專利名稱：在轉(zhuǎn)基因生物中產(chǎn)生麥角甾－5,7－二烯醇和/或其生物合成中間物和/或代謝物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過培養(yǎng)遺傳修飾的生物生產(chǎn)麥角甾-5，7-二烯醇(ergosta-5，7-dienol)和/或其生物合成中間物和/或代謝物的方法，還涉及遺傳修飾的生物自身，尤其涉及酵母。
甾醇代謝的麥角甾-5，7-二烯醇和其生物合成中間物，如法呢醇、香葉醇、角鯊烯和羊毛甾醇和酵母甾醇，及其例如在哺乳動物中甾醇代謝的生物合成代謝物，如菜油甾醇、孕烯醇酮、17-OH-孕烯醇酮、孕酮、17-OH-孕酮、11-脫氧皮質(zhì)醇、皮質(zhì)醇、脫氧皮質(zhì)酮或皮質(zhì)酮為高經(jīng)濟(jì)價值的化合物。
麥角甾-5，7-二烯醇可作為由生物轉(zhuǎn)化、化學(xué)合成或生物技術(shù)生產(chǎn)制備類固醇激素的起始化合物。
皮質(zhì)醇具有弱的糖皮質(zhì)激素作用并為高的消炎、流產(chǎn)或抗增殖作用活性成分合成的廣受歡迎的起始化合物。
角鯊烯用作萜合成的結(jié)構(gòu)單元。角鯊烯以其氫化形式在皮膚病學(xué)和化妝品中用作角鯊?fù)?，并以其多種衍生物形式用作護(hù)膚和護(hù)發(fā)產(chǎn)品的成分。
其他在經(jīng)濟(jì)上可利用的物質(zhì)為甾醇，如酵母甾醇和羊毛甾醇，羊毛甾醇為皂苷和類固醇激素化學(xué)合成的核心原料和合成材料。由于其良好的皮膚滲透和鋪展特性，羊毛甾醇用作乳劑助劑和護(hù)膚膏的活性成分。
因此生產(chǎn)麥角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中間物和/或代謝物的經(jīng)濟(jì)方法非常重要。
尤其經(jīng)濟(jì)的方法為利用天然生物和通過遺傳修飾方法優(yōu)化的生物生產(chǎn)麥角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中間物和/或代謝物的生物技術(shù)方法。
酵母中麥角甾醇代謝的基因?yàn)楸娝苤牟⒌玫娇寺?，例如?br> 編碼HMG-CoA還原酶(HMG)的核酸(Bason M.E.等，(1988)酵母和人類的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶——甾醇生物合成的限速酶之間的結(jié)構(gòu)和功能保守性。Mol Cell Biol 83797-3808)，編碼截短的HMG-CoA還原酶(t-HMG)的核酸(Polakowski T，StahlU，Lang C(1998)胞質(zhì)羥基甲基戊二酰-CoA還原酶的過量表達(dá)引起酵母中角鯊烯的累積。Appl Microbiol Biotechnol.Jan；49(1)66-71)，編碼羊毛甾醇C14-脫甲基酶(ERG11)的核酸(Kalb VF，Loper JC，Dey CR，Woods CW，Sutter TR (1986)從釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中分離細(xì)胞色素P-450結(jié)構(gòu)基因。Gene 45(3)237-45)，編碼角鯊烯環(huán)氧酶(ERG1)的核酸(Jandrositz，A.等，(1991)釀酒酵母中編碼角鯊烯環(huán)氧酶的基因克隆及表征。Gene 107155-160)和編碼角鯊烯合成酶(ERG9)的核酸(Jennings，S.M.，(1991)酵母角鯊烯合成酶基因的分子克隆和表征。Proc Natl Acad Sci USA.Jul15；88(14)6038-42)。
還有針對增加酵母和真菌中甾醇代謝特定中間物和分解代謝產(chǎn)物含量的已知方法。
從T.Polakowski，Molekularbiologische Beeinflussung desErgosteroltof wechsels der Hefe Saccharomyces cerevisiae[釀酒酵母麥角甾醇代謝的分子生物學(xué)效應(yīng)]，Shaker Verlag Aachen，1999，59-66頁已知增加HMG-CoA還原酶的表達(dá)速度引起早期甾醇如角鯊烯含量的輕度增加，而晚期甾醇如麥角甾醇的含量基本不變或者甚至有減少的趨勢。
Tainaka等.，J，F(xiàn)erment.Bioeng.1995，79，64-66還描述了ERG11(羊毛甾醇C14-脫甲基酶)的過量表達(dá)引起4，4-二甲基酵母甾醇的累積但不引起麥角甾醇的累積。依賴于發(fā)酵條件，轉(zhuǎn)化體酵母甾醇的含量與野生型相比增力加到1.1-1.47倍。
WO99/16886描述了在過量表達(dá)tHMG、ERG9、SAT1和ERG1基因聯(lián)合的酵母中產(chǎn)生麥角甾醇的方法。
EP486 290公開了通過增加HMG-CoA還原酶表達(dá)速度同時阻斷麥角甾-5，7，24(28)-三烯醇-22-脫氫酶(下文也稱為Δ22-去飽和酶(ERG5))代謝途徑增加酵母中角鯊烯、酵母甾醇、麥角甾-5，7，-24(28)-三烯醇和麥角甾-5，7-二烯醇含量的方法。
然而此方法的缺點(diǎn)為麥角甾-5，7-二烯醇產(chǎn)量仍不盡人意。
本發(fā)明的目的是提供具有有利特性如更高產(chǎn)率的生產(chǎn)麥角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中間物和/或代謝物的其他方法。
我們發(fā)現(xiàn)此目的通過培養(yǎng)生物生產(chǎn)麥角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中間物和/或代謝物的方法實(shí)現(xiàn)，所述方法中所述的生物與野生型相比具有降低的Δ22-去飽和酶活性和增加的HMG-CoA還原酶活性和至少一種選自羊毛甾醇C14-脫甲基酶活性、角鯊烯環(huán)氧酶活性和角鯊烯合成酶活性的增加的活性。
降低的活性理解為不僅指活性的降低也指活性的完全消失。因此，活性的降低也包括生物中通過相關(guān)蛋白質(zhì)完全缺失導(dǎo)致相關(guān)蛋白質(zhì)的量降低，其可通過例如相關(guān)酶活性可檢測性的缺乏或相關(guān)蛋白質(zhì)免疫學(xué)可檢測性的缺乏測定。
Δ22-去飽和酶活性理解為是指Δ22-去飽和酶的酶活性。
Δ22-去飽和酶理解為是指具有將麥角甾-5，7-二烯醇轉(zhuǎn)化成麥角甾-5，7，22，24-四烯-3β-醇的酶活性的蛋白質(zhì)。
因此，Δ22-去飽和酶活性理解為是指特定時間內(nèi)通過蛋白質(zhì)Δ22-去飽和酶轉(zhuǎn)化的麥角甾-5，7-二烯醇的量或形成的麥角甾-5，7，22，24-四烯-3β-醇的量。
這樣在與野生型相比Δ22-去飽和酶活性降低的情況下，特定時間內(nèi)通過蛋白質(zhì)Δ22-去飽和酶轉(zhuǎn)化的麥角甾-5，7-二烯醇的量或形成的麥角甾-5，7，22，24-四烯-3β-醇的量與野生型相比降低。
Δ22-去飽和酶活性優(yōu)選地降低到野生型Δ22-去飽和酶活性的至少90％，更優(yōu)選地至少70％，更優(yōu)選地至少50％，更優(yōu)選地至少30％，甚至更優(yōu)選地至少10％，甚至更優(yōu)選地至少5％，尤其是0％。因此尤其優(yōu)選的為生物中Δ22-去飽和酶活性消失。
Δ22-去飽和酶(ERG5)活性可通過如下所述確定從釀酒酵母Erg5突變體分離的多種濃度的麥角甾-5，7-二烯醇，(Parks等，1985，酵母甾醇.酵母突變體作為研究甾醇代謝的工具，MethodsEnzymol.111333-346)和50μg二月桂酰磷脂酰膽堿混合并超聲處理直到形成白色懸浮液。加入處理的微粒體(1ml)(3mg/ml蛋白質(zhì))。在檢測混合物中加入NADPH(終濃度1mM)以開始酶反應(yīng)?；旌衔镌?7℃孵育20分鐘。反應(yīng)通過加入3ml甲醇停止，甾醇通過加入2ml 60％(質(zhì)量/體積(wt/vol))KOH水溶液水解?；旌衔镌?0℃孵育2小時。冷卻后，混合物用5ml已烷萃取三次并通過在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸發(fā)濃縮。甾醇隨后用雙(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(50μl于50μl甲苯中)60℃硅烷基化1小時。甾醇通過氣相色譜/質(zhì)譜(GC-MS)(例如VG 12-250型氣相色譜-質(zhì)譜儀；VG Biotech，Manchester，英國)分析。得到的Δ22-去飽和中間物可作為所用底物量的函數(shù)鑒定。不與底物孵育的微粒體作為參比。
此方法為Lamb等致病性真菌光滑假絲酵母(Candida glabrata)細(xì)胞色素P-450甾醇Δ22-去飽和酶的純化、重建和抑制。Antimicrob AgentsChemother.1999Jul；43(7)1725-8中所述方法的修改。
Δ22-去飽和酶活性可通過不同的細(xì)胞學(xué)機(jī)制獨(dú)立地降低，例如通過在蛋白質(zhì)水平抑制相應(yīng)的活性，例如通過加入該酶的抑制劑，或通過與野生型相比降低編碼Δ22-去飽和酶的相應(yīng)核酸的基因表達(dá)水平。
在根據(jù)本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，通過降低編碼Δ22-去飽和酶相應(yīng)核酸的基因表達(dá)水平，與野生型相比降低Δ22-去飽和酶活性。
與野生型相比降低編碼Δ22-去飽和酶核酸的基因表達(dá)水平同樣可以多種方式實(shí)現(xiàn)，例如a)引入這樣的核酸序列，其可轉(zhuǎn)錄成反義核酸序列，該反義核酸序列能例如通過抑制內(nèi)源Δ22-去飽和酶活性的表達(dá)抑制Δ22-去飽和酶活性，b)過量表達(dá)同源Δ22-去飽和酶核酸序列，其引起共抑制，c)通過在生物中引入RNA/DNA寡核苷酸在內(nèi)源基因(endogen)中引入無義突變，
d)引入特定DNA-結(jié)合因子，例如鋅指轉(zhuǎn)錄因子類型的因子，其引起降低的基因表達(dá)，或者e)產(chǎn)生敲除突變體，例如利用T-DNA誘變或同源重組產(chǎn)生基因敲除突變體。
在根據(jù)本發(fā)明方法優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼Δ22-去飽和酶核酸的基因表達(dá)水平通過，尤其是優(yōu)選地通過同源重組產(chǎn)生敲除突變體來降低。
因此使用無功能性Δ22-去飽和酶基因的生物是優(yōu)選的。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，敲除突變體的產(chǎn)生，也就是說通過同源重組，靶基因座Δ22-去飽和酶基因的缺失與表達(dá)盒的整合同時進(jìn)行，所述表達(dá)盒包含至少下述核酸之一，編碼活性與野生型相比增加的蛋白質(zhì)。
為此，可能使用這樣的核酸構(gòu)建體，其除了下述表達(dá)盒還包含啟動子、編碼序列和如果適當(dāng)?shù)脑挵K止子，并且除了下述選擇標(biāo)記還在3’和5’端包含與待缺失基因開頭和末尾核酸序列相同的核酸序列。
一旦選擇發(fā)生，通過重組酶系統(tǒng)方法再次去除選擇標(biāo)記是優(yōu)選的，例如通過選擇標(biāo)記3’和5’端的loxP信號使用Cre重組酶(Cre-LoxP系統(tǒng))去除選擇標(biāo)記。
在優(yōu)選生物釀酒酵母中，Δ22-去飽和酶基因稱為基因ERG5(SEQ.ID.NO.1).SEQ.ID.NO.2組成了相應(yīng)的釀酒酵母Δ22-去飽和酶(Skaggs，B.A.等，編碼另一種參與麥角甾醇生物合成的細(xì)胞色素P-450的釀酒酵母C-22甾醇去飽和酶基因的克隆和表征。Gene.1996Feb22；169(1)105-9.)。
HMG-CoA還原酶活性理解為是指HMG-CoA還原酶(3-羥基-3-甲基戊二酰-輔酶A還原酶)的酶活性。
HMG-CoA還原酶理解為是指具有將3-羥基-3-甲基戊二酰-輔酶A轉(zhuǎn)化成甲羥戊酸的酶活性的蛋白質(zhì)。
因此，HMG-CoA還原酶活性理解為是指特定時間內(nèi)通過蛋白質(zhì)HMG-CoA還原酶轉(zhuǎn)化的3-羥基-3-甲基戊二酰-輔酶A的量或形成的甲羥戊酸的量。
這樣在與野生型相比增加的HMG-CoA還原酶活性的情況下，特定時間內(nèi)通過蛋白質(zhì)HMG-CoA還原酶轉(zhuǎn)化的3-羥基-3-甲基戊二酰-輔酶A的量或形成的甲羥戊酸的量與野生型相比增加了。
此HMG-CoA還原酶活性的增加優(yōu)選地達(dá)到野生型HMG-CoA還原酶活性的至少5％，更優(yōu)選地至少20％，更優(yōu)選地至少50％，更優(yōu)選地至少100％，甚至更優(yōu)選地至少300％，尤其優(yōu)選地至少500％，特別優(yōu)選地至少600％。
HMG-CoA還原酶活性如Th.Polakowski，MolekularbiologischeBeeinflussung des Ergosterolstoffwechsels der Hefe Saccharomycescerevisiae，Shaker-Verlag，Aachen 1999，ISBN 3-8265-6211-9中所述確定。
根據(jù)此參考，離心(3500xg，5分鐘)收集培養(yǎng)48小時的109個酵母細(xì)胞并在2ml緩沖液I(100mM磷酸鉀緩沖液，pH7.0)中洗滌。細(xì)胞沉淀溶于500μl緩沖液1(胞質(zhì)蛋白質(zhì))或緩沖液2(100mM磷酸鉀緩沖液pH7.0；1％Triton X-100)(總蛋白)中，并加入1μl 500mM PMSF的異丙醇溶液。細(xì)胞中加入500μl玻璃珠(d＝0.5mm)，渦旋5次1分鐘破碎細(xì)胞。玻璃珠間的液體轉(zhuǎn)入新Eppendorf管中。離心15分鐘(14000xg)去除細(xì)胞碎片和膜成分。上清液轉(zhuǎn)入新Eppendorf管中并組成蛋白質(zhì)級分。
HMG-CoA活性通過測量3-羥基-3-甲基戊二酰-CoA還原中消耗的NADPH+H+確定，其中3-羥基-3-甲基戊二酰-CoA作為底物加入。
1000μl的反應(yīng)體積中加入20μl酵母蛋白質(zhì)分離物和910μl緩沖液I；50μl 0.1M DTT和10μl 16mM NADPH+H+。反應(yīng)混合物加熱到30℃并在光度計中340nm下測量7.5分鐘。此時間內(nèi)測量的NADPH減少為不加入底物的分解速度并作為背景考慮。
此后加入底物(10μl 30mM HMG-CoA)，測量持續(xù)7.5分鐘。HMG-CoA還原酶活性通過確定特定的NADPH分解速度計算。
羊毛甾醇C14-脫甲基酶活性理解為是指羊毛甾醇C14-脫甲基酶的酶活性。
羊毛甾醇C14-脫甲基酶理解為是指具有將羊毛甾醇轉(zhuǎn)化成4，4-二甲基膽-8，14，24-三烯醇的酶活性的蛋白質(zhì)。
因此羊毛甾醇C14-脫甲基酶活性理解為是指特定時間內(nèi)通過蛋白質(zhì)羊毛甾醇C14-脫甲基酶轉(zhuǎn)化的羊毛甾醇的量或形成的4，4-二甲基膽-8，14，24-三烯醇的量。
這樣在與野生型相比增加的羊毛甾醇C14-脫甲基酶活性的情況下，特定時間內(nèi)通過蛋白質(zhì)羊毛甾醇C14-脫甲基酶轉(zhuǎn)化的羊毛甾醇的量或形成的4，4-二甲基膽-8，14，24-三烯醇的量與野生型相比增加。
羊毛甾醇C14-脫甲基酶活性的增加優(yōu)選地達(dá)到野生型羊毛甾醇C14-脫甲基酶活性的至少5％，更優(yōu)選地至少20％，更優(yōu)選地至少50％，更優(yōu)選地至少100％，甚至更優(yōu)選地至少300％，尤其優(yōu)選地至少500％，特別是至少600％。
羊毛甾醇C14-脫甲基酶活性如Omura，T和Sato，R.(1964)肝微粒體中的一氧化碳結(jié)合色素。J.Biol.Chem.239，2370-2378中所述確定。在此檢測中，P450酶的量半定量為帶有結(jié)合血紅素的全酶。(活性)全酶(帶有血紅素)可被CO還原，并且只有CO還原的酶在450nm具有最大吸收。這樣450nm的最大吸收用于測量羊毛甾醇C14-脫甲基酶活性。
為進(jìn)行活性確定，微粒體級分(100mM磷酸鉀緩沖液中4-10mg/ml蛋白質(zhì))1∶4稀釋，以使測定中使用的蛋白質(zhì)濃度為2mg/ml。測定直接在細(xì)胞中進(jìn)行。
在微粒體中加入spatula-tipful連二亞硫酸鹽(S2O4Na2)。用分光光度計在380-500nm范圍記錄基線。
大約20-30個CO泡隨后從樣品中冒出。現(xiàn)在在同樣的范圍內(nèi)測量吸收。450nm的吸收水平與反應(yīng)混合物中P450酶的量對應(yīng)。
角鯊烯環(huán)氧酶活性理解為是指角鯊烯環(huán)氧酶的酶活性。
角鯊烯環(huán)氧酶理解為是指具有將角鯊烯轉(zhuǎn)化成環(huán)氧化角鯊烯的酶活性的蛋白質(zhì)。
因此角鯊烯環(huán)氧酶活性理解為是指特定時間內(nèi)通過蛋白質(zhì)角鯊烯環(huán)氧酶轉(zhuǎn)化的角鯊烯的量或形成的環(huán)氧化角鯊烯的量。
這樣在角鯊烯環(huán)氧酶活性與野生型相比增加的情況下，特定時間內(nèi)通過蛋白質(zhì)角鯊烯環(huán)氧酶轉(zhuǎn)化的角鯊烯的量或形成的環(huán)氧化角鯊烯的量與野生型相比增加。
角鯊烯環(huán)氧酶活性的增加優(yōu)選地達(dá)到野生型角鯊烯環(huán)氧酶活性的至少5％，更優(yōu)選地至少20％，更優(yōu)選地至少50％，更優(yōu)選地至少100％，甚至更優(yōu)選地至少300％，尤其優(yōu)選地至少500％，特別是至少600％。
角鯊烯環(huán)氧酶活性如Leber R，Landl K，Zinser E，Ahorn H，Spok A，Kohlwein SD，Turnowsky F，Daum G(1998)酵母中角鯊烯環(huán)氧酶Erg1p的二元定位反映了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和脂質(zhì)微粒之間的關(guān)系，Mol.Biol.Cell.1998，F(xiàn)eb；9(2)375-86中所述確定。
此方法包括將100mM Tris-HCl，pH7.5中的0.35-0.7mg微粒體蛋白質(zhì)或3.5-75μg脂質(zhì)微粒蛋白質(zhì)，1mM EDTA，0.1mM FAD，3mMNADPH，0.1mM角鯊烯2，3-環(huán)氧酶環(huán)化酶抑制劑U18666A、32μM[3H]角鯊烯分散于0.005％Tween 80中，總體積為500μl。
測定在30℃進(jìn)行。預(yù)處理10分鐘之后，加入角鯊烯開始反應(yīng)并在15、30、45分鐘后通過用3ml氯仿/甲醇(2∶1體積/體積(vol/vol))和750μl0.035％MgCl2脂類萃取停止反應(yīng)。
脂類在氮環(huán)境中干燥并再溶解于0.5ml氯仿/甲醇(2∶1體積/體積)中。為進(jìn)行薄層層析，各部分置于硅膠60板(0.2mm)上并用氯仿作為洗脫劑分離。刮出含有[3H]2，3-環(huán)氧角鯊烯和[3H]角鯊烯的位置并用閃爍計數(shù)器定量。
角鯊烯合成酶活性理解為是指角鯊烯合成酶的酶活性。
角鯊烯合成酶理解為是指具有將焦磷酸法呢酯轉(zhuǎn)化成角鯊烯的酶活性的蛋白質(zhì)。
因此角鯊烯合成酶活性理解為是指特定時間內(nèi)通過蛋白質(zhì)角鯊烯合成酶轉(zhuǎn)化的焦磷酸法呢酯的量或形成的角鯊烯的量。
這樣在與野生型相比增加的角鯊烯合成酶活性的情況下，特定時間內(nèi)通過蛋白質(zhì)角鯊烯合成酶轉(zhuǎn)化的焦磷酸法呢酯的量或形成的角鯊烯的量與野生型相比增加。
角鯊烯合成酶活性的增加優(yōu)選地達(dá)到野生型角鯊烯合成酶活性的至少5％，更優(yōu)選地至少20％，更優(yōu)選地至少50％，更優(yōu)選地至少100％，甚至更優(yōu)選地至少300％，尤其優(yōu)選地至少500％，特別是至少600％。
角鯊烯合成酶活性可如下所述確定反應(yīng)混合物包含玻璃管中總體積200μl的50mM Mops，pH7.2，10mM MgCl2，1％(v/v)Tween-80，10％(v/v)2-丙醇，1mM DTT，1mg/mlBSA，NADPH，F(xiàn)PP(或PSPP)和微粒體(蛋白質(zhì)含量3mg)。含有放射性底物[1-3H]FPP(15-30mCi/μmol)的反應(yīng)物在30℃孵育30分鐘，懸浮混合物用1體積的1∶1(v/v)40％水性KOH∶甲醇裝滿。加入液體NaCl直到溶液飽和，同樣加入含0.5％(v/v)角鯊烯的2ml石油醚。
懸浮液渦旋30秒。使用巴斯德吸管加入1ml石油醚層部分到填充的0.5×6cm鋁柱(80-200網(wǎng)孔，F(xiàn)isher)上。用含0.5％(v/v)角鯊烯的2ml石油醚預(yù)平衡柱子。隨后用含0.5％(v/v)角鯊烯的5×1ml甲苯洗脫柱子。使用閃爍計數(shù)器(Beckman)在Cytoscint(ICN)閃爍液中測量角鯊烯放射性。
此方法為Radisky等，Biochemistry.2000Feb 22；39(7)1748-60，Zhang等(1993)Arch.Biochem.Biophys.304，133-143和Poulter C.D.等(1989)J.Am.Chem.Soc.111，3734-3739中所述方法的修改。
野生型理解為是指非遺傳修飾的起始生物。優(yōu)選地并且特別是在生物或野生型不能明確鑒定的情況下，關(guān)于Δ22-去飽和酶活性的降低、HMG-CoA還原酶活性的增加、羊毛甾醇C14-脫甲基酶活性的增加、角鯊烯環(huán)氧酶活性的增加和角鯊烯合成酶活性的增加和麥角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中間物和/或代謝物含量的增加的野生型理解為是指參考生物。此參考生物優(yōu)選地為酵母菌株釀酒酵母AH22。
HMG-CoA還原酶活性、羊毛甾醇C14-脫甲基酶活性、角鯊烯環(huán)氧酶活性或角鯊烯合成酶活性可以多種方式獨(dú)立地增加，例如通過在表達(dá)和蛋白質(zhì)水平消除抑制調(diào)節(jié)機(jī)制，或通過與野生型相比增加相應(yīng)核酸，也就是說編碼HMG-CoA還原酶、羊毛甾醇C14-脫甲基酶、角鯊烯環(huán)氧酶或角鯊烯合成酶的核酸的基因表達(dá)水平。
與野生型相比增加相應(yīng)核酸的基因表達(dá)水平也可以多種方式實(shí)現(xiàn)，例如通過激活劑誘導(dǎo)相應(yīng)基因，也就是說通過激活劑誘導(dǎo)HMG-CoA還原酶基因、羊毛甾醇C14-脫甲基酶基因、角鯊烯環(huán)氧酶基因或角鯊烯合成酶基因或通過引入相應(yīng)核酸的一種或多種基因拷貝，也就是說在生物中引入編碼HMG-CoA還原酶、羊毛甾醇C14-脫甲基酶、角鯊烯環(huán)氧酶或角鯊烯合成酶的一種或多種核酸。
根據(jù)本發(fā)明，增加編碼HMG-CoA還原酶、羊毛甾醇C14-脫甲基酶、角鯊烯環(huán)氧酶或角鯊烯合成酶的核酸的基因表達(dá)也理解為是指操作生物自身的，尤其是酵母自身的內(nèi)源HMG-CoA還原酶、羊毛甾醇C14-脫甲基酶、角鯊烯環(huán)氧酶或角鯊烯合成酶的表達(dá)。
這可例如通過修飾編碼HMG-CoA還原酶、羊毛甾醇C14-脫甲基酶、角鯊烯環(huán)氧酶或角鯊烯合成酶的基因的啟動子DNA序列實(shí)現(xiàn)。引起所述基因表達(dá)速度增加的這種修飾可例如通過DNA序列的缺失或插入完成。
如上所述，可能通過應(yīng)用外源刺激物修飾內(nèi)源HMG-CoA還原酶、羊毛甾醇C14-脫甲基酶、角鯊烯環(huán)氧酶或角鯊烯合成酶的表達(dá)。這可通過特定生理?xiàng)l件實(shí)現(xiàn)，也就是說通過應(yīng)用外來物質(zhì)實(shí)現(xiàn)。
此外，內(nèi)源HMG-CoA還原酶、羊毛甾醇C14-脫甲基酶、角鯊烯環(huán)氧酶或角鯊烯合成酶基因經(jīng)修飾的或增加的表達(dá)可通過非轉(zhuǎn)化生物中不存在并與這些基因的啟動子相互作用的調(diào)節(jié)物蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)。
此種調(diào)節(jié)物可為例如WO96/06166中所述由DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活劑結(jié)構(gòu)域組成的嵌合蛋白質(zhì)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，與野生型相比羊毛甾醇C14-脫甲基酶活性的增加通過增加編碼羊毛甾醇C14-脫甲基酶的核酸的基因表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。
在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼羊毛甾醇C14-脫甲基酶的核酸基因表達(dá)的增加通過在生物中引入編碼羊毛甾醇C14-脫甲基酶的一種或多種核酸來實(shí)現(xiàn)。
原則上，任何羊毛甾醇C14-脫甲基酶基因(ERG11)，也就是說編碼羊毛甾醇C14-脫甲基酶的任何核酸都可用于此目的。在真核來源的含有內(nèi)含子的基因組羊毛甾醇C14-脫甲基酶核酸序列的情況下，如果宿主生物不能或不可使其能表達(dá)相應(yīng)羊毛甾醇C14-脫甲基酶，優(yōu)選使用預(yù)處理的核酸序列，如相應(yīng)的cDNAs。
羊毛甾醇C14-脫甲基酶基因的實(shí)例為編碼釀酒酵母(Kalb VF，LoperJC，Dey CR，Woods CW，Sutter TR(1986)釀酒酵母細(xì)胞色素P-450結(jié)構(gòu)基因的分離，Gene 45(3)237-45)、白色念珠茵(Candida albicans)(LambDC，Kelly DE，Baldwin BC，Gozzo F，Boscott P，Richards WG，KellySL(1997)用吡咯抗真菌立體異構(gòu)體對白色念珠茵CYP51的分化抑制，F(xiàn)EMS Microbiol Lett 149(1)25-30)、人類(Homo sapiens)(Stromstedt M，Rozman D，Waterman MR.(1996)遍在表達(dá)的人CYP51編碼羊毛甾醇14a-脫甲基酶，表達(dá)受氧甾醇調(diào)節(jié)的細(xì)胞色素P450，Arch Biochem Biophys1996May 1；329(1)73-81c)或褐鼠(Rattus norvegicus)(Aoyama Y，F(xiàn)unae Y，Noshiro M，Horiuchi T，Yoshida Y(1994)大鼠肝中存在與酵母羊毛甾醇14-脫甲基酶(P450(14DM))高度同源的P450，Biochem BiophysRes Commun.Jun 30；201(3)1320-6)羊毛甾醇C14-脫甲基酶的核酸。
在根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因生物中，這樣在此優(yōu)選的實(shí)施方案中存在與野生型相比至少一種其他的羊毛甾醇C14-脫甲基酶基因。
根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因生物中羊毛甾醇C14-脫甲基酶基因的量至少為兩種，優(yōu)選地多于兩種，尤其優(yōu)選地多于三種，非常尤其優(yōu)選地多于五種。
說明書中提到的所有核酸可為例如RNA、DNA或cDNA序列。
上述方法優(yōu)選地使用編碼包含氨基酸序列SEQ.ID.NO.6或通過氨基酸的替代、插入或缺失衍生于此序列的序列的蛋白質(zhì)的核酸，其中所述衍生序列與序列SEQ.ID.NO.6在氨基酸水平上具有至少30％，優(yōu)選地至少50％，更優(yōu)選地至少70％，尤其優(yōu)選地至少90％，最優(yōu)選地至少95％的同一性，其中所述蛋白質(zhì)具有羊毛甾醇C14-脫甲基酶的酶特征。
序列SEQ.ID.NO.6組成了釀酒酵母羊毛甾醇C14-脫甲基酶的氨基酸序列。
羊毛甾醇C14-脫甲基酶和羊毛甾醇C14-脫甲基酶基因的其他實(shí)例可例如通過氨基酸序列或數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)回譯(backtranslate)核酸序列與SEQ.ID.NO.2的同源性比較從基因組序列已知的多種生物中容易地發(fā)現(xiàn)。
羊毛甾醇C14-脫甲基酶和羊毛甾醇C14-脫甲基酶基因的其他實(shí)例可以本來已知的方式通過雜交和PCR技術(shù)，例如以序列SEQ.ID.NO.5開始從基因組序列未知的多種生物容易地找到。
在說明書中，術(shù)語“替代”理解為是指一個或多個氨基酸替代一個或多個氨基酸。優(yōu)選地進(jìn)行已知為保守替代的替代，其中替代的氨基酸具有與原來氨基酸相似的性質(zhì)，例如天冬氨酸替代谷氨酸，天冬酰胺替代谷氨酰胺，異亮氨酸替代纈氨酸，異亮氨酸替代亮氨酸，蘇氨酸替代絲氨酸。
缺失為通過直接鍵(direct bond)替代氨基酸。缺失的優(yōu)選位置為多肽的末端和單獨(dú)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域間的連接。
插入為在多肽鏈中引入氨基酸，直接鍵形式上被一個或多個氨基酸替代。
兩種蛋白質(zhì)間的同一性理解為是指每一種情況下整個蛋白質(zhì)長度中氨基酸的同一性，尤其是指用Clustal方法(Higgins DG，Sharp PM.微型計算機(jī)上快速靈敏的多序列比對。Comput Appl.Biosci.1989Apr；5(2)151-1)在來自DNASTAR，inc.Madison，Wisconsin(USA)的Lasergene軟件輔助下通過比對計算的同一性，其中設(shè)置如下參數(shù)多重比對參數(shù)缺口罰分10缺口長度罰分10配對比對參數(shù)K-tuple 1缺口罰分3窗口5
節(jié)省的對角線5因此在蛋白質(zhì)水平與序列SEQ.ID.NO.6有至少30％同一性的蛋白質(zhì)理解為是指當(dāng)該蛋白質(zhì)的序列與序列SEQ.ID.NO.6比對，尤其是根據(jù)上面的程序算法用上面的參數(shù)設(shè)置比對時具有至少30％同一性的蛋白質(zhì)。
在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，在生物中引入編碼包含釀酒酵母羊毛甾醇C14-脫甲基酶氨基酸序列(SEQ.ID.NO.6)的蛋白質(zhì)的核酸。
適當(dāng)?shù)暮怂嵝蛄锌筛鶕?jù)遺傳密碼通過回譯多肽序列獲得。
優(yōu)選地用于此目的的密碼子為根據(jù)生物特異性密碼子選擇經(jīng)常使用的密碼子。密碼子選擇可在該生物其他已知基因的計算機(jī)評估的輔助下容易地確定。
如果例如蛋白質(zhì)要在酵母中表達(dá)，當(dāng)回譯時使用酵母密碼子選擇經(jīng)常是有利的。
在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，在生物中引入包含序列SEQ.ID.NO.5的核酸。
序列SEQ.ID.NO.5組成了釀酒酵母的基因組DNA(ORF S0001049)，其編碼具有序列SEQ.ID.NO.6的羊毛甾醇C14-脫甲基酶。
所有上述羊毛甾醇C14-脫甲基酶基因也可以本來已知的方式通過化學(xué)合成如通過雙螺旋單個重疊互補(bǔ)核酸單位的片段縮合從核苷酸單位產(chǎn)生。寡核苷酸可以已知的方式使用亞磷酸胺(phosphoamidite)法(Voet，Voet，第二版，Wiley Press New York，896-897頁)化學(xué)合成。合成寡核苷酸的退火和在DNA聚合酶Klenow片段輔助下缺口的填充以及連接反應(yīng)在Sambrook等(1989)，Molecular cloningA laboratory manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press中作為常規(guī)克隆方法描述。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，與野生型相比增加HMG-CoA還原酶活性通過增加編碼HMG-CoA還原酶的核酸的基因表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。
在根據(jù)本發(fā)明方法尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，增加編碼HMG-CoA還原酶的核酸的基因表達(dá)通過在生物中引入編碼HMG-CoA還原酶的核酸的核酸構(gòu)建體實(shí)現(xiàn)，其中所述的核酸在生物中的表達(dá)與野生型相比受下降調(diào)節(jié)。
與野生型相比下降調(diào)節(jié)理解為是指與上面定義的野生型相比降低的調(diào)節(jié)，所述野生型優(yōu)選地在表達(dá)水平或蛋白質(zhì)水平上無調(diào)節(jié)。
下降調(diào)節(jié)可優(yōu)選地通過啟動子方法完成，其中所述的啟動子在核酸構(gòu)建體中與編碼序列有效連接并且在生物中與野生型啟動子相比受下降調(diào)節(jié)。
例如在酵母中中間ADH啟動子只受下降調(diào)節(jié)并因此尤其優(yōu)選作為上述核酸構(gòu)建體中的啟動子。
ADH12s啟動子的此啟動子片段，以下也稱為ADH1，表現(xiàn)出幾乎組成型表達(dá)(Ruohonen L，Penttila M，Keranen S(1991)由釀酒酵母生產(chǎn)芽孢桿菌屬a-淀粉酶的優(yōu)化。Yeast-May-Jun；7(4)337-462；Lang C，LoomanAC(1995)在酵母中有效表達(dá)和分泌黑曲霉(Aspergillus niger)RH5344多聚半乳糖醛酸酶，Appl Microbiol Biotechnol.Dec；44(1-2)147-56.)，所以轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)不再經(jīng)過麥角甾醇生物合成中間物進(jìn)行。
其他具有下降調(diào)節(jié)的優(yōu)選啟動子為組成型啟動子，如酵母TEF1啟動子、酵母GPD啟動子或酵母PGK啟動子(Mumberg D，Muller R，F(xiàn)unkM.(1995)用于不同遺傳背景中異源蛋白質(zhì)受控表達(dá)的酵母載體，Gene.1995Apr 14；156(1)119-22；Chen CY，Oppermann H，Hitzeman RA.(1984)釀酒酵母中同源和異源基因表達(dá)，Nucleic Acid Res.Dec 11；12(23)8951-70)。
在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，下降調(diào)節(jié)可通過使用如編碼HMG-CoA還原酶的核酸完成，其中所述的核酸在生物中的表達(dá)與同源的、直向同源的核酸相比受下降調(diào)節(jié)。
尤其優(yōu)選地使用只編碼HMG-CoA還原酶催化區(qū)域(截短的(t-)HMG-CoA還原酶)的核酸作為編碼HMG-CoA還原酶的核酸。在EP 486290和WO99/16886中描述的此核酸(t-HMG)只編碼HMG-CoA還原酶的催化活性部分而缺少負(fù)責(zé)在蛋白質(zhì)水平上調(diào)節(jié)的膜結(jié)構(gòu)域。這樣此核酸受下降調(diào)節(jié)，尤其在酵母中受下降調(diào)節(jié)并引起HMG-CoA還原酶基因表達(dá)的增加。
上述核酸構(gòu)建體可使用整合載體在染色體水平或使用附加型質(zhì)粒附加型地參入宿主生物，所述載體和質(zhì)粒都包含上述核酸構(gòu)建體。
在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸優(yōu)選地通過上述核酸構(gòu)建體引入，其中所述的構(gòu)建體編碼包含氨基酸序列SEQ.ID.NO.4或通過氨基酸的替代、插入或缺失衍生于此序列的序列的蛋白質(zhì)，其中衍生序列在氨基酸水平上與序列SEQ.ID.NO.4具有至少30％同一性，其中所述的蛋白質(zhì)具有HMG-CoA還原酶的酶特征。
序列SEQ.ID.NO.4組成了截短的HMG-CoA還原酶(t-HMG)的氨基酸序列。
HMG-CoA還原酶的其他實(shí)例，從而減少到催化部分的t-HMG-CoA還原酶的實(shí)例或者編碼基因可例如通過氨基酸序列或來自數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)回譯核酸序列與SEQ ID.NO.4的同源性比較容易地從基因組序列已知的多種生物中發(fā)現(xiàn)。
HMG-CoA還原酶的其他實(shí)例，從而減少到催化部分的t-HMG-CoA還原酶的實(shí)例或者編碼基因通過雜交和PCR技術(shù)，例如以序列SEQ.ID.NO.3開始從基因組序列未知的多種生物容易地找到。
尤其優(yōu)選地使用包含序列SEQ.ID.NO.3的核酸作為編碼截短的HMG-CoA還原酶的核酸。
在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，下降調(diào)節(jié)通過使用如編碼HMG-CoA還原酶的核酸并使用啟動子完成，其中所述的核酸在生物中的表達(dá)與該生物自身的直向同源核酸相比受下降調(diào)節(jié)；所述啟動子與野生型啟動子相比受下降調(diào)節(jié)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，與野生型相比增加角鯊烯環(huán)氧酶活性通過增加編碼角鯊烯環(huán)氧酶的核酸的基因表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。
在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，增加編碼角鯊烯環(huán)氧酶的核酸的基因表達(dá)通過在生物中引入一種或多種編碼角鯊烯環(huán)氧酶的核酸來實(shí)現(xiàn)。
原則上，任何角鯊烯環(huán)氧酶基因(ERG1)，也就是說編碼角鯊烯環(huán)氧酶的任何核酸可用于此目的。在真核來源的含內(nèi)含子的基因組角鯊烯環(huán)氧酶核酸序列的情況中，如果宿主生物不能或不能使其表達(dá)相應(yīng)角鯊烯環(huán)氧酶，優(yōu)選地使用預(yù)處理的核酸序列，如相應(yīng)的cDNAs。
編碼角鯊烯環(huán)氧酶的核酸的實(shí)例為編碼來自釀酒酵母(Jandrositz，A.，等(1991)編碼釀酒酵母角鯊烯環(huán)氧酶的基因克隆及表征，Gene.107155-160)、小鼠(Mus musculus)(Kosuga K，Hata S，Osumi T，SakakibaraJ，Ono T(1995)小鼠角鯊烯環(huán)氧酶cDNA的核苷酸序列，BiochimBiophys Acta，F(xiàn)eb 21；1260(3)345-8b)、褐鼠(Sakakibara J，WatanabeR，Kanai Y，Ono T(1995)大鼠角鯊烯環(huán)氧酶的分子克隆和表達(dá)，J BiolChem Jan 6；270(1)17-20c)或人(Nakamura Y，Sakakibara J，Izumi T，Shibata A，Ono T(1996)HeLa細(xì)胞中通過甾醇和抑制物對角鯊烯環(huán)氧酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，J.Biol.Chem.1996，Apr 5；271(14)8053-6)的角鯊烯環(huán)氧酶的核酸。
在根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因生物中，這樣在此優(yōu)選的實(shí)施方案中存在與野生型相比至少一種其他的角鯊烯環(huán)氧酶基因。
根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因生物中角鯊烯環(huán)氧酶基因的數(shù)目為至少兩種，優(yōu)選地多于兩種，尤其優(yōu)選地多于三種，非常尤其優(yōu)選地多于五種。
上述方法優(yōu)選地使用編碼包含氨基酸序列SEQ.ID.NO.8或通過氨基酸的替代、插入或缺失衍生于此序列的序列的蛋白質(zhì)的核酸，其中所述衍生序列與序列SEQ.ID.NO.8在氨基酸水平上具有至少30％，優(yōu)選地至少50％，更優(yōu)選地至少70％，尤其優(yōu)選地至少90％，最優(yōu)選地至少95％的同一性，其中所述的蛋白質(zhì)具有角鯊烯環(huán)氧酶的酶特征。
序列SEQ.ID.NO.8組成了釀酒酵母角鯊烯環(huán)氧酶的氨基酸序列。
角鯊烯環(huán)氧酶和角鯊烯環(huán)氧酶基因的其他實(shí)例可例如通過氨基酸序列或數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)回譯核酸序列與SEQ.ID.NO.8的同源性比較從基因組序列已知的多種生物中容易地發(fā)現(xiàn)。
角鯊烯環(huán)氧酶和角鯊烯環(huán)氧酶基因的其他實(shí)例可以本來已知的方式通過雜交和PCR技術(shù)，例如以序列SEQ.ID.NO.7開始從基因組序列未知的多種生物容易地找到。
在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，在生物中引入編碼包含釀酒酵母角鯊烯環(huán)氧酶氨基酸序列(SEQ.ID.NO.8)的蛋白質(zhì)的核酸。
適當(dāng)?shù)暮怂嵝蛄锌衫缤ㄟ^根據(jù)遺傳密碼回譯多肽序列獲得。
優(yōu)選地用于此目的的密碼子為根據(jù)生物特異密碼子選擇經(jīng)常使用的密碼子。密碼子選擇可容易地在該生物其他已知基因的計算機(jī)評價輔助下確定。
如果例如蛋白質(zhì)要在酵母中表達(dá)，回譯時使用酵母密碼子選擇經(jīng)常是有利的。
在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，在生物中引入包含序列SEQ.ID.NO.7的核酸。
序列SEQ.ID.NO.7組成了釀酒酵母的基因組DNA(ORF S0003407)，其編碼序列SEQ ID NO.8的角鯊烯環(huán)氧酶。
所有上述角鯊烯環(huán)氧酶基因也可以本來已知的方式通過化學(xué)合成如通過雙螺旋單個重疊互補(bǔ)核酸單位的片段縮合從核苷酸單位產(chǎn)生。寡核苷酸可以已知的方式使用亞磷酸胺法化學(xué)合成(Voet，Voet，第二版，WileyPress New York，896-897頁)。合成寡核苷酸的退火和在DNA聚合酶Klenow片段輔助下缺口的填充以及連接反應(yīng)在Sambrook等(1989)，Molecular cloningA laboratory manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress中作為常規(guī)克隆方法描述。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，與野生型相比增加角鯊烯合成酶活性通過增加編碼角鯊烯合成酶的核酸的基因表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。
在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，增加編碼角鯊烯合成酶的核酸的基因表達(dá)通過在生物中引入一種或多種編碼角鯊烯合成酶的核酸來實(shí)現(xiàn)。
原則上，任何角鯊烯合成酶基因(ERG9)，也就是說編碼角鯊烯合成酶的任何核酸可用于此目的。在真核來源的含內(nèi)含子的基因組角鯊烯合成酶核酸序列的情況中，如果宿主生物不能或不能使其表達(dá)相應(yīng)角鯊烯合成酶，優(yōu)選地使用預(yù)處理的核酸序列，如相應(yīng)的cDNAs。
編碼角鯊烯合成酶的核酸的實(shí)例為編碼釀酒酵母角鯊烯合成酶的核酸(ERG9)(Jennings，S.M.，(1991)酵母角鯊烯合成酶基因的分子克隆和表征，Proc Natl Acad Sci USA.Jul15；88(14)6038-42)、編碼Botryococcusbraunii Okada角鯊烯合成酶的核酸(Devarenne，T.P.等綠色微合金產(chǎn)烴葡萄藻(green microalga Botryococcus braunii)角鯊烯合成酶raceB的分子表征，Arch.Biochem.Biophys.2000，Jan15，373(2)307-17)、編碼馬鈴薯塊莖的角鯊烯合成酶的核酸(Yoshioka H.等，倍半萜環(huán)化酶和角鯊烯合成酶的cDNA克隆，和致病疫霉(Phytophthora infestans)感染的馬鈴薯塊莖中這些基因的表達(dá)，Plant.Cell.Physiol.1999，Sep；40(9)993-8)或編碼光果甘草(Glycyrrhiza glabra)角鯊烯合成酶的核酸(Hayashi，H.等，光果甘草角鯊烯合成酶兩種cDNA的分子克隆和表征，Biol.Pharm.Bull.1999，Sep；22(9)947-50)。
在根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因生物中，從而在此優(yōu)選的實(shí)施方案中與野生型相比存在至少一種其他的角鯊烯合成酶基因。
根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因生物中角鯊烯合成酶基因的數(shù)目為至少兩種，尤其優(yōu)選地多于三種，非常尤其優(yōu)選地多于五種。上述方法優(yōu)選地使用編碼包含氨基酸序列SEQ.ID.NO.10或通過氨基酸的替代、插入或缺失衍生于此序列的序列的蛋白質(zhì)的核酸，其中衍生序列在氨基酸水平上與序列SEQ.ID.NO.10具有至少30％，，優(yōu)選地至少50％，更優(yōu)選地至少70％，尤其優(yōu)選地至少90％，最優(yōu)選地至少95％的同一性，其中所述的蛋白質(zhì)具有角鯊烯合成酶的酶特征。
序列SEQ.ID.NO.10組成了釀酒酵母角鯊烯合成酶(ERG9)的氨基酸序列。
角鯊烯合成酶和角鯊烯合成酶基因的其他實(shí)例可通過氨基酸序列或來自數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)回譯核酸序列與SEQ ID.NO.10的同源性比較從基因組序列已知的多種生物中容易地發(fā)現(xiàn)。
角鯊烯合成酶和角鯊烯合成酶基因的其他實(shí)例可容易地以本來已知的方式通過雜交和PCR技術(shù)，例如以序列SEQ.ID.NO.9開始從基因組序列未知的多種生物容易地找到。
在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，在生物中引入編碼包含釀酒酵母角鯊烯合成酶氨基酸序列(SEQ.ID.NO.10)的蛋白質(zhì)的核酸。
適當(dāng)?shù)暮怂嵝蛄锌衫缤ㄟ^根據(jù)遺傳密碼回譯多肽序列獲得。
優(yōu)選地用于此目的的密碼子為根據(jù)生物特異密碼子選擇經(jīng)常使用的密碼子。密碼子選擇可容易地在該生物其他已知基因的計算機(jī)評價輔助下確定。
如果例如蛋白質(zhì)要在酵母中表達(dá)，回譯時使用酵母密碼子選擇經(jīng)常是有利的。
在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，在生物中引入包含序列SEQ.ID.NO.9的核酸。
序列SEQ.ID.NO.9組成了釀酒酵母的基因組DNA(ORFYHR190W)，其編碼序列SEQ.ID.NO.10的角鯊烯合成酶。
所有上述角鯊烯合成酶基因也可以本來已知的方式通過化學(xué)合成如通過雙螺旋單個重疊互補(bǔ)核酸單位的片段縮合從核苷酸單位產(chǎn)生。寡核苷酸可以已知的方式使用亞磷酸胺法化學(xué)合成(Voet，Voet，第二版，WileyPress New York，896-897頁)。合成寡核苷酸的退火和在DNA聚合酶Klenow片段輔助下缺口的填充以及連接反應(yīng)在Sambrook等(1989)，Molecular cloningA laboratory manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress中作為常規(guī)克隆方法描述。
根據(jù)本發(fā)明的方法中培養(yǎng)的生物為與野生型相比具有降低的Δ22-去飽和酶活性和增加的HMG-CoA還原酶活性以及選自羊毛甾醇C14-脫甲基酶活性、角鯊烯環(huán)氧酶活性和角鯊烯合成酶活性的至少一種活性增加的生物。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，培養(yǎng)的生物為與野生型相比具有降低的Δ22-去飽和酶活性和增加的HMG-CoA還原酶活性和增加的羊毛甾醇C14-脫甲基酶活性、角鯊烯環(huán)氧酶活性或角鯊烯合成酶活性的生物。
根據(jù)本發(fā)明的方法的尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述生物與野生型相比具有降低的Δ22-去飽和酶活性和增加的HMG-CoA還原酶活性和選自羊毛甾醇C14-脫甲基酶活性、角鯊烯環(huán)氧酶活性和角鯊烯合成酶活性至少兩種活性增加的活性。
尤其優(yōu)選的組合為與野生型相比降低的Δ22-去飽和酶活性和增加的HMG-CoA還原酶活性和增加的羊毛甾醇C14-脫甲基酶活性和角鯊烯環(huán)氧酶活性或羊毛甾醇C14-脫甲基酶活性和角鯊烯合成酶活性或增加的角鯊烯環(huán)氧酶活性和角鯊烯合成酶活性。
根據(jù)本發(fā)明的方法的尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述生物與野生型相比具有降低的Δ22-去飽和酶活性和增加的HMG-CoA還原酶活性和增加的羊毛甾醇C14-脫甲基酶活性和增加的角鯊烯環(huán)氧酶活性和增加的角鯊烯合成酶活性。
生物或經(jīng)遺傳修飾的生物根據(jù)本發(fā)明理解為是指例如細(xì)菌，尤其是芽孢桿菌屬(Bacillus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、乳酸桿茵屬(Lactobacillus spec)或鏈霉菌屬(Streptomyces spec.)的細(xì)菌，例如酵母，尤其是釀酒酵母、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)或克魯維酵母屬(Klyveromyces spec.)的酵母，例如真菌，尤其是曲霉屬(Aspergillus spec.)、青霉屬(Penicillium spec.)、或網(wǎng)柄茵屬(Dictyostelium spec.)的真菌，以及例如昆蟲細(xì)胞系，這些生物作為野生型或由于前述遺傳修飾而能夠產(chǎn)生麥角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中間物和/或代謝物。
尤其優(yōu)選的生物或經(jīng)遺傳修飾的生物為酵母，尤其是釀酒酵母種，尤其是酵母菌株釀酒酵母AH22、釀酒酵母GRF、釀酒酵母DBY747和釀酒酵母BY4741。
麥角甾-5，7-二烯醇的生物合成中間物理解為是指所用生物的麥角甾-5，7-二烯醇生物合成中以中間物存在的所有化合物，優(yōu)選指化合物甲羥戊酸、焦磷酸法呢酯、香葉醇焦磷酸酯、環(huán)氧化角鯊烯、4-二甲基膽-8，14，24-三烯醇、4，4-二甲基酵母甾醇、角鯊烯、法呢醇、香葉醇、羊毛甾醇、酵母甾酮(zymosterone)和酵母甾醇。
麥角甾-5，7-二烯醇的生物合成代謝物理解為是指為所用生物中麥角甾-5，7-二烯醇生物合成衍生物的所有那些化合物，也就是說其中麥角甾-5，7-二烯醇以中間物存在。所述化合物可為所用生物天然地從麥角甾-5，7-二烯醇產(chǎn)生的化合物。
然而麥角甾-5，7-二烯醇的生物合成代謝物也理解為是指只能通過引入起始生物其他生物的基因和酶活性在該經(jīng)遺傳修飾的生物中從麥角甾-5，7-二烯醇產(chǎn)生的化合物，其中所述起始生物不具有與所述其他生物直向同源的基因。
由于在酵母中引入其他植物基因和/或哺乳動物基因，可能例如在此酵母中產(chǎn)生僅在植物和/或哺乳動物中天然存在的生物合成麥角甾-5，7-二烯醇代謝物。
在酵母中引入例如編碼植物Δ7-還原酶(DWF5)或其功能等價物或變體的核酸和編碼CYP11A1、ADX(FDX1)、ADR(FDXR)和3β-HSD的成熟形式或它們的功能等價物或變體的核酸引起此酵母中孕酮的生物合成。酵母相應(yīng)遺傳修飾的步驟和方法和材料的詳細(xì)描述公開在C.Duport等，Nat.Biotechnol.1998，16，186-189和其引用的參考文獻(xiàn)中，將它們特別引用作為參考。
在酵母中引入例如編碼植物Δ7-還原酶(DWF5)或其功能等價物或變體的核酸和編碼CYP11A1、ADX(FDX1)和ADR(FDXR)的成熟形式或其功能等價物或變體的核酸和編碼線粒體形式的ADX和CYP11B1、3b-HSD、CYP17A1和CYP21A1或其功能等價物或變體的核酸引起皮質(zhì)醇、11-脫氧皮質(zhì)醇、皮質(zhì)酮和縮醛孕烯醇酮的生物合成。
為進(jìn)一步增加生物合成的麥角甾-5，7-二烯醇代謝物如皮質(zhì)醇的含量，抑制浪費(fèi)的代謝途徑，也就是說抑制導(dǎo)致目的產(chǎn)物的生物合成途徑也是有利的。例如在酵母中降低ATF2、GCY1和YPR1基因產(chǎn)物的活性，尤其優(yōu)選地是缺失這些活性引起皮質(zhì)醇含量的進(jìn)一步增加。
酵母相應(yīng)遺傳修飾的該步驟和方法以及材料的詳細(xì)描述公開在F.M.Szczebara等，Nat.Biotechnol.2003，21，143-149和其引用的參考文獻(xiàn)中，將它們特別引用作為參考。
因此生物合成的麥角甾-5，7-二烯醇代謝物理解為尤其是指菜油甾醇、孕烯醇酮、17-OH孕烯醇酮、孕酮、17-OH-孕酮、11-脫氧皮質(zhì)醇、皮質(zhì)醇、脫氧皮質(zhì)酮和/或皮質(zhì)酮。
優(yōu)選的生物合成代謝物為孕酮、皮質(zhì)酮和皮質(zhì)醇，尤其優(yōu)選地為皮質(zhì)醇。
根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的一些化合物本身為類固醇激素并可用于治療目的。
產(chǎn)生的化合物，如麥角甾-5，7-二烯醇或皮質(zhì)醇也可用于通過生物轉(zhuǎn)化、化學(xué)合成或生物技術(shù)生產(chǎn)來制備類固醇激素或合成具有強(qiáng)烈消炎、流產(chǎn)或抗增殖活性的活性成分。
根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)麥角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中間物和/或代謝物的方法中，培養(yǎng)經(jīng)遺傳修飾的生物(以下也稱為轉(zhuǎn)基因生物)的步驟后優(yōu)選地為收獲生物和從該生物分離麥角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中間物和/或代謝物。
以本來已知的適合該生物的方式收獲生物。通過發(fā)酵在液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長的微生物如細(xì)菌、蘚類、酵母和真菌或植物細(xì)胞可通過例如離心、傾析或過濾分離。
所收獲的生物量中的麥角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中間物和/或代謝物以本來已知的方式一起分離或分別分離每一種化合物，例如通過提取和如果適當(dāng)?shù)脑挘渌瘜W(xué)和物理純化方法如沉淀法、結(jié)晶、熱分離法像精餾法或物理分離法如層析。
本發(fā)明還涉及從起始生物開始產(chǎn)生經(jīng)遺傳修飾的生物的方法，所述經(jīng)遺傳修飾的生物中Δ22-去飽和酶活性降低，HMG-CoA還原酶活性增加并且選自羊毛甾醇C14-脫甲基酶活性、角鯊烯環(huán)氧酶活性和角鯊烯合成酶活性的至少一種活性增加。
缺失目標(biāo)基因座Δ22-去飽和酶基因的方法在上文中已詳細(xì)描述。
轉(zhuǎn)基因生物，尤其是酵母可優(yōu)選地用核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化起始生物，尤其是酵母來產(chǎn)生，其中所述核酸構(gòu)建體包含至少一種編碼HMG-CoA還原酶的核酸并包含至少一種選自編碼羊毛甾醇C14-脫甲基酶的核酸、編碼角鯊烯環(huán)氧酶的核酸和編碼角鯊烯合成酶的核酸的核酸，其中所述核酸與一種或多種確保生物中轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)節(jié)信號有效連接。在此實(shí)施方案中，使用核酸構(gòu)建體產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物。
可用于此目的的核酸構(gòu)建體為除了下述表達(dá)盒還包含啟動子、編碼序列和如果適當(dāng)?shù)脑挘K止子，和除了下述選擇標(biāo)記還含有在3’和5’端包含與待缺失基因開始和末尾的核酸序列相同的核酸序列的核酸構(gòu)建體。
然而轉(zhuǎn)基因生物也可優(yōu)選地用幾種核酸構(gòu)建體的聯(lián)合轉(zhuǎn)化起始生物尤其是酵母產(chǎn)生，其中所述的核酸構(gòu)建體包含這樣的核酸構(gòu)建體，其包含至少一種編碼HMG-CoA還原酶的核酸，其中所述的核酸構(gòu)建體還包含包含選自編碼羊毛甾醇C14-脫甲基酶的核酸、編碼角鯊烯環(huán)氧酶的核酸和編碼角鯊烯合成酶的核酸至少一種核酸的核酸構(gòu)建體或核酸構(gòu)建體的聯(lián)合，其中每一種情況下核酸構(gòu)建體與確保在生物中轉(zhuǎn)錄和翻譯的一種或多種調(diào)節(jié)信號有效連接。在此實(shí)施方案中，使用單個的核酸構(gòu)建體或核酸構(gòu)建體的聯(lián)合產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物。
其中編碼核酸序列與一種或多種確保在生物中尤其是酵母中轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)節(jié)信號有效連接的核酸構(gòu)建體在下文中也稱為表達(dá)盒。
包含此表達(dá)盒的核酸構(gòu)建體為例如載體或質(zhì)粒。
調(diào)節(jié)信號優(yōu)選地包含確保生物中尤其是酵母中轉(zhuǎn)錄和翻譯的一個或多個啟動子。
表達(dá)盒包含調(diào)節(jié)信號，也就是說控制宿主細(xì)胞中編碼序列表達(dá)的調(diào)節(jié)核酸序列。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，表達(dá)盒包括啟動子上游，即在編碼序列的5’端，和終止子下游，即在3’端，以及如果適當(dāng)?shù)脑?，與至少一種上述基因的插入編碼序列有效連接的其他調(diào)節(jié)元件。
有效連接理解為是指啟動子、編碼序列，如果適當(dāng)?shù)脑挘K止子和如果適當(dāng)?shù)脑?，其他調(diào)節(jié)元件的順序排列使得每一種調(diào)節(jié)元件在編碼序列的表達(dá)中可完成其計劃的功能。
作為實(shí)例，酵母、真菌的優(yōu)選核酸構(gòu)建體、表達(dá)盒和質(zhì)粒和產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因酵母的方法以及轉(zhuǎn)基因酵母本身在下文中描述。
表達(dá)盒的適當(dāng)啟動子原則上為能控制生物中尤其是酵母中外源基因表達(dá)的任何啟動子。
優(yōu)選使用的啟動子，尤其是在酵母中受下降調(diào)節(jié)的啟動子為例如中間ADH啟動子。
ADH12s啟動子的此啟動子片段以下也稱為ADH1，其表現(xiàn)出接近組成型表達(dá)(Ruohonen L，Penttila M，Keranen S(1991)通過釀酒酵母優(yōu)化芽孢桿菌α-淀粉酶生產(chǎn)，Yeast.May-Jun；7(4)337-462；Lang C，LoomanAC(1995)黑曲霉RH5344多聚半乳糖醛酸酶在釀酒酵母中的有效表達(dá)和分泌，Appl Microbiol Biotechnol.Dec；44(1-2)147-56.)，從而轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)不再受麥角甾醇生物合成中間物的影響。
其他下降調(diào)節(jié)的優(yōu)選啟動子為組成型啟動子如酵母TEF1啟動子、酵母GPD啟動子或酵母PGK啟動子(Mumberg D，Muller R，F(xiàn)unk M.(1995)不同遺傳背景中異源蛋白質(zhì)受控表達(dá)的酵母載體，Gene.1995Apr 14；156(1)119-22；Chen CY，Oppermann H，Hitzeman RA.(1984)釀酒酵母中同源和異源基因表達(dá)，Nucleic Acid Res.Dec 11；12(23)8951-70.)。
表達(dá)盒也可以包含誘導(dǎo)型啟動子，尤其是化學(xué)誘導(dǎo)型啟動子，通過所述啟動子，編碼HMG-CoA還原酶、羊毛甾醇C14-脫甲基酶、角鯊烯環(huán)氧酶或角鯊烯合成酶的核酸在生物中的表達(dá)可在特定時間點(diǎn)受到控制。
作為實(shí)例，可以使用此類啟動子，例如酵母CupI啟動子(Etcheverry T.(1990)使用酵母銅金屬硫蛋白啟動子的誘導(dǎo)表達(dá)，Methods Enzymol.1990；185319-29)、酵母Gall-10啟動子(Ronicke V，Graulich W，MumbergD，Muller R，F(xiàn)unk M(1997)釀酒酵母中表達(dá)異源蛋白質(zhì)的條件啟動子的用途，Methods Enzymol.283313-22)或酵母Pho5啟動子(Bajwa W，Rudolph H，Hinnen A(1987)PHO5上游序列賦予組成型PHO3基因的磷酸控制，Yeast.1987Mar；3(1)33-42)。
原則上，表達(dá)盒的適當(dāng)終止子為能控制生物中尤其是酵母中外源基因表達(dá)的任何終止子。
優(yōu)選的為酵母色氨酸終止子(TRP1終止子)。
表達(dá)盒優(yōu)選地通過適當(dāng)啟動子與上述編碼HMG-CoA還原酶、羊毛甾醇C14-脫甲基酶、角鯊烯環(huán)氧酶或角鯊烯合成酶的核酸和如果適當(dāng)?shù)脑挘K止子的融合來產(chǎn)生，所述融合使用例如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)，T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)和Ausubel，F(xiàn).M.等，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience(1987)中所述的常規(guī)重組和克隆技術(shù)進(jìn)行。
根據(jù)本發(fā)明的核酸可以合成或天然獲得或包含合成的和天然核酸成分的混合物或由來自多種生物的多種異源基因片段組成。
如上所述，優(yōu)選的為具有酵母優(yōu)選密碼子的合成核苷酸序列。這些酵母優(yōu)選的密碼子可從在大多數(shù)目的酵母種類中表達(dá)的具有最高蛋白質(zhì)頻率密碼子確定。
當(dāng)制備表達(dá)盒時，可操作多種DNA片段以獲得以正確方向方便閱讀并配有正確閱讀框的核苷酸序列?？稍谄沃屑尤虢宇^或連接體以連接DNA片段與另一個DNA片段。
可方便地提供轉(zhuǎn)錄方向的啟動子和終止子區(qū)域，它們具有包含用于此序列插入的一個或多個限制性切割位點(diǎn)的連接體或多聚連接體提供。通常，連接體具有1-10個，大多數(shù)情況下1-8個，優(yōu)選地2-6個限制性切割位點(diǎn)?？傊?，調(diào)節(jié)區(qū)域中的連接體具有少于100bp，經(jīng)常少于60bp，但至少5bp的大小。啟動子可關(guān)于宿主生物為天然的或同源的，或者外源的或異源的。表達(dá)盒優(yōu)選地在5’-3’轉(zhuǎn)錄方向上包含啟動子、編碼核酸序列或核酸構(gòu)建體和轉(zhuǎn)錄終止的區(qū)域。多種終止區(qū)域可按需要互相替換。
還可以使用提供適當(dāng)限制性切割位點(diǎn)或者除去多余DNA或限制性切割位點(diǎn)的操作。在插入、缺失或替代如轉(zhuǎn)換和顛換適當(dāng)?shù)牡胤剑墒褂皿w外誘變、引物修復(fù)、限制或連接。
適當(dāng)?shù)牟僮魅缦拗啤hewing back或填補(bǔ)突出端得到平端可提供用于連接反應(yīng)的片段互補(bǔ)末端。
本發(fā)明還涉及上述核酸、上述核酸構(gòu)建體或上述蛋白質(zhì)對產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物尤其是轉(zhuǎn)基因酵母的用途。
這些轉(zhuǎn)基因生物，尤其是轉(zhuǎn)基因酵母與野生型相比優(yōu)選地具有增加的麥角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中間物和/或代謝物含量。
本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的上述核酸或核酸構(gòu)建體對增加生物中麥角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中間物和/或代謝物含量的用途。
上述蛋白質(zhì)和核酸可用于在轉(zhuǎn)基因生物中產(chǎn)生麥角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中間物和/或代謝物。
外源基因向生物，尤其是酵母基因組中的轉(zhuǎn)移稱作轉(zhuǎn)化。
本身已知的轉(zhuǎn)化方法可用于此目的，尤其用于酵母中。
轉(zhuǎn)化酵母的適當(dāng)方法為例如Schiestl RH，Gietz RD(1989)使用單鏈核酸作為載體高效轉(zhuǎn)化完整酵母細(xì)胞，Curr Genet.Dec；16(5-6)339-46中所述的LiAC方法，如Manivasakam P，Schicstl RH(1993)通過電穿孔高效轉(zhuǎn)化釀酒酵母，Nucleic Acid Res.Sep 11；21(18)4414-5中描述的電穿孔，或如Morgan AJ.(1983)通過原生質(zhì)體融合和轉(zhuǎn)化對酵母菌株的改進(jìn)，Experientia Suppl.46155-66中所述的原生質(zhì)體制備。
待表達(dá)的構(gòu)建體優(yōu)選地克隆到載體中，尤其克隆到適于轉(zhuǎn)化酵母的質(zhì)粒中，如載體系統(tǒng)Yep24(Naumovski L，F(xiàn)riedberg EC(1982)經(jīng)UV輻射的DNA的切除修復(fù)所需的真核基因的分子克隆釀酒酵母RAD3基因的分離和部分表征，J Bacteriol Oct；152(1)323-31)、Yep13(Broach JR，Strathern JN，Hicks JB.(1979)酵母中的轉(zhuǎn)化開發(fā)雜合克隆載體和分離CAN1基因，Gene.1979Dec；8(1)121-33)、pRS載體系列(著絲粒和附加體)(Sikorski RS，Hieter P.(1989)為在釀酒酵母中有效操作DNA設(shè)計的穿梭載體系統(tǒng)和酵母宿主菌株，Genetics.May；122(1)19-27)和載體系統(tǒng)YCp19或pYEXBX。
因此本發(fā)明還涉及載體，尤其涉及包含上述核酸、核酸構(gòu)建體或表達(dá)盒的質(zhì)粒。
本發(fā)明還涉及通過在起始生物中功能性插入上述核酸或上述核酸構(gòu)建體產(chǎn)生經(jīng)遺傳修飾的生物的方法。
本發(fā)明還涉及經(jīng)遺傳修飾的生物，其中遺傳修飾與野生型相比降低Δ22-去飽和酶活性，增加HMG-CoA還原酶活性并增加選自羊毛甾醇C14-脫甲基酶活性、角鯊烯環(huán)氧酶活性和角鯊烯合成酶活性的至少一種活性。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，經(jīng)遺傳修飾的生物與野生型相比具有降低的Δ22-去飽和酶活性和增加的HMG-CoA還原酶活性和增加的羊毛甾醇C14-脫甲基酶活性。
在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，經(jīng)遺傳修飾的生物與野生型相比具有降低的Δ22-去飽和酶活性和增加的HMG-CoA還原酶活性和增加的角鯊烯環(huán)氧酶活性。
在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，經(jīng)遺傳修飾的生物與野生型相比具有降低的Δ22-去飽和酶活性和增加的HMG-CoA還原酶活性和增加的角鯊烯合成酶活性。
在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，經(jīng)遺傳修飾的生物與野生型相比具有降低的Δ22-去飽和酶活性和增加的HMG-CoA還原酶活性和增加的羊毛甾醇C14-脫甲基酶活性和增加的角鯊烯環(huán)氧酶活性。
在另一個尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，經(jīng)遺傳修飾的生物與野生型相比具有降低的Δ22-去飽和酶活性和增加的HMG-CoA還原酶活性和增加的羊毛甾醇C14-脫甲基酶活性和增加的角鯊烯合成酶活性。
在另一個尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，經(jīng)遺傳修飾的生物與野生型相比具有降低的Δ22-去飽和酶活性和增加的HMG-CoA還原酶活性和增加的角鯊烯環(huán)氧酶活性和增加的角鯊烯合成酶活性。
在非常尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，經(jīng)遺傳修飾的生物與野生型相比具有降低的Δ22-去飽和酶活性和增加的HMG-CoA還原酶活性和增加的羊毛甾醇C14-脫甲基酶活性和增加的角鯊烯環(huán)氧酶活性和增加的角鯊烯合成酶活性。
如上面提到的，這些活性優(yōu)選地通過與野生型相比獨(dú)立地增加編碼HMG-CoA還原酶的核酸、編碼羊毛甾醇C14-脫甲基酶的核酸、編碼角鯊烯環(huán)氧酶的核酸或編碼角鯊烯合成酶的核酸的基因表達(dá)來自增加。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的經(jīng)遺傳修飾的生物的其他優(yōu)選實(shí)施方案在上文的方法中描述。
上述經(jīng)遺傳修飾的生物與野生型相比具有增加的麥角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中間物和/或代謝物含量。
因此本發(fā)明涉及上述經(jīng)遺傳修飾的生物，其中經(jīng)遺傳修飾的生物與野生型相比具有增加的麥角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中間物和/或代謝物含量。
生物或經(jīng)遺傳修飾的生物根據(jù)本發(fā)明理解為是指例如細(xì)菌，尤其是芽孢桿菌屬、大腸桿菌、乳酸菌屬或鏈霉菌屬的細(xì)菌，例如酵母，尤其是釀酒酵母、巴斯德畢赤酵母或克魯維酵母屬的酵母，例如真菌，尤其是曲霉屬、青霉屬、或網(wǎng)柄茵屬的真菌，以及例如還有昆蟲細(xì)胞系，這些生物作為野生型或由于前述遺傳修飾而能夠產(chǎn)生麥角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中間物和/或代謝物。
尤其優(yōu)選的生物或經(jīng)遺傳修飾的生物為酵母，尤其是釀酒酵母種，尤其是酵母菌株釀酒酵母AH22、釀酒酵母GRF、釀酒酵母DBY747和釀酒酵母BY4741。
對于本發(fā)明，優(yōu)選地，增加麥角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中間物和/或代謝物的含量是指與未經(jīng)遺傳修飾的生物相比，經(jīng)遺傳修飾的生物中所提到的這些化合物中至少一種開始時的生物合成速度增加這一人工獲得的能力。
與野生型相比麥角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中間物和/或代謝物增加的含量尤其理解為指與野生型相比生物中至少一種上述化合物增加至少50％，優(yōu)選100％，更優(yōu)選地200％，尤其優(yōu)選地400％。
確定至少一種上述化合物的含量優(yōu)選地通過本來已知的分析法進(jìn)行，并優(yōu)選地涉及生物中甾醇產(chǎn)生的那些區(qū)室。
與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的優(yōu)勢如下根據(jù)本發(fā)明的方法使生產(chǎn)生物中增加麥角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中間物和/或代謝物含量成為可能。
本發(fā)明現(xiàn)將通過下面實(shí)施例描述，但不局限于這些實(shí)施例I.常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件1.限制酶反應(yīng)質(zhì)粒(1-10μg)在30μl反應(yīng)物中限制性切割。為此，將DNA溶于24μlH2O中并用3μl目標(biāo)緩沖液、1ml BSA(牛血清白蛋白)和2μl酶處理。根據(jù)DNA的量，酶濃度為1單位/μl或5單位/μl。一些情況下，反應(yīng)物中也加入1μl RNA酶以分解tRNA。限制性反應(yīng)物于37℃孵育2小時。用微型膠檢測限制性反應(yīng)。
2.凝膠電泳凝膠電泳在微型膠或?qū)捨⑿湍z裝置中進(jìn)行。微型膠(約20ml，8孔)和寬微型膠(50ml，15或30孔)由溶于TAE的1％瓊脂糖組成。所用的運(yùn)行緩沖液為1×TAE。樣品(10μl)用3μl終止溶液處理并應(yīng)用。HindIII-切割的I-DNA作為標(biāo)準(zhǔn)(帶位于23.1kb；9.4kb；6.6kb；4.4kb；2.3kb；2.0kb；0.6kb)。為了分離，使用80伏特進(jìn)行45-60分鐘。此后，凝膠在溴化乙錠中染色并于紫外線下用視頻記錄系統(tǒng)INTAS記錄或使用橙色濾光器拍照。
3.凝膠洗脫目的片段通過凝膠洗脫方法分離。限制性反應(yīng)物加入到微型膠的多個孔中并進(jìn)行電泳。只有λ-HindIII和“犧牲泳道”(sacrificial lane)用溴化乙錠染色并在紫外線下觀察，標(biāo)記目的片段。這樣避免了溴化乙錠和紫外線對剩余孔中DNA的破壞。通過將染色的和未染色的凝膠板相鄰放置，可能以標(biāo)記為參考從未染色凝膠板中切出目的片段。含待分離片段的瓊脂糖部分放于透析管中，用少量無氣泡的TAE緩沖液密封并放于BioRad微型膠裝置中。運(yùn)行緩沖液由1×TAE組成，所用的電壓為100V 40分鐘。此后，電流極性顛倒2分鐘以再溶解粘附在透析管上的DNA。含DNA片段的透析管緩沖液移入反應(yīng)容器中并用于進(jìn)行乙醇沉淀。為此，向DNA溶液中加入1/10體積的3M醋酸鈉，tRNA(每50μl溶液1μ1)和2.5體積用冰預(yù)冷的96％乙醇。反應(yīng)物于-20℃孵育30分鐘然后于4℃以12000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘。干燥DNA沉淀并溶于10-50μl H2O中(取決于DNA量)。
4.Klenow處理Klenow處理引起DNA片段突出端的填充以產(chǎn)生平端。每微克DNA中將下列混合物吸取到一起DNA沉淀+11μl H2O+1.5μl 10×Klenow緩沖液+1μl 0.1 M DTT+1μl寡核苷酸(dNTP 2mM)25+1μl Klenow聚合酶(1單位/μl)用于此目的的DNA應(yīng)來源于乙醇沉淀以防止污染物抑制Klenow聚合酶?；旌衔镉?7℃C孵育30分鐘并再于70℃孵育5分鐘停止反應(yīng)。通過乙醇沉淀從混合物中獲得DNA并溶于10μl H2O中。
5.連接合并待連接的DNA片段。13.1μl的終體積中含有載體插入片段比例為1∶5的約0.5μl DNA。樣品于70℃C孵育45秒，冷卻到室溫(約3分鐘)然后在冰上孵育10分鐘。此后，加入連接緩沖液2.6μl 500mM trisHCl pH7.5和1.3μl 100mM MgCl2，混合物在冰上再孵育10分鐘。加入1μl 500mMDTT和1μl 10mM ATP并在冰上再孵育10分鐘之后，加入1μl連接酶(1單位/pl)。整個處理過程應(yīng)該盡可能得避免震動以防止再次分離已連接的DNA末端。連接反應(yīng)在14℃過夜進(jìn)行。
6.大腸桿菌轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌(E.coli)NM522細(xì)胞用連接反應(yīng)的DNA轉(zhuǎn)化。同時用50μg pScL3質(zhì)粒作為陽性對照和無DNA的反應(yīng)物作為零對照進(jìn)行反應(yīng)。每一個轉(zhuǎn)化反應(yīng)中，在臺式離心機(jī)管中吸入100μl 8％PEG溶液、10μlDNA和200μl感受態(tài)細(xì)胞(大腸桿菌NM522)。反應(yīng)物置于冰上30分鐘并偶爾搖動。
然后施以熱激處理42℃ 1分鐘。為了再生，向細(xì)胞中加入1ml LB培養(yǎng)基，混合物于搖動器上37℃孵育90分鐘。將100μl未稀釋反應(yīng)物、1∶10稀釋的反應(yīng)物和1∶100稀釋的反應(yīng)物鋪于LB+氨芐青霉素平板上并于37℃孵育過夜。
7.從大腸桿菌分離質(zhì)粒(小量制備)大腸桿菌克隆在1.5ml LB+氨芐青霉素培養(yǎng)基的臺式離心機(jī)管中37℃120轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)過夜。次日于4℃5000轉(zhuǎn)/分離心細(xì)胞5分鐘，沉淀溶于50μl TE緩沖液中。每一種反應(yīng)物用100μl 0.2N NaOH、1％SDS溶液處理，混合并放于冰上5分鐘(細(xì)胞溶解)。此后，加入400μl醋酸鈉/NaCl溶液(230μl H2O，130μl 3M醋酸鈉，40μl 5M NaCl)，混合反應(yīng)物并再放于冰上15分鐘(蛋白質(zhì)沉淀)。11000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘之后，含有質(zhì)粒DNA的上清液轉(zhuǎn)入Eppendorf管中。如果上清液不是完全澄清，將其再次離心。上清液用360μl冰上預(yù)冷的異丙醇處理并于-20℃孵育30分鐘(DNA沉淀)。離心出DNA(15分鐘，12000轉(zhuǎn)/分，4℃)，棄上清液，沉淀用100μl冰上預(yù)冷96％乙醇洗滌，于-20℃孵育15分鐘并再次離心(15分鐘，12000轉(zhuǎn)/分，4℃)。沉淀在Speed Vac裝置中干燥然后溶于100μl H2O中。質(zhì)粒通過限制性分析來鑒定。為此，10μl每一種反應(yīng)物進(jìn)行限制性酶切并在寬微型膠中通過凝膠電泳分離(見上文)。
8.從大腸桿菌制備質(zhì)粒(大量制備)為分離大量質(zhì)粒DNA，實(shí)施大量制備方法。含100ml LB+氨芐青霉素培養(yǎng)基的兩個燒瓶中接種茵落或含有待分離質(zhì)粒的100μl冰凍培養(yǎng)物并于37℃120轉(zhuǎn)/分孵育過夜。次日，培養(yǎng)物(200ml)轉(zhuǎn)入GSA燒杯中并以4000轉(zhuǎn)/分(2600xg)離心10分鐘。細(xì)胞沉淀溶于6ml TE緩沖液中。為消化細(xì)胞壁，加入1.2ml溶茵酶溶液(20mg/ml TE緩沖液)，混合物室溫孵育10分鐘。細(xì)胞隨后用12ml 0.2N NaOH，1％SDS溶液裂解并再于室溫孵育5分鐘。通過加入9ml冷的3M醋酸鈉溶液(pH4.8)并于冰上孵育15分鐘沉淀蛋白質(zhì)。離心(GSA13000轉(zhuǎn)/分(27500xg)，20分鐘，4℃)之后，含有DNA的上清液轉(zhuǎn)入新的GSA燒杯中，用15ml冰上預(yù)冷的異丙醇沉淀DNA，-20℃孵育30分鐘。DNA沉淀在5ml冰上預(yù)冷的乙醇中洗滌并于空氣中干燥(約30-60分鐘)。然后將DNA沉淀溶于1mlH2O中。質(zhì)粒通過限制性分析驗(yàn)證。通過在微型膠中應(yīng)用稀釋確定濃度。微量透析(孔徑0.025μm)進(jìn)行30-60分鐘以降低鹽含量。
9.酵母轉(zhuǎn)化建立釀酒酵母AH22菌株的預(yù)培養(yǎng)物用于酵母轉(zhuǎn)化。含有20ml YE培養(yǎng)基的燒瓶中接種100μl冷凍培養(yǎng)物并于28℃120轉(zhuǎn)/分孵育過夜。主要培養(yǎng)在含有100ml YE培養(yǎng)基的燒瓶中于相同條件下進(jìn)行，其中所述的培養(yǎng)基已用10μl、20μl或50μl預(yù)培養(yǎng)物接種。
9.1感受態(tài)細(xì)胞的產(chǎn)生次日，燒瓶用血細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)，選擇具有3-5×107個細(xì)胞/ml細(xì)胞濃度的燒瓶用于下一步操作。通過離心(GSA5000轉(zhuǎn)/分(4000xg)l0分鐘)收獲細(xì)胞。細(xì)胞沉淀溶于10ml TE緩沖液中并分到兩個臺式離心管中(每一個5ml)。6000轉(zhuǎn)/分3分鐘離心出細(xì)胞，用每一情況中5ml TE緩沖液洗滌細(xì)胞兩次。細(xì)胞沉淀隨后以每109個細(xì)胞330μl醋酸鋰緩沖液溶解，轉(zhuǎn)入無菌50ml錐形瓶中并于28℃搖動1小時。這樣細(xì)胞為轉(zhuǎn)化的感受態(tài)。
9.2轉(zhuǎn)化每一次轉(zhuǎn)化反應(yīng)中，在臺式離心管中吸入15μl鯡精DNA(10mg/ml)、10μl待轉(zhuǎn)化DNA(約0.5μg)和330μl感受態(tài)細(xì)胞并于28℃孵育30分鐘(不需搖動)。此后，加入700μl 50％PEG 6000，反應(yīng)物于28℃不搖動再孵育一小時。然后于42℃熱激處理5分鐘。100μl懸浮物鋪于選擇培養(yǎng)基(YNB，Difco)上以選擇亮氨酸光合營養(yǎng)性。對于G418抗性的選擇，細(xì)胞在熱激處理之后再生(見9.3，再生期)。
9.3再生期因?yàn)檫x擇標(biāo)記為G418抗性，細(xì)胞需要時間表達(dá)抗性基因。轉(zhuǎn)化反應(yīng)物用4ml YE培養(yǎng)基處理并于振蕩器上(120轉(zhuǎn)/分)28℃孵育過夜。次日，離心出細(xì)胞(6000轉(zhuǎn)/分，3分鐘)，溶于1ml YE培養(yǎng)基中，100μl或200μl此培養(yǎng)基鋪于YE+G418平皿上。平皿于28℃孵育數(shù)天。
10.PCR反應(yīng)條件聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的反應(yīng)條件必須為每一單獨(dú)的情況優(yōu)化并且不對每一操作均有效。這樣就可能改變所用DNA的量、鹽濃度和解鏈溫度。對我們的方法來說，證明適宜的是在Eppendorf管中混合用于熱循環(huán)儀中的下列物質(zhì)5μl Super Buffer、8μl dNTPs(每一種0.625μM)、5’-引物、3’-引物和0.2μg模板DNA，溶解于一定量的水中使PCR反應(yīng)物總體積50μl，加入2μl(＝0.1U)Super Taq聚合酶。短暫離心反應(yīng)物并用一滴油覆蓋。選擇37-40個循環(huán)用于擴(kuò)增。
II.實(shí)施例實(shí)施例1在釀酒酵母GRF中表達(dá)截短的HMG-CoA還原酶。
由ADH-啟動子-tHMG-色氨酸-終止子組成的表達(dá)盒的編碼核酸序列使用上文詳述的標(biāo)準(zhǔn)方法在常規(guī)反應(yīng)條件下通過PCR從載體YepH2(Polakowski等(1998)胞質(zhì)羥基甲基戊二酰-CoA還原酶的過量表達(dá)引起酵母中角鯊烯的積累，Appl Microbiol Biotechnol.Jan；49(1)66-71)擴(kuò)增。
用于此目的的引物為DNA寡聚物AtHT-5’(正向tHMGNotF5’-CTGCGGCCGCATCATGGACCAATTGGTGAAAACTG-3’；SEQ.ID.NO.11)和AtHT-3’(反向tHMGXhoR5’-AACTCGAGAGACACATGGTGCTGTTGTGCTTC-3’；SEQ.ID.No.12)。
得到的DNA片段首先用Klenow處理然后平末端克隆到載體pUG6的EcoRV切割位點(diǎn)中，產(chǎn)生載體pUG6-tHMG(

圖1)。
分離質(zhì)粒之后，通過PCR方法從載體pUG-tHMG擴(kuò)增延長的片段以使得到的片段由下列成分組成loxP-kanMX-ADH-啟動子-tHMG-色氨酸-終止子-loxP。所選的引物為在5’和3’突出端分別包含URA3基因的5’或3’序列并在退火區(qū)域包含載體pUG-tHMG的loxP區(qū)域5’和3’的序列。這首先確保了包括KanR和tHMG的全部片段得到擴(kuò)增并其次確保了此片段可隨后轉(zhuǎn)化酵母和全部片段通過同源重組整合到酵母URA3基因座中。
所用的選擇標(biāo)記為G418抗性。得到的菌株釀酒酵母GRF-tHlura3為尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型并含有ADH啟動子和色氨酸終止子控制下的基因tHMG的拷貝。
為隨后再次去除G418抗性，得到的酵母菌株用cre重組酶載體pSH47(Guldener U，Heck S，F(xiàn)ielder T，Beinhauer J，Hegemann JH.(1996)在出芽酵母中重復(fù)使用的新的有效基因破壞盒，Nucleic Acid Res.Jul 1；24(13)2519-24.)轉(zhuǎn)化。由于此載體，cre重組酶在酵母中表達(dá)并且結(jié)果，兩個loxP序列中的序列區(qū)域在基因外重組。結(jié)果是兩個loxP序列中只有一個和ADH-tHMG-TRP盒保留在URA3基因座中。結(jié)果，酵母菌株再次丟失G418抗性并由此適于分別通過此cre-lox系統(tǒng)在酵母菌株中整合其他基因或去除這些基因?，F(xiàn)在載體pSH47可通過在添加尿嘧啶(20mg/l)和FOA(5-氟乳清酸)(1g/l)的YNB瓊脂板上反選擇再次去除。為此，具有此質(zhì)粒的細(xì)胞必須首先在非選擇條件下培養(yǎng)并隨后在含F(xiàn)OA的選擇平板上生長。只有自身不能合成尿嘧啶的細(xì)胞能在這些條件下生長。在這種情況下，這些細(xì)胞為不再含有質(zhì)粒(pSH47)的細(xì)胞。
酵母菌株GRFtH1ura3和原始茵株GRF在20ml的培養(yǎng)體積中于WMXIII培養(yǎng)基中28℃下以160轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)48小時。隨后500μl此預(yù)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入50ml相同培養(yǎng)基的主要培養(yǎng)基中并在帶擋板搖瓶中28℃和160轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)4天。
4天后按照Parks LW，Bottema CD，Rodriguez RJ，Lewis TA.(1985)酵母甾醇用作甾醇代謝研究工具的酵母突變體，Methods Enzymol.1985；111333-46中所述的方法提取甾醇并通過氣相層析分析。這得到了表1中所列數(shù)據(jù)。百分?jǐn)?shù)基于酵母干重。
表1
實(shí)施例2在釀酒酵母GRFtH1ura3中表達(dá)ERG1同時缺失ERG5；GRFtH1ura3ERG1erg5的產(chǎn)生實(shí)施例2.1整合載體pUG6-ERG1的產(chǎn)生由ADH-啟動子-ERG1-色氨酸-終止子組成的盒的DNA序列通過用酶NheI和Bsp68I(NruI)限制性酶切使用常規(guī)方法從載體pFlat3-ERG1中分離。得到的DNA片段用Klenow處理然后以平端克隆到載體pUG6的EcoRV切割位點(diǎn)中，產(chǎn)生載體pUG6-ERG1(圖2)。
實(shí)施例2.2整合轉(zhuǎn)化分離質(zhì)粒之后，通過PCR從載體pUG6-ERG1擴(kuò)增延長的片段以使得到的片段由下列組分組成loxP-kanMX-loxP-ADH1-Pr.-ERG1-Trp-Term。所用的引物為寡核苷酸序列，其在退火區(qū)域分別含有載體pUG6-ERG1待擴(kuò)增盒之外的序列和在5’和3’突出端含有整合基因座ERG5的5’或3’序列。這首先確保包括KanR和靶基因ERG1的完整片段得到擴(kuò)增，其次確保此片段可隨后轉(zhuǎn)化到酵母中并通過同源重組整合到酵母靶基因座ERG5中。下列引物用于此目的ERG5-Crelox-5’(SEQ ID NO13)5’-ATGAGTTCTG TCGCAGAAAATATAATACAA CATGCCACTC CCAGCTGAAGCTTCGTACGC-3’和ERG5-Crelox-3’(SEQ ID NO14)5’-TTATTCGAAG ACTTCTCCAGTAATTGGGTC TCTCTTTTTG GCATAGGCCA CTAGTGGATCTG-3’所用的選擇標(biāo)記為遺傳霉素(G418)抗性。得到的菌株含有ADH1啟動子和色氨酸終止子控制下的靶基因ERG1的一份拷貝。通過基因的整合同時可能缺失靶基因座的相應(yīng)基因ERG5。為隨后再次去除G418抗性，得到的酵母菌株用cre重組酶載體pSH47轉(zhuǎn)化。由于此載體，cre重組酶在酵母中表達(dá)并作為結(jié)果兩個loxP序列中的序列區(qū)域在所述基因外重組，其結(jié)果是兩個loxP序列中只有一個和由ADH1-prom.-ERG1-TRPl-term組成的盒保留在靶基因座ERG5中。結(jié)果，酵母菌株再次丟失G418抗性?，F(xiàn)在載體pSH47可通過在FOA培養(yǎng)基上培養(yǎng)選擇性的除去。
得到的酵母菌株GRFtH1ura3ERG1erg5在20ml的培養(yǎng)體積中于WMVII培養(yǎng)基中28℃和160轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)48小時。隨后500μl此預(yù)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入50ml相同培養(yǎng)基的主要培養(yǎng)基中并在帶擋板搖瓶中28℃和160轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)3天。
4天后按照Parks LW，Bottema CD，Rodriguez RJ，Lewis TA.(1985)酵母甾醇用作甾醇代謝研究工具的酵母突變體，Methods Enzymol.1985；111333-46中所述的方法提取甾醇并通過氣相層析分析。這得到表2中所列的數(shù)據(jù)。百分比基于酵母干重。
表2
比較實(shí)施例1 缺失釀酒酵母GRFtH1ura3中的ERG5；產(chǎn)生GRFtH1ura3erg5釀酒酵母GRFtH1ura3中ERG5的缺失類似于實(shí)施例2進(jìn)行。為了只缺失ERG5基因，使用相同的方法，但是使用載體pUG6代替載體pUG6-ERG1。此載體pUG6不含有由ADH-prom-ERG1-Trp-term組成的盒。通過使用此載體可以缺失一個基因，在這種情況下為基因ERG5。
得到的酵母菌株GRFtH1ura3erg5在20ml的培養(yǎng)體積中于WMVII培養(yǎng)基中28℃和160轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)48小時。隨后500μl此預(yù)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入50ml相同培養(yǎng)基的主要培養(yǎng)基中并在帶擋板搖瓶中28℃和160轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)3天。
4天后按照Parks LW，Bottema CD，Rodriguez RJ，Lewis TA.(1985)酵母甾醇用作甾醇代謝研究工具的酵母突變體，Methods Enzymol.1985；111333-46中所述的方法提取甾醇并通過氣相層析分析。這得到表3中所列的數(shù)據(jù)。百分比基于酵母干重。
表3
序列表<110>巴斯福股份公司<120>在轉(zhuǎn)基因生物中產(chǎn)生麥角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中間物和/或代謝物的方法<130>20020748<160>14<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>1617<212>DNA<213>釀酒酵母(saccharomyces cerevisiae)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1617)<223>
<400>1
atg agt tct gtc gca gaa aat ata ata caa cat gcc act cat aat tct 48Met Ser Ser Val Ala Glu Asn Ile Ile Gln His Ala Thr His Asn Ser1 5 10 15acg cta cac caa ttg gct aaa gac cag ccc tct gta ggc gtc act act 96Thr Leu His Gln Leu Ala Lys Asp Gln Pro Ser Val Gly Val Thr Thr20 25 30gcc ttc agt atc ctg gat aca ctt aag tct atg tca tat ttg aaa ata 144Ala Phe Ser Ile Leu Asp Thr Leu Lys Ser Met Ser Tyr Leu Lys Ile35 40 45ttt gct act tta atc tgt att ctt ttg gtt tgg gac caa gtt gca tat 192Phe Ala Thr Leu Ile Cys Ile Leu Leu Val Trp Asp Gln Val Ala Tyr50 55 60caa atc aag aaa ggt tcc atc gca ggt cca aag ttt aag ttc tgg ccc 240Gln Ile Lys Lys Gly Ser Ile Ala Gly Pro Lys Phe Lys Phe Trp Pro65 70 75 80atc atc ggt cca ttt ttg gaa tcc tta gat cca aag ttt gaa gaa tat 288Ile Ile Gly Pro Phe Leu Glu Ser Leu Asp Pro Lys Phe Glu Glu Tyr85 90 95aag gct aag tgg gca tcc ggt cca ctt tca tgt gtt tct att ttc cat 336Lys Ala Lys Trp Ala Ser Gly Pro Leu Ser Cys Val Ser Ile Phe His100 105 110aaa ttt gtt gtt atc gca tct act aga gac ttg gca aga aag atc ttg 384Lys Phe Val Val Ile Ala Ser Thr Arg Asp Leu Ala Arg Lys Ile Leu115 120 125caa tct tcc aaa ttc gtc aaa cct tgc gtt gtc gat gtt gct gtg aag 432Gln Ser Ser Lys Phe Val Lys Pro Cys Val Val Asp Val Ala Val Lys130 135 140atc tta aga cct tgc aat tgg gtt ttt ttg gac ggt aaa gct cat act 480Ile Leu Arg Pro Cys Asn Trp Val Phe Leu Asp Gly Lys Ala His Thr145 150 155 160gat tac aga aaa tca tta aac ggt ctt ttc act aaa caa gct ttg gct 528Asp Tyr Arg Lys Ser Leu Asn Gly Leu Phe Thr Lys Gln Ala Leu Ala165 170 175caa tac tta cct tca ttg gaa caa atc atg gat aag tac atg gat aag 576Gln Tyr Leu Pro Ser Leu Glu Gln Ile Met Asp Lys Tyr Met Asp Lys180 185 190
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aaa atg aag tac acc aat atg gtc ata aaa gaa act ttg cgt tac aga 1200Lys Met Lys Tyr Thr Asn Met Val Ile Lys Glu Thr Leu Arg Tyr Arg385 390 395 400cct cct gtc ttg atg gtt cca tat gtt gtt aag aag aat ttc cca gtt 1248Pro Pro Val Leu Met Val Pro Tyr Val Val Lys Lys Asn Phe Pro Val405 410 415tcc cct aac tat acc gca cca aag ggc gct atg tta att cca acc tta 1296Ser Pro Asn Tyr Thr Ala Pro Lys Gly Ala Met Leu Ile Pro Thr Leu420 425 430tac cca gct tta cat gat cct gaa gtt tac gaa aat cct gat gag ttc 1344Tyr Pro Ala Leu His Asp Pro Glu Val Tyr Glu Asn Pro Asp Glu Phe435 440 445atc cct gaa aga tgg gta gaa ggc tct aag gct agt gaa gca aag aag 1392Ile Pro Glu Arg Trp Val Glu Gly Ser Lys Ala Ser Glu Ala Lys Lys450 455 460aat tgg ttg gtt ttt ggt tgt ggt cca cac gtt tgc tta ggt caa aca 1440Asn Trp Leu Val Phe Gly Cys Gly Pro His Val Cys Leu Gly Gln Thr465 470 475 480tat gtc atg att acc ttc gcc gct ttg ttg ggt aaa ttt gca cta tat 1488Tyr Val Met Ile Thr Phe Ala Ala Leu Leu Gly Lys Phe Ala Leu Tyr485 490 495act gat ttc cat cat aca gtg act cca tta agt gaa aaa atc aag gtt 1536Thr Asp Phe His His Thr Val Thr Pro Leu Ser Glu Lys Ile Lys Val500 505 5l0ttc gct aca att ttc cca aaa gat gat ttg tta ctg act ttc aaa aag 1584Phe Ala Thr Ile Phe Pro Lys Asp Asp Leu Leu Leu Thr Phe Lys Lys515 520 525aga gac cca att act gga gaa gtc ttc gaa taa 1617Arg Asp Pro Ile Thr Gly Glu Val Phe Glu530 535<210>2<211>538<212>PRT
<213>釀酒酵母<400>2Met Ser Ser Val Ala Glu Asn Ile Ile Gln His Ala Thr His Asn Ser1 5 10 15Thr Leu His Gln Leu Ala Lys Asp Gln Pro Ser Val Gly Val Thr Thr20 25 30Ala Phe Ser Ile Leu Asp Thr Leu Lys Ser Met Ser Tyr Leu Lys Ile35 40 45Phe Ala Thr Leu Ile Cys Ile Leu Leu Val Trp Asp Gln Val Ala Tyr50 55 60Gln Ile Lys Lys Gly Ser Ile Ala Gly Pro Lys Phe Lys Phe Trp Pro65 70 75 80Ile Ile Gly Pro Phe Leu Glu Ser Leu Asp Pro Lys Phe Glu Glu Tyr85 90 95Lys Ala Lys Trp Ala Ser Gly Pro Leu Ser Cys Val Ser Ile Phe His100 105 110Lys Phe Val Val Ile Ala Ser Thr Arg Asp Leu Ala Arg Lys Ile Leu115 120 125Gln Ser Ser Lys Phe Val Lys Pro Cys Val Val Asp Val Ala Val Lys130 135 140Ile Leu Arg Pro Cys Asn Trp Val Phe Leu Asp Gly Lys Ala His Thr145 150 155 160Asp Tyr Arg Lys Ser Leu Asn Gly Leu Phe Thr Lys Gln Ala Leu Ala
165 170 175Gln Tyr Leu Pro Ser Leu Glu Gln Ile Met Asp Lys Tyr Met Asp Lys180 185 190Phe Val Arg Leu Ser Lys Glu Asn Asn Tyr Glu Pro Gln Val Phe Phe195 200 205His Glu Met Arg Glu Ile Leu Cys Ala Leu Ser Leu Asn Ser Phe Cys210 215 220Gly Asn Tyr Ile Thr Glu Asp Gln Val Arg Lys Ile Ala Asp Asp Tyr225 230 235 240Tyr Leu Val Thr Ala Ala Leu Glu Leu Val Asn Phe Pro Ile Ile Ile245 250 255Pro Tyr Thr Lys Thr Trp Tyr Gly Lys Lys Thr Ala Asp Met Ala Met260 265 270Lys Ile Phe Glu Asn Cys Ala Gln Met Ala Lys Asp His Ile Ala Ala275 280 285Gly Gly Lys Pro Val Cys Val Met Asp Ala Trp Cys Lys Leu Met His290 295 300Asp Ala Lys Asn Ser Asn Asp Asp Asp Ser Arg Ile Tyr His Arg Glu305 310 315 320Phe Thr Asn Lys Glu Ile Ser Glu Ala Val Phe Thr Phe Leu Phe Ala325 330 335Ser Gln Asp Ala Ser Ser Ser Leu Ala Cys Trp Leu Phe Gln Ile Val340 345 350Ala Asp Arg Pro Asp Val Leu Ala Lys Ile Arg Glu Glu Gln Leu Ala
355 360 365Val Arg Asn Asn Asp Met Ser Thr Glu Leu Asn Leu Asp Leu Ile Glu370 375 380Lys Met Lys Tyr Thr Asn Met Val Ile Lys Glu Thr Leu Arg Tyr Arg385 390 395 400Pro Pro Val Leu Met Val Pro Tyr Val Val Lys Lys Asn Phe Pro Val405 410 415Ser Pro Asn Tyr Thr Ala Pro Lys Gly Ala Met Leu Ile Pro Thr Leu420 425 430Tyr Pro Ala Leu His Asp Pro Glu Val Tyr Glu Asn Pro Asp Glu Phe435 440 445Ile Pro Glu Arg Trp Val Glu Gly Ser Lys Ala Ser Glu Ala Lys Lys450 455 460Asn Trp Leu Val Phe Gly Cys Gly Pro His Val Cys Leu Gly Gln Thr465 470 475 480Tyr Val Met Ile Thr Phe Ala Ala Leu Leu Gly Lys Phe Ala Leu Tyr485 490 495Thr Asp Phe His His Thr Val Thr Pro Leu Ser Glu Lys Ile Lys Val500 505 510Phe Ala Thr Ile Phe Pro Lys Asp Asp Leu Leu Leu Thr Phe Lys Lys515 520 525Arg Asp Pro Ile Thr Gly Glu Val Phe Glu530 535
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aaa cct gct gaa cca aca aaa cct aac aat ttg gac gcc act gat ata 1536Lys Pro Ala Glu Pro Thr Lys Pro Asn Asn Leu Asp Ala Thr Asp Ile500 505 510aat cgt ttg aaa gat ggg tcc gtc acc tgc att aaa tcc taa 1578Asn Arg Leu Lys Asp Gly Ser Val Thr Cys Ile Lys Ser515 520 525<210>4<211>525<212>PRT<213>人工序列<400>4Met Asp Gln Leu Val Lys Thr Glu Val Thr Lys Lys Ser Phe Thr Ala1 5 10 15Pro Val Gln Lys Ala Ser Thr Pro Val Leu Thr Asn Lys Thr Val Ile20 25 30Ser Gly Ser Lys Val Lys Ser Leu Ser Ser Ala Gln Ser Ser Ser Ser35 40 45Gly Pro Ser Ser Ser Ser Glu Glu Asp Asp Ser Arg Asp Ile Glu Ser50 55 60Leu Asp Lys Lys Ile Arg Pro Leu Glu Glu Leu Glu Ala Leu Leu Ser65 70 75 80Ser Gly Asn Thr Lys Gln Leu Lys Asn Lys Glu Val Ala Ala Leu Val85 90 95Ile His Gly Lys Leu Pro Leu Tyr Ala Leu Glu Lys Lys Leu Gly Asp100 105 110
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Tyr Ser Leu Arg Lys Asp Arg Pro Pro Leu Val Phe Tyr Trp Ile Pro50 55 60Trp Val Gly Ser Ala Val Val Tyr Gly Met Lys Pro Tyr Glu Phe Phe65 70 75 80Glu Glu Cys Gln Lys Lys Tyr Gly Asp Ile Phe Ser Phe Val Leu Leu85 90 95Gly Arg Val Met Thr Val Tyr Leu Gly Pro Lys Gly His Glu Phe Val100 105 110Phe Asn Ala Lys Leu Ala Asp Val Ser Ala Glu Ala Ala Tyr Ala His115 120 125Leu Thr Thr Pro Val Phe Gly Lys Gly Val Ile Tyr Asp Cys Pro Asn130 135 140Ser Arg Leu Met Glu Gln Lys Lys Phe Val Lys Gly Ala Leu Thr Lys145 150 155 160Glu Ala Phe Lys Ser Tyr Val Pro Leu Ile Ala Glu Glu Val Tyr Lys165 170 175Tyr Phe Arg Asp Ser Lys Asn Phe Arg Leu Asn Glu Arg Thr Thr Gly180 185 190Thr Ile Asp Val Met Val Thr Gln Pro Glu Met Thr Ile Phe Thr Ala195 200 205Ser Arg Ser Leu Leu Gly Lys Glu Met Arg Ala Lys Leu Asp Thr Asp210 215 220Phe Ala Tyr Leu Tyr Ser Asp Leu Asp Lys Gly Phe Thr Pro Ile Asn225 230 235 240
Phe Val Phe Pro Asn Leu Pro Leu Glu His Tyr Arg Lys Arg Asp His245 250 255Ala Gln Lys Ala Ile Ser Gly Thr Tyr Met Ser Leu Ile Lys Glu Arg260 265 270Arg Lys Asn Asn Asp Ile Gln Asp Arg Asp Leu Ile Asp Ser Leu Met275 280 285Lys Asn Ser Thr Tyr Lys Asp Gly Val Lys Met Thr Asp Gln Glu Ile290 295 300Ala Asn Leu Leu Ile Gly Val Leu Met Gly Gly Gln His Thr Ser Ala305 310 315 320Ala Thr Ser Ala Trp Ile Leu Leu His Leu Ala Glu Arg Pro Asp Val325 330 335Gln Gln Glu Leu Tyr Glu Glu Gln Met Arg Val Leu Asp Gly Gly Lys340 345 350Lys Glu Leu Thr Tyr Asp Leu Leu Gln Glu Met Pro Leu Leu Asn Gln355 360 365Thr Ile Lys Glu Thr Leu Arg Met His His Pro Leu His Ser Leu Phe370 375 380Arg Lys Val Met Lys Asp Met His Val Pro Asn Thr Ser Tyr Val Ile385 390 395 400Pro Ala Gly Tyr His Val Leu Val Ser Pro Gly Tyr Thr His Leu Arg405 4l0 415Asp Glu Tyr Phe Pro Asn Ala His Gln Phe Asn Ile His Arg Trp Asn420 425 430
Lys Asp Ser Ala Ser Ser Tyr Ser Val Gly Glu Glu Val Asp Tyr Gly435 440 445Phe Gly Ala Ile Ser Lys Gly Val Ser Ser Pro Tyr Leu Pro Phe Gly450 455 460Gly Gly Arg His Arg Cys Ile Gly Glu His Phe Ala Tyr Cys Gln Leu465 470 475 480Gly Val Leu Met Ser Ile Phe Ile Arg Thr Leu Lys Trp His Tyr Pro485 490 495Glu Gly Lys Thr Val Pro Pro Pro Asp Phe Thr Ser Met Val Thr Leu500 505 510Pro Thr Gly Pro Ala Lys Ile Ile Trp Glu Lys Arg Asn Pro Glu Gln515 520 525Lys Ile530<210>7<211>1491<212>DNA<213>釀酒酵母<220>
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ata ttg aag gat gaa aag aat gag gtt gtt ggt gcc aag gtt gac att 576Ile Leu Lys Asp Glu Lys Asn Glu Val Val Gly Ala Lys Val Asp Ile180 185 190gat ggc cgt ggc aag gtg gaa ttc aaa gcc cac ttg aca ttt atc tgt 624Asp Gly Arg Gly Lys Val Glu Phe Lys Ala His Leu Thr Phe Ile Cys195 200 205gac ggt atc ttt tca cgt ttc aga aag gaa ttg cac cca gac cat gtt 672Asp Gly Ile Phe Ser Arg Phe Arg Lys Glu Leu His Pro Asp His Val210 215 220cca act gtc ggt tct tcg ttt gtc ggt atg tct ttg ttc aat gct aag 720Pro Thr Val Gly Ser Ser Phe Val Gly Met Ser Leu Phe Asn Ala LVs225 230 235 240aat cct gct cct atg cac ggt cac gtt att ctt ggt agt gat cat atg 768Asn Pro Ala Pro Met His Gly His Val Ile Leu Gly Ser Asp His Met245 250 255cca atc ttg gtt tac caa atc agt cca gaa gaa aca aga atc ctt tgt 816Pro Ile Leu Val Tyr Gln Ile Ser Pro Glu Glu Thr Arg Ile Leu Cys260 265 270gct tac aac tct cca aag gtc cca gct gat atc aag agt tgg atg att 864Ala Tyr Asn Ser Pro Lys Val Pro Ala Asp Ile Lys Ser Trp Met Ile275 280 285aag gat gtc caa cct ttc att cca aag agt cta cgt cct tca ttt gat 912Lys Asp Val Gln Pro Phe Ile Pro Lys Ser Leu Arg Pro Ser Phe Asp290 295 300gaa gcc gtc agc caa ggt aaa ttt aga gct atg cca aac tcc tac ttg 960Glu Ala Val Ser Gln Gly Lys Phe Arg Ala Met Pro Asn Ser Tyr Leu305 310 315 320cca gct aga caa aac gac gtc act ggt atg tgt gtt atc ggt gac gct 1008Pro Ala Arg Gln Asn Asp Val Thr Gly Met Cys Val Ile Gly Asp Ala325 330 335cta aat atg aga cat cca ttg act ggt ggt ggt atg act gtc ggt ttg 1056Leu Asn Met Arg His Pro Leu Thr Gly Gly Gly Met Thr Val Gly Leu340 345 350cat gat gtt gtc ttg ttg att aag aaa ata ggt gac cta gac ttc agc 1104His Asp Val Val Leu Leu Ile Lys Lys Ile Gly Asp Leu Asp Phe Ser355 360 365
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Met Ser Ala Val Asn Val Ala Pro Glu Leu Ile Asn Ala Asp Asn Thr1 5 10 15Ile Thr Tyr Asp Ala Ile Val Ile Gly Ala Gly Val Ile Gly Pro Cys20 25 30Val Ala Thr Gly Leu Ala Arg Lys Gly Lys Lys Val Leu Ile Val Glu35 40 45Arg Asp Trp Ala Met Pro Asp Arg Ile Val Gly Glu Leu Met Gln Pro50 55 60Gly Gly Val Arg Ala Leu Arg Ser Leu Gly Met Ile Gln Ser Ile Asn65 70 75 80Asn Ile Glu Ala Tyr Pro Val Thr Gly Tyr Thr Val Phe Phe Asn Gly85 90 95Glu Gln Val Asp Ile Pro Tyr Pro Tyr Lys Ala Asp Ile Pro Lys Val100 105 110Glu Lys Leu Lys Asp Leu Val Lys Asp Gly Asn Asp Lys Val Leu Glu115 120 125Asp Ser Thr Ile His Ile Lys Asp Tyr Glu Asp Asp Glu Arg Glu Arg130 135 140Gly Val Ala phe Val His Gly Arg Phe Leu Asn Asn Leu Arg Asn Ile145 150 155 160Thr Ala Gln Glu Pro Asn Val Thr Arg Val Gln Gly Asn Cys Ile Glu165 170 175Ile Leu Lys Asp Glu Lys Asn Glu Val Val Gly Ala Lys Val Asp Ile180 185 190
Asp Gly Arg Gly Lys Val Glu Phe Lys Ala His Leu Thr Phe Ile Cys195 200 205Asp Gly Ile Phe Ser Arg Phe Arg Lys Glu Leu His Pro Asp His Val210 215 220Pro Thr Val Gly Ser Ser Phe Val Gly Met Ser Leu Phe Asn Ala Lys225 230 235 240Asn Pro Ala Pro Met His Gly His Val Ile Leu Gly Ser Asp His Met245 250 255Pro Ile Leu Val Tyr Gln Ile Ser Pro Glu Glu Thr Arg Ile Leu Cys260 265 270Ala Tyr Asn Ser Pro Lys Val Pro Ala Asp Ile Lys Ser Trp Met Ile275 280 285Lys Asp Val Gln Pro Phe Ile Pro Lys Ser Leu Arg Pro Ser Phe Asp290 295 300Glu Ala Val Ser Gln Gly Lys Phe Arg Ala Met Pro Asn Ser Tyr Leu305 310 315 320Pro Ala Arg Gln Asn Asp Val Thr Gly Met Cys Val Ile Gly Asp Ala325 330 335Leu Asn Met Arg His Pro Leu Thr Gly Gly Gly Met Thr Val Gly Leu340 345 350His Asp Val Val Leu Leu Ile Lys Lys Ile Gly Asp Leu Asp Phe Ser355 360 365Asp Arg Glu Lys Val Leu Asp Glu Leu Leu Asp Tyr His Phe Glu Arg370 375 380
Lys Ser Tyr Asp Ser Val Ile Asn Val Leu Ser Val Ala Leu Tyr Ser385 390 395 400Leu Phe Ala Ala Asp Ser Asp Asn Leu Lys Ala Leu Gln Lys Gly Cys405 410 415Phe Lys Tyr Phe Gln Arg Gly Gly Asp Cys Val Asn Lys Pro Val Glu420 425 430Phe Leu Ser Gly Val Leu Pro Lys Pro Leu Gln Leu Thr Arg Val Phe435 440 445Phe Ala Val Ala Phe Tyr Thr Ile Tyr Leu Asn Met Glu Glu Arg Gly450 455 460Phe Leu Gly Leu Pro Met Ala Leu Leu Glu Gly Ile Met Ile Leu Ile465 470 475 480Thr Ala Ile Arg Val Phe Thr Pro Phe Leu Phe Gly Glu Leu Ile Gly485 490 495<210>9<211>1335<212>DNA<213>釀酒酵母<220>
<221>CDS<222>(1)..(1335)<223>
<400>9atg gga aag cta tta caa ttg gca ttg cat ccg gtc gag atg aag gca 48Met Gly Lys Leu Leu Gln Leu Ala Leu His Pro Val Glu Met Lys Alal 5 10 15gct ttg aag ctg aag ttt tgc aga aca ccg cta ttc tcc atc tat gat 96Ala Leu Lys Leu Lys Phe Cys Arg Thr Pro Leu Phe Ser Ile Tyr Asp20 25 30cag tcc acg tct cca tat ctc ttg cac tgt ttc gaa ctg ttg aac ttg 144Gln Ser Thr Ser Pro Tyr Leu Leu His Cys Phe Glu Leu Leu Asn Leu35 40 45acc tcc aga tcg ttt gct gct gtg atc aga gag ctg cat cca gaa ttg 192Thr Ser Arg Ser Phe Ala Ala Val Ile Arg Glu Leu His Pro Glu Leu50 55 60aga aac tgt gtt act ctc ttt tat ttg att tta agg gct ttg gat acc 240Arg Asn Cys Val Thr Leu Phe Tyr Leu Ile Leu Arg Ala Leu Asp Thr65 70 75 80atc gaa gac gat atg tcc atc gaa cac gat ttg aaa att gac ttg ttg 288Ile Glu Asp Asp Met Ser Ile Glu His Asp Leu Lys Ile Asp Leu Leu85 90 95cgt cac ttc cac gag aaa ttg ttg tta act aaa tgg agt ttc gac gga 336Arg His Phe His Glu Lys Leu Leu Leu Thr Lys Trp Ser Phe Asp Gly100 105 110aat gcc ccc gat gtg aag gac aga gcc gtt ttg aca gat ttc gaa tcg 384Asn Ala Pro Asp Val Lys Asp Arg Ala Val Leu Thr Asp Phe Glu Ser115 120 125att ctt att gaa ttc cac aaa ttg aaa cca gaa tat caa gaa gtc atc 432Ile Leu Ile Glu Phe His Lys Leu Lys Pro Glu Tyr Gln Glu Val Ile130 135 140aag gag atc acc gag aaa atg ggt aat ggt atg gcc gac tac atc tta 480Lys Glu Ile Thr Glu Lys Met Gly Asn Gly Met Ala Asp Tyr Ile Leu145 150 155 160gat gaa aat tac aac ttg aat ggg ttg caa acc gtc cac gac tac gac 528Asp Glu Asn Tyr Asn Leu Asn Gly Leu Gln Thr Val His Asp Tyr Asp165 170 175gtg tac tgt cac tac gta gct ggt ttg gtc ggt gat ggt ttg acc cgt 576
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<221>引物<222>(1)..(32)<223>AtHT-3′<400>12aactcgagag acacatggtg ctgttgtgct tc 32
<210>13<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(60)<223>ERG5-Crelox-5′<400>13atgagttctg tcgcagaaaa tataatacaa catgccactc ccagctgaag cttcgtacgc 60<210>14<211>62<212>DNA<213>人工序列<220>
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tg6權(quán)利要求
1.通過培養(yǎng)生物產(chǎn)生麥角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中間物和/或代謝物的方法，其中所述生物與野生型相比具有降低的Δ22-去飽和酶活性和增加的HMG-CoA-還原酶活性和選自羊毛甾醇C14-脫甲基酶活性、角鯊烯環(huán)氧酶活性和角鯊烯合成酶活性的至少一種活性的增加的活性。
2.權(quán)利要求1的方法，其中為了降低Δ22-去飽和酶活性，編碼Δ22-去飽和酶的核酸的基因表達(dá)與野生型相比降低。
3.權(quán)利要求2的方法，其中使用無功能性Δ22-去飽和酶基因的生物。
4.權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)的方法，其中為了增加HMG-CoA還原酶活性，編碼HMG-CoA還原酶的核酸的基因表達(dá)與野生型相比增加。
5.權(quán)利要求4的方法，其中為增加基因表達(dá)，將包含編碼HMG-CoA還原酶的核酸的核酸構(gòu)建體引入生物中，并且HMG-CoA還原酶在該生物中的表達(dá)與野生型相比受下降調(diào)節(jié)。
6.權(quán)利要求5的方法，其中核酸構(gòu)建體包含與野生型啟動子相比在生物中受下降調(diào)節(jié)的啟動子。
7.權(quán)利要求6的方法，其中編碼HMG-CoA還原酶的核酸為與同源的、直向同源的核酸相比在生物中的表達(dá)受下降調(diào)節(jié)的核酸。
8.權(quán)利要求7的方法，其中編碼HMG-CoA還原酶的核酸為編碼HMG-CoA還原酶催化區(qū)域的核酸。
9.權(quán)利要求8的方法，其中引入的核酸為編碼包含氨基酸序列SEQ.ID.NO.4或通過氨基酸的替代、插入或缺失衍生于此序列的序列的蛋白質(zhì)的核酸，其中衍生序列在氨基酸水平上與序列SEQ.ID.NO.4具有至少30％同一性，其中所述的蛋白質(zhì)具有HMG-CoA還原酶的酶特征。
10.權(quán)利要求9的方法，其中引入包含序列SEQ.ID.NO.3的核酸。
11.權(quán)利要求1-10任意一項(xiàng)的方法，其中為增加羊毛甾醇C14-脫甲基酶活性，編碼羊毛甾醇C14-脫甲基酶的核酸的基因表達(dá)與野生型相比增加。
12.權(quán)利要求11的方法，其中為增加基因表達(dá)，在生物中引入一種或多種編碼羊毛甾醇C14-脫甲基酶的核酸。
13.權(quán)利要求12的方法，其中引入的核酸為編碼包含氨基酸序列SEQ.ID.NO.6或通過氨基酸的替代、插入或缺失衍生于此序列的序列的蛋白質(zhì)的核酸，其中衍生序列在氨基酸水平上與序列SEQ.ID.NO.6具有至少30％同一性，其中所述蛋白質(zhì)具有羊毛甾醇C14-脫甲基酶的酶特征。
14.權(quán)利要求13的方法，其中引入包含序列SEQ.ID.NO.5的核酸。
15.權(quán)利要求1-14任意一項(xiàng)的方法，其中為增加角鯊烯環(huán)氧酶活性，編碼角鯊烯環(huán)氧酶的核酸的基因表達(dá)與野生型相比增加。
16.權(quán)利要求15的方法，其中為增加基因表達(dá)，在生物中引入一種或多種編碼角鯊烯環(huán)氧酶的核酸。
17.權(quán)利要求16的方法，其中引入的核酸為編碼包含氨基酸序列SEQ.ID.NO.8或通過氨基酸的替代、插入或缺失衍生于此序列的序列的蛋白質(zhì)的核酸，其中衍生序列在氨基酸水平上與序列SEQ.ID.NO.8具有至少30％同一性，其中所述的蛋白質(zhì)具有角鯊烯環(huán)氧酶的酶特征。
18.權(quán)利要求17的方法，其中引入包含序列SEQ.ID.NO.7的核酸。
19.權(quán)利要求1-18任意一項(xiàng)的方法，其中為增加角鯊烯合成酶活性，編碼角鯊烯合成酶的核酸的基因表達(dá)與野生型相比增加。
20.權(quán)利要求19的方法，其中為增加基因表達(dá)，在生物中引入一種或多種編碼角鯊烯合成酶的核酸。
21.權(quán)利要求20的方法，其中引入的核酸為編碼包含氨基酸序列SEQ.ID.NO.10或通過氨基酸的替代、插入或缺失衍生于此序列的序列的蛋白質(zhì)的核酸，其中衍生序列在氨基酸水平上與序列SEQ.ID.NO.10具有至少30％同一性，，其中所述的蛋白質(zhì)具有角鯊烯合成酶的酶特征。
22.權(quán)利要求21的方法，其中引入包含序列SEQ.ID.NO.9的核酸。
23.權(quán)利要求1-22任意一項(xiàng)的方法，其中所用的生物為酵母。
24.權(quán)利要求1-23任意一項(xiàng)的方法，其中在培養(yǎng)生物之后，收獲該生物并隨后從該生物中分離麥角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中間物和/或代謝物。
25.經(jīng)遺傳修飾的生物，其中遺傳修飾與野生型相比降低Δ22-去飽和酶活性，增加HMG-CoA還原酶活性，且增加選自羊毛甾醇C14-脫甲基酶活性、角鯊烯環(huán)氧酶活性和角鯊烯合成酶活性的至少一種的活性。
26.權(quán)利要求25的經(jīng)遺傳修飾的生物，其中遺傳修飾與野生型相比降低Δ22-去飽和酶活性，增加HMG-CoA還原酶活性，且增加羊毛甾醇C14-脫甲基酶活性。
27.權(quán)利要求25或26的經(jīng)遺傳修飾的生物，其中經(jīng)遺傳修飾的生物與野生型相比具有增加的麥角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中間物和/或代謝物含量。
28.權(quán)利要求25或26的經(jīng)遺傳修飾的生物，其中所用的生物為酵母。
29.權(quán)利要求25-27任意一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的生物的用途，用于產(chǎn)生麥角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中間物和/或代謝物。
30.產(chǎn)生經(jīng)遺傳修飾的生物的方法，其中從起始生物開始降低Δ22-去飽和酶活性，增加HMG-CoA還原酶活性，且增加選自羊毛甾醇C14-脫甲基酶活性、角鯊烯環(huán)氧酶活性和角鯊烯合成酶活性的至少一種的活性。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過培養(yǎng)經(jīng)遺傳修飾的生物產(chǎn)生麥角甾－5，7－二烯醇和/或其生物合成中間物和/或代謝物的方法，還涉及經(jīng)遺傳修飾的生物自身，尤其是酵母。
文檔編號C12P33/00GK1761741SQ200480007058
公開日2006年4月19日 申請日期2004年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月19日
發(fā)明者A·金克爾, M·維恩, C·朗 申請人:巴斯福股份公司