專利名稱：一種復(fù)雜組織器官前體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種復(fù)雜組織器官前體的制備方法，屬于生物組織工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
世界上每年患有組織缺損或器官衰竭的病人數(shù)逾千萬，僅美國每年以外科手術(shù)治療此類病人約800萬。然而，活體供體器官有限，現(xiàn)有的機械裝置不具備器官的所以功能，不能防止患者的病情進一步惡化。據(jù)此，以提高此類疾患治療水平為宗旨的組織工程(TissueEngineering)技術(shù)應(yīng)運而生。組織工程是一門由生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、材料學(xué)、工程學(xué)等多學(xué)科交叉產(chǎn)生的高新技術(shù)學(xué)科。其含義是應(yīng)用生命科學(xué)與工程學(xué)的原理與技術(shù)，在正確認(rèn)識哺乳動物的正常及病理兩種狀態(tài)下的組織結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的基礎(chǔ)上，研究、開發(fā)用于修復(fù)、維護、促進人體各種組織或器官損傷后的功能和形態(tài)的生物替代物[Merem RM.Med & Biol Eng&Comput.1992；308-12]。近十年來，科學(xué)家們運用組織工程技術(shù)，利用人體殘余器官的少量正常細(xì)胞進行體外繁殖，獲得患者所需的、具有相同功能的器官，又不存在排斥反應(yīng)，已取可喜的成果，不少新近成立的生物技術(shù)公司正準(zhǔn)備正在投入巨資實現(xiàn)商品化。在美國，已形成價值40億美元的產(chǎn)業(yè)，并以每年25％的速度遞增。如Pro Osteon珊瑚骨移植材料產(chǎn)值超過1000萬美元[Miller M，Biotech Bioeng，1996；504347-4348]。但現(xiàn)存的組織工程技術(shù)面臨許多困難和限制，組織工程應(yīng)用研究所取得的成功均是在那些結(jié)構(gòu)與生理功能較為簡單的組織器官如骨骼、軟骨、皮膚。傳統(tǒng)的支架制備技術(shù)不能準(zhǔn)確地控制孔的大小、結(jié)構(gòu)、空間分布及貫通的通道，營養(yǎng)供應(yīng)和血管長入都受到很大的限制。傳統(tǒng)組織工程方法一般先制備結(jié)構(gòu)支架，在進行細(xì)胞培養(yǎng)過程中由于上層細(xì)胞消耗大部分的氧氣和營養(yǎng)，限制了這些組分向底層擴散，從而限制了細(xì)胞向支架深層的遷移等。這種先制備支架，再培養(yǎng)細(xì)胞的方法，耗時又費力，細(xì)胞在向支架內(nèi)遷移的過程中很可能就已經(jīng)變型、老化，達(dá)不到及時治療臨床病人的要求。同時傳統(tǒng)的組織工程技術(shù)不能滿足將不同的細(xì)胞在空間準(zhǔn)確定位與定點放置，構(gòu)建復(fù)雜組織器官的功能梯度結(jié)構(gòu)的需求。本發(fā)明在綜合前人工作的基礎(chǔ)上，利用各種先進技術(shù)，實現(xiàn)細(xì)胞和支架材料在空間的準(zhǔn)確定位，利用零部件組合的原理實現(xiàn)復(fù)雜組織器官的重建，從而達(dá)到修復(fù)再生的目的，具有廣泛的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種復(fù)雜組織器官前體的制備方法，旨在前人工作的基礎(chǔ)上，利用計算機輔助的快速成型技術(shù)、涂覆法或一次性灌注成形技術(shù)，實現(xiàn)細(xì)胞和支架材料在空間的準(zhǔn)確定位，利用零部件組合的原理實現(xiàn)復(fù)雜組織器官的重建，從而達(dá)到修復(fù)再生的目的本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種復(fù)雜組織器官前體的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟
1)種子細(xì)胞或基因與基質(zhì)材料微膠珠的制備a.分離或誘導(dǎo)所需的種子細(xì)胞或基因，將所得的不同種類的種子細(xì)胞或基因的懸浮液離心分離后分別與含有1～40％的基質(zhì)材料的溶液均勻混合，制成細(xì)胞或基因與基質(zhì)材料的混合物；所述的基質(zhì)材料為明膠、膠原、明膠/膠原、明膠/殼聚糖或明膠/海藻酸鈉，其中所述的明膠/殼聚糖或明膠/海藻酸鈉的混合溶液中明膠與殼聚糖或明膠與海藻酸鈉的質(zhì)量比0.5～100∶1，所述種子細(xì)胞或基因占所述基質(zhì)材料混合溶液的0.01～10％；所述的基質(zhì)材料的溶液為水溶液或pH＝6～8的0.09M的氯化鈉或0.09M的氯化鈉和3-羥甲基氨基甲烷鹽酸溶液；b.用靜電微囊發(fā)生器或微滴注入技術(shù)將細(xì)胞或基因與明膠/殼聚糖基質(zhì)材料噴入1～20％三磷酸鈉水溶液交聯(lián)；對于明膠/海藻酸鈉基質(zhì)材料噴或注入濃度為1～20％乳酸鈣或氯化鈣水溶液交聯(lián)，形成微球；然后將三磷酸鈉水溶液或乳酸鈣、氯化鈣水溶液吸出；將微球與濃度為0.1～1％的戊二醛溶液進一步反應(yīng)1～180秒鐘，形成微膠珠；對于細(xì)胞或基因與明膠、膠原或明膠/膠原混合物直接噴或注入濃度為0.1～1％的戊二醛溶液反應(yīng)1～180秒鐘，形成微膠珠；對于細(xì)胞或基因與明膠/殼聚糖、明膠/海藻酸鈉基質(zhì)材料形成的微膠珠再與濃度為0.1～10％檸檬酸鈉緩沖溶液反應(yīng)10分鐘～2小時，形成液化微膠珠；2)制備網(wǎng)管狀結(jié)構(gòu)將生物可降解高分子材料或其與肝素的復(fù)合物溶液，利用計算機輔助的快速成型技術(shù)、涂覆法或一次性灌注成形技術(shù)，經(jīng)冷凍干燥，制成網(wǎng)管狀組織器官不同零件的三維結(jié)構(gòu)支架；所述的生物可降解高分子材料為聚氨酯、聚乳酸、乳酸與乙醇酸共聚物、聚羥基酸、3-羥基丁酸和3-羥基己酸共聚物、聚己內(nèi)酯、膠原、明膠、纖維蛋白、纖維粘連蛋白、膠原/殼聚糖、膠原/硫酸軟骨素、明膠/殼聚糖或其中兩種復(fù)合物，其中聚氨酯、聚乳酸、乳酸與乙醇酸共聚物、聚羥基酸、3-羥基丁酸和3-羥基己酸共聚物、聚己內(nèi)酯采用濃度為1～10％的1，4-二氧六環(huán)溶液；其中膠原、明膠、纖維蛋白、纖維粘連蛋白、膠原/殼聚糖、膠原/硫酸軟骨素、明膠/殼聚糖或其中兩種復(fù)合物采用濃度為1～40％的的水溶液或pH＝6～8的0.09M的氯化鈉或0.09M的氯化鈉和3-羥甲基氨基甲烷鹽酸溶液，成形后用濃度為0.1～1％的交聯(lián)劑戊二醛或濃度1～10％的三磷酸鈉平衡溶液交聯(lián)；3)組裝利用微囊注射技術(shù)將步驟1)b中的微膠珠注射到所述的三維結(jié)構(gòu)支架相應(yīng)的位置上，體外培養(yǎng)或進行體內(nèi)植入；上述步驟1)a中所述的細(xì)胞或基因與基質(zhì)材料的混合物利用凝膠注射技術(shù)直接注射到步驟2)中的三維結(jié)構(gòu)支架中，再用濃度為0.1～1％的戊二醛溶液、1～20％乳酸鈣、氯化鈣或三磷酸鈉水溶液交聯(lián)。所述的基質(zhì)材料中復(fù)合有細(xì)胞生長因子。
本發(fā)明提供的另一種復(fù)雜組織器官前體的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟1)種子細(xì)胞或基因與基質(zhì)材料管道狀三維結(jié)構(gòu)的制備a.分離或誘導(dǎo)所需的種子細(xì)胞或基因，將所得的不同種類的種子細(xì)胞或基因的懸浮液離心分離后分別與含有1～40％的基質(zhì)材料的溶液均勻混合，制成細(xì)胞或基因與基質(zhì)材料的混合物；所述的基質(zhì)材料為明膠、膠原、明膠/膠原、明膠/殼聚糖或明膠/海藻酸鈉，其中所述的明膠/殼聚糖或明膠/海藻酸鈉的混合溶液中明膠與殼聚糖或明膠與海藻酸鈉的質(zhì)量比0.5～100∶1，所述種子細(xì)胞或基因占所述基質(zhì)材料混合溶液的0.01～10％；所述的基質(zhì)材料的溶液為水溶液或pH＝6～8的0.09M的氯化鈉或0.09M的氯化鈉和3-羥甲基氨基甲烷鹽酸溶液；b.在0～30℃的環(huán)境下根據(jù)預(yù)先設(shè)計的結(jié)構(gòu)和定義規(guī)劃的路徑，將上述細(xì)胞與基質(zhì)材料的混合物通過微滴噴射、數(shù)字?jǐn)D壓技術(shù)利用細(xì)胞組裝機在成形室中逐層堆積得到細(xì)胞與基質(zhì)材料的多管道三維立體結(jié)構(gòu)；對于基質(zhì)材料為明膠/殼聚糖形成的管道狀三維結(jié)構(gòu)，用1～20％三磷酸鈉水溶液交聯(lián)；對于基質(zhì)材料為明膠/海藻酸鈉形成的管道狀三維結(jié)構(gòu)，用濃度為1～20％乳酸鈣或氯化鈣水溶液交聯(lián)；然后將交聯(lián)劑吸出，再與濃度為0.1～1％的戊二醛水或生理鹽水溶液反應(yīng)1～180秒鐘；對于基質(zhì)材料為明膠/殼聚糖、明膠/海藻酸鈉基質(zhì)材料形成的管道狀三維結(jié)構(gòu)再與濃度為0.1～10％檸檬酸鈉緩沖溶液反應(yīng)10分鐘～2小時，形成內(nèi)部液化的管道狀三維結(jié)構(gòu)；對于基質(zhì)材料為明膠、膠原或明膠/膠原形成的管道狀三維結(jié)構(gòu)，直接用濃度為0.1～1％的戊二醛溶液交聯(lián)1～180秒鐘；2)制備網(wǎng)管狀結(jié)構(gòu)將生物可降解高分子材料或其與肝素的復(fù)合物溶液，利用計算機輔助的快速成型技術(shù)、涂覆法或一次性灌注成形技術(shù)，經(jīng)冷凍干燥，制成網(wǎng)管狀組織器官不同零件的三維結(jié)構(gòu)支架；所述的生物可降解高分子材料為聚氨酯、聚乳酸、乳酸與乙醇酸共聚物、聚羥基酸、3-羥基丁酸和3-羥基己酸共聚物、聚己內(nèi)酯、膠原、明膠、纖維蛋白、纖維粘連蛋白、膠原/殼聚糖、膠原/硫酸軟骨素、明膠/殼聚糖或其中兩種復(fù)合物，其中聚氨酯、聚乳酸、乳酸與乙醇酸共聚物、聚羥基酸、3-羥基丁酸和3-羥基己酸共聚物、聚己內(nèi)酯采用濃度為1～10％的1，4-二氧六環(huán)溶液；其中膠原、明膠、纖維蛋白、纖維粘連蛋白、膠原/殼聚糖、膠原/硫酸軟骨素、明膠/殼聚糖或其中兩種復(fù)合物采用濃度為1～40％的的水溶液或pH＝6～8的0.09M的氯化鈉或0.09M的氯化鈉和3-羥甲基氨基甲烷鹽酸溶液，成形后用濃度為0.1～1％的交聯(lián)劑戊二醛或濃度1～10％的三磷酸鈉平衡溶液交聯(lián)；3)組裝將步驟2)制備的網(wǎng)管狀結(jié)構(gòu)插入步驟1)制備的管道狀三維結(jié)構(gòu)中，外包一層可降解的、降解速度在1～6個月的組織相容性的高分子膜。
本發(fā)明可以實現(xiàn)不同細(xì)胞和基質(zhì)材料在空間的準(zhǔn)確定位，克服了組織工程目前存在的在三維支架中誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞需要時間長，細(xì)胞在支架中分布不均勻，細(xì)胞很難滲入到深層結(jié)構(gòu)中等缺點。利用零部件組合的原理可以達(dá)到復(fù)雜器官中不同部位不同細(xì)胞類型及結(jié)構(gòu)類型的要求，實現(xiàn)復(fù)雜組織器官的重建，從而達(dá)到修復(fù)再生的目的。
具體實施例方式
下面舉出的幾個實施例以進一步理解本發(fā)明實施例1人工復(fù)合肝前體的制備1)采購已有的細(xì)胞系如HepG2肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞，將兩種類細(xì)胞懸液離心后分別與重量比1％明膠/海藻酸鈉(100∶1w/w)0.09M NaCI溶液、細(xì)胞生長因子混合均勻。用靜電微囊發(fā)生器噴入重量比5％乳酸鈣溶液中，以形成微球。吸出乳酸鈣溶液，加入濃度為0.1％的戊二醛溶液反應(yīng)1秒鐘，形成微膠珠；將微膠珠與重量比0.1％檸檬酸鈉(也叫枸櫞酸鈉)緩沖溶液反應(yīng)數(shù)分鐘，以液化微珠芯，形成液化微膠囊。
2)制備網(wǎng)管狀結(jié)構(gòu)將生物濃度為1％的可降解高分子材料聚氨酯(PU)1，4-二氧六環(huán)溶液利用計算機輔助的快速成型技術(shù)，制成網(wǎng)管狀組織器官不同零件的三維結(jié)構(gòu)支架；3)組裝利用微囊注射技術(shù)將步驟1)制備的液化微膠囊注射到三維結(jié)構(gòu)支架相應(yīng)的位置上，體外培養(yǎng)，備用。
實施例2人工復(fù)合肝前體的制備1)采購已有的細(xì)胞系如HepG2肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞。將兩種細(xì)胞懸液離心后分別與重量比20％明膠/海藻酸鈉(1∶1w/w)0.09M NaCI溶液、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子混合均勻。
2)制備網(wǎng)管狀結(jié)構(gòu)將生物濃度為1％的可降解高分子材料聚氨酯(PU)1，4-二氧六環(huán)溶液利用計算機輔助的快速成型技術(shù)，制成網(wǎng)管狀組織器官不同零件的三維結(jié)構(gòu)支架；3)組裝利用微滴注射技術(shù)將步驟1)制備的兩種細(xì)胞與基質(zhì)的復(fù)合物注射到三維結(jié)構(gòu)支架相應(yīng)的位置上，用重量比5％乳酸鈣溶液交聯(lián)。吸出乳酸鈣溶液，加入濃度為0.1％的戊二醛溶液反應(yīng)180秒鐘；將微膠珠與重量比0.1％檸檬酸鈉(也叫枸櫞酸鈉)緩沖溶液反應(yīng)數(shù)分鐘，體外培養(yǎng)或進行體內(nèi)植入。
實施例3人工復(fù)合肝前體的制備分離病人的肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、星狀細(xì)胞，體外培養(yǎng)、擴增。將三種細(xì)胞懸液離心后分別或混合與10％明膠/殼聚糖(1∶100w/w)的0.09M NaCI溶液、肝細(xì)胞生長因子和內(nèi)皮細(xì)胞長因子，由細(xì)胞組裝機制備由內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞與星狀細(xì)胞層組成的多管道三維立體結(jié)構(gòu)。用濃度為1％的戊二醛溶液反應(yīng)1秒鐘，生理鹽水沖洗。此結(jié)構(gòu)可直接種植于腸膜或與肝損傷部位，也可與內(nèi)附內(nèi)皮細(xì)胞的管網(wǎng)狀聚氨酯復(fù)合后再植入。
實施例4人工復(fù)合肝前體的制備分離病人的肝細(xì)胞、肺內(nèi)皮細(xì)胞、星狀細(xì)胞等，體外培養(yǎng)、擴增。將不同種類細(xì)胞懸液離心后分別或混合與40％明膠的0.09M的氯化鈉·三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸溶液混合均勻，由細(xì)胞組裝機制備由內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞(與星狀細(xì)胞)層組成的多管道三維立體結(jié)構(gòu)。用濃度為3％的三磷酸哪水溶液交聯(lián)5分鐘，再用1％的戊二醛溶液反應(yīng)1秒鐘，生理鹽水沖洗。此結(jié)構(gòu)可直接種植于腸膜或與肝損傷部位，也可與內(nèi)附內(nèi)皮細(xì)胞的管網(wǎng)狀聚氨酯復(fù)合后再植入。
實施例5人工復(fù)合肝前體的制備分離肝的干細(xì)胞、肝細(xì)胞基因等，體外誘導(dǎo)、培養(yǎng)、擴增。將不同種類細(xì)胞懸液離心后分別與1％的膠原0.09M NaCI溶液、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子混合均勻由細(xì)胞組裝機制備由內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞層組成的多管道三維立體結(jié)構(gòu)，外包一層肝素處理聚己內(nèi)酯(PCL)膜種植于腸膜或與肝損傷部位。
附肝素處理的PCL膜的制備將丙酮與1wt％肝素鈉水溶液按1∶1(v/v)混合，再將由PCL膜薄膜浸入其中浸泡8h。然后在濃度依次遞減的丙酮水溶液中縮聚，使外套具備抗凝血性。
實施例6人工復(fù)合肝前體的制備分離肝的干細(xì)胞、肝細(xì)胞基因等，體外誘導(dǎo)、培養(yǎng)、擴增。將不同種類細(xì)胞懸液離心后分別與20％明膠/殼聚糖(100∶1w/w)的0.09M的氯化鈉·三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸溶液混合均勻，由細(xì)胞組裝機制備干細(xì)胞、肝細(xì)胞基因與明膠/殼聚糖基質(zhì)組成的多管道三維立體結(jié)構(gòu)，用0.1％的戊二醛生理鹽水交聯(lián)10秒鐘，外包一層肝素處理聚己內(nèi)酯(PCL)膜種植于腸膜或與肝損傷部位。
附肝素處理的PCL膜的制備將丙酮與1wt％肝素鈉水溶液按1∶1(v/v)混合，再將由PCL膜薄膜浸入其中浸泡8h。然后在濃度依次遞減的丙酮水溶液中縮聚，使外套具備抗凝血性。
實施例7復(fù)合皮膚的制備用快速成形技術(shù)制備網(wǎng)格狀成纖維細(xì)胞與20％明膠水溶液層(10×10×0.5mm3，貫通孔徑50μm)，更換針頭或噴頭，在原網(wǎng)格層上加一層上皮細(xì)胞與明膠基質(zhì)材料(10×10×0.5mm3，貫通孔徑50μm)。制成厚度為1mm的雙層膜。膜上還可上覆一層無細(xì)胞殼聚糖膜或病人真皮，防止水份流失。
實施例8復(fù)合皮膚的制備用凍干技術(shù)將膠原/殼聚糖(10∶1，0.5％w/w)制成厚0.5mm厚的海綿層，將含成纖維生長因子細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的明膠/殼聚糖微球(直徑50μm)用針頭注射在底層，再在上層注射含上皮細(xì)胞的明膠/海殼聚糖微球(直徑50μm)，上蓋一層硅膠膜防止水份流失。
實施例9乳房前體的制備分離脂肪細(xì)胞，體外培養(yǎng)、擴增。將脂肪細(xì)胞懸液離心后分別與1％明膠/硫酸軟骨素(100∶1w/w)0.09M NaCI、細(xì)胞生長因子混合均勻制備直徑50μm的微球。將微球注射到由凍干技術(shù)形成的傘房形由0.25％戊二醛水溶液交聯(lián)的膠原或膠原/殼聚糖海綿體內(nèi)。外覆一層聚氨酯肝素膜，此復(fù)合體可直接植于乳房損傷處或經(jīng)體外培養(yǎng)后再植入。
實施例10乳房前體的制備分離脂肪干細(xì)胞，體外培養(yǎng)、擴增。將脂肪干細(xì)胞懸液離心后分別與1％膠原(100∶1w/w)0.09M NaCI溶液(pH≈7.4)、脂肪細(xì)胞生長因子混合均勻按乳房的形狀由快速成形技術(shù)制備多管道細(xì)胞與膠原/明膠基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，將兩個乳房狀的管網(wǎng)結(jié)構(gòu)，通過鉆孔等技術(shù)并列插入到有一定形狀的快速成形技術(shù)制備的細(xì)胞與基質(zhì)材料的三維結(jié)構(gòu)中。將三維結(jié)構(gòu)進行修剪，外包(縫合，將材料保護起來外涂)一層經(jīng)3-羥基丁酸和3-羥基己酸共聚物膜。管口處與內(nèi)層管網(wǎng)結(jié)構(gòu)相吻合，但液體不泄漏?？芍苯臃N植于體內(nèi)或體外培養(yǎng)一段時間再植入體內(nèi)。
實施例11腎臟前體的制備分離腎細(xì)胞基因，體外培養(yǎng)、擴增。將腎細(xì)胞基因(DNA)與1％明膠/海藻酸鈉(100∶1w/w)水溶液、細(xì)胞生長因子混合均勻，制備直徑0.5μm的微球。用灌注成形技術(shù)、凍干技術(shù)制備腎形三維結(jié)構(gòu)，用0.3％戊二醛水溶液交聯(lián)。此復(fù)合體可直接植于腎損傷處或經(jīng)體外培養(yǎng)后再植入。
實施例12腎臟前體的制備分離腎細(xì)胞，體外培養(yǎng)、擴增。將腎細(xì)胞懸液離心后分別與重量比10％明膠/膠原(10∶1w/w)0.09M NaCI溶液(pH6)混合均勻由快速成形技術(shù)制備多管道腎形三維結(jié)構(gòu)，用0.3％戊二醛水溶液交聯(lián)2秒鐘，外涂一層經(jīng)PLGA膜。管口處與內(nèi)層管網(wǎng)結(jié)構(gòu)相吻合，但液體不泄漏?？芍苯臃N植于體內(nèi)或體外培養(yǎng)一段時間再植入體內(nèi)。
實施例13胰腺前體的制備分離胰島細(xì)胞，體外培養(yǎng)、擴增。將胰島細(xì)胞懸液離心后分別與重量比20％明膠水溶液、細(xì)胞生長因子混合均勻，制備直徑100μm的微球。將微球注射到快速成形技術(shù)制備的網(wǎng)管狀由0.3戊二醛水溶液交聯(lián)的膠原或膠原/殼聚糖海綿體內(nèi)。此復(fù)合體可直接植于胰腺、肝臟等部位。
實施例14胰腺前體的制備分離胰島細(xì)胞基因，體外培養(yǎng)、擴增。將胰島細(xì)胞基因與重量比20％明膠/海藻酸鈉(1∶2w/w)0.09M NaCI溶液pH8、細(xì)胞生長因子混合由快速成形技術(shù)制備多管道細(xì)胞與明膠/海藻酸鈉基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，5％乳酸鈣溶液交聯(lián)，用放在有一定形狀的快速成形技術(shù)制備聚氨酯網(wǎng)管三維結(jié)構(gòu)中。外包(縫合，將材料保護起來外涂)一層聚氨酯膜。管口處與內(nèi)層管網(wǎng)結(jié)構(gòu)相吻合，但液體不泄漏。可直接種植于體內(nèi)或體外培養(yǎng)一段時間再植入體內(nèi)。
實施例15胰腺前體的制備分離胰島基因，體外培養(yǎng)、擴增。將胰島基因與重量比1％明膠/殼聚糖(100∶1w/w)0.09M NaCI NaCI·三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸溶液(pH≈7.4)、混合均勻，由快速成形技術(shù)制備多管道細(xì)胞與基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，0.1％戊二醛生理鹽水溶液交聯(lián)20秒，外包一層聚羥基酸膜。管口處與內(nèi)層管網(wǎng)結(jié)構(gòu)相吻合，但液體不泄漏。可直接種植于體內(nèi)或體外培養(yǎng)一段時間再植入體內(nèi)。
實施例16肺前體的制備分離肺上皮細(xì)胞、肺細(xì)胞，體外培養(yǎng)、擴增。將分離細(xì)胞懸液離心后分別與重量比1％明膠/海藻酸鈉(1∶1w/w)0.09M NaCI NaCI·三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸溶液(pH≈7.4)、細(xì)胞生長因子混合均勻，制備直徑0.5μm的微球。將微球注射到樹枝狀由戊二醛交聯(lián)的膠原或膠原/殼聚糖海綿體內(nèi)，再包一層聚己內(nèi)酯膜(PCL)膜。此復(fù)合體可直接植于肺損傷處或經(jīng)體外培養(yǎng)后再植入。
實施例17肺前體的制備分離肺上皮細(xì)胞、肺細(xì)胞。將肺上皮細(xì)胞、肺細(xì)胞懸液離心后分別與重量比10％明膠/殼聚糖(1∶2w/w)0.09M NaCI溶液(pH7.4)、細(xì)胞生長因子混合均勻，由快速成形技術(shù)制備扁園形多管道細(xì)胞與基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，5％三磷酸鈉交聯(lián)后再用0.1％戊二醛生理鹽水溶液交聯(lián)20秒，將三維結(jié)構(gòu)外包一層丙酮肝素/水(1∶1)溶液處理的聚氨酯膜。肺管與內(nèi)層管網(wǎng)結(jié)構(gòu)相吻合，但液體不泄漏?？芍苯臃N植于體內(nèi)或體外培養(yǎng)一段時間再植入體內(nèi)。
實施例18脾前體的制備分離脾細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞，體外培養(yǎng)、擴增。將脾細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞懸液離心后分別與20％的明膠/殼聚糖(pH7.4)溶液混合備用；注射到膠原或膠原/殼聚糖海綿體內(nèi)后，由0.2％戊二醛生理鹽水溶液交聯(lián)后。此復(fù)合體可直接植于脾損傷處或經(jīng)體外培養(yǎng)后再植入。
實施例19胰腺前體的制備分離脾細(xì)胞島基因，體外培養(yǎng)、擴增。將脾細(xì)胞島基因與重量比1％明膠/海藻酸鈉(3∶2w/w)0.09M NaCI溶液pH7、細(xì)胞生長因子混合均勻按扁園形的形狀由快速成形技術(shù)制備多管道細(xì)胞與基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，0.5％戊二醛生理鹽水溶液交聯(lián)10秒，外包一層乳酸與乙醇酸共聚物(PLGA)膜。管口處與內(nèi)層管網(wǎng)結(jié)構(gòu)相吻合，但液體不泄漏?？芍苯臃N植于體內(nèi)或體外培養(yǎng)一段時間再植入體內(nèi)。
實施例20神經(jīng)修復(fù)導(dǎo)管的制備用細(xì)胞裝配機制備圓柱狀多管道雪旺氏細(xì)胞(干細(xì)胞)與重量比20％明膠/膠原(1∶100w/w)0.09M NaCI溶液pH7.4基質(zhì)材料三維結(jié)構(gòu)(圓柱外徑4mm，貫通孔徑50μm)。外套一層相當(dāng)大小的膠原膜，1％戊二醛生理鹽水溶液交聯(lián)5秒，防止周圍組織長入。
實施例21神經(jīng)修復(fù)導(dǎo)管的制備用細(xì)胞裝配機制備圓柱狀多管道干細(xì)胞、生長因子、基因(DNA)與重量比20％明膠/膠原(10∶1w/w)0.09M NaCI·三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸溶液(pH7.4)基質(zhì)材料三維結(jié)構(gòu)(直徑4mm，貫通孔徑900μm)。0.5％戊二醛生理鹽水溶液交聯(lián)30秒，外套一層相當(dāng)大小的膠原/殼聚糖膜(10∶1w/w，由1％膠原/殼聚糖溶液反復(fù)涂覆，用1％戊二醛交聯(lián)而得)，防止周圍組織長入。
實施例22骨與軟骨前體的制備用快速成形技術(shù)將成骨細(xì)胞、骨形成蛋白(BMP)、軟骨細(xì)胞與明膠/殼聚糖(20∶1w/w)基質(zhì)材料三維結(jié)構(gòu)(直徑3mm，貫通孔徑300μm，長10mm)，體外培養(yǎng)。
實施例23心臟前體的制備分別制備心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞與20％明膠基質(zhì)，設(shè)計心血管和心包膜模型，利用雙噴頭快速成形技術(shù)將心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞與基質(zhì)組裝成多管道心包狀結(jié)構(gòu)(內(nèi)皮細(xì)胞在外層，心肌細(xì)胞在內(nèi)層)。用涂覆法制備管網(wǎng)狀多管道心血管系統(tǒng)，并插入到心包狀細(xì)胞/基質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中，外包一層聚氨酯膜，管道可與提內(nèi)心血管系統(tǒng)相連，液體不滲漏。
權(quán)利要求
1.一種復(fù)雜組織器官前體的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟1)種子細(xì)胞或基因與基質(zhì)材料微膠珠的制備a.分離或誘導(dǎo)所需的種子細(xì)胞或基因，將所得的不同種類的種子細(xì)胞或基因的懸浮液離心分離后分別與含有1～40％的基質(zhì)材料的溶液均勻混合，制成細(xì)胞或基因與基質(zhì)材料的混合物；所述的基質(zhì)材料為明膠、膠原、明膠/膠原、明膠/殼聚糖或明膠/海藻酸鈉，其中所述的明膠/殼聚糖或明膠/海藻酸鈉的混合溶液中明膠與殼聚糖或明膠與海藻酸鈉的質(zhì)量比0.5～100∶1，所述種子細(xì)胞或基因占所述基質(zhì)材料混合溶液的0.01～10％；所述的基質(zhì)材料的溶液為水溶液或pH＝6～8的0.09M的氯化鈉或0.09M的氯化鈉和3-羥甲基氨基甲烷鹽酸溶液；b.用靜電微囊發(fā)生器或微滴注入技術(shù)將細(xì)胞或基因與明膠/殼聚糖基質(zhì)材料噴入1～20％三磷酸鈉水溶液交聯(lián)；對于明膠/海藻酸鈉基質(zhì)材料噴或注入濃度為1～20％乳酸鈣或氯化鈣水溶液交聯(lián)，形成微球；然后將三磷酸鈉水溶液或乳酸鈣、氯化鈣水溶液吸出；將微球與濃度為0.1～1％的戊二醛溶液進一步反應(yīng)1～180秒鐘，形成微膠珠；對于細(xì)胞或基因與明膠、膠原或明膠/膠原混合物直接噴或注入濃度為0.1～1％的戊二醛溶液反應(yīng)1～180秒鐘，形成微膠珠；對于細(xì)胞或基因與明膠/殼聚糖、明膠/海藻酸鈉基質(zhì)材料形成的微膠珠再與濃度為0.1～10％檸檬酸鈉緩沖溶液反應(yīng)10分鐘～2小時，形成液化微膠珠；
2)制備網(wǎng)管狀結(jié)構(gòu)將生物可降解高分子材料或其與肝素的復(fù)合物溶液，利用計算機輔助的快速成型技術(shù)、涂覆法或一次性灌注成形技術(shù)，經(jīng)冷凍干燥，制成網(wǎng)管狀組織器官不同零件的三維結(jié)構(gòu)支架；所述的生物可降解高分子材料為聚氨酯、聚乳酸、乳酸與乙醇酸共聚物、聚羥基酸、3-羥基丁酸和3-羥基己酸共聚物、聚己內(nèi)酯、膠原、明膠、纖維蛋白、纖維粘連蛋白、膠原/殼聚糖、膠原/硫酸軟骨素、明膠/殼聚糖或其中兩種復(fù)合物，其中聚氨酯、聚乳酸、乳酸與乙醇酸共聚物、聚羥基酸、3-羥基丁酸和3-羥基己酸共聚物、聚己內(nèi)酯采用濃度為1～10％的1，4-二氧六環(huán)或氯仿溶液；其中膠原、明膠、纖維蛋白、纖維粘連蛋白、膠原/殼聚糖、膠原/硫酸軟骨素、明膠/殼聚糖或其中兩種復(fù)合物采用濃度為1～40％的的水溶液或pH＝6～8的0.09M的氯化鈉或0.09M的氯化鈉和3-羥甲基氨基甲烷鹽酸溶液，成形后用濃度為0.1～1％的交聯(lián)劑戊二醛或濃度1～10％的三磷酸鈉平衡溶液交聯(lián)；3)組裝利用微囊注射技術(shù)將步驟1)b中的微膠珠注射到所述的三維結(jié)構(gòu)支架相應(yīng)的位置上，體外培養(yǎng)或體內(nèi)植入；
2.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟1)a中所述的細(xì)胞或基因與基質(zhì)材料的混合物利用凝膠注射技術(shù)直接注射到步驟2)中的三維結(jié)構(gòu)支架中，再用濃度為0.1～1％的戊二醛溶液、1～20％乳酸鈣、氯化鈣或三磷酸鈉水溶液交聯(lián)。
3.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的基質(zhì)材料中復(fù)合有細(xì)胞生長因子。
4.一種復(fù)雜組織器官前體的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟1)種子細(xì)胞或基因與基質(zhì)材料管道狀三維結(jié)構(gòu)的制備a.分離或誘導(dǎo)所需的種子細(xì)胞或基因，將所得的不同種類的種子細(xì)胞或基因的懸浮液離心分離后分別與含有1-40％的基質(zhì)材料的溶液均勻混合，制成細(xì)胞或基因與基質(zhì)材料的混合物；所述的基質(zhì)材料為明膠、膠原、明膠/膠原、明膠/殼聚糖或明膠/海藻酸鈉，其中所述的明膠/殼聚糖或明膠/海藻酸鈉的混合溶液中明膠與殼聚糖或明膠與海藻酸鈉的質(zhì)量比0.5～100∶1，所述種子細(xì)胞或基因占所述基質(zhì)材料混合溶液的0.01～10％；所述的基質(zhì)材料的溶液為水溶液或pH＝6～8的0.09M的氯化鈉或0.09M的氯化鈉和3-羥甲基氨基甲烷鹽酸溶液；b.在0～30℃的環(huán)境下根據(jù)預(yù)先設(shè)計的結(jié)構(gòu)和定義規(guī)劃的路徑，將上述細(xì)胞與基質(zhì)材料的混合物通過微滴噴射、數(shù)字?jǐn)D壓技術(shù)利用細(xì)胞組裝機在成形室中逐層堆積得到細(xì)胞與基質(zhì)材料的多管道三維立體結(jié)構(gòu)；對于基質(zhì)材料為明膠/殼聚糖形成的管道狀三維結(jié)構(gòu)，用1～20％三磷酸鈉水溶液交聯(lián)；對于基質(zhì)材料為明膠/海藻酸鈉形成的管道狀三維結(jié)構(gòu)，用濃度為1～20％乳酸鈣或氯化鈣水溶液交聯(lián)；然后將交聯(lián)劑吸出，再與濃度為0.1～1％的戊二醛水或生理鹽水溶液反應(yīng)1～180秒鐘；對于基質(zhì)材料為明膠/殼聚糖、明膠/海藻酸鈉基質(zhì)材料形成的管道狀三維結(jié)構(gòu)再與濃度為0.1～10％檸檬酸鈉緩沖溶液反應(yīng)10分鐘～2小時，形成內(nèi)部液化的管道狀三維結(jié)構(gòu)；對于基質(zhì)材料為明膠、膠原或明膠/膠原形成的管道狀三維結(jié)構(gòu)，直接用濃度為0.1～1％的戊二醛溶液交聯(lián)1～180秒鐘；2)制備網(wǎng)管狀結(jié)構(gòu)將生物可降解高分子材料或其與肝素的復(fù)合物溶液，利用計算機輔助的快速成型技術(shù)、涂覆法或一次性灌注成形技術(shù)，經(jīng)冷凍干燥，制成網(wǎng)管狀組織器官不同零件的三維結(jié)構(gòu)支架；所述的生物可降解高分子材料為聚氨酯、聚乳酸、乳酸與乙醇酸共聚物、聚羥基酸、3-羥基丁酸和3-羥基己酸共聚物、聚己內(nèi)酯、膠原、明膠、纖維蛋白、纖維粘連蛋白、膠原/殼聚糖、膠原/硫酸軟骨素、明膠/殼聚糖或其中兩種復(fù)合物，其中聚氨酯、聚乳酸、乳酸與乙醇酸共聚物、聚羥基酸、3-羥基丁酸和3-羥基己酸共聚物、聚己內(nèi)酯采用濃度為1～10％的1，4-二氧六環(huán)溶液；其中膠原、明膠、纖維蛋白、纖維粘連蛋白、膠原/殼聚糖、膠原/硫酸軟骨素、明膠/殼聚糖或其中兩種復(fù)合物采用濃度為1～40％的的水溶液或pH＝6～8的0.09M的氯化鈉或0.09M的氯化鈉和3-羥甲基氨基甲烷鹽酸溶液，成形后用濃度為0.1～1％的交聯(lián)劑戊二醛或濃度1～10％的三磷酸鈉平衡溶液交聯(lián)；3)組裝將步驟2)制備的網(wǎng)管狀結(jié)構(gòu)插入步驟1)制備的管道狀三維結(jié)構(gòu)中，外包一層可降解的、降解速度在1～6個月的組織相容性的高分子膜。
全文摘要
一種復(fù)雜組織器官前體的制備方法，屬于生物組織工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用種子細(xì)胞或基因與基質(zhì)材料制備成微膠珠或多管道三維結(jié)構(gòu)，并利用計算機輔助快速成型法、涂覆法、一次性灌注成形等技術(shù)實現(xiàn)細(xì)胞和支架材料在空間的準(zhǔn)確定位，克服了組織工程目前存在的在三維支架中誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞需要時間長、細(xì)胞在支架中分布不均勻、細(xì)胞很難滲入到深層結(jié)構(gòu)中等缺點。利用零部件組合的原理可以達(dá)到復(fù)雜器官中不同部位不同細(xì)胞類型及結(jié)構(gòu)類型的要求，實現(xiàn)復(fù)雜組織器官的重建，從而達(dá)到修復(fù)再生的目的。
文檔編號C12N5/08GK1609200SQ20041009155
公開日2005年4月27日 申請日期2004年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月19日
發(fā)明者顏永年, 王小紅, 熊卓, 林峰, 吳任東, 張人佶, 盧清萍 申請人:清華大學(xué)