將上述結(jié)果與第二種三色代碼簿(如上所示)所示的編碼方案相對照，可看出“bce”是細(xì)菌物種“2”的代碼，同時“abc”是細(xì)菌物種“9”的代碼。因此圖8所示的結(jié)果消除了圖7所示結(jié)果的不確定性，明確地表明樣品中包含物種“2”和物種“9”，其濃度大致相同。
圖6a顯示當(dāng)根據(jù)第二種三色代碼簿對探針進(jìn)行編碼時，以大致相同濃度存在于樣品中的兩種不同的細(xì)菌物種將會產(chǎn)生的所有45種不同的組合。將圖6a的兩個部分的表與圖6b的兩個部分的表相比較，結(jié)果顯示，當(dāng)需要解決第一次分析中所產(chǎn)生的不確定性時，采用替代編碼的探針進(jìn)行第二種分析，能夠明確鑒定出兩種不同細(xì)菌物種的所有45種可能的組合。
本發(fā)明描述了多個實施方案。但是，應(yīng)當(dāng)理解的是，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對上述實施方案作出多種改進(jìn)。相應(yīng)的，其它的實施方案同樣包括在本發(fā)明權(quán)利要求所要求保護(hù)的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種高度多重均相體外分析方法，其用于篩選樣品中至少六種不同核酸靶中的任何一種的存在，該方法包含a)將樣品與一組包括至少六種組合編碼的熒光雜交探針的熒光雜交探針相接觸，其中每一探針均特異于不同的核酸靶，其中i)所述組中的探針由最多四種不同發(fā)射熒光團(tuán)組合編碼，上述熒光團(tuán)來自由至少四種不同光譜的熒光團(tuán)組成的組，ii)所述組中的探針通過用不同的發(fā)射熒光團(tuán)標(biāo)記其部分進(jìn)行編碼，和iii)每一探針部分的雜交產(chǎn)生可檢測的熒光信號變化，這種變指示其標(biāo)記；b)激發(fā)與樣品共存在的熒光團(tuán)；和c)檢測來自所述熒光團(tuán)的發(fā)射信號的變化，其中核酸靶沒有進(jìn)行彼此的空間分隔。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，其進(jìn)一步包含指數(shù)擴增所述核酸靶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分析方法，其中在擴增過程中實時檢測發(fā)射信號的變化。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分析方法，其中每一探針包含兩個、三個或四個帶有不同標(biāo)記的部分。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，其中調(diào)節(jié)每一探針各部分彼此間的相對量，從而提供平衡的信號變化。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，其中所述探針組另外還包括至少一種比率編碼的探針。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，其中所述組合編碼的探針是淬滅的探針，其熒光通過與其靶的雜交而恢復(fù)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的分析方法，其中所述組合編碼的探針是分子信標(biāo)探針，在其中一個臂上具有非-熒光淬滅劑，在另外一個臂上具有發(fā)射熒光團(tuán)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的分析方法，其中每一探針各部分間的熒光強度是彼此平衡的。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的分析方法，進(jìn)一步包含在存在所述探針的情況下指數(shù)擴增所述核酸靶，并實時檢測發(fā)射熒光團(tuán)所發(fā)出的熒光的增加。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的分析方法，其中每一探針包含兩個、三個或四個帶有不同標(biāo)記的部分，其來自由四個到八個不同熒光團(tuán)組成的組，其中調(diào)節(jié)每一探針各部分彼此間的相對量，以提供平衡的熒光發(fā)射。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的分析方法，其中調(diào)節(jié)所有探針的所有部分彼此間的相對量，以提供平衡的熒光發(fā)射。
13.用于高度多重體外分析方法的試劑盒，該試劑盒用于篩選樣品中至少六種不同核酸靶中的任何一種的存在，該試劑盒包含一組包括至少六種組合編碼的熒光雜交探針的熒光雜交探針，每種探針均特異于不同的核酸靶，在所述的分析中可以通過熒光信號變化檢測探針與各自靶的雜交，這種變化指示其標(biāo)記，其中通過用不同的發(fā)射熒光團(tuán)對每一探針的各部分進(jìn)行標(biāo)記，以便所述組中的探針由最多四種不同發(fā)射熒光團(tuán)組合編碼，上述熒光團(tuán)來自由至少四種不同光譜的熒光團(tuán)組成的組。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的試劑盒，進(jìn)一步包含用于指數(shù)擴增所述核酸靶的引物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的試劑盒，進(jìn)一步包含利用所述引物擴增所述核酸靶的擴增試劑。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的試劑盒，進(jìn)一步包含至少一個比率編碼的探針。
17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的試劑盒，其中所述組合編碼的探針是淬滅的探針，其熒光通過與其靶的雜交而恢復(fù)。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑盒，其中所述探針是分子信標(biāo)探針，在其中一個臂上具有非-熒光淬滅劑，在另外一個臂上具有發(fā)射熒光團(tuán)。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的試劑盒，其中調(diào)節(jié)每一探針各部分彼此間的相對量，以提供平衡的熒光發(fā)射。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的試劑盒，其中調(diào)節(jié)所有探針的所有部分彼此間的相對量，以提供平衡的熒光發(fā)射。
21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的試劑盒，進(jìn)一步包含用于指數(shù)擴增所述核酸靶的引物。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的試劑盒，進(jìn)一步包含利用所述引物擴增所述核酸靶的擴增試劑。
全文摘要
用于多個可能的核酸靶的高度多重均相體外篩選分析方法，樣品中可能存在所述核酸靶的任何一種，在該分析方法中采用了由一組熒光團(tuán)組合編碼的熒光雜交探針，將每一探針分成各部分，然后對每一部分進(jìn)行不同的標(biāo)記，這樣當(dāng)將各部分組合到一起時，每一探針就具有了一種獨特的代碼。該分析方法可以包括靶擴增和實時檢測。包含其它分析試劑的探針組和試劑盒也可以用于實施上述篩選分析。
文檔編號C12Q1/00GK1863924SQ200480018729
公開日2006年11月15日 申請日期2004年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月30日
發(fā)明者F·R·克雷默 申請人:紐約公共衛(wèi)生研究所公司