專利名稱：發(fā)酵生產(chǎn)α－熊果苷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及α-熊果苷的制備方法。
背景技術(shù)：
目前，國(guó)內(nèi)對(duì)于生物法合成α-熊果苷的文獻(xiàn)尚未見報(bào)道；國(guó)外α-熊果苷的制備方法主要是通過以α糖苷酶為催化劑，催化合成對(duì)苯二酚與葡萄糖為α-熊果苷，由于α糖苷酶價(jià)格昂貴，所以生產(chǎn)的α-熊果苷成本很高，且采用上述方法制備α-熊果苷產(chǎn)率不高，給實(shí)際推廣應(yīng)用帶來了很大困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種α-熊果苷的制備方法，該制備方法通過對(duì)野油菜黃單胞菌進(jìn)行篩選、誘變獲得一株α-熊果苷產(chǎn)率很高、抗對(duì)苯二酚能力強(qiáng)的菌株野油菜黃單胞菌CGMCC NO.1243，選用合適的培養(yǎng)基在最適培養(yǎng)條件下培養(yǎng)一定時(shí)間，加入反應(yīng)物對(duì)苯二酚與蔗糖，在最佳反應(yīng)條件下發(fā)酵生產(chǎn)α-熊果苷，發(fā)酵液通過大孔吸附樹脂柱的分離、純化后，可得到高純度的α-熊果苷。該方法具有工藝操作簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低、操作安全等優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明的整體技術(shù)構(gòu)思是發(fā)酵法生產(chǎn)α-熊果苷，該方法由下列工藝步驟組成(1)將野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243菌種接種到試管中的斜面培養(yǎng)基制成斜面菌種；(2)將斜面菌株擴(kuò)大培養(yǎng)作為種子液；(3)將種子液接入發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵；(4)加入反應(yīng)物對(duì)苯二酚和蔗糖；(5)α-熊果苷的分離純化。
本發(fā)明的具體工藝步驟及工藝條件是步驟(1)中斜面培養(yǎng)基由下列重量份組分組成蔗糖40-60份、蛋白胨10-20份、酵母粉2.0-3.5份、硫酸鎂0.5份、磷酸氫二鉀2.0份、氯化鈉2.0份、瓊脂15-20份和水1000份；制備斜面菌種的工藝條件為pH值為7.0-8.0、溫度25-35℃、培養(yǎng)時(shí)間為24-48小時(shí)。
步驟(2)中種子液和步驟(3)中發(fā)酵液由下列重量份組分組成蔗糖40-60份、蛋白胨10-20份、硫酸鎂0.5-1.0份、碳酸鈣2份和水1000份；發(fā)酵的工藝條件為發(fā)酵液接種量為10-15％，pH值為7.0-7.5，培養(yǎng)溫度為25-35℃，通風(fēng)量為0.4-0.6vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為120-160轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵時(shí)間為24-36小時(shí)。步驟(4)中反應(yīng)條件為反應(yīng)物對(duì)苯二酚物質(zhì)量濃度為30-48mmol/l，蔗糖物質(zhì)量濃度為100-200mmol/l，反應(yīng)溫度為30-55℃，反應(yīng)時(shí)間為36-72小時(shí)，攪拌轉(zhuǎn)速為160-200轉(zhuǎn)/分鐘。在此反應(yīng)條件下，對(duì)苯二酚轉(zhuǎn)化為α-熊果苷的轉(zhuǎn)化率達(dá)87-92％，每升發(fā)酵液中含α-熊果苷8-11g。
步驟(5)中α-熊果苷的分離純化包括以下四個(gè)步驟；a、將發(fā)酵完成后的發(fā)酵液在4000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心20分鐘；b、把經(jīng)過a步驟后的發(fā)酵液通過弱極性大孔吸附樹脂柱進(jìn)行脫色，弱極性大孔吸附樹脂柱為大孔吸附樹脂AB-8柱，經(jīng)過a步驟后的發(fā)酵液經(jīng)過AB-8柱吸附后，發(fā)酵液變成無色透明液體；c、把經(jīng)過b步驟的發(fā)酵液通過極性大孔吸附樹脂柱進(jìn)行分離純化，極性大孔吸附樹脂柱為大孔吸附樹脂S-8柱；d、把經(jīng)過c步驟的發(fā)酵液真空干燥，即可得到純度為98％以上的α-熊果苷，真空干燥真空度為0.1Mpa，溫度為65度，干燥后的成品為白色粉末狀。
本發(fā)明所用的野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243已經(jīng)在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)為野油菜黃單胞菌CGMCCNO.1243。
野油菜黃單胞菌CGMCC NO.1243的篩選，由下列工藝步驟組成(1)將安培管野油菜黃單胞菌菌種接種斜面制得斜面菌種；(2)將復(fù)壯后菌種涂布平板；(3)將平板菌落接種搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，進(jìn)行初篩和復(fù)篩；(4)將復(fù)篩后的菌株進(jìn)行復(fù)合誘變；步驟(1)中斜面培養(yǎng)基和步驟(2)中的平板培養(yǎng)基由下列重量份組分組成蔗糖40-60份、蛋白胨10-20份、酵母粉2.0-3.5份、硫酸鎂0.5份、磷酸氫二鉀2.0份、氯化鈉2.0份、瓊脂15-20份和水1000份；制備斜面菌種和平板的工藝條件為pH值為7.0-8.0、溫度25-35℃、培養(yǎng)時(shí)間為24-48小時(shí)。
步驟(3)中發(fā)酵液由下列重量份組分組成蔗糖40-60份、蛋白胨10-20份、硫酸鎂0.5-1.0份、碳酸鈣2份和水1000份；發(fā)酵的工藝條件為pH值為7.0-7.5，培養(yǎng)溫度為25-35℃，攪拌轉(zhuǎn)速為120-160轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵時(shí)間為24-36小時(shí)。
步驟(4)中誘變依次包括種子菌懸液的制備，誘變劑的加入量，紫外照射時(shí)間。
將斜面菌種接種到含5ml生理鹽水試管中，往試管中加入體積百分比為0.5％-2.0％的硫酸二乙酯誘變劑，在漩渦振蕩器上振蕩1-2min，取0.5ml該菌懸液涂布平板，把平板放在紫外燈照射20-60s，然后把平板暗培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度25-35℃、培養(yǎng)時(shí)間為48-72小時(shí)。
最后，得到野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243。
本發(fā)明所取得的技術(shù)進(jìn)步在于本發(fā)明是通過野油菜黃單胞菌CGMCC NO.1243發(fā)酵生產(chǎn)α-熊果苷，降低了生產(chǎn)成本，且生產(chǎn)過程中不使用有機(jī)溶劑，發(fā)酵過程中不產(chǎn)生有害物質(zhì)，工藝步驟簡(jiǎn)單，提高了生產(chǎn)操作安全性。采用本發(fā)明生產(chǎn)的α-熊果苷產(chǎn)量高，每升發(fā)酵液中含8-11gα-熊果苷，通過大孔吸附樹脂分離純化，純度可達(dá)到98％以上，具有重大工業(yè)化意義。
實(shí)施例以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述。
實(shí)施例1(1)菌種斜面培養(yǎng)將野油菜黃單胞菌CGMCC NO.1243菌種接種到試管中的斜面培養(yǎng)基制成斜面菌種；其中菌種斜面培養(yǎng)基由下列重量份組分組成蔗糖55份、蛋白胨15份、酵母粉3份、硫酸鎂0.5份、磷酸氫二鉀2.0份、氯化鈉2.0份、瓊脂15份和水1000份制備斜面菌種的工藝條件為pH值為7.0、溫度30℃、培養(yǎng)時(shí)間為36小時(shí)。
(2)接種發(fā)酵將斜面菌株擴(kuò)大培養(yǎng)作為種子液；
將種子液按10％的接種量接入發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵；其中種子液和發(fā)酵液由下列重量份組分組成蔗糖55份、蛋白胨15份、硫酸鎂1.0份、碳酸鈣2份和水1000份發(fā)酵的工藝條件為發(fā)酵液接種量為10％，pH值為7.0，培養(yǎng)溫度為30℃，通風(fēng)量為0.6vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為130轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時(shí)間為36小時(shí)。
(3)生產(chǎn)α-熊果苷加入反應(yīng)物對(duì)苯二酚物質(zhì)量濃度為35mmol/l及蔗糖物質(zhì)量濃度為150mmol/l；其中反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度為35℃，反應(yīng)時(shí)間為48小時(shí)，攪拌轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘。在此反應(yīng)條件下，對(duì)苯二酚轉(zhuǎn)化為α-熊果苷的轉(zhuǎn)化率達(dá)91.5％，每升發(fā)酵液中含α-熊果苷8.5g。
(4)α-熊果苷的分離純化，包括以下四個(gè)步驟a、將發(fā)酵完成后的發(fā)酵液在4000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心20分鐘b、步驟中的弱極性大孔吸附樹脂柱為大孔吸附樹脂AB-8柱，經(jīng)過a步驟后的發(fā)酵液經(jīng)過AB-8柱吸附后，發(fā)酵液變成無色透明液體。
c、步驟中的極性大孔吸附樹脂柱為大孔吸附樹脂S-8柱。
d、步驟中的真空干燥真空度為0.1Mpa，溫度為65℃，干燥后的成品為白色粉末狀，純度達(dá)99％。
實(shí)施例2(1)菌種斜面培養(yǎng)將野油菜黃單胞菌CGMCC NO.1243菌種接種到試管中的斜面培養(yǎng)基制成斜面菌種；其中斜面培養(yǎng)基由下列重量份組分組成蔗糖45份、蛋白胨10份、酵母粉2.5份、硫酸鎂0.5份、磷酸氫二鉀2.0份、氯化鈉2.0份、瓊脂15份和水1000份制備斜面菌種的工藝條件為pH值為7.5、溫度30℃、培養(yǎng)時(shí)間為24小時(shí)。
(2)接種發(fā)酵將斜面菌株擴(kuò)大培養(yǎng)作為種子液；將種子液按15％的接種量接入發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵；其中種子液和發(fā)酵液由下列重量份組分組成蔗糖45份、蛋白胨10份、硫酸鎂1.0份、碳酸鈣2份和水1000份發(fā)酵的工藝條件為發(fā)酵液接種量為15％，pH值為7.5，培養(yǎng)溫度為30℃，通風(fēng)量為0.5vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為140轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時(shí)間為24小時(shí)。
(3)生產(chǎn)α-熊果苷加入反應(yīng)物對(duì)苯二酚物質(zhì)量濃度為40mmol/l及蔗糖物質(zhì)量濃度為200mmol/l；其中反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度為40℃，反應(yīng)時(shí)間為48小時(shí)，攪拌轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘。在此反應(yīng)條件下，對(duì)苯二酚轉(zhuǎn)化為α-熊果苷的轉(zhuǎn)化率達(dá)90.2％，每升發(fā)酵液中含α-熊果苷9.6g。
(4)α-熊果苷的分離純化，包括以下四個(gè)步驟a、將發(fā)酵完成后的發(fā)酵液在4000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心20分鐘；b、步驟中的弱極性大孔吸附樹脂為大孔吸附樹脂AB-8柱，經(jīng)過a步驟后的發(fā)酵液經(jīng)過AB-8柱吸附后，發(fā)酵液變成無色透明液體。
c、步驟中的極性大孔吸附樹脂為大孔吸附樹脂S-8柱。
d、步驟中的真空干燥真空度為0.1Mpa，溫度為65℃，干燥后的成品為白色粉末狀，純度達(dá)98.3％。
實(shí)施例3(1)菌種斜面培養(yǎng)將野油菜黃單胞菌CGMCC NO.1243菌種接種到試管中的斜面培養(yǎng)基制成斜面菌種；其中斜面培養(yǎng)基由下列重量份組分組成蔗糖55份、蛋白胨10份、酵母粉2.0份、硫酸鎂0.5份、磷酸氫二鉀2.0份、氯化鈉2.0份、瓊脂15份和水1000份制備斜面菌種的工藝條件為pH值為7.5、溫度30℃、培養(yǎng)時(shí)間為36小時(shí)。
(2)接種發(fā)酵將斜面菌株擴(kuò)大培養(yǎng)作為種子液；將種子液按12.5％的接種量接入發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵；其中種子液和發(fā)酵液由下列重量份組分組成蔗糖55份、蛋白胨10份、硫酸鎂1.0份、碳酸鈣2份和1000份發(fā)酵的工藝條件為發(fā)酵液接種量為12.5％，pH值為7.5，培養(yǎng)溫度為30℃，通風(fēng)量為0.4vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為160轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時(shí)間為36小時(shí)。
(3)生產(chǎn)α-熊果苷加入反應(yīng)物對(duì)苯二酚物質(zhì)量濃度為45mmol/l及蔗糖物質(zhì)量濃度為200mmol/l；反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度為50℃，反應(yīng)時(shí)間為48小時(shí)，攪拌轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘。在此反應(yīng)條件下，對(duì)苯二酚轉(zhuǎn)化為α-熊果苷的轉(zhuǎn)化率達(dá)87.0％，每升發(fā)酵液中含α-熊果苷10g。
(4)α-熊果苷的分離純化，包括以下四個(gè)步驟a、將發(fā)酵完成后的發(fā)酵液在4000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心20分鐘；b、步驟中的弱極性大孔吸附樹脂為大孔吸附樹脂AB-8柱，經(jīng)過a步驟后的發(fā)酵液經(jīng)過AB-8柱吸附后，發(fā)酵液變成無色透明液體。
c、步驟中的極性大孔吸附樹脂為大孔吸附樹脂S-8柱。
d、步驟中的真空干燥真空度為0.1Mpa，溫度為65℃，干燥后的成品為白色粉末狀，純度達(dá)98.0％。
權(quán)利要求
1.發(fā)酵生產(chǎn)α-熊果苷的方法，其特征在于用野油菜黃單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)α-熊果苷，生產(chǎn)過程由下列工藝步驟組成(1)將野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243菌種接種到試管中的斜面培養(yǎng)基制成斜面菌種；(2)將斜面菌種擴(kuò)大培養(yǎng)作為種子液；(3)將種子液接入發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵；(4)加入反應(yīng)物對(duì)苯二酚和蔗糖；(5)α-熊果苷的分離純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵生產(chǎn)α-熊果苷的方法，其特征在于所述的(1)步驟中的斜面培養(yǎng)基由下列重量份組分組成蔗糖40-60份、蛋白胨10-20份、酵母粉2.0-3.5份、硫酸鎂0.5份、磷酸氫二鉀2.0份、氯化鈉2.0份、瓊脂15-20份和水1000份。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的發(fā)酵生產(chǎn)α-熊果苷的方法，其特征在于制備斜面菌種的工藝條件為pH值為7.0-8.0、溫度25-35℃、培養(yǎng)時(shí)間為24-48小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵生產(chǎn)α-熊果苷的方法，其特征在于所述的(2)步驟中的種子液和(3)步驟中發(fā)酵液由下列重量份組分組成蔗糖40-60份、蛋白胨10-20份、硫酸鎂0.5-1.0份、碳酸鈣2份和水1000份。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的發(fā)酵生產(chǎn)α-熊果苷的方法，其特征在于發(fā)酵的工藝條件為發(fā)酵液接種量為10-15％，pH值為7.0-7.5，培養(yǎng)溫度為25-35℃，通風(fēng)量為0.4-0.6vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為120-160轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時(shí)間為24-36小時(shí)，。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵生產(chǎn)α-熊果苷的方法，其特征在于所述的(4)步驟中的反應(yīng)條件為反應(yīng)物對(duì)苯二酚物質(zhì)量濃度為30-48mmol/l，蔗糖物質(zhì)量濃度為100-200mmol/l，反應(yīng)溫度為30-55℃，反應(yīng)時(shí)間為36-72小時(shí)，攪拌轉(zhuǎn)速為160-200轉(zhuǎn)/分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵生產(chǎn)α-熊果苷的方法，其特征在于所述的(5)步驟中的α-熊果苷的分離純化包括以下四個(gè)步驟a、將發(fā)酵完成后的發(fā)酵液在4000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心20分鐘；b、把經(jīng)過a步驟后的發(fā)酵液通過弱極性大孔吸附樹脂柱進(jìn)行脫色；c、把經(jīng)過b步驟的發(fā)酵液通過極性大孔吸附樹脂柱進(jìn)行分離純化；d、把經(jīng)過c步驟的發(fā)酵液真空干燥，即可得到純度為98％以上的α-熊果苷。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的發(fā)酵生產(chǎn)α-熊果苷的方法，其特征在于所述的a步驟發(fā)酵液在4000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心20分鐘；b步驟中的弱極性大孔吸附樹脂柱為AB-8柱；c步驟中的極性大孔吸附樹脂柱為S-8柱；d步驟中的真空干燥真空度為0.1Mpa，溫度為65度，干燥后的成品純度達(dá)98％以上。
9.野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243。
全文摘要
本發(fā)明涉及α－熊果苷的制備方法，它包括斜面種子的制備，培養(yǎng)基的選擇，反應(yīng)條件的優(yōu)化和產(chǎn)物的提取等工藝步驟。本發(fā)明通過野油菜黃單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)α－熊果苷，具有生產(chǎn)成本低，生產(chǎn)過程中不使用有機(jī)溶劑，發(fā)酵過程中不產(chǎn)生有害物質(zhì)，工藝步驟簡(jiǎn)單，生產(chǎn)操作安全等優(yōu)點(diǎn)。采用本發(fā)明生產(chǎn)α－熊果苷產(chǎn)量高，每升發(fā)酵液中含有8－11g α－熊果苷，對(duì)苯二酚轉(zhuǎn)化率可達(dá)91％。α－熊果苷具有顯著的抑制酪氨酸酶活性，減少酪氨酸酶在皮膚中的沉積，對(duì)皮膚有漂白、防色變和祛斑的功效。
文檔編號(hào)C12P33/00GK1635139SQ200410090980
公開日2005年7月6日 申請(qǐng)日期2004年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月15日
發(fā)明者劉春巧 申請(qǐng)人:劉春巧