專利名稱：細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物的制作方法
本申請是同名中國專利申請97191855.4號的分案申請，原案國際申請日1997年1月21日，國際申請?zhí)朠CT/JP97/00116。
本發(fā)明涉及可用于醫(yī)藥品的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物、抗癌藥物和制癌藥物。本發(fā)明還提供了一種誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法，這種方法在例如，解釋細(xì)胞凋亡機(jī)理和篩選細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)抑制劑上是有用的。本發(fā)明還提供了純化的含硫酸巖藻糖多糖及其降解產(chǎn)物以及可用于產(chǎn)生含硫酸巖藻糖多糖的降解產(chǎn)物并研究其結(jié)構(gòu)的含硫酸巖藻糖多糖的降解酶。
近幾年，在關(guān)于細(xì)胞組織的死亡方面，細(xì)胞凋亡(apoptosis，自我破碎細(xì)胞死亡或者自殺性細(xì)胞死亡)的方式已經(jīng)引起了人們的關(guān)注。
人們認(rèn)為，細(xì)胞凋亡與壞死意義上的病理細(xì)胞死亡不同，是在基因中固定編程的死亡。也就是一些外部或者內(nèi)部因子觸發(fā)細(xì)胞凋亡的編程基因的活化。在基因基礎(chǔ)上，隨后生物合成了編程的死亡基因蛋白質(zhì)并且分解細(xì)胞本身，因此引起死亡。
如果可能，在所需的組織或者細(xì)胞中表達(dá)細(xì)胞凋亡是很有意義的，因為可以從活體中自發(fā)地除去不必要的或者病原細(xì)胞。
本發(fā)明目的在于開發(fā)具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的高度安全的化合物，并且因此提供含有這些化合物的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物、抗癌藥物和制癌藥物和通過使用這些化合物作為活性成分來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法。本發(fā)明的目的還在于提供能夠降解本發(fā)明的化合物的酶，所說的酶在產(chǎn)生這些化合物的降解產(chǎn)物方面是有用的。
總之，本發(fā)明的第一項發(fā)明涉及細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)物，其特征在于包含含硫酸巖藻糖多糖和/或其降解產(chǎn)物。
本發(fā)明的第二項發(fā)明涉及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法，其特征在于使用含有硫酸巖藻糖的巖藻糖多糖和/或其降解產(chǎn)物作為活性成分。
本發(fā)明的第三項發(fā)明涉及抗癌藥物，其特征在于含有本發(fā)明的第五項或者第六項發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖和/或其降解產(chǎn)物。
本發(fā)明的第四項發(fā)明涉及包含含硫酸巖藻糖多糖和/或其降解產(chǎn)物的制癌藥物。
本發(fā)明的第五項發(fā)明涉及具有下列理化性質(zhì)的含硫酸巖藻糖多糖(1)組成糖類含有糖醛酸；和(2)由黃桿菌Flavobacterium sp.SA-0082(FERM BP-5402)產(chǎn)生的巖藻依聚糖分解酶降解，結(jié)果形成了至少一種由下列化學(xué)式(I)、(II)和(III)代表的化合物


本發(fā)明的第六項發(fā)明涉及具有下列理化性質(zhì)的含硫酸巖藻糖多糖(1)組成糖類實質(zhì)上不含有糖醛酸；和(2)實質(zhì)上不能被黃桿菌Flavobacterium sp.SA-0082(FERM BP-5402)產(chǎn)生的巖藻依聚糖分解酶降解。
本發(fā)明的第七項發(fā)明涉及本發(fā)明的第五項發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖的制造方法，其特征在于含有使用能夠聚合酸性多糖的藥物，在鹽存在下處理含硫酸巖藻糖多糖的混合物，并且除去沉淀的步驟。
本發(fā)明的第八項發(fā)明涉及本發(fā)明的第五項發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖的制造方法，其特征在于含有使用陰離子交換樹脂，在二價陽離子存在下處理含硫酸巖藻糖多糖的混合物，并提取目的多糖的步驟。
本發(fā)明的第九項發(fā)明涉及產(chǎn)生本發(fā)明的第五項發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖的制造方法，其特征在于含有在產(chǎn)生本發(fā)明的第五項發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖的過程中，通過使用多糖物質(zhì)或者具有陰離子交換基團(tuán)的物質(zhì)除去共存的著色物質(zhì)的步驟。
本發(fā)明的第十項發(fā)明涉及本發(fā)明的第六項發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖的制造方法，包括使用能夠降解含有糖醛酸的含硫酸巖藻糖多糖的降解酶或者含有此酶的微生物處理含硫酸巖藻糖多糖的混合物，并收集目的多糖的步驟。
本發(fā)明的第十一項發(fā)明涉及本發(fā)明的第六項發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖的制造方法，包括使用能夠聚合酸性多糖的藥物，在鹽的存在下處理含硫酸巖藻糖多糖的混合物和沉淀出目的多糖的步驟。
本發(fā)明的第十二項發(fā)明涉及本發(fā)明的第六項發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖的制造方法，包括在二價陽離子存在下，使用陰離子交換樹脂處理含硫酸巖藻糖多糖的混合物以吸收所說的多糖的步驟。
本發(fā)明的第十三項發(fā)明涉及本發(fā)明的第六項發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖的制造方法，包括在本發(fā)明的第六項發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖的過程中，通過使用多糖物質(zhì)或者具有陰離子交換基團(tuán)的物質(zhì)除去共存的著色物質(zhì)的步驟。
本發(fā)明的第十四項發(fā)明涉及含硫酸巖藻糖多糖混合物的制造方法，其特征在于在乙酸根離子和鈣離子存在下，從海藻類中提取在本發(fā)明的第七項、第八項、第十項、第十一項或者第十二項發(fā)明中使用的含硫酸巖藻糖多糖混合物。
本發(fā)明的第十五項發(fā)明涉及具有下列理化性質(zhì)的含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶(i)功能作用于具有下列理化性質(zhì)的含硫酸巖藻糖多糖并降解該含硫酸巖藻糖多糖(a)組成糖類實質(zhì)上不含有糖醛酸；和(b)實質(zhì)上不能被黃桿菌Flavobacterium sp.SA-0082(FERM BP-5402)產(chǎn)生的巖藻依聚糖分解酶降解。
不作用于具有下列理化性質(zhì)的含硫酸巖藻糖多糖(c)組成糖類含有糖醛酸；和(d)能被黃桿菌Flavobacterium sp.SA-0082(FERM BP-5402)產(chǎn)生的巖藻依聚糖分解酶降解以形成至少一種由下列化學(xué)式(I)、(II)和(III)代表的化合物


(ii)最適pH值大約pH7-8；和(iii)最適溫度大約30-35℃。
本發(fā)明的第十六項發(fā)明涉及一種酶組合物，這種組合物包含本發(fā)明的第十五項發(fā)明的鈣源和含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶。
本發(fā)明的第十七項發(fā)明涉及本發(fā)明的第十五項發(fā)明的含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶的制造方法，包括培養(yǎng)能夠產(chǎn)生本發(fā)明的第十五項發(fā)明的含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶的交替單胞菌屬和從培養(yǎng)基中回收所說的酶。
本發(fā)明的第十八項發(fā)明涉及一種含硫酸巖藻糖多糖的降解產(chǎn)物，這種降解產(chǎn)物是通過使用本發(fā)明的第十五項發(fā)明的含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶處理本發(fā)明的第六項發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖所獲得的。
本發(fā)明人成功地獲得了各種純化的含硫酸巖藻糖多糖或其降解產(chǎn)物，并且考查了這些物質(zhì)的生物活性。結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)這些物質(zhì)誘導(dǎo)癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，并且具有強(qiáng)烈的抗癌作用。他們還發(fā)現(xiàn)含硫酸巖藻糖多糖和/或其降解產(chǎn)物具有強(qiáng)烈的制癌作用。他們還成功地分離了能夠降解含硫酸巖藻糖多糖并且在制備本發(fā)明的降解產(chǎn)物時有用的酶，從而完成了本發(fā)明。
附圖的簡要說明

圖1.顯示含硫酸巖藻糖多糖的沉淀比。
圖2.顯示通過凝膠過濾方法用Sephacryl S-500測定的含硫酸巖藻糖多糖-U的分子量分布。
圖3.是含硫酸巖藻糖多糖-U的IR光譜。
圖4.是含硫酸巖藻糖多糖-U的1H-NMR譜。
圖5.顯示從L-柱中洗脫的糖類化合物(a)的吡啶基-(2)-氨基化物(PA-a)的洗脫模式。
圖6.顯示從L-柱中洗脫的糖類化合物(b)的吡啶基-(2)-氨基化物(PA-b)的洗脫模式。
圖7.顯示從L-柱中洗脫的糖類化合物(c)的吡啶基-(2)-氨基化物(PA-c)的洗脫模式。
圖8.是糖類化合物(a)的質(zhì)譜圖(負(fù)測量)。
圖9.是糖類化合物(b)的質(zhì)譜圖(負(fù)測量)。
圖10.是糖類化合物(c)的質(zhì)譜圖(負(fù)測量)。
圖11.是糖類化合物(a)的質(zhì)-質(zhì)譜圖(負(fù)測量)。
圖12.是糖類化合物(b)的質(zhì)-質(zhì)光譜圖(負(fù)測量)。
圖13.是糖類化合物(c)的質(zhì)-質(zhì)光譜圖(負(fù)測量)。
圖14.是糖類化合物(a)的1H-NMR譜。
圖15.是糖類化合物(b)的1H-NMR譜。
圖16.是糖類化合物(c)的1H-NMR譜。
圖17顯示通過凝膠過濾方法用聚丙烯酰胺葡聚糖S-500測定的含硫酸巖藻糖多糖-F的分子量分布。
圖18.是含硫酸巖藻糖多糖-F的IR光譜。
圖19.是含硫酸巖藻糖多糖-F的1H-NMR譜。
圖20.顯示了本發(fā)明得到的含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶的相對活性和pH值之間的關(guān)系。
圖21.顯示了本發(fā)明得到的含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶的相對活性和溫度之間的關(guān)系。
圖22.顯示通過凝膠過濾方法，使用Cellulofine GCL-300用本發(fā)明獲得的含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖降解酶降解含硫酸巖藻糖多糖-F前后的分子量分布。
圖23.顯示了本發(fā)明得到的含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖降解酶的相對活性與反應(yīng)混合物中的鈣離子濃度之間的關(guān)系。
圖24.顯示了在實施例19-(6)中，用本發(fā)明得到的含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶降解后，通過凝膠過濾方法使用Cellulofine GCL-300測定的含硫酸巖藻糖多糖-F的分子量分布。
圖25.是用本發(fā)明得到的含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖降解酶降解的含硫酸巖藻糖多糖-F的IR光譜。
圖26.是用本發(fā)明得到的含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖降解酶降解的含硫酸巖藻糖多糖-F的1H-NMR譜。
圖27.顯示了培養(yǎng)時間與HL-60細(xì)胞培養(yǎng)液中活細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系，所說的培養(yǎng)液中已經(jīng)按濃度為1mg/ml加入了實施例1、15和18中獲得的含硫酸巖藻糖多糖。
圖28顯示培養(yǎng)時間與MOLT-3細(xì)胞培養(yǎng)液中的活細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系，其中向MOLT-3細(xì)胞培養(yǎng)液中加入了實施例1得到的含硫酸巖藻糖多糖、實施例12得到的含硫酸巖藻糖多糖-F、實施例15和17中得到的含硫酸巖藻糖多糖和葡聚糖硫酸酯。
圖29.顯示培養(yǎng)時間和HCT 116細(xì)胞培養(yǎng)液中的活細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系，其中向HCT 116細(xì)胞培養(yǎng)液中加入了在實施例1中所獲得的包含含硫酸巖藻糖多糖的標(biāo)品；在實施例1中所獲得的含硫酸巖藻糖多糖的混合物；在實施例12中所獲得的含硫酸巖藻糖多糖-U和含硫酸巖藻糖多糖-F、F-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3和F-Fd-4；在實施例15獲得的含硫酸巖藻糖多糖和肝素和葡聚糖硫酸酯。
圖30.顯示培養(yǎng)時間和HCT 116細(xì)胞培養(yǎng)液中的活細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系，其中以不同的濃度向HCT 116細(xì)胞培養(yǎng)液中加入了在實施例1中所獲得的含硫酸巖藻糖多糖的標(biāo)品。
圖31.顯示培養(yǎng)時間和AGS細(xì)胞培養(yǎng)液中的活細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系，其中以不同的濃度向AGS細(xì)胞培養(yǎng)液中加入實施例1中所獲得的含硫酸巖藻糖多糖標(biāo)品。
圖32.顯示培養(yǎng)時間和SW 480細(xì)胞培養(yǎng)液中的活細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系，其中以不同的濃度向SW 480細(xì)胞培養(yǎng)液中加入實施例1中所獲得的含硫酸巖藻糖多糖標(biāo)品。
圖33.顯示培養(yǎng)時間和WiDR細(xì)胞培養(yǎng)液中的活細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系，其中向WiDR細(xì)胞培養(yǎng)液中加入實施例1中所獲得的含硫酸巖藻糖多糖標(biāo)品；在實施例12中所獲得的含硫酸巖藻糖多糖-F、F-Fd-3和F-Fd-4和在實施例15中所獲得的含硫酸巖藻糖多糖。
圖34.顯示培養(yǎng)時間和WiDR細(xì)胞培養(yǎng)液中的活細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系，其中以不同的濃度向WiDR細(xì)胞培養(yǎng)液中加入實施例1中所獲得的含硫酸巖藻糖多糖標(biāo)品。
現(xiàn)在，以更詳細(xì)的方式描述本發(fā)明。
用于本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖沒有特別的限制。例如，可以使用那些來源于墨角藻(Fucus vesicilosus)、Kjellmaniella crassifolia、昆布Laminaria japonica、裙帶菜Undaria pinnatifida和任何其它的褐藻(褐藻門)的含硫酸巖藻糖多糖。已知在海參的體壁中有含硫酸巖藻糖多糖。在本發(fā)明中也可以使用源于海參的含硫酸巖藻糖多糖。此外，在本發(fā)明中使用了含硫酸巖藻糖多糖的降解產(chǎn)物。例如，可以通過化學(xué)降解方法(如用酸處理)和物理降解方法(如超聲處理)或者酶促降解方法降解含硫酸巖藻糖多糖。
本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)當(dāng)將如上所述的各種含硫酸巖藻糖多糖和/或其降解產(chǎn)物加入到癌細(xì)胞的培養(yǎng)基中，在加入后的一至幾天內(nèi)癌細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞凋亡。同時也確認(rèn)對正常細(xì)胞沒有任何毒性。
本文所使用的術(shù)語″含硫酸巖藻糖多糖″是指沒有任何特殊限定的硫酸化的在分子中具有巖藻糖的多糖。這種多糖的例子包括褐藻和海參中的多糖[《多糖類化學(xué)》，左右田德郎監(jiān)修，江上不二夫編輯、共立出版株式會社，1955年12月15日出版p.319，p.321]。一般把來源于褐藻的含硫酸巖藻糖多糖稱為巖藻依聚糖、巖藻多糖和脫氧半乳聚糖。雖然已知這種多糖具有幾種分子類型，但是一般把這些含硫酸巖藻糖多糖稱為巖藻聚糖。例如，據(jù)報導(dǎo)由Sigma化學(xué)公司生產(chǎn)的巖藻依聚糖可以分成13種分子類型[Carbonhydrate Research，255，213-224(1994)]，其中包括一種以巖藻糖作為主要組分的組和另一種含有百分之幾的糖醛酸且組成糖類富含巖藻糖和甘露糖的組。已經(jīng)有人報道過，這些含硫酸巖藻糖多糖具有各種生物活性，例如加強(qiáng)巨噬細(xì)胞活性、抑制癌轉(zhuǎn)移和抑制血液凝聚活性。然而，含硫酸巖藻糖多糖涉及各種分子形式，因此需要分離和純化含硫酸巖藻糖多糖，以確認(rèn)哪一種分子形式實際上具有某種特定的活性。含硫酸巖藻糖多糖涉及那些實質(zhì)上不含糖醛酸并以巖藻糖作為主要組成成分的多糖；和那些含有百分之幾的糖醛酸并富含巖藻糖和甘露糖(作為組成糖類)的多糖。在下文，將實質(zhì)上不含有糖醛酸的含硫酸巖藻糖多糖稱為含硫酸巖藻糖多糖-F，將那些含有糖醛酸的含硫酸巖藻糖多糖稱為含硫酸巖藻糖多糖-U，以上兩種的混合物的含硫酸巖藻糖多糖的混合物稱為含硫酸巖藻糖多糖混合物。
雖然已經(jīng)知道分離含硫酸巖藻糖多糖-F和含硫酸巖藻糖多糖-U的方法，例如分子量分級分離和使用陰離子交換樹脂分離，但是這些分離方法是不夠的，這使得大規(guī)模制備用作藥物或者功能性食品的含硫酸巖藻糖多糖變得困難。
另外，已知著色物質(zhì)很難從含硫酸巖藻糖多糖完全除去。市售的巖藻聚糖產(chǎn)物等也都含有著色物質(zhì)物質(zhì)。通常，這些由多酚聚合物組成的著色物質(zhì)具有高度的反應(yīng)活性，并且阻礙各種酶促反應(yīng)，抑制細(xì)胞的生長。此外，這些著色物質(zhì)有時不可逆地吸附到與之接觸的樹脂或者由樹脂制成的容器上。因此，必需從含硫酸巖藻糖多糖中除去這些具有高度反應(yīng)活性的著色物質(zhì)，以便精確地檢測所說的含硫酸巖藻糖多糖的生物活性，并且防止污染容器或者樹脂。
已知當(dāng)從例如，褐藻或者其的乙醇洗滌的殘留物中提取含硫酸巖藻糖多糖混合物時，通過加入可溶性的乙酸鋇、氯化鋇、氯化鈣等可以抑制抽提物中的含有藻酸的雜質(zhì)，這有利于隨后的純化。然而，加入可溶性的鋇鹽給廢液體處理帶來困難。另一方面，氯化鈣與海藻類混合時，引起pH值發(fā)生變化，為得到不可降解的含硫酸巖藻糖多糖必須對pH值進(jìn)行調(diào)節(jié)。在調(diào)節(jié)pH值的步驟中，由于海藻類膠粘和聚合在一起，在隨后的抽提中的效率會降低，或者固/液分離時過濾變得困難。
雖然正在期待含硫酸巖藻糖多糖的工業(yè)實用性，但是目前既沒有任何已經(jīng)對分子種類進(jìn)行足夠分級分離的含硫酸巖藻糖多糖-F或者含硫酸巖藻糖多糖-U的上市產(chǎn)物，也沒有有關(guān)有效生產(chǎn)含硫酸巖藻糖多糖的方法的報告。此外，如上所述市售的含硫酸巖藻糖多糖含有具有高度反應(yīng)活性的著色物質(zhì)。
雖然含硫酸巖藻糖多糖具有各種活性，但是如上所述，由于這種多糖分級制備上的困難，迄今為止實質(zhì)上既沒有獲得含硫酸巖藻糖多糖-F，也沒有獲得含硫酸巖藻糖多糖-U。
然而，本發(fā)明實質(zhì)上提供了純化的含硫酸巖藻糖多糖-U、一種方便地提取這種多糖的方法和生產(chǎn)含硫酸巖藻糖多糖-U的方法。本發(fā)明還提供了含硫酸巖藻糖多糖-U，從這種多糖里已經(jīng)除去了具有高度反應(yīng)活性的著色物質(zhì)，通常這種物質(zhì)很難從含硫酸巖藻糖多糖中除去，其抑制酶促反應(yīng)并污染樹脂等。
此外，本發(fā)明實質(zhì)上提供了純化的含硫酸巖藻糖多糖-F、一種方便地提取這種多糖的方法和產(chǎn)生含硫酸巖藻糖多糖-F的方法。
本發(fā)明還提供了含硫酸巖藻糖多糖-F，從這種多糖里已經(jīng)除去了具有高度反應(yīng)活性的著色物質(zhì)，通常這種物質(zhì)很難從含硫酸巖藻糖多糖中除去，其抑制酶促反應(yīng)并污染樹脂等。
本發(fā)明中使用的含硫酸巖藻糖多糖，可以使用褐藻和海參等具含有含硫酸巖藻糖多糖的物體，例如將其干燥和粉碎而利用。另外可以使用從具有含硫酸巖藻糖多糖的物質(zhì)中獲得的包含含硫酸巖藻糖多糖的提取液或者這種提取液的純化形式?？梢酝ㄟ^公知的方法制備和純化包含含硫酸巖藻糖多糖的提取物，沒有特別限制。
用于本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖的降解產(chǎn)物是通過使用酶促、化學(xué)或者物理方法降解含硫酸巖藻糖多糖獲得的，也可以通過公知的酶促、化學(xué)或者物理方法來降解。
用于本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖和其降解產(chǎn)物包括其藥學(xué)上可接受的鹽。
作為含硫酸巖藻糖多糖的褐藻(可以從其中制備含硫酸巖藻糖多糖)，例如《原色日本海藻圖鑒》[山田幸雄序，瀨川宗吉著，保育社，22-52頁(1977)]中所描述的那些褐藻，例如墨角藻、Kjellmaniella crassifolia、昆布、和裙帶菜Undaria pinnatifida等。
作為包含含硫酸巖藻糖多糖的海參，例如特開平91027/1992中所述，例如可以用刺參Stichopus japonicus和玉足海參Holothuria leucospilota等從中制備含硫酸巖藻糖多糖。
在含硫酸巖藻糖多糖的分子中具有硫酸根基團(tuán)可與各種堿基反應(yīng)形成鹽。當(dāng)這些含硫酸巖藻糖多糖及其降解產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為鹽時，就會變得穩(wěn)定。通常以鈉和/或鉀鹽等形式分離。通過使用陽離子交換樹脂(例如Dowex50W)處理這些物質(zhì)的鹽可以將它們轉(zhuǎn)化成游離的含硫酸巖藻糖多糖或其游離降解產(chǎn)物。此外，如果需要，可以將這些鹽通過常規(guī)的方式進(jìn)行鹽交換反應(yīng)以便將它們轉(zhuǎn)化成各種所需的鹽。對于含硫酸巖藻糖多糖、其降解產(chǎn)物，可以使用藥學(xué)上可接受的一種，例如堿金屬(如鉀和鈉)鹽、堿土金屬(如鈣、鎂和鋇)鹽、含有有機(jī)堿(如吡啶鎓)的鹽、銨鹽等。
可以通過將褐藻、海參等并研磨來制備包含含硫酸巖藻糖多糖的粉體。
可以通過熱水或者稀酸提取包含含硫酸巖藻糖多糖的粉體來制備包含含硫酸巖藻糖多糖的提取液。
為了提取包含含硫酸巖藻糖多糖的提取物，可以根據(jù)提取的目的選擇合適的提取溫度和時間，溫度的變化范圍為0-200℃，時間的范圍為1-360分鐘。通常抽提溫度和時間的選擇范圍分別為10-150℃(優(yōu)選的是50-130℃)和5至240分鐘(優(yōu)選的為10至180分鐘)。
有關(guān)純化所說的提取物以提高含硫酸巖藻糖多糖濃度的方法，例如可以使用通過氯化鈣、乙酸鋇等對含硫酸巖藻糖多糖進(jìn)行分級分離；通過使用酸性多糖凝集劑(例如氯化十六烷基吡啶鎓鹽)對含硫酸巖藻糖多糖進(jìn)行分級分離；在鹽的存在下通過使用酸性多糖凝集劑對含硫酸巖藻糖多糖進(jìn)行分級分離；凝膠過濾；離子交換層析。如果需要，可以將這些方法結(jié)合起來進(jìn)行純化。
可以通過已知的用于降解含硫酸巖藻糖多糖的方法來降解含硫酸巖藻糖多糖，例如，使用含硫酸巖藻糖多糖降解酶、通過酸降解和超聲處理進(jìn)行降解。可以按照上述的方法純化所說的降解產(chǎn)物。
褐藻通常包含多種的含硫酸巖藻糖多糖。至于本發(fā)明所使用者對褐藻種類沒有特別的限定。例如，可以使用來源于墨角藻、Kjellmaniellacrassifolia、昆布、裙帶菜Undaria pinnatifida的褐藻和任何其它的褐藻。
為了產(chǎn)生含硫酸巖藻糖多糖，首先用含水的溶劑提取褐藻。
將要提取的海藻類可以是新鮮的海藻。然而，在提取物的制備前，將褐藻干燥，研成粉，并用60至100％的醇或者丙酮洗滌或者浸在含有甲醛、乙醛、戊二醛、氨等的水溶液中是有利的，這是因為這樣可以大量地除去帶有著色物質(zhì)的含硫酸巖藻糖多糖中的雜質(zhì)。
當(dāng)從例如，褐藻或它的乙醇洗滌殘留物中提取含硫酸巖藻糖多糖時，可以通過加入可溶性的乙酸鋇、氯化鋇、氯化鈣或其它類似物來抑制提取物中的含有藻酸的雜質(zhì)，這樣有利于隨后的純化。由于上述的原因，優(yōu)選在50-130℃的溫度下使用1mM-1M的乙酸鈣溶液提取含硫酸巖藻糖多糖。
當(dāng)藻類較厚，并且粉末顆粒大時，可以觀察到最初使用濃度為0.2M或更高的乙酸鈣溶液提取時效率很低。在這種情況下，可以首先用水提取含硫酸巖藻糖多糖，然后向提取物中加入乙酸鈣，再除去藻酸并沉淀。
當(dāng)要同時提取含硫酸巖藻糖多糖和藻酸時，或者要在此提取步驟中獲得部分的降解產(chǎn)物時，提取的溶劑和條件不作特別限制。在這種情況下，可以使用水、或氯化鈉和氯化鎂等各種濃度的中性鹽的水溶液、檸檬酸、磷酸和鹽酸等各種濃度的酸性水溶液、各種濃度的堿性水溶液(例如氫氧化鈉和氫氧化鉀)。也可以向其中加入緩沖液和防腐劑。此外，提取物的pH值、提取溫度和提取時間不作特別限定。然而，通常含硫酸巖藻糖多糖對酸和堿不穩(wěn)定。因此，當(dāng)使用酸性或堿性溶液時，容易發(fā)生降解?？梢酝ㄟ^控制加熱溫度、加熱時間、pH值等來制備任意的降解產(chǎn)物。例如，可以通過使用凝膠過濾、用分子量分級分離膜處理等等來控制降解產(chǎn)物的平均值分子量、分子量分布等。
這就是說，本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-U和含硫酸巖藻糖多糖-F的分子量和糖類組分的變化取決于含硫酸巖藻糖多糖物質(zhì)的收獲期、干燥此原料所使用的方法、存儲此原料所用的方法、含硫酸巖藻糖多糖的提取條件(如加熱條件和pH值)而各異。例如，可以用酸水解含硫酸巖藻糖多糖。另一方面，在堿性條件下，含硫酸巖藻糖多糖的糖醛酸發(fā)生β消除而降解。因此，本文描述的含硫酸巖藻糖多糖-U和含硫酸巖藻糖多糖-F的分子量和分子量分布只是一個例子。通過控制含硫酸巖藻糖多糖的處理條件可以很容易改變所說的分子量和分子量分布。例如，可以通過將起始材料在100℃和弱堿性條件下加熱1小時并在脫鹽步驟中使用孔大小為300的分子篩膜來制備分子量分布為大約1,000至10,000的含硫酸巖藻糖多糖-U和含硫酸巖藻糖多糖-F。可以通過選擇適當(dāng)?shù)奶幚項l件來制備任意分子量和分子量分布的本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-U和含硫酸巖藻糖多糖-F。
為從上述的褐藻提取物中除去藻酸和中性糖，可以通過在例如0.2至0.6M的濃度的食鹽等鹽類的存在下加入酸性多糖凝集劑(例如氯化十六烷基吡啶鎓鹽)，直到?jīng)]有沉淀產(chǎn)生為止，然后收集所說的沉淀。
如果需要，用鹽溶液(例如0.2至0.6M的氯化鈉)洗滌所得的沉淀，并用飽和的氯化鈉乙醇溶液將沉淀中含有的氯化十六烷基吡啶鎓鹽洗掉，這樣就得到了含硫酸巖藻糖多糖的混合物。為了從所得的含硫酸巖藻糖多糖混合物中除去著色物質(zhì)，可以將所說的沉淀溶解，然后用陰離子交換樹脂或者多糖樹脂進(jìn)行處理，或者進(jìn)行超濾?；?qū)⑺玫某恋砻擕}并且冷凍干燥，可以獲得干燥的制品。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-F和含硫酸巖藻糖多糖-U在濃度為0.6至3M的一種或多種鹽存在下對酸性多糖凝集劑有完全不同的反應(yīng)。
例如，通過使用本發(fā)明的方法可以從含硫酸巖藻糖多糖混合物的水溶液中分離本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-U。
首先，向含硫酸巖藻糖多糖混合物的水溶液加入一種或多種鹽，使總鹽濃度為0.6至2M。添加的鹽沒有特別的限制，例如可以使用氯化鈉、氯化鈣等。
通常，在鹽濃度大約為1.5M時，可以分離本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-U以及本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-F(參見下文給出的圖1的具體描述)。例如，將上述提及的鹽的濃度調(diào)整到1.5M，然后加入酸性多糖凝集劑(例如氯化十六烷基吡啶鎓鹽)，直到不再有沉淀產(chǎn)生，沉淀出了含硫酸巖藻糖多糖-F。除去這些沉淀，可以得到本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-U的溶液。根據(jù)需要將此溶液濃縮，然后通過向其中加入，例如4倍的乙醇來沉淀溶液中的含硫酸巖藻糖多糖-U。接下來，用飽和的氯化鈉乙醇溶液洗滌除去沉淀中的氯化十六烷基吡啶鎓鹽，這樣就得到了本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-U?？梢詫⑺玫暮蛩釒r藻糖多糖-U溶解，然后進(jìn)行超濾，就可以從中除去著色物質(zhì)。脫鹽后冷凍干燥可以獲得干燥的標(biāo)品。在此過程中可以加入防腐劑等。
當(dāng)需要有效地只產(chǎn)生本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-F時，在用例如氯化十六烷基吡啶鎓鹽凝集作用步驟中的鹽濃度調(diào)節(jié)為2M，而不是0.2至0.6M。這樣，所獲得的沉淀中只含有本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-F。
本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，在二價陽離子存在下使用陰離子交換樹脂純化含硫酸巖藻糖多糖時，可以增加每單位樹脂上所吸附的含硫酸巖藻糖多糖的量，這樣可以更有效地分離含硫酸巖藻糖多糖。即，采用本發(fā)明的方法生產(chǎn)本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-U時，首先優(yōu)選以1mM或更高的濃度向含硫酸巖藻糖多糖混合物中加入充當(dāng)二價陽離子源的化學(xué)藥品。接下來用含有所說優(yōu)選的濃度為1mM或更高的二價陽離子的溶液平衡陰離子交換樹脂，吸附上述的含硫酸巖藻糖多糖的混合物。使用平衡化后的溶液充分洗滌所說的陰離子交換樹脂后，例如使用氯化鈉通過梯度洗脫來溶出含硫酸巖藻糖多糖。在實施此方法時，加入的二價陽離子的最終濃度為1mM或更高，當(dāng)要通過此柱來吸附本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-U時，優(yōu)選地將濃度調(diào)節(jié)為低于0.5M。有關(guān)此方法中所使用的充當(dāng)二價陽離子源的化學(xué)制劑，鈣鹽和鋇鹽顯示出特別優(yōu)良的效果，然而，對此沒有任何限制，也可以使用硫酸鎂、氯化錳等。
當(dāng)通過常規(guī)的方法從褐藻中生產(chǎn)含硫酸巖藻糖多糖的混合物時，所獲得的混合物污染有高反應(yīng)活性的著色物質(zhì)，上述物質(zhì)污染與之接觸的樹脂或樹脂性容器，或者抑制酶活性或細(xì)胞的生育。已發(fā)現(xiàn)通過使用多糖性物質(zhì)或帶有陰離子交換基團(tuán)的物質(zhì)經(jīng)結(jié)合或者吸附可以容易地除去這些著色物質(zhì)。這就是說，可以通過向包含含硫酸巖藻糖多糖的溶液中加入多糖樹脂(如Cellulofine、GCL-2000(由生化學(xué)工業(yè)社制造)、聚丙烯酰胺葡聚糖Sephacryl S-500、交聯(lián)葡聚糖凝膠Sephadex G-200和瓊脂糖凝膠Sepharose CL-2B(均由Pharmacia制造))或帶有陰離子交換基團(tuán)的物質(zhì)(如DEAE-Cellulofine A-800(由生化學(xué)工業(yè)社制造)、DEAE-SepharoseFF、DEAE-Sephadex A-50、QAE-Sephadex A-50、DEAE-Sephacel(均由Pharmacia公司生產(chǎn))、TSK-Gel DEAE-Toyopearl 650、TSK-凝膠DEAE Toyopearl 550(均由Tosoh公司制造)、Amberlite陰離子交換樹脂(由Organo出售)和chitopearl陰離子交換樹脂(由富士紡績有限公司制造))，然后攪拌后除去，或使包含含硫酸巖藻糖多糖的溶液流過由這些物質(zhì)裝載的柱，從而將該反應(yīng)性強(qiáng)的著色物質(zhì)容易地去除。不過，因為陰離子交換樹脂也和含硫酸巖藻糖多糖結(jié)合。因此，優(yōu)選在著色物質(zhì)的吸附步驟中把鹽的濃度控制在大約2M。
可以按照例如在實施例6中描述的方法制備本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-U。接下來，將說明所說的含硫酸巖藻糖多糖-U的理化性質(zhì)，但并非限定本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-U。
圖1顯示了在過剩量的氯化十六烷基吡啶鎓鹽存在下，在各種氯化鈉濃度下，本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-U與實施例8中獲得的本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-F的沉淀形成性。
在圖1中，縱坐標(biāo)為沉淀比(％)，橫坐標(biāo)為氯化鈉濃度(M)。實線和圓圈代表在各種氯化鈉濃度下的本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-U的沉淀比；虛線和三角形代表在各種氯化鈉濃度(M)下，本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-F的沉淀比。
此沉淀比是在溶液溫度為37℃時通過下列方法測定的。
將本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-U和含硫酸巖藻糖多糖-F分別溶解在水和4M的氯化鈉中，濃度為2％。然后，以各種比例混合這些溶液，以便得到具有各種氯化鈉濃度的含硫酸巖藻糖多糖-U以及含硫酸巖藻糖多糖-F的各125μl的溶液。接下來，將氯化十六烷基吡啶鎓鹽溶解在水中和4M的氯化鈉中，濃度為2.5％，將所獲得的溶液以各種比例混合，得到具有各種氯化鈉濃度的1.25％的氯化十六烷基吡啶鎓鹽溶液。
分別完全沉淀出以2％的濃度溶解在水中的本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-U和含硫酸巖藻糖多糖-F需要3.2倍(體積比)的1.25％氯化十六烷基吡啶鎓鹽溶液。將400μl的具有各種氯化鈉濃度的氯化十六烷基吡啶鎓鹽溶液加入到125μl的具有各種氯化鈉濃度的含硫酸巖藻糖多糖-U和含硫酸巖藻糖多糖-F的2％溶液中。充分?jǐn)嚢韬?，靜止30分鐘，將每一種混合物離心，并通過酚-硫酸方法[Analytical Chemistry 28，350(1956)]測定上清液中的糖含量，然后計算在每種氯化鈉濃度時每個含硫酸巖藻糖多糖的沉淀比。
通過凝膠過濾方法經(jīng)Sephacryl S-500測定上述獲得的本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-U的分子量。結(jié)果，分子量分布為大約190,000(圖2)。在圖2中，縱坐標(biāo)代表通過酚-硫酸方法測定的樣品中的糖含量(以480nm下的吸收率表示)，而橫坐標(biāo)代表組分號。
在下列條件下進(jìn)行凝膠過濾柱大小3.08×162.5cm；溶劑含有0.2M氯化鈉和10％乙醇的10mM磷酸鈉緩沖液(pH 6.0)流速1.5毫升/分鐘；樣品濃度0.25％；樣品體積20ml；和分子量標(biāo)準(zhǔn)物Shodex STANDARD P-82(由昭和電工株式會社制造)
接下來，分析了上述獲得的本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-U的組分。
首先，按照J(rèn)ournal of Biological Chemistry 175，595(1948)中描述的方法測定巖藻糖含量。
接下來，將上述獲得的含硫酸巖藻糖多糖-U的干燥標(biāo)品溶解在1N的鹽酸溶液中，得到0.5％濃度的溶液，并在110℃下處理2小時以便水解成組成單糖。其后，使用GlycoTAG和GlycoTAG試劑盒(均為寶酒造有限公司制造)將由水解獲得的單糖的還原末端吡啶基-(2)-氨基化(PA)，通過HPLC分析組成單糖的組分比。在下列條件下進(jìn)行HPLC儀器L-6200型(由日立制作所制造)；柱PALPAK Type A(4.6mm×150mm，由寶酒造社制造)；洗脫液700mM硼酸緩沖液(pH 9.0)∶乙腈＝9∶1；檢測儀熒光檢測器F-1150(日立制作所制造)，激發(fā)波長310nm，熒光波長380nm；流速0.3毫升/分鐘；和柱溫65℃。
接下來，按照Analytical Chemistry 4，330(1962)中描述的方法測定糖醛酸的含量。
其后，按照Biochemical Jorunal 84，106(1962)中描述的方法測定硫酸的含量。
結(jié)果，表明上述獲得的含硫酸巖藻糖多糖-U的組成糖化物是巖藻糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖、糖醛酸，并且實質(zhì)上不含其它的中性糖。主要成分的組成比(mol比)如下巖藻糖∶甘露糖∶半乳糖∶糖醛酸∶硫酸根基團(tuán)＝大約10∶7∶4∶5∶20。
然后，用傅里葉變換紅外分光光度計JIR-DIAMOND 20(由JEOL有限公司制造)測定含硫酸巖藻糖多糖-U鈣鹽的IR光譜。這樣，得到了在圖3中所示的光譜。在圖3中，縱坐標(biāo)代表透光度(％)，橫坐標(biāo)代表到波數(shù)(cm-1)。
接下來，使用核磁共振波譜儀JNM-a500型(500MHz；JEOL有限公司制造)測量了本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-U鈣鹽的NMR光譜。這樣，得到了在圖4中所示的波譜。
在圖4中，縱坐標(biāo)代表信號強(qiáng)度，橫坐標(biāo)代表化學(xué)位移(ppm)。通過將HOD的化學(xué)位移作為4.65ppm來表達(dá)在1H-NMR中的化學(xué)位移。
1H-NMR(D2O)δ5.27(甘露糖的1-位H)、5.07(巖藻糖的1-位H)、4.49(巖藻糖的3-位H)、4.37(葡糖醛酸的1-位H)、4.04(巖藻糖的4-位H)、3.82(巖藻糖的2-位H)、3.54(葡糖醛酸的3-位H)、3.28(葡糖醛酸的2-位H)、1.09(巖藻糖的5-位CH3中的H)。
使用高速、高靈敏度的旋光計SEPA-300(堀場制作所制造)測量本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-U的冷凍干燥產(chǎn)物，具有-53.6°的比旋。
本發(fā)明人以下列的方式已鑒定了所獲得的本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-U的結(jié)構(gòu)。
使用能夠降解含硫酸巖藻糖多糖-U的降解酶降解含硫酸巖藻糖多糖-U，并純化所得的降解產(chǎn)物使用下文描述的內(nèi)-巖藻依聚糖分解酶處理純化的含硫酸巖藻糖多糖-U，并純化所得的降解產(chǎn)物。
也就是說，將16ml的1％含硫酸巖藻糖多糖-U的溶液、12ml 50mM磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)、4ml 4M氯化鈉溶液和8ml 32mU/ml的內(nèi)-巖藻依聚糖分解酶溶液混合，并在25℃下反應(yīng)48小時。已經(jīng)證明在反應(yīng)過程中反應(yīng)混合物在230nm的吸光度有所提高，這表明此酶對含硫酸巖藻糖多糖-U的降解正在進(jìn)行中。用Micro Acilyzer G3(旭化成公司制造)脫鹽后，將反應(yīng)混合物分成三部分(a)、(b)、(c)，并用DEAE-Sepharose FF純化。
以下列方式制備上述內(nèi)-巖藻依聚糖分解酶。
用于產(chǎn)生這種酶的菌株可以是任何能夠產(chǎn)生內(nèi)巖藻依聚糖分解酶的菌株。作為一個特殊例子，可以使用黃桿菌Flavobacterium sp.SA-0082(FERM BP-5402)。
由本發(fā)明人從青森的海水中分離的這種菌株具有下列的菌學(xué)特性。
1.Flavobacterium sp.SA-0082菌株a.形態(tài)學(xué)的特征(1)短桿菌；寬度0.8-1.0μm
長度1.0-1.2μm(2)孢子無(3)革蘭氏染色陰性b.生理學(xué)特性(1)生長溫度范圍能夠在37℃或更低的溫度生長，適宜的生長溫度范圍為15-28℃。
(2)對氧的反應(yīng)需氧(3)過氧化氫酶+(4)氧化酶+(5)脲酶 弱+(6)酸形成 D-葡萄糖 +乳糖 +麥芽糖+D-甘露糖醇+蔗糖 -海藻糖-(7)水解淀粉 -明膠 +酪蛋白-七葉苷+(8)硝酸鹽的還原性-(9)吲哚形成 -(10)硫化氫形成 -(11)牛奶的凝固 -(12)對鈉的需求 +(13)對鹽的需求在無NaCl的培養(yǎng)基中的生長-在1％的NaCl培養(yǎng)基中的生長-在海水培養(yǎng)基中的生長 +(14)醌 甲基萘醌類6
(15)菌體內(nèi)DNA的GC含量32％(16)OF-檢驗 ○(17)菌落顏色 黃色(18)運動性無(19)滑行 無可以推測，這種菌株是Bergey系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊，1(1984)和Bergey鑒定細(xì)菌學(xué)手冊，9(1994)中描述的水生黃桿菌(Flavobacterium aquatile)和腦膜膿毒性金黃桿菌(Flavobacterium meningosepticum)的細(xì)菌類似物。然而，此菌株與水生黃桿菌的不同點在于不可以通過蔗糖代謝形成任何的酸、不能分解酪蛋白、能夠分解七葉苷、能夠使明膠液化并且為脲酶陽性，這種菌株與腦膜膿毒性金黃桿菌的不同在于不能分解酪蛋白、在37℃下生長緩慢。因此，此菌株被鑒定為屬于黃桿菌屬的細(xì)菌，并且命名為黃桿菌Flavobacterium sp.SA-0082。
上述菌株命名為Flavobacterium sp.SA-0082，并且自1995年3月25日以登記號FERM P-14872保藏在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工業(yè)技術(shù)研究所(日本茨城縣筑波市東1丁目1番3號，305)，并且以登記號FERMBP-5402保藏在如上所述的通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工業(yè)技術(shù)研究所(日本茨城縣筑波市東1丁目1番3號，305)(根據(jù)1996年2月15日的請求轉(zhuǎn)為國際保藏)。
加入到培養(yǎng)此菌株的培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)可以是任何此菌株能夠利用產(chǎn)生內(nèi)-巖藻依聚糖分解酶的物質(zhì)。合適的碳源的例子包括巖藻依聚糖、海藻類粉末、藻酸、巖藻糖、葡萄糖、甘露糖醇、甘油、蔗糖、麥芽糖、乳糖和淀粉等；氮源合適的例子包括酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白氨基酸、玉米漿、肉膏、脫脂大豆、硫酸銨和氯化銨。培養(yǎng)基中還可以含有無機(jī)物質(zhì)和金屬鹽，例如鈉鹽、磷酸鹽、鉀鹽、鎂鹽和鋅鹽。
通過培養(yǎng)此菌株產(chǎn)生的內(nèi)-巖藻依聚糖分解酶的產(chǎn)量變化取決于培養(yǎng)條件。一般來說，優(yōu)選的培養(yǎng)溫度為15℃至30℃，優(yōu)選的培養(yǎng)基pH值范圍為5至9。在通氣和攪拌條件下培養(yǎng)5至72小時可以得到最大產(chǎn)量的內(nèi)-巖藻依聚糖分解酶。當(dāng)然，合適的培養(yǎng)溫育的選擇取決于所使用的菌株、培養(yǎng)基組分等等，以便獲得最大產(chǎn)量。
在菌體和培養(yǎng)物上清液中都可以獲得上述的內(nèi)-巖藻依聚糖分解酶。
在合適的培養(yǎng)基培養(yǎng)上述的Flavobacterium sp.SA-0082，收獲菌體，經(jīng)通常使用的破碎細(xì)胞的方法(如超聲處理)破碎菌體。這樣，可以獲得無細(xì)胞的提取物。
其后，通過本領(lǐng)域一般所使用的純化方法純化這些提取物，這樣就得到了純化的酶制品。例如，純化可以通過鹽析、離子交換層析、疏水結(jié)合柱層析、凝膠過濾或其它純化方法進(jìn)行純化，以便得到純化的不含任何其它巖藻依聚糖分解酶的內(nèi)-巖藻依聚糖分解酶。
通過從上述的培養(yǎng)基中除去菌而獲得的培養(yǎng)物上清液也含有大量的所說的酶(菌體外酶)，可以通過與純化菌體內(nèi)酶所使用的相同方法純化此酶。
下面給出純化內(nèi)巖藻依聚糖分解酶的例子。
將黃桿菌Flavobacterium sp.SA-0082(FERM BP-5402)接種在人工海水(pH7.5，Jamarin實驗室制造)培養(yǎng)基600ml中，其中人工海水含有0.25％的葡萄糖、1.0％的蛋白胨和0.05％酵母提取物，并將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到2升錐形瓶(在120℃滅菌20分鐘)中，然后，在24℃將菌株培養(yǎng)24小時以得到種培養(yǎng)液。在一個30升發(fā)酵罐中加入20L含有0.25％的葡萄糖、1.0％的蛋白胨、0.05％酵母提取物和0.01％脫泡劑(信越化學(xué)工業(yè)公司制造的KM70)的人工海水(pH7.5，Jamarin實驗室制造)培養(yǎng)基，并在120℃滅菌20分鐘。在冷卻后，將培養(yǎng)基用上述的600ml種培養(yǎng)液接種，然后以10升/分鐘的速率充氣和125rpm攪拌，在24℃下將其培養(yǎng)24小時。在培養(yǎng)完成后，將培養(yǎng)基離心以收集菌體。
將這些細(xì)胞懸浮在含有200mM氯化鈉的20mM醋酸鹽-磷酸鹽緩沖液(pH7.5)中，用超聲處理打碎細(xì)胞，并通過離心以得到菌體提取物。在此菌體提取物中的內(nèi)-巖藻依聚糖分解酶表現(xiàn)出5mU/ml培養(yǎng)基的活性。
把硫酸銨加入所說的提取物，得到硫酸銨的90％飽和溶液。通過攪拌溶解后，將混合物離心，并將沉淀懸浮在與上述提及的懸浮細(xì)胞的同一緩沖液中，。然后，將懸液用含有50mM氯化鈉的20mM醋酸鹽-磷酸鹽緩沖液(pH7.5)完全透析。在透析形成的沉淀和通過心除去后，先用含有50mM氯化鈉的20mM醋酸鹽-磷酸鹽緩沖液(pH7.5)平衡的DEAE-Sepharose FF柱吸附，然后，用同一緩沖液充分洗滌吸附的物質(zhì)，并且用50mM-600mM的氯化鈉的線型梯度洗脫以展開吸附的物質(zhì)。收集活性組分，并加入氯化鈉，使氯化鈉的終濃度為4M。接下來，用含有4M氯化鈉的20mM磷酸鹽緩沖液(pH8.0)平衡的苯基Sepharose凝膠CL-4B柱吸附。然后，用同一緩沖液充分洗滌所說的吸附物質(zhì)，并且用4M-1M的氯化鈉的線型梯度洗脫以展開吸附的物質(zhì)。收集活性組分，并用超濾器濃縮。接下來，用含有50mM氯化鈉的10mM磷酸鹽緩沖液平衡的SephacrylS-300進(jìn)行凝膠過濾。收集活性組分。通過在聚丙烯酰胺葡聚糖S-300中的保留時間測定的酶的分子量大約為460,000。接下來用含有250mM氯化鈉的10mM磷酸鹽緩沖液(pH7)將活性組分透析。通過用含有250mM氯化鈉的10mM磷酸鹽緩沖液(pH7)平衡的Mono Q HR5/5柱吸附酶溶液。用同一緩沖液充分洗滌吸附的物質(zhì)，并且用250mM-450mM的氯化鈉的線型梯度洗脫以展開吸附的物質(zhì)。收集活性組分，得到純化的酶。表1總結(jié)了上述的純化步驟。
表1
通過下列方式測定所說的酶的活性。
將來源于Kjellmaniella crassifolia巖藻依聚糖的50μl 2.5％溶液、與10μl的所說的酶和60μl含有667mM氯化鈉的83mM磷酸鹽緩沖液(pH7.5)混合并在37℃反應(yīng)3小時。然后，將2ml的水和105μl的反應(yīng)混合物攪拌混合，并在230nm測量吸光度(AT)。把使用相同的方法(但是只用上述的緩沖液(用來溶解酶)代替酶)制備的反應(yīng)混合物、使用相同的方法(但是只用水代替巖藻依聚糖溶液)制備的另一個反應(yīng)混合物作為對照，也測定吸光度(AB1和AB2)。
將上述反應(yīng)體系中可在1分鐘切割1μmol的在甘露糖和糖醛酸之間的糖苷鍵的酶量作為1U。通過將在消除反應(yīng)中形成的不飽和糖醛酸的毫摩爾分子吸光系數(shù)定為5.5對上述方法切斷的鍵定量。按照下列計算式測定酶的活性活性(U/ml)＝(AT-AB1-AB2)×2.105×120/(5.5×105×0.01×180)；2.105待測的吸收樣品的體積(ml)；120酶反應(yīng)混合物的體積(μl)；5.5在230nm不飽和糖醛酸的毫摩爾分子消光系數(shù)(/mM)；105用于稀釋的反應(yīng)混合物的體積(μl)；0.01酶的體積(ml)；和180反應(yīng)時間(分鐘)。
通過在280nm測量酶溶液的吸光度測定蛋白質(zhì)，并將1mg/ml蛋白質(zhì)溶液的吸光度作為1.0計算蛋白質(zhì)的量。
以下列方式制備了來源于Kjellmaniella crassifolia的用作底物的巖藻聚糖。
用自由粉碎機(jī)M-2型(由奈良機(jī)械制作所制)將干燥的Kjellmaniellacrassifolia研成粉末，并在70℃下用10倍的85％甲醇處理2小時。然后過濾，將殘留物在70℃下用10倍的甲醇再處理2小時。過濾后，向殘留物中加入20倍的水。然后，將所得的混合物在100℃下處理3小時，過濾混合物得到提取物。將提取物的鹽濃度調(diào)整到與400mM氯化鈉溶液中鹽濃度的水平相同。然后，向其中加入氯化十六烷基吡啶鎓鹽，直到沉淀不再產(chǎn)生，離心后，將沉淀用乙醇充分洗滌以完全除去氯化十六烷基吡啶鎓鹽。接下來通過使用超濾器(超濾膜的排阻分子量100,000，由Amicon制造)進(jìn)行脫鹽并除去低分子量物質(zhì)。通過離心除去所得的沉淀。將上清液冷凍干燥，得到純化的Kjellmaniella crassifolia巖藻依聚糖。酶反應(yīng)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)解析上述的內(nèi)-巖藻依聚糖分解酶是專一降解含硫酸巖藻糖多糖-U的D-甘露糖和D-葡萄糖醛酸之間的α1→4鍵的酶。用此酶處理上面獲得的含硫酸巖藻糖多糖-U，形成了其結(jié)構(gòu)由下列化學(xué)式(I)、(II)和(III)代表的低聚糖


現(xiàn)在進(jìn)行詳細(xì)描述。
通過使用GlycoTAG和GlycoTAG試劑盒將上述分離并經(jīng)DEAE-Sepharose FF純化的三個組分(a)、(b)和(c)的還原性末端分別進(jìn)行吡啶基-(2)-氨基化(PA)，得到PA化糖(PA-a)、(PA-b)和(PA-c)，然后通過HPLC進(jìn)行分析。
在下列條件下進(jìn)行HPLC(i)通過使用分子量分級分離柱進(jìn)行HPLC分析儀器L-6200型(日立制作所制造)；柱SHODEX SE-803(4.6×250mm，由昭和電工社制造)；洗脫液0.2M氯化鈉∶二甲基亞砜＝9∶1；檢測儀熒光檢測器F-1150(由日立制作所制造)，激發(fā)波長320nm，熒光波長400nm；流速1毫升/分鐘；和柱溫50℃。
(ii)使用反相柱進(jìn)行HPLC分析儀器L-6200型(由日立制作所制造)；柱L-柱(4.6×250mm，由化學(xué)藥品檢查協(xié)會制造)；洗脫液50mM醋酸-三乙胺(pH5.5)；檢測儀熒光檢測器F-1150(由日立制作所制造)，激發(fā)波長320nm，熒光波長400nm；流速1毫升/分鐘；和柱溫40℃。
圖5、6和7分別表明了吡啶基-(2)-氨基化糖類化合物(PA-a)、(PA-b)和(PA-c)的HPLC洗脫模式。在每一個圖中，縱坐標(biāo)代表相對熒光強(qiáng)度，橫坐標(biāo)代表保留時間(分鐘)。
接下來，將說明化合物(a)、(b)和(c)(即由化學(xué)式(I)、(II)和(II)代表的化合物)理化性質(zhì)。
圖(8)、(9)和(10)分別表明化合物(a)、(b)和(c)的質(zhì)譜，而圖11、12和13分別表明化合物(a)、(b)和(c)的質(zhì)-質(zhì)譜。在每一個圖中，縱坐標(biāo)代表相對強(qiáng)度(％)，橫坐標(biāo)代表m/z值。
此外，圖14、15和16分別表明化合物(a)、(b)和(c)的1H-NMR譜。在每一個圖中，縱坐標(biāo)代表信號強(qiáng)度，橫坐標(biāo)代表化學(xué)位移(ppm)。
把HOD的化學(xué)位移作為4.65ppm為基準(zhǔn)來表示1H-NMR的化學(xué)位移。
化合物(a)的理化性質(zhì)分子量564MS m/z563[M-H+]-MS/MS m/z97[HSO4]-，157[不飽和D-葡萄糖醛酸-H2O-H+]-，175[不飽和D-葡萄糖醛酸-H+]-，225[L-巖藻糖硫酸酯-H2O-H+]-，243[L-硫酸巖藻糖-H+]-，319[不飽和D-葡糖醛酸與D-甘露糖的結(jié)合物-H2O-H+]-，405[M-不飽和D-葡萄糖醛酸-H+]-，483[M-SO3-H+]-。
1H-NMR(D2O)δ5.78(1H，d，J＝3.7Hz，4″-H)，5.26(1H，d，J＝1.2Hz，1-H)，5.12(1H，d，J＝4.0Hz，1′-H)，5.03(1H，d，J＝6.1Hz，1″-H)，4.47(1H，d-d，J＝3.4，10.4Hz，3′-H)，4.21(1H，br-s，2-H)，4.12(1H，m，5′-H)，4.10(1H，d-d，J＝3.7，5.8Hz，3″-H)，4.03(1H，d，J＝3.4Hz，4′-H)，3.86(1H，m，3-H)，3.83(1H，d-d，J＝4.0，10.4Hz，2′-H)，3.72(1H，m，4-H)，3.72(1H，m，5-H)，3.70(2H，m，5-CH2的H2)，3.65(1H，d-d，J＝5.8，6.1Hz，2″-H)，1.08(3H，d，J＝6.7Hz，5′-CH3的H3)糖的組成L-巖藻糖∶不飽和D-葡萄糖醛酸∶D-甘露糖＝1∶1∶1(各1分子)硫酸鹽1分子(在L-巖藻糖的3-位上)在1H-NMR中的峰歸屬如下式(IV)中數(shù)字顯示
化合物(b)的理化性質(zhì)分子量724MS m/z723[M-H+]-，361[M-2H+]2-MS/MS m/z97[HSO4]-，175[不飽和D-葡萄糖醛酸-H+]-，243[L-硫酸巖藻糖-H+]-，321[M-SO3-2H+]2-，405[M-不飽和D-葡萄糖醛酸-2SO3-H+]-，417[M-L-巖藻糖-2SO3-H+]-。
1H-NMR(D2O)δ5.66(1H，d，J＝3.4Hz，4″-H)，5.27(1H，d，J＝7.3Hz，1″-H)，5.22(1H，d，J＝1.8Hz，′-H)，5.21(1H，d，J＝3.7Hz，1′-H)，4.50(1H，d，J＝3.1Hz，4′-H)，4.32(1H，q，J＝6.7Hz，5′-H)，4.27(1H，d-d，J＝3.7，10.4Hz，2′-H)，4.21(1H，d-d，丁＝3.4，6.7Hz，3″-H)，4.18(1H，d-d，J＝1.8，11.0Hz，5-CH的H)，4.15(1H，br-s，2-H)，4.10(1H，d-d，J＝5.8，11.0Hz，5-CH的H)，3.99(1H，d-d，J＝3.1，10.4Hz，3′-H)，3.90(1H，m，5-H)，3.82(1H，m，3-H)，3.82(1H，m，4-H)，3.54(1H，br-t，J＝7.3Hz，2″-H)，1.11(3H，d，J＝6.7Hz，5′-CH3的H3).
糖的組成L-巖藻糖∶不飽和D-葡萄糖醛酸∶D-甘露糖＝1∶1∶1(各1分子)。
硫酸鹽3分子(在L-巖藻糖的2-和4-位上及D-甘露糖的6-位上)在1H-NMR中的峰歸屬如下式(V)中數(shù)字顯示
分子量1128MS m/z1127[M-H+]-MS/MS m/z97[HSO4]-，175[不飽和D-葡萄糖醛酸酯-H+]-，225[L-巖藻糖硫酸酯-H2O-H+]-，243[L-硫酸巖藻糖-H+]-，371[M-不飽和D-葡萄糖醛酸-L-巖藻糖-SO3-2H+]2-，405[硫酸化的L-巖藻糖與D-甘露糖結(jié)合物-H+]-，721[M-D-甘露糖-L-巖藻糖-SO3-H2O-H+]-1H-NMR(D2O)δ5.69(1H，d，J＝3.7Hz，(4)″-H)，5.34(1H，s，(1)-H)，5.16(1H，s，1-H)，5.10(1H，d，J＝4.0Hz，(1)′-H)，5.50(1H，d，J＝3.7Hz，1’-H)，4.93(1H，d，J＝6.4Hz，(1)”-H)，4.50(1H，d-d，J＝3.4，10.7Hz，3′-H)，4.47(1H，d-d，J＝3.4，10.4Hz，(3)’-H)，4.39(1H，d，J＝7.9Hz，1″-H)，4.33(1H，br-s，(2)-H)，4.14(1H，m，2-H)，4.12(1H，m，(3)″-H)，4.12(1H，m，5′-H)，4.12(1H，m，(5)’-H)，4.04(1H，m，4′-H)，4.03(1H，m，(4)’-H)，3.85(1H，m，(2)′-H)，3.85(1H，m，2’-H)，3.82(1H，m，3-H)，3.82(1H，m，(3)-H)，3.73(1H，m，4-H)，3.73(1H，m，5-H)，3.73(1H，m，(4)-H)，3.70(2H，m，5-CH2的H2)，3.70(2H，m，(5)-CH2的H2)，3.67(1H，m，5″-H)，3.62(1H，m，4″-H)，3.62(1H，m，(2)″-H)，3.62(1H，m，(5)-H)，3.51(1H，t，J＝8.9Hz，3″-H)，3.28(1H，t，J＝7.9Hz，2″-H)，1.09(3H，d，J＝6.7Hz，(5)′-CH3的H3)，1.07(1H，d，J＝6.7Hz，5′-CH3的H3)。
糖的組成L-巖藻糖∶不飽和D-葡萄糖醛酸∶D-葡萄糖醛酸∶D-甘露糖＝2∶1∶1∶2(兩個L-巖藻糖分子，兩個D-甘露糖分子，一個不飽和D-葡糖醛酸分子和一個D-葡萄糖醛酸分子)。
硫酸根兩個分子(在每個L-巖藻糖的3-位上)。
1H-NMR中的峰歸屬如下式(VI)中數(shù)字顯示

當(dāng)使用上述的內(nèi)-巖藻依聚糖分解酶處理所得的含硫酸巖藻糖多糖-U時，當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行過程中發(fā)生消除反應(yīng)，增加了在230nm的吸光度。所有的主要反應(yīng)產(chǎn)物都帶有消除反應(yīng)產(chǎn)物不飽和己糖醛酸鹽基團(tuán)，這表明所獲得的含硫酸巖藻糖多糖-U具有由相互結(jié)合的己糖醛酸和甘露糖組成的糖鏈。由于主要組成糖類包括巖藻糖，所以與一般的多糖相比，所獲得的含硫酸巖藻糖多糖-U容易被酸降解，另一方面，已知己糖醛酸和甘露糖之間的鍵對酸有較高耐受性。本發(fā)明人試圖以下列方式參考CarbohycrrateResearch，125，283-290(1984)中描述的方法鑒定糖鏈中的己糖醛酸，所說的糖鏈由相互結(jié)合的己糖醛酸和甘露糖組成，并且包含在Kjellmaniellacrassifolia的含硫酸巖藻糖多糖的混合物中。首先，將含硫酸巖藻糖多糖混合物溶解在0.3M草酸中，并且在100℃處理3小時。然后進(jìn)行分子量分級分離，收集分子量為3,000或更高的組分。然后，使用陰離子交換樹脂處理，收集吸附的物質(zhì)。將所獲得的物質(zhì)冷凍干燥，并用4N的鹽酸進(jìn)行酸水解。將pH值調(diào)整到8后，將其吡啶基-(2)-氨基化，通過HPLC分析糖醛酸。在下列條件下進(jìn)行HPLC儀器L-6200型(由日立制作所制造)；柱PALPAK Type N(4.6mm×250mm，由寶酒造社制造)；洗脫液200mM醋酸-三乙胺緩沖液(pH 7.3)∶乙腈＝25∶75；檢測儀熒光檢測器F-1150(由Hitachi有限公司制造)，激發(fā)波長320nm，熒光波長400nm；流速0.8毫升/分鐘；和柱溫40℃。
此外，將Sigma公司產(chǎn)的葡萄糖醛酸，和光純藥社產(chǎn)的半乳糖醛酸，將Sigam公司產(chǎn)的4-甲基傘形烷基-L-艾桿糖苷酸水解得到的艾桿糖醛酸，按Acta Chemica Scandinavica，15，1397-1398(1961)記載的方法，將和光純藥社產(chǎn)的藻酸經(jīng)水解、然后經(jīng)陰離子交換樹脂分離而得到的甘露糖醛酸和古洛糖醛酸PA化，得到PA化己糖醛酸的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在上述的含硫酸巖藻糖多糖混合物的糖鏈只含有葡萄糖醛酸形式的己糖醛酸。
此外，通過使用陰離子交換樹脂和冷凍干燥將上述糖鏈的水解產(chǎn)物中的葡萄糖醛酸與D-甘露糖分離。然后測量它的比旋光度。因此證明葡萄糖醛酸是右旋的，即D-葡糖醛酸。
此外，先用上述的內(nèi)-巖藻依聚糖分解酶處理來源于Kjellmaniellacrassifolia的含硫酸巖藻糖多糖混合物，然后，和上述相同使用草酸水解。然而，卻沒有發(fā)現(xiàn)任何具有D-葡糖醛酸和D-甘露糖二者相互結(jié)合的聚合物?；谶@一結(jié)果，說明上述的內(nèi)-巖藻依聚糖分解酶是通過消除反應(yīng)切斷的含硫酸巖藻糖多糖骨架結(jié)構(gòu)具有由D-葡糖醛酸和D-甘露糖二者相互結(jié)合組成的結(jié)構(gòu)。
此外，通過對草酸降解而獲得的聚合物進(jìn)行NMR分析，以確定D-甘露糖和D-葡萄糖醛酸的結(jié)合位點以及糖苷鍵的異構(gòu)構(gòu)型。
聚合物的NMR分析的數(shù)據(jù)如下。通過將在三乙胺中甲基基團(tuán)的化學(xué)位移作為1.13ppm來表示在1H-NMR中的化學(xué)位移；而將在三乙胺中甲基基團(tuán)的化學(xué)位移作為9.32ppm來表示在13C-NMR中的化學(xué)位移。
1H-NMR(D2O)5.25(1H，br-s，1-H)，4.32(1H，d，J＝7.6Hz，1′-H)，4.00(1H，br-s，2-H)，3.71(1H，m，5′-H)，3.69(1H，m，5-CH的H)，3.68(1H，m，3-H)，3.63(1H，m，5-CH的H)，3.63(1H，m，4′-H)，3.57(1H，m，4-H)，3.54(1H，m，3′-H)，3.53(1H，m，5-H)，3.25(1H，t，J＝8.5Hz，2′-H)13C-NMR(D2O)δ175.3(5′-COOH中的C)，102.5(1′-C)，99.6(1-C)，78.5(2-C)，77.9(4′-C)，77.0(3′-C)，76.7(5′-C)，73.9(5-C)，73.7(2′-C)，70.6(3-C)，67.4(4-C)，61.0(5-CH2OH中的C)。
峰分別歸屬于下列式(VII)中數(shù)字所示的位置 關(guān)于D-葡萄糖醛酸在1-位的立體構(gòu)型，由于其7.6Hz的鄰位偶合常數(shù)，所以將其確定為β-D-葡萄糖醛酸。
關(guān)于D-甘露糖在1-位的構(gòu)型，由于其具有5.25ppm的化學(xué)位移，所以將其確定為α-D-甘露糖。
通過HMBC方法(即C-H-異核異核遠(yuǎn)程相關(guān))分析了組成糖的結(jié)合方式。在1H-NMR的歸屬中使用了DQF-COSY和HOHAHA方法，而在13C-NMR的歸屬中使用了HSQC方法。
在HMBC光譜中，觀察到在1-H和4’-C之間與4’-H和1-C之間、1’-H和2-C之間與2-H和1’-C之間均存在相關(guān)的峰。這些事實表明D-葡萄糖通過β-鍵結(jié)合到D-甘露糖的2-位上，而D-甘露糖通過α-鍵結(jié)合到D-葡萄糖醛酸的4-位上。
綜合考慮上述的結(jié)果表明所說的化合物(a)具有這樣的結(jié)構(gòu)，其中不飽和D-葡萄糖醛酸及結(jié)合有硫酸基團(tuán)的L-巖藻糖結(jié)合到還原末端D-甘露糖的殘基上；所說的化合物(b)具有這樣的結(jié)構(gòu)，其中不飽和D-葡萄糖醛酸及結(jié)合有兩個硫酸基團(tuán)的L-巖藻糖結(jié)合到與一個硫酸根結(jié)合的還原末端D-甘露糖殘基上；所說的化合物(C)具有這樣的結(jié)構(gòu)，其中還原末端的D-甘露糖的殘基上結(jié)合了D-葡萄糖醛酸和結(jié)合有硫酸根的L-巖藻糖，D-葡萄糖醛酸上結(jié)合了D-甘露糖，該D-甘露糖上又結(jié)合了不飽和D-葡萄糖醛酸和結(jié)合有硫酸根的L-巖藻糖。
如上述所討論的，所獲得的含硫酸巖藻糖多糖-U中具有D-葡萄糖醛酸和D-甘露糖相互結(jié)合的結(jié)構(gòu)，并且至少有一個D-甘露糖上結(jié)合有L-巖藻糖。
而且，所說的含硫酸巖藻糖多糖-U具有下面的通式(VIII)所代表的部分結(jié)構(gòu)，其中至少有一個醇羥基已經(jīng)硫酸酯化，n代表1或更大的整數(shù)
本發(fā)明提供了與本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-F相分離的含硫酸巖藻糖多糖-U。本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-U以糖醛酸作為它的組成糖類，并且由黃桿菌Flavobacterium sp.SA-0082(FERM BP-5402)產(chǎn)生的巖藻依聚糖分解酶降解，同時產(chǎn)生至少一種由上述化學(xué)式(I)、(II)和(III)代表的化合物。其分子量、分子量分布和糖類組成對本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-U沒有任何限制。也就是說，可以制備具有任意分子量和分子量分布的含硫酸巖藻糖多糖-U，并且可以提供具有已經(jīng)限定的理化性質(zhì)的含硫酸巖藻糖多糖。
本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-U沒有含硫酸巖藻糖多糖-F的強(qiáng)抗凝血活性。這樣可以提供實質(zhì)上不表現(xiàn)抗凝血活性的含硫酸巖藻糖多糖。本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-U作為純化的含硫酸巖藻糖多糖可能作為抗癌劑、抗轉(zhuǎn)移劑、制癌劑等。另外，其作為針對抗含硫酸巖藻糖多糖抗體的抗原是有用的。從含硫酸巖藻糖多糖-U產(chǎn)生具有上述化學(xué)式(I)、(II)和(III)結(jié)構(gòu)的低聚糖也是可能的。也就是說，其在生產(chǎn)這些新奇化合物方面是有用的。
接下來將描述本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-F及其產(chǎn)生方法。
通過下列方式使用本發(fā)明的方法可以產(chǎn)生本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-F。用能夠降解含硫酸巖藻糖多糖-U的降解酶處理含硫酸巖藻糖多糖混合物。在酶促反應(yīng)完成后，通過超濾等除去這樣降解的含硫酸巖藻糖多糖-U。關(guān)于上述的降解酶，任何只要能夠選擇地降解含硫酸巖藻糖多糖-U的酶都可以使用。作為它的特殊的例子，可以引用的是上述的由黃桿菌Flavobacterium sp.SA-0082(FERM BP-5402)產(chǎn)生的內(nèi)-巖藻依聚糖分解酶。
在用此酶處理時，可以選擇適當(dāng)?shù)牡孜餄舛?、溫度、pH值等等以便有利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行。通常理想的是底物濃度范圍從0.1至10％，溫度范圍從20至大約40℃，pH值范圍從6至大約9。
也可以將能夠產(chǎn)生降解酶(此酶能夠降解含硫酸巖藻糖多糖-U)的微生物接種在其中已經(jīng)加入了含硫酸巖藻糖多糖混合物的培養(yǎng)基中，然后從此培養(yǎng)基中純化含硫酸巖藻糖多糖-F。用于此目的微生物可以是任何一種能夠產(chǎn)生降解含硫酸巖藻糖多糖-U的降解酶的微生物。作為它的一個特殊的例子，可以引用的是上述的黃桿菌Flavobacterium sp.SA-0082(FERMBP-5402)和Fucoidanobacter marinus SI-0098(FERM BP-5403)。
培養(yǎng)基中將要加入的營養(yǎng)源可以是任何一種所使用的菌株能夠利用的物質(zhì)，以便產(chǎn)生所說的降解酶。合適的碳源的例子包括巖藻依聚糖、海藻類粉末、藻酸、巖藻糖、葡萄糖、甘露糖醇、甘油、蔗糖、麥芽糖、乳糖和淀粉等；而氮源合適的例子包括酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白氨基酸、玉米漿、肉膏、脫脂大豆、硫酸銨和氯化銨。培養(yǎng)基中還可以含有無機(jī)物質(zhì)和金屬鹽，例如鈉鹽、磷酸鹽、鉀鹽、鎂鹽和鋅鹽。
更不用說可以依據(jù)所使用的菌株、培養(yǎng)基組成等等選擇培養(yǎng)條件來降解含硫酸巖藻糖多糖-U的活性以便獲得最大水平的降解含硫酸巖藻糖多糖-U的活性。一般來說，優(yōu)選的培養(yǎng)溫度為15℃至30℃，培養(yǎng)基的pH值范圍為5至9。在通氣攪拌條件下培養(yǎng)5至72小時。在培養(yǎng)完成后，例如可以通過超濾除去培養(yǎng)基中非含硫酸巖藻糖多糖-F的組分，即所降解的含硫酸巖藻糖多糖-U。
本發(fā)明人從青森縣海水中分離的菌株Fucoidanobacter marinus SI-0098具有下列菌學(xué)性質(zhì)。
1.Fucoidanobacter marinus SI-0098菌株a.形態(tài)學(xué)的特征(1)雙球菌(短桿菌)；寬度0.5-0.7μm長度0.5-0.7μm(2)孢子無(3)革蘭氏染色-b.生理學(xué)特性(1)生長溫度范圍能夠在37℃生長，適宜的生長溫度范圍為15-28℃。
(2)對氧的反應(yīng)需氧(3)過氧化氫酶+(4)氧化酶-(5)脲酶 -(6)水解 淀粉 +明膠 -
酪蛋白 -七葉苷 +(7)硝酸鹽的還原性-(8)吲哚形成 -(9)硫化氫形成+(10)牛奶的凝固 -(11)對鈉的需求 +(12)對鹽的需求在無NaCl的培養(yǎng)基中的生長-在1％的NaCl培養(yǎng)基中的生長-在海水培養(yǎng)基中的生長 +(13)醌甲基萘醌類7(14)胞內(nèi)DNA的GC含量61％(15)在細(xì)胞壁中的二氨基庚二酸-(16)羥乙?；鶛z驗 -(17)羥基脂肪酸存在+(18)OF-檢驗 ○(19)菌落顏色 不形成有特征的菌落顏色(20)運動性有(21)滑行性無(22)鞭毛 極性單鞭毛根據(jù)在Bergey的鑒定細(xì)菌學(xué)手冊，9(1994)中描述的基本分類，此菌株屬于第4組(革蘭氏陰性需氧桿菌和球菌)。然而，此菌株在很大程度上與屬于4組的細(xì)菌不同，后者在電子傳遞鏈上具有甲基萘醌類7和含有61％的GC。原則上，革蘭氏陰性細(xì)菌在電子傳遞鏈中存在泛醌，而革蘭氏陽性細(xì)菌具有甲基萘醌類。
盡管屬于黃桿菌屬和噬纖維菌屬的革蘭氏陰性細(xì)菌在電子傳遞鏈中例外地含有甲基萘醌類，但是在GC含量方面它們與上述的菌株在很大程度上不同，如為土壤細(xì)菌的棲地噬纖維菌(Cytophaga arvensicola)含有43至46％的GC，而為海洋細(xì)菌的流散噬纖維菌(Cytophaga diffluens)、發(fā)酵噬纖維菌(Cytophaga fermentans)、海洋噬纖維菌(Cytophaga marina)和潮濕噬纖維菌(Cytophaga uliginosa)含有42％的GC。當(dāng)比較此菌株和已經(jīng)鑒定的菌株的16S rDNA序列的同源性時，甚至最同源的菌株(多刺疣微菌(Verrucomicrobium spinosum))也只有76.6％的同源性。已知兩個同源性為90％或少于90％的細(xì)菌屬于不同的屬。因此，確定此菌株為一種新型細(xì)菌，不屬于任何已知的屬，將其命名為海洋巖藻依聚糖桿菌Fucoidanobactermarinus SI-0098。
上述菌株命名為Fucoidanobacter marinus SI-0098，并且自1995年3月29日以登記號FERM P-14873保藏在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工業(yè)技術(shù)研究所(日本茨城縣筑波市東1丁目1番3號，305)，并且以登記號FERM BP-5403保藏在如上所述的通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工業(yè)技術(shù)研究所(日本茨城縣筑波市東1丁目1番3號，305)(根據(jù)1996年2月15日的要求轉(zhuǎn)為國際保藏)。
如前所述，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-F和含硫酸巖藻糖多糖-U在0.6至3M濃度的一種或多種鹽的存在下，對酸性多糖凝集劑顯示出完全不同的表現(xiàn)。
例如，可以通過使用本發(fā)明的方法從含硫酸巖藻糖多糖混合物的水溶液中分離本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-F。
首先，將一種或多種鹽加入到含硫酸巖藻糖多糖混合物的水溶液中，使總鹽濃度為0.6至3M。至于要加入的鹽，例如可以使用氯化鈉和氯化鈣等(沒有限定)。在調(diào)整鹽濃度后，加入酸性多糖凝結(jié)劑(例如氯化十六烷基吡啶鎓鹽)，直到不再形成沉淀為止。然后，收集沉淀得到本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-F。
然而，當(dāng)上述的鹽濃度超過2M時，并且使用氯化十六烷基吡啶鎓鹽作為酸性多糖凝結(jié)劑時，本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-F很難形成沉淀，這一點必需注意。通常，可以在大約1.5M鹽濃度的溶液中將含硫酸巖藻糖多糖-U與本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-F分離(參見圖1的描述)。
在洗滌沉淀后，如果需要，用飽和的氯化鈉醇溶液洗去沉淀中的氯化十六烷基吡啶鎓鹽以得到本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-F。
可以將沉淀溶解并進(jìn)行超濾以便從所得的本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-F中除去著色物質(zhì)。也可以脫鹽和凍干所得的沉淀以得到干燥的制。此外，在此過程中可以加入防腐劑等物質(zhì)。
本發(fā)明人也已發(fā)現(xiàn)，如前所述，當(dāng)使用陰離子交換樹脂純化含硫酸巖藻糖多糖時，由于二價陽離子的共存造成吸附在每單位樹脂的含硫酸巖藻糖多糖的量增加，因此可以更有效地分離含硫酸巖藻糖多糖。為了通過使用本發(fā)明的方法生產(chǎn)本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-F，因此，優(yōu)選地以1mM或更高的濃度將化學(xué)上作為二價陽離子源的物質(zhì)加入到含硫酸巖藻糖多糖混合物中。接下來，用含有二價陽離子的溶液平衡陰離子交換樹脂，優(yōu)選的溶液濃度為1mM或者更高一些，因此吸附了上述的含硫酸巖藻糖多糖混合物。在用平衡溶液徹底洗滌陰離子交換樹脂后，通過用例如，氯化鈉的線型梯度洗脫以展開含硫酸巖藻糖多糖-F。在此方法的實踐中，可以加入二價陽離子以便使得溶液的濃度為1mM或者更高。至于在本方法中作為二價陽離子源的化學(xué)試劑，鈣鹽和鋇鹽展示出特別好效果。然而，本發(fā)明沒有限定在上述方法中使用的鹽，例如也可以使用硫酸鎂、氯化錳等。
例如，通過實施例8中所描述的方法獲得本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-F。接下來將說明含硫酸巖藻糖多糖-F的理化性質(zhì)，但并非限定本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-F。
通過凝膠過濾方法使用Sephacryl S-500測量上述獲得的含硫酸巖藻糖多糖-F的分子量。結(jié)果顯示其分子量分布大約為190,000(圖17)。在圖17中，縱坐標(biāo)代表通過酚-硫酸方法測定的樣品中糖類的含量，以480nm的吸光度來表示，橫坐標(biāo)代表組分號。
在下列條件下進(jìn)行凝膠過濾柱大小3.08×162.5cm；溶劑含有0.2M氯化鈉和10％乙醇的10mM磷酸鈉緩沖液(pH6.0)；流速1.5毫升/分鐘；樣品濃度0.25％；樣品量20ml；分子量標(biāo)準(zhǔn)Shodex STANDARD P-82(由昭和電工社制造)。
接下來，分析了上述獲得的本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-F的組分。
首先，按照J(rèn)ournal of Biological Chemical 175，595(1948)中所描述的方法測定巖藻糖含量。
接下來，在1N鹽酸中溶解上述獲得的含硫酸巖藻糖多糖-F的干燥制品以使得濃度為0.5％，并且在110℃下處理2小時以水解成結(jié)構(gòu)單糖。其后，通過使用GlycoTAG和GlycoTAG試劑盒將由水解獲得的單糖的還原端吡啶基-(2)-氨基化(PA)，并由HPLC分析組成單糖的組成比。在下列條件下進(jìn)行HPLC儀器L-6200型(由Hitachi有限公司制造)；柱PALPAK Type A(4.6mm×150mm)；洗脫液700mM嚴(yán)格緩沖液(pH 9.0)∶乙腈＝9∶1；檢測儀熒光檢測器F-1150(由Hitachi有限公司制造)，激發(fā)波長310nm，熒光波長380nm；流速0.3毫升/分鐘；和柱溫65℃。
接下來，按照Analytical Biochemistry 4，330(1962)中描述的方法測定糖醛酸的含量。
其后，按照Biochemical Journal 84，106(1962)中描述的方法測定硫酸的含量。
結(jié)果，表明上述獲得的含硫酸巖藻糖多糖-F的組成糖是大約10∶1摩爾比的巖藻糖和半乳糖，含硫酸巖藻糖多糖-F實質(zhì)上不含有糖醛酸或者其它的中性糖類。巖藻糖和硫酸鹽摩爾比大約為1∶2。
接下來，將6ml的巖藻依聚糖-F的1％溶液、12ml的50mM磷酸鹽緩沖液(pH8.0)、4ml的4M氯化鈉和8ml 32mU/ml的上述內(nèi)-巖藻依聚糖分解酶(來源于黃桿菌Flavobacterium sp.SA-0082(FERM BP-5402))的溶液混合，并且在25℃反應(yīng)48小時。結(jié)果，沒有形成任何降解產(chǎn)物，底物沒有被降解。
然后，用傅里葉變換紅外分光光度計JIR-DIAMOND 20(由JEOL有限公司制造)測定含硫酸巖藻糖多糖-F鈣鹽的IR光譜。這樣，得到了在圖18中所示的光譜。在圖18中，縱坐標(biāo)代表透光度(％)，橫坐標(biāo)代表到波數(shù)(cm-1)。
接下來，使用核磁共振波譜儀JNM-a500型(500MHz；JEOL有限公司制造)測量了本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-F鈉鹽的NMR光譜。這樣，得到了在圖19中所示的波譜。
在圖19中，縱坐標(biāo)代表信號強(qiáng)度，橫坐標(biāo)代表化學(xué)位移(ppm)。通過將HOD的化學(xué)位移作為4.65ppm來表達(dá)在1H-NMR中的化學(xué)位移。
1H-NMR(D2O)5.30(巖藻糖的1-位H)、1.19(巖藻糖的5-位CH3的H)。
當(dāng)使用高速、高靈敏度的旋光計SEPA-300(堀場制作所制造)測量時，本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-F的冷凍干燥產(chǎn)物具有-135°的比旋。
本發(fā)明提供了與本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-U相分離并純化的含硫酸巖藻糖多糖-F。本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-F實質(zhì)上不含糖醛酸作為組成糖類，并且不被黃桿菌Flavobacterium sp.SA-0082(FERM BP-5402)產(chǎn)生的巖藻依聚糖分解酶降解。本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-F在分子量、分子量分布、和糖類組分方面，沒有限制。也就是說，可以制備具有任意分子量和分子量分布的含硫酸巖藻糖多糖-F，也可以制備具有能清楚地說明理化性質(zhì)(例如糖類組分、還原端和極其高度硫酸化)含硫酸巖藻糖多糖F。
由于是從實質(zhì)上不含有抗凝血活性的含硫酸巖藻糖多糖-U相分離得到的，所以本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-F具有很強(qiáng)的抗凝劑活性。這樣，可以將含硫酸巖藻糖多糖-F和/或其降解產(chǎn)物用于抗凝劑中(使用純化的含硫酸巖藻糖多糖)，也可以用作為抗含硫酸巖藻糖多糖抗體的抗原。
當(dāng)以1μg/ml或更高濃度將按照本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖或者降解產(chǎn)物加入到癌細(xì)胞的培養(yǎng)基中時，在加入后的一至幾天內(nèi)，癌細(xì)胞經(jīng)歷細(xì)胞凋亡。這就是說，含硫酸巖藻糖多糖和其降解產(chǎn)物具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。這些物質(zhì)對正常細(xì)胞既沒有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡也沒有毒性。特別是來源于可食用的褐藻和海參的含硫酸巖藻糖多糖和其降解產(chǎn)物是非常安全的。
為了制備本發(fā)明的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物制劑，可將含硫酸巖藻糖多糖和/或其降解產(chǎn)物用作活性成分，并且與公知的藥物載體結(jié)合。一般來說，將含硫酸巖藻糖多糖和/或其降解產(chǎn)物與藥學(xué)上可接受的液體或者固體載體混合。在選擇性地加入溶劑、分散劑、乳化劑、緩沖液、穩(wěn)定劑、充填劑、結(jié)合劑、崩解劑、潤滑劑等試劑后，將混合物制成固體制劑，如片劑、顆粒劑、粉末劑、膠囊劑等或者液體制劑如溶液、混懸劑、乳劑等。另外，也可以制成干燥制劑，這種制劑在使用前可以通過加入適當(dāng)?shù)妮d體進(jìn)行液化。
可以通過口服或者腸胃外(例如，注射或者靜脈內(nèi)滴注)施用本發(fā)明的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物。
可以根據(jù)施用習(xí)慣和前面描述的劑量形式適當(dāng)?shù)剡x擇藥物載體。在口服藥物的情況下，可以采用例如淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖醇、羧甲基纖維素、玉米淀粉和無機(jī)鹽作為藥物載體。為了制備口服藥物也可以加入結(jié)合劑、崩解劑、表面活性劑、潤滑劑、流動性改進(jìn)劑、矯味劑、著色物質(zhì)劑、香味劑等等。這些添加劑的特殊的例子如下。
粘合劑淀粉、糊精、粉碎的阿拉伯膠、明膠、羥丙基淀粉、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、羥丙基纖維素、結(jié)晶纖維素、乙基纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮和聚乙二醇。
崩解劑淀粉、羥丙基淀粉、羧甲基纖維素鈉、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素和低取代的羥丙基纖維素。
表面活性劑月桂基硫酸鈉、大豆卵磷脂、蔗糖脂肪酸酯和聚山梨醇酯八十。
潤滑劑滑石、蠟、氫化植物油、蔗糖脂肪酸酯、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂酸鋁和聚乙二醇。
流動性改進(jìn)劑輕無水硅酸、干燥的氫氧化鋁凝膠、合成硅酸鋁和硅酸鎂。
口服的液態(tài)制劑的例子包括混懸劑、乳劑、糖漿劑和酏劑，其中每一種物質(zhì)中可以選擇性地包含矯味、矯臭劑和著色物質(zhì)。
另一方面，可以通過將作為本發(fā)明的活性成分的含硫酸巖藻糖多糖和/或其降解產(chǎn)物以常規(guī)方式溶解或者懸浮在稀釋液(如注射用蒸餾水、生理鹽水、葡萄糖水溶液、注射用植物油(芝麻油、花生油、大豆油、玉米油)、丙二醇、聚乙二醇等等)中來獲得腸胃外制劑，如果需要，可以加入殺菌劑、穩(wěn)定劑、等張劑、無痛化劑等等。
通過與藥劑形式合適的給藥途徑給予本發(fā)明的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物。也沒有特別限定它的施用方法。也就是說，可以選擇內(nèi)用、外用或者注射。例如，可以靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下或皮內(nèi)注射施用本發(fā)明的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物。用于外用的制劑包括栓劑。
本發(fā)明的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物的施用劑量，可以根據(jù)藥劑形式、患者的施用方法、施用目的、年齡、體重、身體狀況適當(dāng)?shù)厥┯茫O(shè)有一定限制。一般對成年人來說，可以施用1至1,000mg/日，優(yōu)選的10至200mg/日的活性成分。實際上，施用的劑量隨著各種因素的變化而異。因此，在一些情況下，施用比上述劑量更低一些的水平就足夠了，在其它情況下可以施用超過上述水平的劑量。
通過使用按照本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-U、含硫酸巖藻糖多糖-F和/或其降解產(chǎn)物作為活性成分，將其與公知的藥物載體結(jié)合，然后將此混合物加工成藥物制劑，從而可以制成抗癌作用的抗癌藥物?？梢园凑丈鲜雒枋龅姆椒ㄉa(chǎn)抗癌藥物。一般來說，將含硫酸巖藻糖多糖和/或其降解產(chǎn)物與藥學(xué)上可接受的液體或者固體載體混合。在選擇性地加入溶劑、分散劑、乳化劑、緩沖液、穩(wěn)定劑、充填劑、結(jié)合劑、崩解劑、潤滑劑等試劑后，將混合物制成固體制劑，如片劑、顆粒劑、粉末劑、散劑、膠囊劑等或者液體制劑如溶液劑、混懸劑、乳劑等。另外，也可以制成干燥制劑，這種制劑在使用前可以通過加入適當(dāng)?shù)妮d體進(jìn)行液化。
可以通過口服或者腸胃外(例如，注射或者靜脈內(nèi)滴注)施用本發(fā)明的抗癌藥物。
可以適當(dāng)?shù)匕凑战o藥方式和按照上述的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物的劑形選擇藥物載體。
通過與藥劑形式合適的給藥方式施用本發(fā)明的抗癌藥物。也沒有特別限定它的給藥方法。也就是說，可以選擇內(nèi)用、外用或者注射。例如，可以靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下或皮內(nèi)注射施用本發(fā)明的抗癌藥物。用于外部施用的制劑包括栓劑。
沒有特別地限定本發(fā)明的抗癌藥物的施用劑量，但是可以根據(jù)劑形、患者的給藥方法、使用目的、年齡、體重、身體狀況適當(dāng)?shù)厥┯?。一般對成年人來說，可以施用1至1,000mg/天(優(yōu)選的10至200mg/天)的活性成分。實際上，施用的劑量隨著各種因素的變化而異。因此，在一些情況下，施用比上述劑量更低一些的水平就足夠了，在其它情況下可以施用超過上述水平的劑量。本發(fā)明的藥物也可以口服施用。另外，也可以將所說的藥物加入到任何的每天攝取的食品或者飲料中。
通過使用按照本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖和/或其降解產(chǎn)物作為活性成分，將其與公知的藥物載體結(jié)合，然后將此混合物加工成藥物制劑，從而可以產(chǎn)生有抑癌作用的制癌藥物?？梢园凑丈鲜雒枋龅姆椒óa(chǎn)生制癌藥物。一般來說，將含硫酸巖藻糖多糖和/或其降解產(chǎn)物與藥學(xué)上可接受的液體或者固體載體混合。在選擇性地加入溶劑、分散劑、乳化劑、緩沖液、穩(wěn)定劑、充填劑、結(jié)合劑、崩解劑、潤滑劑等試劑后，將混合物制成固體制劑，如片劑、顆粒、散劑、粉末劑、膠囊等或者液體制劑如溶液、懸液、乳劑等。另外，也可以制成干燥制劑，這種制劑在使用前可以通過加入適當(dāng)?shù)妮d體進(jìn)行液化。
可以通過口服或者腸胃外(例如，注射或者靜脈內(nèi)滴注)施用本發(fā)明的制癌藥物。
可以適當(dāng)?shù)馗鶕?jù)給藥方式和按照上述的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物的藥劑形式選擇藥物載體。
通過與藥劑形式合適的給藥方式施用本發(fā)明的制癌藥物。也沒有特別限定它的施用方法。也就是說，可以選擇內(nèi)用、外用或者注射。例如，可以靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下或皮內(nèi)注射給予本發(fā)明的制癌藥物。用于外用的制劑包括栓劑。
沒有特別地限定本發(fā)明的制癌藥物的施用劑量，但是可以根據(jù)藥劑形式、患者的施用方法、施用目的、年齡、體重、身體狀況適當(dāng)?shù)厥┯谩Ｒ话銓Τ赡耆藖碚f，可以施用1至1,000mg/天(優(yōu)選的10至200mg/天)的活性成分。實際上，施用的劑量隨著各種因素的變化而異。因此，在一些情況下，施用比上述劑量更低一些的水平就足夠了，在其它情況下可以施用超過上述水平的劑量。本發(fā)明的藥物也可以口服施用。另外，也可以將所說的藥物加入到任何的每天攝取的食品或者飲料中。
按照本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖與它的降解產(chǎn)物是天然來源的物質(zhì)，并且當(dāng)給小鼠口服給藥時沒有顯示任何毒性。
本發(fā)明的藥物目的是用于治療傳染病、免疫機(jī)能低下或亢進(jìn)、癌、病毒性疾病等。也可以將它們用作為防癌劑而保健。本發(fā)明的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法例如在研究生物防御機(jī)制、免疫功能和與癌和病毒相關(guān)的疾病或者開發(fā)抑制細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物中是有用的。尤其是從可食用的褐藻或者海參中制備的本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖和其降解產(chǎn)物都長期被作為食物，在口服施用方面是高度安全的。
由于硫酸化的多糖的分子量是非常大的，含硫酸巖藻糖多糖不適合作為藥物，但是為改進(jìn)它的抗原性、均一性、抗凝血活性等等，有必要在一定程度上降解。本發(fā)明提供了能夠選擇地只降解含硫酸巖藻糖多糖-F和通過使用酶處理含硫酸巖藻糖多糖-F獲得的降解產(chǎn)物的酶。
本發(fā)明所使用的菌株可以是屬于交替單胞菌屬的任何菌株，只要這種菌株可以產(chǎn)生含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶。Alteromonas sp.SA-1009可以作為能夠產(chǎn)生含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶的菌株的一個具體的例子?？梢酝ㄟ^用來源于此菌株的含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶處理含硫酸巖藻糖多糖-F獲得本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-F的降解產(chǎn)物。
由本發(fā)明人從青森縣的海水中最近分離的這種菌株具有下列菌學(xué)性質(zhì)。
a.形態(tài)學(xué)的特征(1)桿菌；寬度大約1μm長度大約2μm(2)孢子無(3)革蘭氏染色-b.生理學(xué)特性(1)生長溫度范圍適宜的生長溫度范圍為15-30℃，能夠在4℃或40℃生長。
(2)對氧的反應(yīng) 需氧(3)過氧化氫酶 +(4)氧化酶 +(5)脂酶 +(6)代謝性 葡萄糖 +甘露糖 -
蔗糖 +乳糖 -纖維二糖 +蜜二糖 -甘露糖醇 +甘油 +甲醇 -DL-蘋果酸-琥珀酸 -富馬酸 -檸檬酸 -水楊甙 -(7)水解淀粉 -明膠 -(8)硝酸鹽的還原性 -(9)脫氮反應(yīng) -(10)藻酸的分解 +(11)β-羥丁酸的使用 -(12)聚羥丁酸的積累 -(13)對鈉的需求 +(14)對鹽的需求在無NaCl的培養(yǎng)基中的生長-在1％的NaCl培養(yǎng)基中的生長-在海水培養(yǎng)基中的生長 +(15)醌 泛醌8(16)胞內(nèi)DNA的GC含量36％(17)OF-檢驗○(18)菌落顏色 不形成有特征的顏色(19)發(fā)光度 -(20)運動性 +
(21)鞭毛 極性的單鞭毛按照“Bergey系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊，1，343-352(1984)”和“Bergey鑒定細(xì)菌學(xué)手冊，9 75，132-133(1994)”中的描述，將這種菌株鑒定為屬于屬交替單胞菌屬的細(xì)菌。然而，此菌株的生理學(xué)特性與手冊中所描述的任一細(xì)菌不同。其顯示出低GC含量。因此，將其命名為Alteromonas sp.SN-1009。
上述菌株命名為Alteromonas sp.SN-1009，并且自1996年2月13日以登記號FERM P-15436保藏在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工業(yè)技術(shù)研究所(日本茨城縣筑波市東1丁目1番3號，305)，并且以登記號FERMBP-5747保藏在如上所述的通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工業(yè)技術(shù)研究所(根據(jù)1996年11月15日的要求轉(zhuǎn)為國際保藏)。
加入到培養(yǎng)此菌株的培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)可以是任何此菌株能夠利用產(chǎn)生本發(fā)明的含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶的物質(zhì)。合適的碳源的例子包括含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖、海藻類粉末、藻酸、巖藻糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖醇、甘油、蔗糖和麥芽糖；合適的氮源的例子包括酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白氨基酸、玉米漿、肉膏、脫脂大豆、硫酸銨和氯化銨。培養(yǎng)基中還可以含有無機(jī)物質(zhì)和金屬鹽，例如鈉鹽、磷酸鹽、鉀鹽、鎂鹽和鋅鹽。
而且，此菌株在包含上述營養(yǎng)物質(zhì)的海水或者人工海水中的生長良好。
在培養(yǎng)此菌株產(chǎn)生發(fā)明的含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶的過程中，所說的含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶的產(chǎn)量變化取決于培養(yǎng)條件。一般來說，通過在15℃至30℃的培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基pH值為6至9、在通氣和攪拌條件下培養(yǎng)5至72小時可以得到最大產(chǎn)量的含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶。
更不用說，可以按照所使用的菌株、培養(yǎng)基組分等選擇培養(yǎng)條件以便獲得本發(fā)明的含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶的最大產(chǎn)量。
在這些菌體和培養(yǎng)物上清液中都可以獲得本發(fā)明的含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶。
在合適的培養(yǎng)基培養(yǎng)上述的Alteromonas sp.SN-1009，收獲菌體，經(jīng)通常使用的破碎細(xì)胞的方法(如超聲處理)破碎這些菌體。這樣，可以獲得無細(xì)胞的提取物。
其后，通過本領(lǐng)域一般所使用的純化方法純化這些提取物，這樣就得到了純化的酶制劑。例如，純化可以通過鹽析、離子交換層析、疏水結(jié)合柱層析、凝膠過濾或其它純化方法進(jìn)行純化，以便得到純化的不含任何其它巖藻依聚糖分解酶的本發(fā)明的含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶。
通過從上述的培養(yǎng)基中除去細(xì)胞而獲得的培養(yǎng)物上清液也含有大量的所說的酶，可以通過與純化胞內(nèi)酶所使用的相同方法純化此酶。
本發(fā)明的含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶的化學(xué)和理化性質(zhì)如下(i)功能作用于具有下列理化性質(zhì)的含硫酸巖藻糖多糖(即含硫酸巖藻糖多糖-F)和降解含硫酸巖藻糖多糖-F(a)組成糖類實質(zhì)上不含有糖醛酸；和(b)實質(zhì)上不能被黃桿菌Flavobacterium sp.SA-0082(FERM BP-5402)產(chǎn)生的巖藻依聚糖分解酶降解。
不作用于具有下列理化性質(zhì)的含硫酸巖藻糖多糖(即含硫酸巖藻糖多糖-U)(c)組成糖類含有糖醛酸；和(d)能被黃桿菌Flavobacterium sp.SA-0082(FERM BP-5402)產(chǎn)生的巖藻依聚糖分解酶降解以形成至少一種由下列化學(xué)式(I)、(II)和(III)代表的化合物


(ii)最適pH值大約pH 7-8(圖20)。
圖20為顯示所說的酶的相對活性和pH值之間的關(guān)系的圖表，其中縱坐標(biāo)代表相對活性(％)，而橫坐標(biāo)代表pH值。通過使用具有PA化還原性末端(PA-FF)的含硫酸巖藻糖多糖-F作為底物得到了實線；通過使用含硫酸巖藻糖多糖-F作為在下文(v)-(2)中將要描述的底物得到了虛線。
(iii)最適溫度大約30-35℃(圖21)。
圖21為顯示所說的酶的相對活性和溫度之間的關(guān)系的圖表，其中縱坐標(biāo)代表相對活性(％)，而橫坐標(biāo)代表溫度(℃)。通過使用具有PA化還原性末端(PA-FF)的含硫酸巖藻糖多糖-F作為底物得到了實線；通過使用含硫酸巖藻糖多糖-F作為在下文(v)-(2)中將要描述的底物得到了虛線。
(iv)分子量通過凝膠過濾使用Sephacryl S-200(由Pharmacia制造)測定的酶的分子量大約為100,000；(v)用于測量酶促活性的方法以下列方式測量了本發(fā)明的含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶的活性。
首先，按照下列步驟(1)-(3)制備了作為本發(fā)明的含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶的底物的含硫酸巖藻糖多糖-F和PA-FF。
(1)制備來源于Kjellmaniella crassifolia的含硫酸巖藻糖多糖混合物用自由粉碎機(jī)M-2型(由奈良機(jī)械制作所)將2kg干燥的Kjellmaniellacrassifolia研成粉末，并在80℃下用4.5倍的80％乙醇處理2小時。然后過濾，將殘留物在按照上述過程處理，即用80％乙醇處理并過濾三次并得到用乙醇洗滌后的1,870g殘留物。向所說的殘留物中加入36升水，將所得的混合物在100℃下處理2小時，然后過濾混合物得到提取物。將提取物的鹽濃度調(diào)整到與400mM氯化鈉溶液的鹽濃度相同的水平。然后，向其中加入5％氯化十六烷基吡啶鎓鹽，直到沉淀不再產(chǎn)生。離心后，將沉淀用80％的乙醇重復(fù)洗滌以完全除去氯化十六烷基吡啶鎓鹽。接下來，將所得的混合物溶解在3升的2M氯化鈉溶液中。在通過離心除去不溶物質(zhì)后，將其懸浮在100ml用2M氯化鈉平衡的100ml DEAE-Cellulofine A-800中。將懸液攪拌，然后過濾以除去樹脂。將濾液加入到用2M氯化鈉平衡的100ml DEAE-Cellulofine A-800柱中，通過使用超濾膜(超濾膜的排阻分子量100,000)將流出的組分脫鹽，從組分中除去低分子量物質(zhì)。通過離心除去所得的沉淀。將上清液冷凍干燥，得到82.2g純化的Kjellmaniellacrassifolia含硫酸巖藻糖多糖混合物。
(2)含硫酸巖藻糖多糖-F的制備將上述的6g來源于Kjellmaniella crassifolia的含硫酸巖藻糖多糖混合物溶解在含有0.2M氯化鈣的600ml的20mM的乙酸鈉(pH 6.0)中。然后，先將溶液加入到用含有0.2M氯化鈣的20mM乙酸鈉(pH 6.0)預(yù)先平衡的3600ml的DEAE-Sepharose FF柱中。然后，將柱用含有0.2M氯化鈣的20mM乙酸鈉(pH 6.0)徹底洗滌，并用0至2M的梯度氯化鈉洗脫展開。
收集在0.75M的氯化鈉濃度洗脫的含硫酸巖藻糖多糖-F組分和上述洗脫的組分，并通過具有100,000排阻分子量的超濾膜的超濾器脫鹽。在冷凍干燥后得到了3.3g的含硫酸巖藻糖多糖-F的凍干制劑。
(3)PA-FF的制備將上述的12mg含硫酸巖藻糖多糖-F的凍干制劑溶解在480μl的水中，并分別將得到12μl的溶液轉(zhuǎn)移到36個管中。在冷凍干燥后，通過使用GlycoTAG和GlycoTAG試劑盒將還原性末端吡啶基-(2)-氨基化(PA)，因此得到PA-FF。將上述獲得的PA-FF溶解在15ml含有10％甲醇的10mM乙酸銨溶液中，并使用Cellulofine GCL-300柱(40×900mm)進(jìn)行凝膠過濾。收集高分子量的組分，并通過使用孔大小為3500的透析膜透析脫鹽。其后，用蒸發(fā)器濃縮至5ml，因此得到了將用作本發(fā)明的含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖-F降解酶底物的PA-FF。
通過與市售的吡啶基-(2)-氨基化的巖藻糖(由寶酒造社有限公司制造；激發(fā)波長320nm，熒光的波長400nm)的熒光強(qiáng)度比較估計上述獲得的PA-FF的數(shù)量大約為40nmol。
通過使用上述步驟(1)和(2)獲得的含硫酸巖藻糖多糖-F，按照下列方式測定本發(fā)明的含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶的活性。
也就是說，將12μl的2.5％的含硫酸巖藻糖多糖-F溶液；6μl的1M氯化鈣溶液；12μl的1M氯化鈉溶液；72μl含有50mM乙酸、咪唑和Tris-鹽酸的緩沖液(pH7.5)和18μl的本發(fā)明的含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖-F降解酶混合，并且在30℃下反應(yīng)3小時。然后100℃將反應(yīng)混合物處理10分鐘并離心。通過HPLC分析100μl的混合物來測定降解程度。
作為對照，使用由此方法制備的反應(yīng)混合物(只是以溶解本發(fā)明的含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶的緩沖液代替本發(fā)明的含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶)和以同樣方法制備的另一種反應(yīng)混合物(只是以水替代含硫酸巖藻糖多糖-F的溶液)。也通過HPLC分析這些對照。
在1分鐘內(nèi)切割1μmol含硫酸巖藻糖多糖-F的巖藻糖基鍵所用的酶量定義為1U。按照下列式子計算所切割的巖藻糖基鍵活性(U/ml)＝{(12×2.5)/(100×MF)}×{(MF/M)-1}×{0.12/(180×0.01)}(12×2.5)/100加入到反應(yīng)系統(tǒng)中的含硫酸巖藻糖多糖-F(mg)；MF底物的平均分子量(含有硫酸巖藻糖的多糖-F)；M反應(yīng)產(chǎn)物的平均分子量；(MF/M)-1一個分子的含有硫酸巖藻糖的多糖-F中由酶切割的數(shù)量；180反應(yīng)時間(分鐘)；0.01酶溶液的量(ml)；和0.12整個反應(yīng)混合物的量(ml)。
在下列條件下進(jìn)行HPLC儀器L-6200型(由Hitachi有限公司制造)；柱OHpak KB-804(8mm×300mm，由昭和電工株式會社制造)；洗脫液25mM含有5mM的疊氮化鈉、25mM的氯化鈣和50mM氯化鈉的咪唑緩沖液(pH 8)。
檢測儀示差折光計檢測儀(Shodex RI-71，昭和電工株式會社制造)；流速1毫升/分鐘；和柱溫25℃。
為了測量反應(yīng)產(chǎn)物的平均分子量，在同樣的條件下如上所述通過HPLC分析市售的分子量已知的支鏈淀粉(標(biāo)準(zhǔn)物P-82，由Showa DenkoK.K.制造)。然后，制備表示OHpak KB-804上支鏈淀粉的分子量和保留時間之間關(guān)系的曲線，并用作測定上述的酶促反應(yīng)產(chǎn)物的分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
通過使用經(jīng)上述步驟(1)-(3)獲得的PA-FF按照下列方式測定本發(fā)明的含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶的活性。
也就是說，將2μl的8pmol/μl的PA-FF溶液、5μl的1M氯化鈣溶液；10μl的1M氯化鈉溶液；23μl的水、50μl含有50mM乙酸、咪唑和Tris鹽酸的緩沖液(pH8.2)和10μl的本發(fā)明的含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶混合，并且在30℃下反應(yīng)3小時。然后100℃下將反應(yīng)混合物處理10分鐘并離心。通過HPLC分析80μl所制備的樣品來測定降解程度。
使用由此方法制備的反應(yīng)混合物(只是以溶解本發(fā)明的含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶的緩沖液代替本發(fā)明的含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶)和以同樣方法制備的另一種反應(yīng)混合物(只是以水替代PA-FF溶液)作為對照。也通過HPLC分析這些對照。
在1分鐘內(nèi)切割1μmol含硫酸巖藻糖多糖的巖藻糖基鍵所用的酶量定義為1U。按照下列式子計算所切割的巖藻糖基鍵活性(U/ml)＝16×10-6×{(MF/M)-1}×{1/(180×0.01)}16×10-6加入到反應(yīng)系統(tǒng)中的PA-FF的量(μmol)；MF底物的平均分子量(含有硫酸巖藻糖的多糖-F)；M反應(yīng)產(chǎn)物的平均分子量；(MF/M)-1一個分子的含有硫酸巖藻糖的多糖-F中由酶切割的數(shù)量；180反應(yīng)時間(分鐘)；0.01酶溶液的量(ml)；和在下列條件下進(jìn)行HPLC儀器L-6200型(由日立制作所制造)；柱OHpakKB-803(8mm×300mm，由昭和電工株式會社制造)；洗脫液200mM含有5mM的疊氮化鈉、10％的二甲基亞砜的氯化鈉溶液。
檢測儀熒光檢測器F-1150(由Hitachi有限公司制造)，激發(fā)波長320nm，熒光波長400nm；流速1毫升/分鐘；和柱溫度50℃。
為了測量反應(yīng)產(chǎn)物的平均分子量，通過使用GlycoTAG和GlycoTAG試劑盒將市售的分子量已知的支鏈淀粉(標(biāo)準(zhǔn)物P-82，由Showa Denko K.K.制造)吡啶基-(2)-氨基化(PA)以得到具有各種分子量的PA-支鏈淀粉。在同樣的條件下如上所述通過HPLC分析這些具有各種分子量的PA-支鏈淀粉。然后，制備表示OHpak KB-803上支鏈淀粉的分子量和保留時間之間關(guān)系的曲線，將其用作測定上述的酶促反應(yīng)產(chǎn)物的分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
通過在280nm測量酶溶液的吸收率來測定蛋白質(zhì)。將1mg/ml蛋白質(zhì)溶液的吸收率作為1.0來進(jìn)行計算。
本發(fā)明人以下列方式解釋了本發(fā)明的含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶的作用機(jī)理。
(1)通過含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶降解含硫酸巖藻糖多糖-F和制備降解產(chǎn)物用含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶處理來源于Kjellmaniella crassifolia的純化含硫酸巖藻糖多糖-F，因此制備了它的降解產(chǎn)物。
首先，制備了含硫酸巖藻糖多糖降解酶。也就是說，將Alteromonas sp.SN-1009(FERM BP-5747)接種到600ml的含有人工海水(pH8.2，Jamarin實驗室制造)的培養(yǎng)基中，其中人工海水含有0.25％的葡萄糖、1.0％的蛋白胨和0.05％酵母提取物(所說的培養(yǎng)基已經(jīng)轉(zhuǎn)移到2-L錐形瓶并在120℃滅菌20分鐘)。然后，在25℃將菌株培養(yǎng)26小時以得到種子培養(yǎng)物。在一個30-L發(fā)酵罐中加入20L含有0.25％的葡萄糖、1.0％的蛋白胨、0.02％酵母提取物和0.2％源于上述的Kjellmaniella crassifolia的含硫酸巖藻糖多糖-F和0.01％脫泡劑(信越化學(xué)工業(yè)公司制造的KM70)的人工海水(pH8.0，Jamarin實驗室制造)培養(yǎng)基，并在120℃滅菌20分鐘。在冷卻后，將培養(yǎng)基用上述的600ml種子培養(yǎng)物接種，然后以10l/分鐘的速率充氣和250rpm攪拌，并在24℃下將其培養(yǎng)24小時。在培養(yǎng)完成后，將培養(yǎng)基離心以得到菌體和培養(yǎng)物上清液。將所得的培養(yǎng)物上清液用具有10,000分級分子量的超濾器濃縮，并且使用85％硫酸銨鹽析。通過離心得到形成的沉淀，并用含有稀釋了10倍的人工海水的20mM Tris-鹽酸緩沖液(pH 8.2)徹底透析。這樣就得到了600ml酶的粗提物。
將40ml所得的酶的粗提物、44ml的人工海水、510mg的上述含硫酸巖藻糖多糖-F和36ml的水混合，將混合物的pH值調(diào)整到8。在25℃反應(yīng)48小時后，通過使用Cellulofine GCL-300將反應(yīng)混合物進(jìn)行凝膠過濾，并且將其分成四個組分，根據(jù)分子量的大小分別命名為F-Fd-1、(分子量超過25,000)、F-Fd-2(分子量12,000-25,000)、F-Fd-3(分子量6,500-12,000)和F-Fd-4(分子量6,500或更小)。將這些組分脫鹽并冷凍干燥，因此分別得到了170、270、300和340mg的干燥制品。
圖22顯示了含硫酸巖藻糖多糖-F的酶促消化產(chǎn)物(即降解產(chǎn)物)的凝膠過濾(使用Cellulofine GCL-300)。在圖22中，縱坐標(biāo)代表在480nm的吸收率(用硫酸苯酯方法測定產(chǎn)生的顏色)，而橫坐標(biāo)代表組分號。每一個組分具有10ml的洗脫物。柱的體積為1,075ml，0.2M含有10％乙醇的乙酸銨溶液作為洗脫液。
在圖22中，○代表已經(jīng)用酶降解的含硫酸巖藻糖多糖-F的凝膠過濾結(jié)果，而黑三角形代表酶促降解前的含硫酸巖藻糖多糖-F的凝膠過濾結(jié)果。
上述的Cellulofine GCL-300凝膠過濾結(jié)果表明本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖降解酶的反應(yīng)產(chǎn)物具有大約1,000至30,000范圍的分子量分布。
(2)在酶促反應(yīng)產(chǎn)物中的還原端糖類和中性糖類組分的分析將上述的F-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3和F-Fd-4分成樣品，并通過使用GlycoTAG和GlycoTAG試劑盒對還原性末端進(jìn)行吡啶基-(2)-氨基化(PA)。通過在100℃下使用4N鹽酸處理3小時將上述獲得的(PA-F-Fd-1)、(PA-F-Fd-2)、(PA-F-Fd-3)和(PA-F-Fd-4)水解，并通過HPLC測定還原性末端糖。
在下列條件下進(jìn)行HPLC儀器L-6200型(由日立制作所制造)；柱PALPAK Type A(4.6mm×150mm)(寶酒造社制)；洗脫液700mM硼酸緩沖液(pH 9.0)∶乙腈＝9∶1；檢測儀熒光檢測器F-1150(由日立制作所制造)，激發(fā)波長310nm，熒光波長380nm；流速0.3毫升/分鐘；和柱溫65℃。
結(jié)果表明(PA-F-Fd-1)、(PA-F-Fd-2)、(PA-F-Fd-3)和(PA-F-Fd-4)還原性末端糖類都是巖藻糖。
此外，用下列方式測定了F-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3和F-Fd-4的中性糖類組分。用硫酸水解作為底物的含硫酸巖藻糖多糖-F，并通過使用GlycoTAG和GlycoTAG試劑盒將其組成糖的還原性末端進(jìn)行吡啶基-(2)-氨基化(PA)，然后在與分析上述酶促反應(yīng)產(chǎn)物的相同條件下進(jìn)行HPLC分析。結(jié)果，只檢測到了分別具有L-和D-構(gòu)型的巖藻糖和半乳糖。這樣，在產(chǎn)物中只發(fā)現(xiàn)了L-巖藻糖和D-半乳糖。
也就是說，按照下列方式測定了組成糖化物之一的D-半乳糖的含量。通過使用F-試劑盒乳糖/半乳糖(由Boehringer-Mannheim-山之內(nèi)制造)，按照生產(chǎn)廠商的說明構(gòu)建了只測定D-半乳糖的反應(yīng)系統(tǒng)。在100℃下使用4N鹽酸分別將F-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3和F-Fd-4水解2小時；在中和后，在此反應(yīng)系統(tǒng)中進(jìn)行測定。
另一方面，按照下列方式測定了作為另一個組成糖類的L-巖藻糖的含量。按照在Clinical Chemistry，36，474-476(1990)中的描述，在100℃下使用4N鹽酸將F-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3和F-Fd-4水解2小時；在中和后，在此反應(yīng)系統(tǒng)中進(jìn)行測定。
結(jié)果表明，F(xiàn)-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3和F-Fd-4的L-巖藻糖與D-半乳糖的比分別為100∶44、100∶27、100∶5和100∶1。
這些結(jié)果可以總結(jié)如下。本發(fā)明的含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶作用于含硫酸巖藻糖多糖-F并且水解巖藻糖基鍵，因此形成了分子量大約為1,000至30,000的降解產(chǎn)物。在這些降解產(chǎn)物中，具有更高的分子量的產(chǎn)物顯示出具有更高的半乳糖含量。所有這些降解產(chǎn)物都具有L-巖藻糖作為還原性末端。
接下來，通過使用本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖降解酶處理含硫酸巖藻糖多糖-U檢驗了此酶的底物特異性。
也就是說，將12μl的2.5％的含硫酸巖藻糖多糖-U溶液；6μl的1M氯化鈣溶液；12μl的1M氯化鈉溶液；72μl的50mM咪唑緩沖液(pH7.5)和18μl的本發(fā)明的含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖-F降解酶(1.6mU/ml)混合，并且在30℃下反應(yīng)3小時。然后100℃將反應(yīng)混合物處理10分鐘并離心。通過HPLC分析100μl的混合物來測定降解程度。
使用由此方法制備的反應(yīng)混合物(只是以溶解本發(fā)明的含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶的緩沖液代替本發(fā)明的含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶)作為對照。也通過HPLC分析這些對照。
在下列條件下進(jìn)行HPLC儀器L-6200型(由日立制作所制造)；柱OHpak KB-804(8mm×300mm，由昭和電工株式會社制造)；洗脫液25mM含有5mM的疊氮化鈉、25mM的氯化鈣和50mM氯化鈉的咪唑緩沖液(pH 8)。
檢測儀示差折光計檢測儀(Shodex RI-71，昭和電工株式會社制造)；流速1毫升/分鐘；和柱溫25℃。
結(jié)果，含硫酸巖藻糖多糖-U沒有完全被本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖降解酶降解。
如上所述，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明上述含硫酸巖藻糖多糖降解酶和鈣源的酶的組合物。
能夠用于固體組合物中的鈣源的例子包括鈣鹽，例如氯化鈣、碳酸鈣、乙酸鈣，氧化鈣、氫氧化鈣或其水合物。在液態(tài)組合物中，鈣源可以溶解在溶劑(如水或者醇)溶解、懸浮或乳化，另一方面，鈣源可以是上述引用的或已經(jīng)電離(例如通過分解)的任何簡單化合物。
這些鈣源在激活或者穩(wěn)定酶上是有效的。
因此，只要不破壞上述鈣源的作用，根據(jù)使用的目的，上述酶組合物還可以含有本領(lǐng)域一般使用的添加劑。
可以通過用本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖降解酶處理包含含硫酸巖藻糖多糖-F的材料來制備含硫酸巖藻糖多糖-F的降解產(chǎn)物。至于包含含硫酸巖藻糖多糖-F的材料，可以使用例如，純化的含硫酸巖藻糖多糖-F產(chǎn)物、上述的含硫酸巖藻糖多糖混合物或者褐藻含水的溶劑的提取物?？梢允褂贸Ｒ?guī)方式溶解包含含硫酸巖藻糖多糖-F的材料。雖然含硫酸巖藻糖多糖可以溶解在高濃度的溶液中，但是濃度通常取決于可使用性和酶的滴度。
可以按照目的從水、緩沖液中適當(dāng)?shù)剡x擇含硫酸巖藻糖多糖-F溶液的溶劑。溶液的pH值通常為中性，酶促反應(yīng)一般在大約30℃下進(jìn)行?？梢酝ㄟ^控制酶量、反應(yīng)時間等調(diào)節(jié)降解產(chǎn)物的分子量。
接下來，對降解產(chǎn)物進(jìn)行分子量分級分離以得到具有更均一分子量分布的含硫酸巖藻糖多糖-F的降解產(chǎn)物。可以通過通常使用的方法(例如凝膠過濾或者使用分子量分級分離膜)進(jìn)行分子量分級分離。如果需要，例如可以用離子交換樹脂或活性碳進(jìn)行處理來進(jìn)一步純化降解產(chǎn)物。如果需要，也可以對降解產(chǎn)物脫鹽、滅菌和冷凍干燥，從而得到本發(fā)明的降解產(chǎn)物的干燥制劑。
實施例為了進(jìn)一步詳細(xì)地說明本發(fā)明(但是并不對本發(fā)明構(gòu)成任何限制)，給出了下列實施例，其中的百分比是重量比。
實施例1用自由粉碎機(jī)(由奈良機(jī)械制作所)將2kg徹底干燥的Kjellmaniellacrassifolia研成粉末。將獲得的干燥粉末懸浮在9升的80％乙醇中，并在80℃下處理2小時。然后將混合物通過濾紙過濾得到了殘留物，將殘留物按照與上述過程相同的方法用乙醇重復(fù)洗滌和過濾三次，因此得到用乙醇洗滌后殘留物。將殘留物懸浮在40升水中，并在95℃下處理2小時，然后過濾。用熱水洗滌殘余物得到36升包含來源于Kjellmaniella crassifolia的含硫酸巖藻糖多糖的提取物。將1.8升上述獲得的提取物冷凍干燥得到15.4g含硫酸巖藻糖多糖制劑。將剩余物提取液加入氯化鈉以使?jié)舛冗_(dá)到0.4M。此外，向其中加入5％氯化十六烷基吡啶鎓鹽，直到不再產(chǎn)生沉淀為止。然后通過離心收集沉淀，并將其懸浮在3升的0.4M氯化鈉的水溶液中，然后離心并洗滌。在重復(fù)三次洗滌過程后，向沉淀中加入1升4M氯化鈉的水溶液。在充分?jǐn)嚢韬?，加入乙醇使之濃度達(dá)到80％。然后將混合物攪拌、離心以得到沉淀。將沉淀懸浮在80％乙醇中并離心。重復(fù)上述過程，直到上清液在260nm的吸收率為0。將沉淀溶解在3升的2M氯化鈉的水溶液中。在通過離心除去不溶解的物質(zhì)后，將其加入到用2M氯化鈉水溶液平衡的100ml DEAE-Cellulofine A-800柱(由生化學(xué)工業(yè)社制造)中并攪拌，接下來，通過過濾除去加入的樹脂。將濾液加入到用2M氯化鈉水溶液平衡的100ml DEAE-Cellulofine A-800柱中，并使用具有100,000的排阻分子量的中空纖維的超濾器將未吸收的組分超濾以完全除去著色物質(zhì)和氯化鈉。接下來，通過離心除去不溶物質(zhì)，然后進(jìn)行過濾和冷凍干燥。凍干的含硫酸巖藻糖多糖混合物的重量為76g。
實施例2用自由粉碎機(jī)(由奈良機(jī)械制作所)將2kg徹底干燥的昆布研成粉末。將獲得的干燥粉末懸浮在9升的80％乙醇中，并在80℃下處理2小時。然后將混合物通過濾紙過濾得到殘留物，將殘留物按照與上述過程相同的方法用乙醇重復(fù)洗滌和過濾三次，因此得到用乙醇洗滌后殘留物。將殘留物懸浮在40升水中，并在95℃下處理2小時，然后過濾。用熱水洗滌殘余物得到36升包含來源于昆布的含硫酸巖藻糖多糖的提取物。將提取液加入氯化鈉以使?jié)舛冗_(dá)到0.4M。此外，向其中加入5％氯化十六烷基吡啶鎓鹽，直到不再產(chǎn)生沉淀為止。然后通過離心收集沉淀，并將其懸浮在3升的0.3M氯化鈉的水溶液中，然后離心并洗滌。在重復(fù)三次洗滌過程后，向沉淀中加入1升4M氯化鈉的水溶液。在充分?jǐn)嚢韬螅尤胍掖际怪疂舛冗_(dá)到80％。然后將混合物攪拌、離心以得到沉淀。將沉淀懸浮在80％乙醇中并離心。重復(fù)上述過程，直到上清液在260nm的吸收率為0。將沉淀溶解在3升的2M氯化鈉的水溶液中。在通過離心除去不溶解的物質(zhì)后，將其加入到用2M氯化鈉水溶液平衡的100ml DEAE-Cellulofine A-800柱(由生化學(xué)工業(yè)社制造)中并攪拌，接下來，通過過濾除去加入的樹脂。將濾液加入到用2M氯化鈉水溶液平衡的100ml DEAE-Cellulofine A-800柱中，并使用具有100,000或更低的排阻分子量的中空纖維的超濾器將未吸收的組分超濾以完全除去著色物質(zhì)和氯化鈉。接下來，通過離心和過濾除去不溶物質(zhì)，然后進(jìn)行冷凍干燥。凍干的含硫酸巖藻糖多糖混合物的重量為52g。
實施例3昆布中的含硫酸巖藻糖多糖混合物的提取用自由粉碎機(jī)(由奈良機(jī)械制作所)將2kg徹底干燥的昆布研成粉末。將獲得的干燥粉末懸浮在9升的80％乙醇中，并在80℃下處理2小時。然后將混合物通過濾紙過濾得到殘留物，將殘留物按照與上述過程相同的方法用乙醇重復(fù)洗滌和過濾三次，因此得到用乙醇洗滌后殘留物。將殘留物懸浮在36升的0.2M乙酸鈣溶液中，并在95℃下處理2小時，然后過濾。用4升的0.2M乙酸鈣溶液洗滌，得到了36升包含來源于昆布的含硫酸巖藻糖多糖的提取物。
實施例4昆布中的含硫酸巖藻糖多糖混合物的制備向?qū)嵤├?中獲得的濾液中加入5％氯化十六烷基吡啶鎓鹽，直到不再產(chǎn)生沉淀為止。然后通過離心收集沉淀，并將其懸浮在3升的0.3M氯化鈉的水溶液中，然后離心并洗滌。在重復(fù)三次洗滌過程后，向沉淀中加入1升4M氯化鈉的水溶液。在充分?jǐn)嚢韬?，加入乙醇使之濃度達(dá)到80％。然后將混合物攪拌、離心以得到沉淀。將沉淀懸浮在80％乙醇中并離心。重復(fù)上述過程，直到上清液在260nm的吸收率為0。將沉淀溶解在3升的2M氯化鈉的水溶液中。在通過離心除去不溶解的物質(zhì)后，將其加入到用2M氯化鈉水溶液平衡的100ml DEAE-Cellulofine A-800柱(由生化學(xué)工業(yè)社制造)中并攪拌，接下來，通過過濾除去加入的樹脂。將濾液加入到用2M氯化鈉水溶液平衡的100ml DEAE-Cellulofine A-800柱中，并使用具有100,000或更低的排阻分子量的中空纖維的超濾器將未吸收的組分超濾以完全除去著色物質(zhì)和氯化鈉。接下來，通過離心和過濾除去不溶物質(zhì)，然后進(jìn)行冷凍干燥。凍干的含硫酸巖藻糖多糖混合物的重量為52g。此含硫酸巖藻糖多糖混合物中不含任何被多糖樹脂吸附的著色物質(zhì)。
實施例5從實施例4中所描述的冷凍干燥的含硫酸巖藻糖多糖混合物中稱量出4份(每份1g)，將其分別溶于水、0.2M氯化鈉、0.2M氯化鈣和0.2M氯化鎂中。接下來，制備體積為500ml的四個DEAE-Sepharose FF柱。在這些柱中，其中有兩個用0.2M氯化鈉平衡，而其它的兩個分別用0.2M氯化鈣和0.2M氯化鎂平衡。將用0.2M氯化鈉平衡一個柱用10倍于柱體積的水洗滌。接下來，溶解在水、氯化鈉、氯化鈣和氯化鎂中的含硫酸巖藻糖多糖混合物樣品分別加入用水、氯化鈉、氯化鈣和氯化鎂平衡的DEAE-Sepharose FF柱中。然后，將每一個柱用平衡時使用的溶液徹底洗滌，并且用0-4M的氯化鈉的梯度洗脫來展開。結(jié)果，只有使用氯化鈣和氯化鎂的系統(tǒng)的柱吸附了全部含硫酸巖藻糖多糖混合物。另一方面，用水和氯化鈉平衡的柱只吸附了少量的(0.4g)含硫酸巖藻糖多糖。
在每一個柱中，實質(zhì)上將本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-F與含硫酸巖藻糖多糖-U進(jìn)行了分離。
實施例6用自由粉碎機(jī)(由奈良機(jī)械制作所)將2kg徹底干燥的Kjellmaniellacrassifolia研成粉末。將獲得的干燥粉末懸浮在9升的80％乙醇中，并在80℃下處理2小時。然后將混合物通過濾紙過濾得到殘留物，將殘留物按照與上述過程相同的方法用乙醇重復(fù)洗滌和過濾三次，因此得到用乙醇洗滌后殘留物。將殘留物懸浮在36升的0.2M乙酸鈣溶液中，并在95℃下處理2小時，然后過濾。然后用4升的0.2M乙酸鈣溶液洗滌，因此得到36升包含來源于Kjellmaniella crassifolia的含硫酸巖藻糖多糖的提取物。
使用具有100,000或更低的排阻分子量膜的超濾器將濾液濃縮至2升。接下來，向其中加入氯化鈉以使最終濃度達(dá)到1.5M。此外，向其中加入5％氯化十六烷基吡啶鎓鹽，直到不再產(chǎn)生沉淀為止。然后通過離心收集沉淀，并將所獲得的上清液通過超濾濃縮至1升。在加入4升的乙醇后，通過離心收集所得的沉淀。向沉淀中加入100ml的4M氯化鈉水溶液，然后充分?jǐn)嚢?。向混合物中加入乙醇使之濃度達(dá)到80％。然后將混合物攪拌、離心。將獲得的沉淀懸浮在80％乙醇中并離心。重復(fù)上述過程，直到上清液在260nm的吸收率為0。將沉淀溶解在2升的2M氯化鈉的水溶液中。在通過離心除去不溶解的物質(zhì)后，將其加入到用2M氯化鈉水溶液平衡的50ml DEAE-Cellulofine A-800柱(由生化學(xué)工業(yè)社制造)中并攪拌，接下來，通過過濾除去加入的樹脂。將濾液加入到用2M氯化鈉水溶液平衡的100ml DEAE-Cellulofine A-800柱中，并將未吸收的組分通過使用具有100,000或更低的中空纖維排阻分子量的超濾器超濾以完全除去著色物質(zhì)和氯化鈉。接下來，通過離心和過濾除去不溶物質(zhì)，然后進(jìn)行冷凍干燥。凍干的含硫酸巖藻糖多糖-U的重量為15g。本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖-U不含有任何被多糖樹脂吸附的著色物質(zhì)。
當(dāng)使用上述的內(nèi)-巖藻依聚糖分解酶處理時，含硫酸巖藻糖多糖-U降解成為上述化學(xué)式(I)、(II)和(III)所代表的低聚糖。
實施例7用自由粉碎機(jī)(由奈良機(jī)械制作所)將2kg徹底干燥的Kjellmaniellacrassifolia研成粉末。將獲得的干燥粉末懸浮在9升的80％乙醇中，并在80℃下處理2小時。然后將混合物通過濾紙過濾得到殘留物，將殘留物按照與上述過程相同的方法用乙醇重復(fù)洗滌和過濾三次，因此得到用乙醇洗滌后殘留物。將殘留物懸浮在36升的0.2M乙酸鈣溶液中，并在95℃下處理2小時，然后過濾。然后用4升的0.2M乙酸鈣溶液洗滌，因此得到36升包含來源于Kjellmaniella crassifolia的含硫酸巖藻糖多糖的提取物。向所得的濾液中加入5％氯化十六烷基吡啶鎓鹽，直到不再產(chǎn)生沉淀為止。然后通過離心收集沉淀，并將其懸浮在3升的0.4M氯化鈉的水溶液中，然后離心并洗滌。在重復(fù)三次洗滌過程后，向沉淀中加入1升4M氯化鈉的水溶液，并充分?jǐn)嚢?。向所得的混合物中加入乙醇使之濃度達(dá)到80％，并將混合物攪拌、離心以得到沉淀。將所得的沉淀懸浮在80％乙醇中并離心。重復(fù)上述過程，直到上清液在260nm的吸收率為0。將沉淀溶解在3升的2M氯化鈉的水溶液中。在通過離心除去不溶解的物質(zhì)后，將其加入到用2M氯化鈉水溶液平衡的100ml DEAE-Cellulofine A-800柱(由生化學(xué)工業(yè)社制造)中并攪拌。接下來，通過過濾除去加入的樹脂。將濾液加入到用2M氯化鈉水溶液平衡的100ml DEAE-Cellulofine A-800柱中，并使用具有100,000或更低的排阻分子量的中空纖維的超濾器將未吸收的組分超濾以完全除去著色物質(zhì)和氯化鈉。接下來，通過離心和過濾除去不溶物質(zhì)，然后進(jìn)行冷凍干燥。凍干的含硫酸巖藻糖多糖混合物的重量為90g。得到的含硫酸巖藻糖多糖混合物不含有任何被多糖樹脂吸附的著色物質(zhì)。所得的冷凍干燥的含硫酸巖藻糖多糖混合物中稱量出7g，然后將其溶于0.2M氯化鈣中。然后用0.2M氯化鈣平衡4000ml的DEAE-Sepharose FF柱。將溶解在0.2M氯化鈣中的含硫酸巖藻糖多糖混合物加入到DEAE-Sepharose FF柱中，并用0.2M氯化鈣溶液徹底洗滌。接下來，用0-4M的氯化鈉的線型梯度洗脫來展開。在這樣洗脫的組分中，將那些具有0.05至0.8M濃度的氯化鈉組分組合，并通過透析來脫鹽，然后冷凍干燥。這樣實質(zhì)上得到與含硫酸巖藻糖多糖-F分離的2.1g含硫酸巖藻糖多糖-U。
在上述洗脫的組分中，將那些具有0.9至1.5M濃度的氯化鈉組分組合，并通過透析來脫鹽，然后冷凍干燥。這樣實質(zhì)上得到與含硫酸巖藻糖多糖-U分離的4.7g含硫酸巖藻糖多糖-F。
實施例8含硫酸巖藻糖多糖-F的制備
從實施例7中所獲得的含硫酸巖藻糖多糖混合物稱量出1.2g，并將其溶解在1.5M氯化鈉溶液中，使之終濃度為0.2％。接下來，向其中加入溶解在1.5M氯化鈉溶液中的1.25％氯化十六烷基吡啶鎓鹽，直到不再產(chǎn)生沉淀為止。然后通過離心收集沉淀，并將其懸浮在500ml的1.5M氯化鈉的水溶液中，然后離心并洗滌。在重復(fù)三次洗滌過程后，向沉淀中加入1升4M氯化鈉的水溶液，并將混合物充分?jǐn)嚢?。向所得的混合物中加入乙醇使之濃度達(dá)到80％，并將混合物攪拌、離心以得到沉淀。將所得的沉淀懸浮在80％乙醇中并離心。重復(fù)上述過程，直到上清液在260nm的吸收率為0。將沉淀溶解在500ml的2M氯化鈉的水溶液中。在通過離心除去不溶解的物質(zhì)后，將其加入到用2M氯化鈉水溶液平衡的1ml DEAE-Cellulofine A-800柱(由生化學(xué)工業(yè)社制造)中并攪拌。接下來，通過過濾除去加入的樹脂。將濾液加入到用2M氯化鈉水溶液平衡的100ml DEAE-Cellulofine A-800柱中，并使用具有100,000或更低的排阻分子量的中空纖維的超濾器將未吸收的組分超濾以完全除去著色物質(zhì)和氯化鈉。接下來，通過離心和過濾除去不溶物質(zhì)，然后進(jìn)行冷凍干燥。凍干的含硫酸巖藻糖多糖-F的重量為710mg。得到的含硫酸巖藻糖多糖-F不含有任何被多糖樹脂吸附的著色物質(zhì)。這種含硫酸巖藻糖多糖-F就是本發(fā)明的不含糖醛酸并含有巖藻糖作為組成糖的主要組分的含硫酸巖藻糖多糖-F。
實施例9用酶促純化含硫酸巖藻糖多糖-F的方法從在實施例7中所獲得的含硫酸巖藻糖多糖混合物稱量出10g，并溶解在500ml的人工海水中。接下來，向其中加入5U上述來源于黃桿菌Flavobacterium sp.SA-0082(FERM BP-5402)內(nèi)-巖藻依聚糖分解酶，并在25℃下反應(yīng)50小時。并使用具有100,000或更低的排阻分子量的中空纖維的超濾器將反應(yīng)混合物進(jìn)行超濾。在完全除去低分子量物質(zhì)后，通過離心和過濾除去不溶物質(zhì)，然后進(jìn)行冷凍干燥。凍干的含硫酸巖藻糖多糖-F的重量為6g。得到的含硫酸巖藻糖多糖-F不含有任何被多糖樹脂吸附的著色物質(zhì)。發(fā)現(xiàn)這種含硫酸巖藻糖多糖-F就是本發(fā)明的不含糖醛酸并含有巖藻糖作為組成糖的主要組分的含硫酸巖藻糖多糖-F。
實施例10
用培養(yǎng)性純化含硫酸巖藻糖多糖-F的方法從在實施例7中所獲得的含硫酸巖藻糖多糖混合物稱量出60g，并溶解在20升的人工海水中。接下來，向其中加入200g蛋白胨和4g酵母提取物。在將其加入到30升的發(fā)酵罐并滅菌后，用上述的黃桿菌Flavobacteriumsp.SA-0082(FERM BP-5402)接種，并在25℃下培養(yǎng)24小時。通過離心除去細(xì)胞后，使用具有100,000或更低的排阻分子量的中空纖維的超濾器將培養(yǎng)基進(jìn)行超濾。在完全除去低分子量物質(zhì)后，通過離心和過濾除去不溶物質(zhì)，然后進(jìn)行冷凍干燥。凍干的含硫酸巖藻糖多糖-F的重量為36g。得到的含硫酸巖藻糖多糖-F不含有任何被多糖樹脂吸附的著色物質(zhì)。發(fā)現(xiàn)這種含硫酸巖藻糖多糖-F就是本發(fā)明的不含糖醛酸并含有巖藻糖作為組成糖的主要組分的含硫酸巖藻糖多糖-F。
實施例11從實施例7中所描述的冷凍干燥的含硫酸巖藻糖多糖混合物中稱量出4份(每份1g)，將其分別溶于水、0.2M氯化鈉、0.2M氯化鈣和0.2M氯化鎂中。接下來，制備體積為500ml的四個DEAE-Sepharose FF柱。在這些柱中，其中有兩個用0.2M氯化鈉平衡，而其它的兩個分別用0.2M氯化鈣和0.2M氯化鎂平衡。將用0.2M氯化鈉平衡一個柱用10倍于柱體積的水洗滌。接下來，將溶解在水、氯化鈉、氯化鈣和氯化鎂中的含硫酸巖藻糖多糖混合物樣品分別加入用水、氯化鈉、氯化鈣和氯化鎂平衡的DEAE-Sepharose FF柱中。然后，將每一個柱用平衡時使用的溶液徹底洗滌，并且用0-4M的氯化鈉的線型梯度洗脫來展開。結(jié)果，只有使用氯化鈣和氯化鎂的系統(tǒng)的柱吸附了全部硫酸巖藻糖多糖混合物。另一方面，用水和氯化鈉平衡的柱只吸附了少量的(0.4g)含硫酸巖藻糖多糖。
在每一個柱中，實質(zhì)上含硫酸巖藻糖多糖-U與含硫酸巖藻糖多糖-F得到分離。
實施例12從在實施例7中所獲得的含硫酸巖藻糖多糖混合物稱量出7g，并溶解在800ml的0.2M氯化鈣中。接下來，用0.2M氯化鈣平衡4升的DEAE-Sepharose FF柱，將上述的含硫酸巖藻糖多糖的全部溶液加入到柱中。在用8升的0.2M氯化鈣洗滌后，通過用0-4M的氯化鈉的線型梯度洗脫來展開。在這樣洗脫組分中，將檢測到了含有糖醛酸的組分(氯化鈉濃度大約0.9M或更低，含硫酸巖藻糖多糖-U)和不含有糖醛酸的組分(氯化鈉濃度大約1.2M，含硫酸巖藻糖多糖-F)分別脫鹽并冷凍干燥。這樣，分別獲得了1.4g和4.8g的干燥制品。
實施例13將實施例1中所獲得的含硫酸巖藻糖多糖混合物用黃桿菌Flavobacterium sp.SA-0082(FERM BP-5402)產(chǎn)生的內(nèi)-巖藻依聚糖分解酶處理。成了具有下列結(jié)構(gòu)的低聚糖
和

本發(fā)明人進(jìn)行了下面所述的酶促反應(yīng)，并且獲得了上述的低聚糖。
也就是說，將80ml 2.5％的實施例1的含硫酸巖藻糖多糖混合物的溶液、60ml的50mM磷酸鹽緩沖液溶液(pH7.5)、20ml 4M氯化鈉和40ml的32mU/ml內(nèi)-巖藻依聚糖分解酶溶液混合，并且在25℃下反應(yīng)48小時。
然后，將反應(yīng)混合物通過使用Cellulofine GCL-300柱(由生化學(xué)工業(yè)社制造)進(jìn)行分子量分級分離，并將分子量為2,000或更小的組分組合。在使用Micro Acilyzer G3脫鹽后，通過使用DEAE-Sepharose FF將其分成三個組分，然后再一次脫鹽并冷凍干燥。這樣，分別獲得了250mg、310mg和52mg上述化學(xué)式(I)、(II)和(III)代表的低聚糖。
實施例14將10g在實施例1獲得的含硫酸巖藻糖多糖混合物溶解在500ml 0.2M檸檬酸中，并將所得溶液的pH值調(diào)整到2.9。然后在100℃下處理3小時。在所得的水解產(chǎn)物中加入150ml 1M乙酸鈣溶液。在通過離心除去所形成的沉淀后，通過凝膠過濾使用Cellulofine GCL-25(分子量＞5,000、5,000-3,000、3,000-2,000、2,000-1,000、1,000-500、＜500)。按照分子量由高到低的順序?qū)⑺@得的組分命名為GFd-Oli-1、Gfd-Oli-2、GFd-Oli-3、GFd-Oli-4、GFd-Oli-5和GFd-Oli-6。將這六個組分都進(jìn)行脫鹽和冷凍干燥。這樣，分別獲得了2.3g、1.7g、0.88g、1.8g、1.4g和0.72g的干燥制品。
實施例15從實施例1中所獲得的含硫酸巖藻糖多糖混合物中稱量出60g，并溶解在20升的人工海水中。接下來，向其中加入200g蛋白胨和4g酵母提取物。在將其加入到30升的發(fā)酵罐并滅菌后，用黃桿菌Flavobacterium sp.SA-0082(FERM BP-5402)接種，并在25℃下培養(yǎng)24小時。通過離心除去菌體后，使用具有100,000或更低的排阻分子量的中空纖維的超濾器將培養(yǎng)基超濾。在完全除去低分子量物質(zhì)后，通過離心和過濾除去不溶物質(zhì)，然后進(jìn)行冷凍干燥。凍干的含硫酸巖藻糖多糖-F的重量為36g。
實施例16將5kg的刺參Stichopus japonicus切開。然后除去內(nèi)臟并收集體壁。在200g濕體壁中加入500ml丙酮。在使用勻漿器處理后，將混合物過濾，用丙酮洗滌殘留物直到完全除去著色物質(zhì)物質(zhì)。然后將殘留物抽吸過濾得到140g的干燥產(chǎn)物。將所得的干燥產(chǎn)物溶解在2.8升的0.4M氯化鈉水溶液中。在100℃下處理1小時后，將混合物過濾，并用0.4M氯化鈉水溶液徹底洗滌殘留物。這樣得到了3.7升的提取物。向所得的提取物中加入5％氯化十六烷基吡啶鎓鹽，直到不再產(chǎn)生沉淀為止。然后通過離心收集沉淀，并將所獲得的沉淀再次懸浮在0.4M氯化鈉水溶液中并離心。將所得的沉淀加入1升4M氯化鈉水溶液中，并使用勻漿器處理所得的混合物。在攪拌的條件下加入4升乙醇，在攪拌1小時后，將混合物過濾，因此得到沉淀。將獲得的沉淀懸浮在80％乙醇中并離心。重復(fù)上述過程，直到上清液在260nm的吸收率為0。將沉淀懸浮在2升的2M氯化鈉的水溶液中，并通過離心除去不溶解的物質(zhì)。使用具有30,000排阻分子量的超濾器超濾將上清液完全脫鹽。在冷凍干燥后，獲得了3.7g的含硫酸巖藻糖多糖。
實施例17用自由粉碎機(jī)(由奈良機(jī)械制作所)將2kg徹底干燥的墨角藻研成粉末。將獲得的干燥粉末懸浮在9升的80％乙醇中，并在80℃下處理2小時。然后將混合物通過濾紙過濾得到殘留物，將殘留物按照與上述過程相同的方法用乙醇重復(fù)洗滌和過濾三次，因此得到用乙醇洗滌后殘留物。將殘留物懸浮在40升水中，并在100℃下處理2小時，然后過濾。將過濾物加入氯化鈉，使其濃度為0.5M。此外，所得的溶液中加入5％氯化十六烷基吡啶鎓鹽，直到不再產(chǎn)生沉淀為止。然后通過離心收集沉淀，并將其懸浮在3升的0.4M氯化鈉的水溶液中，然后離心并洗滌。在重復(fù)三次洗滌過程后，向沉淀中加入250g的氯化鈉，并將其懸浮在3升的乙醇中。然后將懸液離心以得到沉淀。將所得的沉淀懸浮在80％乙醇中并離心。重復(fù)上述過程，直到上清液在260nm的吸收率為0。將沉淀溶解在3升的2M氯化鈉的水溶液中。在通過離心除去不溶解的物質(zhì)后，將其加入到用2M氯化鈉水溶液平衡的100ml DEAE-Cellulofine A-800柱(由生化學(xué)工業(yè)社制造)中并攪拌。接下來，通過過濾除去加入的樹脂。將濾液加入到用2M氯化鈉水溶液平衡的100ml DEAE-Cellulofine A-800柱中，并使用具有100,000或更低的排阻分子量的中空纖維的超濾器將未吸收的組分超濾以完全除去著色物質(zhì)和氯化鈉。接下來，通過離心和過濾除去不溶物質(zhì)，然后進(jìn)行冷凍干燥。凍干的含硫酸巖藻糖多糖混合物的重量為92g。
實施例18用自由粉碎機(jī)(由奈良機(jī)械制作所)將2kg徹底干燥的裙帶菜Undariapinnatifida研成粉末。將獲得的干燥粉末懸浮在9升乙醇中，并在75℃下處理1小時。然后將混合物通過濾紙過濾得到殘留物，向殘留物中加入9升80％的乙醇，并將混合物攪拌，然后在80℃下處理1小時，其后，將混合物通過濾紙過濾得到殘留物。將殘留物按照與上述過程相同的方法用乙醇重復(fù)洗滌和過濾三次，因此得到1,908g的用乙醇洗滌后的殘留物。將684g殘留物懸浮在9升的0.2M乙酸鈣溶液中，并在95℃下處理1小時。在放置24小時后得到了上清液。將通過除去上清液所獲得的沉淀加入9升的0.2M乙酸鈣溶液，并把所得的混合物攪拌，然后放置1小時以得到上清液。將所得的上清液和上述獲得的上清液組合。其后，使用具有100,00或更低的排阻分子量的中空纖維的超濾器將所得的組分超濾，并且濃縮到350ml。然后將濃縮物離心。在除去沉淀后，加入2mM氯化鈉進(jìn)行超濾。在完全除去乙酸鈣后，將殘留物冷凍干燥，因此得到了3.2g的凍干產(chǎn)物。此凍干產(chǎn)物中含有3.1g含硫酸巖藻糖多糖。
實施例19(1)Kjellmaniella crassifolia含硫酸巖藻糖多糖的混合物的制備用自由粉碎機(jī)(由奈良機(jī)械制作所)將2kg徹底干燥的Kjellmaniellacrassifolia研成粉末。在80℃下將獲得的干燥粉末用4.5倍的80％乙醇處理2小時，然后過濾。將獲得的殘留物按照與上述過程相同的方法用80％乙醇重復(fù)洗滌和過濾三次，因此得到1870g的用乙醇洗滌后的殘留物。將36升水中加入到殘留物，并將混合物在100℃下處理2小時以得到提取物。將提取物的鹽濃度調(diào)節(jié)到與400mM氯化鈉溶液相同的水平。向所得的濾液中加入5％氯化十六烷基吡啶鎓鹽，直到不再產(chǎn)生沉淀為止。離心后，將沉淀再次用80％乙醇洗滌以完全除去氯化十六烷基吡啶鎓鹽。接下來，將其溶解在3升的2M氯化鈉溶液中。在通過離心除去不溶解的物質(zhì)后，將其懸浮在用2M氯化鈉水溶液平衡的100ml DEAE-Cellulofine A-800柱中。將此懸液攪拌，然后過濾以除去樹脂。將濾液加入到用2M氯化鈉水溶液平衡的100ml DEAE-Cellulofine A-800柱中，將流出的組分脫鹽，并通過使用超濾器(膜的排阻分子量100,000)除去低分子量物質(zhì)。通過離心除去所得的沉淀。將上清液冷凍干燥，因此，得到了82.2g的純化的Kjellmaniellacrassifolia含硫酸巖藻糖多糖的混合物。
(2)含硫酸巖藻糖多糖-F的制備將6g上述的來源于Kjellmaniella crassifolia的含硫酸巖藻糖多糖混合物溶于600ml含有0.2M氯化鈣的20mM的乙酸鈉(pH 6.0)中。然后，先將此溶液加入到預(yù)先用含有0.2M氯化鈣的20mM的乙酸鈉(pH 6.0)平衡的3600ml DEAE-Sepharose FF柱中，并通過使用0-2M的氯化鈉的線型梯度洗脫來展開。收集在0.75M或更高氯化鈉濃度洗脫的含硫酸巖藻糖多糖-F組分，并通過使用具有10000排阻分子量的超濾膜的超濾器進(jìn)行濃縮脫鹽。在冷凍干燥后，得到了3.3g的含硫酸巖藻糖多糖-F的凍干制劑。
(3)含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶的制備將Alteromonas sp.SN-1009(FERM BP-5747)接種到600ml的含有人工海水(pH8.2，Jamarin實驗室制造)的600ml培養(yǎng)基中，其中在人工海水中含有0.25％的葡萄糖、1.0％的蛋白胨和已經(jīng)轉(zhuǎn)移到2升錐形瓶并滅菌(120℃，20分鐘)的0.05％酵母提取物。然后，在25℃將菌株培養(yǎng)25小時以得到種培養(yǎng)物。在一個30升的發(fā)酵罐中加入18升含有200g蛋白胨、4g酵母提取物和4ml的脫泡劑(KM70，由信越化學(xué)工業(yè)制造)的人工海水(pH8.0)的培養(yǎng)基，并在120℃滅菌20分鐘。在冷卻后，將培養(yǎng)基用20g的用實施例8的方法制備的Kjellmaniella crassifolia的含硫酸巖藻糖多糖-F(已經(jīng)分別溶于2升的在120℃滅菌15分鐘的人工海水中)和600ml上述的種子培養(yǎng)物接種，然后以10l/分鐘的速率充氣和125rpm攪拌，在24℃下將其培養(yǎng)24小時。在培養(yǎng)完成后，將培養(yǎng)基離心以得到菌體和培養(yǎng)物上清液。
當(dāng)使用含硫酸巖藻糖多糖-F作為底物進(jìn)行測量時，培養(yǎng)上清液顯示出具有5mU/ml培養(yǎng)基的本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖降解酶的活性。
將所得的培養(yǎng)物上清液用具有10,000分級分子量的超濾器濃縮，并且通過離心除去形成的沉淀。然后使用85％硫酸銨鹽析。將所得的沉淀進(jìn)行離心，并用含有稀釋了10倍的人工海水(Jamarin S)的20mM Tris鹽酸緩沖液(pH 8.2)徹底透析。這樣就得到了400ml酶的粗提物。
通過用含有5mM疊氮化鈉和稀釋10倍的人工海水(Jamarin S)的20mM Tris鹽酸緩沖液(pH 8.2)平衡的DEAE-Cellulofine A-800柱(由生化學(xué)工業(yè)社制造)吸附所得的酶粗提物溶液。然后使用同一緩沖液徹底洗滌所吸附的物質(zhì)，并使用含有100mM、200mM、300mM、400mM和600mM氯化鈉的溶液洗脫到同一緩沖液中。將活性組分組合。
當(dāng)通過使用含硫酸巖藻糖多糖-F作為底物測量時，部分純化的酶顯示出10,200mU(10.2U)的活性。所說的酶中不含有其它的含硫酸巖藻糖多糖降解酶。
將所得的部分純化的酶使用Sephacryl S-200進(jìn)行凝膠過濾，所使用的Sephacryl S-200是用含有5mM疊氮化鈉和稀釋10倍的人工海水(JamarinS)的10mM Tris鹽酸緩沖液(pH 8.0)平衡的。這樣測定的此酶的分子量大約為100,000。
(4)通過分別使用上述獲得的部分純化的酶和PA-FF作為酶源和底物，測定了鈣濃度對此酶活性的影響。
在酶促反應(yīng)中，使用了含有50mM乙酸、咪唑和Tris鹽酸的緩沖液(pH7)。在反應(yīng)混合物中，加入氯化鈉以使其之終濃度為400mM。
當(dāng)把反應(yīng)混合物中的氯化鈣濃度從0變化至100mM時，測量了酶活性。圖23中顯示了所得的結(jié)果，其中縱坐標(biāo)代表相對活性(％)，而橫坐標(biāo)代表反應(yīng)混合物中的鈣濃度(mM)。
因此表明所說的酶的活性在鈣鹽存在下有很大的提高。
(5)在5℃下將本發(fā)明的含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶在用下面詳細(xì)說明的六種緩沖液透析保存20小時后，測量了此酶的剩余活性。
1.20mM Tris鹽酸緩沖液(pH 8.2)。
2.含有5mM疊氮化鈉的20mM Tris鹽酸緩沖液(pH 8.2)。
3.含有5mM疊氮化鈉和50mM氯化鈉的20mM Tris鹽酸緩沖液(pH 8.2)。
4.含有5mM疊氮化鈉和500mM氯化鈉的20mM Tris鹽酸緩沖液(pH 8.2)。
5.含有5mM疊氮化鈉、50mM氯化鈉和10mM氯化鈣的20mM Tris鹽酸緩沖液(pH 8.2)。
6.含有5mM疊氮化鈉和稀釋10倍的人工海水(Jamarin S)的20mMTris鹽酸緩沖液(pH 8.2)。
結(jié)果，當(dāng)使用緩沖液1、2和3透析時，本發(fā)明的含硫酸巖藻糖多糖降解酶失活；而使用緩沖液4、5和6透析時，所說的酶仍然保持活性。
基于這些結(jié)果，表明此酶在500mM氯化鈉或10mM鈣離子存在下穩(wěn)定。
(6)稱量出5g上述實施例制備的含硫酸巖藻糖多糖-F，并將其與471ml50mM咪唑緩沖液(pH 8)、12.5ml 4M氯化鈉、6.25ml 4M氯化鈣和10ml(相當(dāng)于6mU)實施例19-(3)中獲得的本發(fā)明部分純化的含硫酸巖藻糖多糖降解酶混合。在25℃下反應(yīng)120小時后，得到含硫酸巖藻糖多糖-F的小分子降解產(chǎn)物。
圖25和26分別顯示出上面得到的降解產(chǎn)物的IR和NMR分析數(shù)據(jù)。圖24顯示出Cellulofine GCL-300的凝膠過濾結(jié)果。也就是說，表明此物質(zhì)分子量分布為1,000至30,000。
此物質(zhì)包含46％硫酸根(按照SO4計算，分子量96)，并且表現(xiàn)出含有中性糖類組分的巖藻糖和半乳糖(100∶4)。
在圖24至26的每個圖中，縱坐標(biāo)和橫坐標(biāo)的意義分別與在圖2至4中的意義相同。
實施例20將人類前髓細(xì)胞的白血病細(xì)胞HL-60(ATCC CRL-1964)培養(yǎng)在含有10％胎牛血清(由JRH Bioscience制造)的RPMI 1640培養(yǎng)基中(由Gibco制造)(所說的胎牛血清在56℃下處理30分鐘)，然后懸浮在ASF104培養(yǎng)基(由味之素有限公司制造)中，使最終濃度為5×105細(xì)胞/9ml。向四份9ml的這種懸液中加入實施例1、12和15中獲得的溶解在生理鹽水中的1ml 5mg/ml含硫酸巖藻糖多糖的溶液中，所說的多糖已經(jīng)通過乙酸纖維素濾膜(孔大小為0.20μm，由Corning制造；在接下來的濾膜處理中使用同樣的濾膜)過濾處理，在5％的CO2存在下，37℃下溫育40小時后通過離心從上清液中分離細(xì)胞。將所獲得的細(xì)胞懸浮在20μl 50mM Tris鹽酸緩沖液(pH 7.8)中，所說的緩沖液含有10mM乙二胺四乙酸鹽和0.5％的月桂酰肌氨酸鈉。然后加入1μl的10mg/ml的核糖核酸酶A(由Sigma制造)，在50℃下將混合物處理30分鐘。加入1μl濃度為10mg/ml蛋白酶K后，50℃下處理混合物1小時。將所處理的細(xì)胞作為樣品，100V恒壓下，在2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行凝膠電泳。將此凝膠浸沒在溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓溶液中30分鐘，然后通過使用透照器檢測凝膠中的DNA狀態(tài)。結(jié)果觀察到了代表細(xì)胞凋亡的DNA梯度。為了進(jìn)一步證實，使用10μg/ml的放線菌素D(被認(rèn)為是誘導(dǎo)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的試劑)溶液代替含硫酸巖藻糖多糖來重復(fù)上述的過程。結(jié)果，在溫育20小時后觀察到與含硫酸巖藻糖多糖所得的結(jié)果相似的DNA梯度。
基于這些結(jié)果，說明可以通過實施例1、12和15獲得的含硫酸巖藻糖多糖來誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。
將在實施例1、12和15中所獲得的含硫酸巖藻糖多糖分別溶解在含有120mM氯化鈉的30mM Hepes緩沖液(pH 7.2)中，以便使其濃度達(dá)到5mg/ml，并在121℃下在高壓滅菌器中處理20分鐘。然后以與上述相同的方式檢測這些含硫酸巖藻糖多糖對HL-60細(xì)胞(ATCC CCL-240)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。獲得了相同的結(jié)果。
實施例21將人類前髓細(xì)胞的白血病細(xì)胞HL-60(ATCC CRL-1964)培養(yǎng)在含有10％胎牛血清(由JRH Bioscience制造)的RPMI 1640培養(yǎng)基(由Gibco制造)中(所說的胎牛血清在56℃下處理30分鐘)，然后懸浮在ASF104培養(yǎng)基(由味之素有限公司制造)中，使最終濃度為5×105細(xì)胞/9ml。向9ml的這種懸液中加入實施例15中獲得的溶解在生理鹽水中的1ml 5mg/ml含硫酸巖藻糖多糖的溶液中，所說的多糖溶液已經(jīng)通過濾膜處理。在5％的CO2存在下，37℃下溫育20小時后通過離心從上清液中分離細(xì)胞。將所獲得的細(xì)胞按照《細(xì)胞凋亡實驗通則》(Apoptosis實驗Protocol)(秀潤社，田沼靖一主編，93-95，1995)中所描述的方法進(jìn)行Giemsa染色。也就是說，使用Carnoy固定液(乙酸∶甲醇＝1∶3)將所獲得的細(xì)胞固定在載玻片上，用Giemsa染料(由Merck公司制造)染色，并在光學(xué)顯微鏡下觀察。這樣，觀察到了細(xì)胞凋亡的特有的核片段。此事實表明實施例15所獲得的含硫酸巖藻糖多糖能誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。
將實施例15中所獲得的含硫酸巖藻糖多糖分別溶解在含有120mM氯化鈉的30mM Hepes緩沖液(pH 7.2)中，以使其濃度達(dá)到5mg/ml，并在121℃下在高壓滅菌器中處理20分鐘。然后以與上述相同的方式檢測這些含硫酸巖藻糖多糖誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。獲得了相同的結(jié)果。
實施例22將人類前髓細(xì)胞的白血病細(xì)胞HL-60(ATCC CRL-240)培養(yǎng)在含有10％胎牛血清(由JRH Bioscience制造)的RPMI 1640培養(yǎng)基(由Gibco制造)中(所說的胎牛血清在56℃下處理30分鐘)，然后懸浮在ASF104培養(yǎng)基(由味之素有限公司制造)中，使最終濃度為5×105細(xì)胞/4.5ml。向四份4.5ml的這種懸液中加入0.5ml的濃度為10mg/ml的實施例1、15和18所獲得的含硫酸巖藻糖多糖的溶液，所說的多糖溶解在含有120mM氯化鈉的30mM Hepes緩沖液(pH 7.2)(此溶液已經(jīng)在121℃下在高壓滅菌器中處理了20分鐘)中。在5％的CO2存在下，37℃下溫育24小時和40小時后，通過錐蟲藍(lán)染色方法計算細(xì)胞。
結(jié)果如圖27所示，此圖顯示出培養(yǎng)時間和HL-60細(xì)胞的培養(yǎng)基中的活細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系，其中所說的培養(yǎng)基中已經(jīng)加入在實施例1、15和18中所獲得的含硫酸巖藻糖多糖，所加入的量使其終濃度為1mg/ml。在此圖中，橫坐標(biāo)代表培養(yǎng)時間(小時)，縱坐標(biāo)代表培養(yǎng)基中的活細(xì)胞數(shù)(×105細(xì)胞/5ml)。在圖27中，空正方形代表對照(未加入所說的多糖)；+代表實施例1所獲得的含硫酸巖藻糖多糖；●代表實施例15中所獲得多糖；×代表實施例18中所獲得的多糖。
在這種情況下，死細(xì)胞顯示出細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征(如細(xì)胞的收縮和斷裂)。也就是說，這些結(jié)果表明實施例1、15和18中獲得含硫酸巖藻糖多糖能夠誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，并且大大抑制了這些細(xì)胞的增殖。
將在實施例1、15和18中所獲得的含硫酸巖藻糖多糖溶解在含有120mM氯化鈉的30mM Hepes緩沖液(pH 7.2)中，使其終濃度為10mg/ml，并用濾膜處理。然后，以與上述相同的方式檢測這些含硫酸巖藻糖多糖誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。得到相同的結(jié)果。
實施例23將人急性淋巴母細(xì)胞性白血病細(xì)胞MOLT-3(ATCC CRL-1552)懸浮在含有10％胎牛血清(由JRH Bioscience制造)的RPMI 1640培養(yǎng)基中(由Gibco制造)(所說的胎牛血清在56℃下處理30分鐘)，使最終濃度為5×105細(xì)胞/9ml。向五份9ml這種懸液中加入1ml實施例1、2、12和16中獲得的溶解在生理鹽水中的5mg/ml含硫酸巖藻糖多糖的溶液中，所說的多糖溶液已經(jīng)通過濾膜處理。在5％的CO2存在下，37℃下溫育60小時后通過離心從上清液中分離細(xì)胞。將所獲得的細(xì)胞懸浮在20μl 50mMTris鹽酸緩沖液(pH 7.8)中，所說的緩沖液含有10mM乙二胺四乙酸鹽和0.5％的月桂酰肌氨酸鈉。然后加入1μl的10mg/ml的核糖核酸酶A(由Sigma制造)，在50℃下將混合物處理30分鐘。加入1μl濃度為10mg/ml蛋白酶K后，在50℃下處理混合物1小時。將所處理的細(xì)胞作為樣品，在100V恒壓下，在2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。將此凝膠浸沒在溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓溶液中30分鐘，然后通過使用透照器檢測凝膠中的DNA狀態(tài)。結(jié)果觀察到了代表細(xì)胞凋亡的DNA梯度。為了進(jìn)一步證實，使用10μg/ml的放線菌素D(被認(rèn)為是誘導(dǎo)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的試劑)溶液代替上述的含硫酸巖藻糖多糖來重復(fù)上述的過程。結(jié)果，在溫育20小時后觀察到與含硫酸巖藻糖多糖所得的結(jié)果相似的DNA梯度。
基于這些結(jié)果，說明可以通過實施例1、2、12和16獲得的含硫酸巖藻糖多糖來誘導(dǎo)MOLT-3細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。
將在實施例1、2、12和16中所獲得的含硫酸巖藻糖多糖分別溶解在PBS(所說的PBS是通過將8g氯化鈉、0.2g氯化鉀、2.9g十二水合磷酸氫二鈉和0.2g磷酸二氫鉀溶解在1升水中而制備的)中，得到終濃度為5mg/ml的多糖溶液，并在121℃下在高壓滅菌器中處理20分鐘。然后以與上述相同的方式檢測這些含硫酸巖藻糖多糖誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。獲得了相同的結(jié)果。
實施例24將人急性淋巴母細(xì)菌性白血病細(xì)胞(ATCC CRL-1552)培養(yǎng)在含有10％胎牛血清(由JRH Bioscience制造)的RPMI 1640培養(yǎng)基(由Gibco制造)中(所說的胎牛血清在56℃下處理30分鐘)，然后懸浮在RPMI 1640培養(yǎng)基中，使最終濃度為5×103細(xì)胞/ml。然后將懸液移到24-孔的平板(由FALCON制造)上，每孔1.8毫升。向所說的懸液中加入0.2ml濃度為0.5mg/ml的實施例1中獲得的含硫酸巖藻糖多糖、實施例12中獲得的含硫酸巖藻糖多糖-F、實施例15和17中獲得的含硫酸巖藻糖多糖及葡聚糖硫酸酯(分子量500,000；由和光純藥社制造)溶液，所說的溶液溶解在PBS中并進(jìn)行滅菌，之后在5％的CO2存在下，37℃下溫育。作為對照，只加入等量的PBS，并以同樣的方式進(jìn)行溫育。在培養(yǎng)起始后的2、4、6和8天，由錐蟲藍(lán)方法計算細(xì)胞。
結(jié)果如圖28所示，此圖顯示出溫育時間和MOLT-3細(xì)胞的培養(yǎng)基中的活細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系，其中所說的培養(yǎng)基中已經(jīng)加入了實施例1中獲得的含硫酸巖藻糖多糖、實施例12中獲得的含硫酸巖藻糖多糖-F、實施例15和17中獲得的含硫酸巖藻糖多糖及葡聚糖硫酸酯，所加入的量使其終濃度為0.5mg/ml。在此圖中，橫坐標(biāo)代表培養(yǎng)時間(天)，縱坐標(biāo)代表培養(yǎng)基中的活細(xì)胞數(shù)(×104細(xì)胞/2ml)。在圖28中，○代表對照(未加入所說的多糖)；●代表實施例12中所獲得含硫酸巖藻糖多糖-F；空正方形代表實施例1所獲得的含硫酸巖藻糖多糖；空三角形代表實施例17中所獲得的多糖，■代表實施例15所獲得的多糖。葡聚糖硫酸酯顯示的曲線實質(zhì)上與使用實施例15所獲得的含硫酸巖藻糖多糖所獲得的曲線相同。
在這種情況下，死細(xì)胞顯示出細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征(如細(xì)胞的收縮和斷裂)。也就是說，這些結(jié)果表明實施例1中獲得的含硫酸巖藻糖多糖、實施例12中獲得的含硫酸巖藻糖多糖-F、實施例15和17中獲得的含硫酸巖藻糖多糖及葡聚糖硫酸酯能夠誘導(dǎo)MOLT-3細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，并且大大抑制了這些細(xì)胞的生長。
將實施例1中獲得的含硫酸巖藻糖多糖、實施例15和17中獲得的含硫酸巖藻糖多糖及葡聚糖硫酸酯(分子量500,000；由和光純藥社制造)分別溶解在PBS中，得到終濃度為5mg/ml的多糖溶液，并在121℃下在高壓滅菌器中處理20分鐘。然后以與上述相同的方式檢測這些多糖誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。獲得了相同的結(jié)果。
實施例2537℃下，將人類前髓細(xì)胞的白血病細(xì)胞HL-60(ATCC CRL-240)培養(yǎng)在含有10％胎牛血清(由JRH Bioscience制造)的RPMI 1640培養(yǎng)基(由Gibco制造)中(所說的胎牛血清在56℃下處理30分鐘)，然后懸浮在ASF104培養(yǎng)基(由味之素有限公司制造)中，使最終濃度為5×104細(xì)胞/900μl。向9份900μl的這種懸液中分別加入100μl的生理鹽水，其中分別含有濃度為10mg/ml的實施例1的含硫酸巖藻糖多糖、F-Fd-1至F-Fd-4和實施例13獲得的三種含硫酸巖藻糖低聚糖的生理鹽水溶液，所說的多糖生理鹽水溶液已經(jīng)用濾膜進(jìn)行了處理。在5％的CO2存在下，37℃下溫育40小時后，在顯微鏡下觀察所說的細(xì)胞，以便檢查細(xì)胞的生長程度和細(xì)胞的形態(tài)。
結(jié)果，加入了含硫酸巖藻糖多糖制劑、F-Fd-1至F-Fd-4、和三種含硫酸巖藻糖低聚糖的HL-60細(xì)胞都顯示出細(xì)胞凋亡的特征(如細(xì)胞收縮和斷裂)。加入了生理鹽水的HL-60細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目增加了大約4倍，而加入了含硫酸巖藻糖多糖制劑、F-Fd-1至F-Fd-4、和三種含硫酸巖藻糖多糖的HL-60細(xì)胞則沒有增加或者降低到原來的1/10或更少。這些結(jié)果表明由于含硫酸巖藻糖多糖制劑、F-Fd-1至F-Fd-4、和三種含硫酸巖藻糖低聚糖的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用而抑制了HL-60細(xì)胞的生長。
為了進(jìn)一步證實，使用10μg/ml的放線菌素D(被認(rèn)為是誘導(dǎo)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的試劑)溶液代替上述的含硫酸巖藻糖多糖來重復(fù)上述的過程。結(jié)果，在溫育20小時后觀察到了與含硫酸巖藻糖多糖所得的結(jié)果相似的細(xì)胞收縮和斷裂。基于這些結(jié)果，說明可以通過含硫酸巖藻糖多糖制劑、F-Fd-1至F-Fd-4、和實施例13中獲得的三種含硫酸巖藻糖低聚糖來誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。
將在實施例1獲得的含硫酸巖藻糖多糖制劑、F-Fd-1至F-Fd-4和實施例13獲得的三種含硫酸巖藻糖低聚糖分別溶解在含有120mM氯化鈉的30mM Hepes緩沖液(pH 7)中，使其終濃度為10mg/ml，并于121℃下在高壓滅菌器中處理20分鐘。然后，以與上述相同的方式檢測它們誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。得到相同的結(jié)果。
實施例26將肺癌細(xì)胞A-549(ATCC CCL-185)、SV40-轉(zhuǎn)化的肺細(xì)胞WI-38VA13(ATCC CCL-75.1)和肝癌細(xì)胞Hep G2(ATCC HE-8065)分別懸浮在含有10％胎牛血清(由JRH Bioscience制造)的RPMI 1640培養(yǎng)基(由Gibco制造)中(所說的胎牛血清在56℃下處理30分鐘)，使最終濃度為104細(xì)胞/1.8ml。向每個細(xì)胞系的1.8ml懸液中加入200μl的生理鹽水和濃度為1mg/ml的實施例1和實施例15獲得的含硫酸巖藻糖多糖、實施例14獲得的六種含有硫酸巖藻糖的低聚糖溶液，所說的多糖溶解在生理鹽水中并已經(jīng)用濾膜進(jìn)行了處理。在5％的CO2存在下，37℃下溫育6天后，在顯微鏡下觀察所說的細(xì)胞，以便檢查細(xì)胞的生長程度和細(xì)胞的形態(tài)。
結(jié)果，加入了實施例1和實施例15獲得的含硫酸巖藻糖多糖、實施例14獲得的六種含有硫酸巖藻糖的低聚糖中的三種分子量為2,000或更多的組分的肺癌細(xì)胞A-549、SV40-轉(zhuǎn)化的肺細(xì)胞WI-38VA13)和肝癌細(xì)胞HepG2都顯示出細(xì)胞凋亡的特征(如細(xì)胞收縮和斷裂)。加入了生理鹽水的癌細(xì)胞系的細(xì)胞數(shù)目明顯增加，而加入了實施例1和實施例15獲得的含硫酸巖藻糖多糖、實施例14獲得的六種含有硫酸巖藻糖的低聚糖中的三種分子量為2,000或更多的組分的那些細(xì)胞每一種的細(xì)胞數(shù)目都降低了。這些結(jié)果表明由于這些含硫酸巖藻糖多糖和低聚糖的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用而抑制了每一種癌細(xì)胞系的生長。
將在實施例1和實施例15獲得的含硫酸巖藻糖多糖、實施例14獲得的六種含有硫酸巖藻糖的低聚糖分別溶解在PBS中，使其終濃度為1mg/ml，并于121℃下在高壓滅菌器中處理20分鐘。然后，以與上述相同的方式檢測它們誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。得到相同的結(jié)果。
實施例27將結(jié)腸癌細(xì)胞HCT 116(ATCC CCL-247)和胃癌細(xì)胞AGS(ATCCCCL-1739)分別懸浮在含有10％胎牛血清(由JRH Bioscience制造)的McCoy 5a培養(yǎng)基(由Gibco制造)和Ham F12培養(yǎng)基(由Gibco制造)中(所說的胎牛血清在56℃下處理30分鐘)，使最終濃度為104細(xì)胞/1.8ml。向每個細(xì)胞系的1.8ml懸液中加入200μl的生理鹽水和濃度為10mg/ml的實施例1、12和15獲得的含硫酸巖藻糖多糖和四種含有硫酸巖藻糖的低聚糖F-Fd-1至F-Fd-4，所說的多糖溶解在生理鹽水中并已經(jīng)用濾膜進(jìn)行了處理。在5％的CO2存在下，37℃下溫育48小時后，在顯微鏡下觀察所說的細(xì)胞，以便檢查細(xì)胞的生長程度和細(xì)胞的形態(tài)。
結(jié)果，加入了實施例1、12和15獲得的含硫酸巖藻糖多糖和四種含有硫酸巖藻糖的低聚糖F-Fd-1至F-Fd-4的結(jié)腸癌細(xì)胞HCT 116和胃癌細(xì)胞AGS都顯示出細(xì)胞凋亡的特征(如細(xì)胞收縮和斷裂)。加入了生理鹽水的癌細(xì)胞系的細(xì)胞數(shù)目明顯增加，而加入了實施例1、12和15獲得的含硫酸巖藻糖多糖和四種含有硫酸巖藻糖的低聚糖F-Fd-1至F-Fd-4的那些細(xì)胞每一種的細(xì)胞數(shù)目都降低了。這些結(jié)果表明由于這些含硫酸巖藻糖多糖和低聚糖的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用而抑制了每一種癌細(xì)胞系的生長。
將在實施例1、12和15獲得的含硫酸巖藻糖多糖和四種含有硫酸巖藻糖的低聚糖F-Fd-1至F-Fd-4分別溶解在PBS中，使其終濃度為10mg/ml，并于121℃下在高壓滅菌器中處理20分鐘。然后，以與上述相同的方式檢測它們誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。得到相同的結(jié)果。
實施例2837℃下將人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT 116培養(yǎng)在含有10％胎牛血清(由JRHBioscience制造)的McCoy 5a培養(yǎng)基(由Gibco制造)中(所說的胎牛血清在56℃下處理30分鐘)，然后懸浮在McCoy 5a培養(yǎng)基中，使最終濃度為5×103細(xì)胞/ml。然后將懸液移到24-孔的平板(由FALCON制造)上，每孔1.8毫升。向所說的懸液中加入0.2ml濃度為10mg/ml的實施例1中獲得的含硫酸巖藻糖多糖制劑和含硫酸巖藻糖多糖的混合物、實施例12獲得的含硫酸巖藻糖多糖-F和含硫酸巖藻糖多糖-U、F-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3和F-Fd-4以及實施例15獲得的含硫酸巖藻糖多糖溶液(所說的溶液溶解在PBS中)、5mg/ml的肝素(由和光純藥社制造)和葡聚糖硫酸酯溶液(分子量500,000，由和光純藥社制造)(這些溶液都已經(jīng)在121℃下在高壓滅菌器中處理20分鐘)，之后在5％的CO2存在下，37℃下溫育。作為對照，只加入等量的PBS，并以同樣的方式進(jìn)行溫育。在培養(yǎng)起始后的1、2、3、4天，按照《組織培養(yǎng)技術(shù)》(第二版)，朝倉出版，由日本組織培養(yǎng)學(xué)會編輯，26-28(1990)描述的方法(也就是說錐蟲藍(lán)染色方法)在計數(shù)室中計算活細(xì)胞數(shù)目。
結(jié)果如圖29所示，此圖顯示出溫育時間和HCT 116細(xì)胞的培養(yǎng)基中的活細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系，其中所說的培養(yǎng)基中已經(jīng)加入了實施例1中獲得的含硫酸巖藻糖多糖制劑和含硫酸巖藻糖多糖的混合物、實施例12獲得的含硫酸巖藻糖多糖-F和含硫酸巖藻糖多糖-U、F-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3和F-Fd-4以及實施例15獲得的含硫酸巖藻糖多糖(濃度均為1mg/ml)，肝素和葡聚糖硫酸酯(兩種的濃度均為0.5mg/ml)。在此圖中，橫坐標(biāo)代表培養(yǎng)時間(天)，縱坐標(biāo)代表培養(yǎng)基中的活細(xì)胞數(shù)(×104細(xì)胞/2ml)。在圖29中，○代表對照(未加入所說的多糖)；●代表實施例1中所獲得含硫酸巖藻糖多糖；■代表實施例1獲得的含硫酸巖藻糖多糖的混合物。實施例12獲得的含硫酸巖藻糖多糖-F和含硫酸巖藻糖多糖-U、F-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3和F-Fd-4以及實施例15獲得的含硫酸巖藻糖多糖顯示的曲線實質(zhì)上與實施例1的含硫酸巖藻糖多糖的混合物的曲線相同。另一方面，肝素和葡聚糖硫酸酯顯示曲線實質(zhì)上與實施例1的含硫酸巖藻糖多糖的曲線相同。
結(jié)果，加入了PBS的HCT 116細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目明顯增加，而加入了實施例1中獲得的含硫酸巖藻糖多糖制劑和實施例1的含硫酸巖藻糖多糖的混合物、實施例12獲得的含硫酸巖藻糖多糖-F和含硫酸巖藻糖多糖-U、F-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3和F-Fd-4以及肝素和葡聚糖硫酸酯那些細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目都幾乎沒有增加或減少。
結(jié)果，加入了實施例1中獲得的含硫酸巖藻糖多糖制劑和含硫酸巖藻糖多糖的混合物、實施例12獲得的含硫酸巖藻糖多糖-F和含硫酸巖藻糖多糖-U、F-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3和F-Fd-4以及實施例15獲得的含硫酸巖藻糖多糖、肝素和葡聚糖硫酸酯的HCT 116細(xì)胞都顯示出細(xì)胞凋亡的特征(如細(xì)胞收縮和斷裂)。
也就是說，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)由于這些含硫酸巖藻糖多糖和低聚糖的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用而抑制了HCT 116細(xì)胞的生長。
將在實施例1中獲得的含硫酸巖藻糖多糖制劑和含硫酸巖藻糖多糖的混合物、實施例12獲得的含硫酸巖藻糖多糖-F和含硫酸巖藻糖多糖-U、F-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3和F-Fd-4以及實施例15獲得的含硫酸巖藻糖多糖分別溶解在PBS中，使其終濃度為10mg/ml。肝素和葡聚糖硫酸酯也分別溶解在PBS中，使其終濃度為5mg/ml。這些溶液都用濾膜處理，然后以與上述相同的方式檢測它們誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。得到相同的結(jié)果。
實施例2937℃下將人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT 116培養(yǎng)在含有10％胎牛血清(由JRHBioscience制造)的McCoy 5a培養(yǎng)基(由Gibco制造)中(所說的胎牛血清在56℃下處理30分鐘)，然后懸浮在McCoy 5a培養(yǎng)基中，使最終濃度為5×103細(xì)胞/ml。然后將懸液移到24-孔的平板(由FALCON制造)上，每孔1.8毫升。向所說的懸液中加入0.2ml濃度為20mg/ml、30mg/ml和50mg/ml的實施例1中獲得的含硫酸巖藻糖多糖制劑溶液(所說的溶液溶解在PBS中，并且已經(jīng)在121℃下在高壓滅菌器中處理20分鐘)，之后在5％的CO2存在下，37℃下溫育。作為對照，只加入等量的PBS，并以同樣的方式進(jìn)行溫育。培養(yǎng)后，按照《組織培養(yǎng)技術(shù)》(第二版)，朝倉出版，由日本組織培養(yǎng)學(xué)會編輯，26-28(1990)描述的方法(也就是說錐蟲藍(lán)染色方法)，在一定的時間間隔，在計數(shù)室中計算活細(xì)胞數(shù)目。
結(jié)果如圖30所示，此圖顯示出溫育時間和HCT 116細(xì)胞的培養(yǎng)基中的活細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系，其中所說的培養(yǎng)基中已經(jīng)加入了各種濃度的實施例1中獲得的含硫酸巖藻糖多糖制劑。在此圖中，橫坐標(biāo)代表培養(yǎng)時間(小時)，縱坐標(biāo)代表培養(yǎng)基中的活細(xì)胞數(shù)(×104細(xì)胞/2ml)。在圖30中，○代表對照(未加入所說的多糖)；●代表加入2mg/ml的含硫酸巖藻糖多糖的制劑；■代表加入3mg/ml的含硫酸巖藻糖多糖的制劑；▲代表加入5mg/ml的含硫酸巖藻糖多糖的制劑。
結(jié)果，加入了PBS的HCT 116細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目明顯增加，而加入了實施例1中獲得的含硫酸巖藻糖多糖制劑的那些細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目都減少。
加入了實施例1中獲得的含硫酸巖藻糖多糖制劑的HCT 116細(xì)胞都顯示出細(xì)胞凋亡的特征(如細(xì)胞收縮和斷裂)。
也就是說，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)實施例1中獲得的含硫酸巖藻糖多糖的制劑在濃度至少為2mg/ml時能夠誘導(dǎo)HCT 116細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，因此抑制了這些細(xì)胞的生長。
將在實施例1中獲得的含硫酸巖藻糖多糖制劑溶解在PBS中，使其終濃度為20mg/ml、30mg/ml、50mg/ml，并用濾膜處理。然后以與上述相同的方式檢測它們誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。得到相同的結(jié)果。
實施例3037℃下將人胃癌細(xì)胞AGS培養(yǎng)在含有10％胎牛血清(由JRHBioscience制造)的Ham F12培養(yǎng)基(由Gibco制造)中(所說的胎牛血清在56℃下處理30分鐘)，然后懸浮在Ham F12培養(yǎng)基中，使最終濃度為5×103細(xì)胞/ml。然后將懸液移到24-孔的平板(由FALCON制造)上，每孔1.8毫升。向所說的懸液中加入0.2ml濃度為20mg/ml、30mg/ml和50mg/ml的實施例1中獲得的含硫酸巖藻糖多糖制劑溶液(所說的溶液溶解在PBS中，并且已經(jīng)在121℃下在高壓滅菌器中處理20分鐘)，之后在5％的CO2存在下，37℃下溫育。作為對照，只加入等量的PBS，并以同樣的方式進(jìn)行溫育。培養(yǎng)后，按照《組織培養(yǎng)技術(shù)》(第二版)，朝倉出版，由日本組織培養(yǎng)學(xué)會編輯，26-28(1990)描述的方法(也就是說錐蟲藍(lán)染色方法)，在一定的時間間隔，在計數(shù)室中計算活細(xì)胞數(shù)目。
結(jié)果如圖31所示，此圖顯示出溫育時間和AGS細(xì)胞的培養(yǎng)基中的活細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系，其中所說的培養(yǎng)基中已經(jīng)加入了各種濃度的實施例1中獲得的含硫酸巖藻糖多糖制劑。在此圖中，橫坐標(biāo)代表培養(yǎng)時間(小時)，縱坐標(biāo)代表培養(yǎng)基中的活細(xì)胞數(shù)(×104細(xì)胞/2ml)。在圖31中，○代表對照(未加入所說的多糖)；●代表加入2mg/ml的含硫酸巖藻糖多糖的制劑；■代表加入3mg/ml的含硫酸巖藻糖多糖的制劑；▲代表加入5mg/ml的含硫酸巖藻糖多糖的制劑。
結(jié)果，加入了PBS的AGS細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目明顯增加，而加入了實施例1的含硫酸巖藻糖多糖制劑(最終濃度為3mg/ml或更高)的那些細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目都減少，加入2mg/ml實施例1的含硫酸巖藻糖多糖制劑則大大抑制了所說的細(xì)胞的生長。
加入了實施例1中獲得的含硫酸巖藻糖多糖制劑的AGS細(xì)胞都顯示出細(xì)胞凋亡的特征(如細(xì)胞收縮和斷裂)。
也就是說，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)實施例1中獲得的含硫酸巖藻糖多糖的制劑在濃度至少為2mg/ml時能夠誘導(dǎo)AGS細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，因此抑制了這些細(xì)胞的生長。
將在實施例1中獲得的含硫酸巖藻糖多糖制劑溶解在PBS中，使其終濃度為20mg/ml、30mg/ml、50mg/ml，并用濾膜處理。然后以與上述相同的方式檢測它們誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。得到相同的結(jié)果。
實施例3137℃下將人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480(ATCC CCL-228)培養(yǎng)在含有10％胎牛血清(由JRH Bioscience制造)的L-15培養(yǎng)基(由Gibco制造)中(所說的胎牛血清在56℃下處理30分鐘)，然后懸浮在L-15培養(yǎng)基中，使最終濃度為5×103細(xì)胞/ml。然后將懸液移到24-孔的平板(由FALCON制造)上，每孔1.8毫升。向所說的懸液中加入0.2ml濃度為10mg/ml、30mg/ml和50mg/ml的實施例1中獲得的含硫酸巖藻糖多糖制劑溶液(所說的溶液溶解在PBS中，并且已經(jīng)在121℃下在高壓滅菌器中處理20分鐘)，之后在5％的CO2存在下，37℃下溫育。作為對照，只加入等量的PBS，并以同樣的方式進(jìn)行溫育。培養(yǎng)后，按照《組織培養(yǎng)技術(shù)》(第二版)，朝倉出版，由日本組織培養(yǎng)學(xué)會編輯，26-28(1990)描述的方法(也就是說錐蟲藍(lán)染色方法)，在一定的時間間隔，在計數(shù)室中計算活細(xì)胞數(shù)目。
結(jié)果如圖32所示，此圖顯示出溫育時間和SW480細(xì)胞的培養(yǎng)基中的活細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系，其中所說的培養(yǎng)基中已經(jīng)加入了各種濃度的實施例1中獲得的含硫酸巖藻糖多糖制劑。在此圖中，橫坐標(biāo)代表培養(yǎng)時間(小時)，縱坐標(biāo)代表培養(yǎng)基中的活細(xì)胞數(shù)(×104細(xì)胞/2ml)。在圖32中，○代表對照(未加入所說的多糖)；●代表加入1mg/ml的含硫酸巖藻糖多糖的制劑；■代表加入3mg/ml的含硫酸巖藻糖多糖的制劑；▲代表加入5mg/ml的含硫酸巖藻糖多糖的制劑。
結(jié)果，加入了PBS的SW480細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目明顯增加，而加入了實施例1的含硫酸巖藻糖多糖制劑(最終濃度為3mg/ml或更高)的那些細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目都明顯減少，加入1mg/ml實施例1的含硫酸巖藻糖多糖制劑則大大抑制了所說的細(xì)胞的生長。
加入了實施例1中獲得的含硫酸巖藻糖多糖制劑的SW480細(xì)胞都顯示出細(xì)胞凋亡的特征(如細(xì)胞收縮和斷裂)。
也就是說，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)實施例1中獲得的含硫酸巖藻糖多糖的制劑在濃度至少為1mg/ml時能夠誘導(dǎo)SW480細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，因此抑制了這些細(xì)胞的生長。
將在實施例1中獲得的含硫酸巖藻糖多糖制劑溶解在PBS中，使其終濃度為10mg/ml、30mg/ml、50mg/ml，并用濾膜處理。然后以與上述相同的方式檢測它們誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。得到相同的結(jié)果。
實施例3237℃下將人結(jié)腸癌細(xì)胞WiDr(ATCC CCL-218)培養(yǎng)在含有10％胎牛血清(由JRH Bioscience制造)和1％NEAA(由大日本制藥公司制造)的DMEM培養(yǎng)基(由大日本制藥公司制造)中(所說的胎牛血清在56℃下處理30分鐘)，然后懸浮在上述的培養(yǎng)基中，使最終濃度為5×103細(xì)胞/ml。然后將懸液移到24-孔的平板(由FALCON制造)上，每孔1.8毫升。向所說的懸液中加入0.2ml濃度為10mg/ml的實施例1中獲得的含硫酸巖藻糖多糖混合物溶液、實施例12獲得的含硫酸巖藻糖多糖-F、F-Fd-3和F-Fd-4、實施例15獲得的含硫酸巖藻糖多糖(所說的溶液溶解在PBS中，并且已經(jīng)在121℃下在高壓滅菌器中處理20分鐘)，之后在5％的CO2存在下，37℃下溫育。作為對照，只加入等量的PBS，并以同樣的方式進(jìn)行溫育。培養(yǎng)后，按照《組織培養(yǎng)技術(shù)》(第二版)，朝倉出版，由日本組織培養(yǎng)學(xué)會編輯，26-28(1990)描述的方法(也就是說錐蟲藍(lán)染色方法)，在一定的時間間隔，在計數(shù)室中計算活細(xì)胞數(shù)目。
結(jié)果如圖33所示，此圖顯示出溫育時間和WiDr細(xì)胞的培養(yǎng)基中的活細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系，其中所說的培養(yǎng)基中已經(jīng)加入了最終濃度均為1mg/ml的實施例1中獲得的含硫酸巖藻糖多糖混合物溶液、實施例12獲得的含硫酸巖藻糖多糖-F、F-Fd-3和F-Fd-4、實施例15獲得的含硫酸巖藻糖多糖。在此圖中，橫坐標(biāo)代表培養(yǎng)時間(小時)，縱坐標(biāo)代表培養(yǎng)基中的活細(xì)胞數(shù)(×104細(xì)胞/2ml)。在圖33中，○代表對照(未加入所說的多糖)；■代表實施例12獲得的含硫酸巖藻糖多糖-F；●代表實施例15獲得的含硫酸巖藻糖多糖。F-Fd-3和F-Fd-4顯示的曲線實質(zhì)上都與實施例15獲得的含硫酸巖藻糖多糖所顯示的曲線相同。
結(jié)果，加入了PBS的WiDr細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目明顯增加，而加入了的實施例1中獲得的含硫酸巖藻糖多糖混合物溶液、實施例12獲得的含硫酸巖藻糖多糖-F、F-Fd-3和F-Fd-4、實施例15獲得的含硫酸巖藻糖多糖的那些細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目都有所減少。
加入了的實施例1中獲得的含硫酸巖藻糖多糖混合物溶液、實施例12獲得的含硫酸巖藻糖多糖-F、F-Fd-3和F-Fd-4、實施例15獲得的含硫酸巖藻糖多糖的WiDr細(xì)胞都顯示出細(xì)胞凋亡的特征(如細(xì)胞收縮和斷裂)。
也就是說，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)實施例1中獲得的含硫酸巖藻糖多糖混合物溶液、實施例12獲得的含硫酸巖藻糖多糖-F、F-Fd-3和F-Fd-4、實施例15獲得的含硫酸巖藻糖多糖能夠誘導(dǎo)WiDr細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，因此可以抑制這些細(xì)胞的生長。
將在的實施例1中獲得的含硫酸巖藻糖多糖混合物溶液、實施例12獲得的含硫酸巖藻糖多糖-F、F-Fd-3和F-Fd-4、實施例15獲得的含硫酸巖藻糖多糖分別溶解在PBS中，使其終濃度為10mg/ml，并用濾膜處理。然后以與上述相同的方式檢測它們誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。得到相同的結(jié)果。
實施例3337℃下將人結(jié)腸癌細(xì)胞WiDr(ATCC CCL-218)培養(yǎng)在含有10％胎牛血清(由JRH Bioscience制造)和1％NEAA(由大日本制藥公司制造)的DMEM培養(yǎng)基(由大日本制藥公司制造)中(所說的胎牛血清在56℃下處理30分鐘)，然后懸浮在上述的培養(yǎng)基中，使最終濃度為5×103細(xì)胞/ml。然后將懸液移到24-孔的平板(由FALCON制造)上，每孔1.8毫升。向所說的懸液中加入0.2ml濃度為10mg/ml、30mg/ml、50mg/ml的實施例1中獲得的含硫酸巖藻糖多糖制劑溶液(所說的溶液溶解在PBS中，并且已經(jīng)在121℃下在高壓滅菌器中處理20分鐘)，之后在5％的CO2存在下，37℃下溫育。作為對照，只加入等量的PBS，并以同樣的方式進(jìn)行溫育。培養(yǎng)后，按照《組織培養(yǎng)技術(shù)》(第二版)，26-28(1990)描述的方法(也就是說錐蟲藍(lán)染色方法)，在一定的時間間隔，在計數(shù)室中計算活細(xì)胞數(shù)目。
結(jié)果如圖34所示，此圖顯示出溫育時間和WiDr細(xì)胞的培養(yǎng)基中的活細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系，其中所說的培養(yǎng)基中已經(jīng)加入了各種濃度的實施例1獲得的含硫酸巖藻糖多糖的制劑。在此圖中，橫坐標(biāo)代表培養(yǎng)時間(小時)，縱坐標(biāo)代表培養(yǎng)基中的活細(xì)胞數(shù)(×104細(xì)胞/2ml)。在圖34中，○代表對照(未加入所說的多糖)；●代表加入1mg/ml的含硫酸巖藻糖多糖的制劑；■代表加入3mg/ml的含硫酸巖藻糖多糖的制劑；▲代表加入5mg/ml的含硫酸巖藻糖多糖的制劑。
結(jié)果，加入了PBS的WiDr細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目明顯增加，而加入了最終濃度為3mg/ml或更高的實施例1中獲得的含硫酸巖藻糖多糖制劑的那些細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目都明顯減少，并且加入1mg/ml實施例1中獲得的含硫酸巖藻糖多糖的制劑則大大抑制了這些細(xì)胞的生長。
加入了的實施例1中獲得的含硫酸巖藻糖多糖制劑的WiDr細(xì)胞都顯示出細(xì)胞凋亡的特征(如細(xì)胞收縮和斷裂)。
也就是說，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)實施例1中獲得的含硫酸巖藻糖多糖制劑在濃度至少為1mg/ml時能夠誘導(dǎo)WiDr細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，因此抑制了這些細(xì)胞的生長。
將在的實施例1中獲得的含硫酸巖藻糖多糖制劑溶解在PBS中，使其終濃度為10mg/ml、30mg/ml、50mg/ml，并用濾膜處理。然后以與上述相同的方式檢測它們誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。得到相同的結(jié)果。
實施例3437℃下將人前髓細(xì)胞白血病細(xì)胞HL-60(ATCC CCL-240)培養(yǎng)在含有10％胎牛血清(由JRH Bioscience制造)的RPMI 1640培養(yǎng)基(由Gibco制造)中(所說的胎牛血清在56℃下處理30分鐘)，然后懸浮在ASF104培養(yǎng)基(由味之素有限公司制造)中，使最終濃度為5×104細(xì)胞/900μl。然后將懸液移到6-孔的平板(由FALCON制造)上，每孔4.5毫升。向所說的懸液中加入0.5ml濃度為10mg/ml實施例19中描述的冷凍干燥的含硫酸巖藻糖多糖-F的降解產(chǎn)物(所說的溶液溶解在含有120mM氯化鈉的30mMHepes緩沖液中溶解(pH7)中)，然后通過濾膜處理，之后在5％的CO2存在下，37℃下溫育。作為對照，只加入等量的上述緩沖液，并以同樣的方式進(jìn)行溫育。培養(yǎng)22和46小時后，按照《組織培養(yǎng)技術(shù)》(第二版)，朝倉出版，由日本組織培養(yǎng)學(xué)會編輯，26-28(1990)描述的方法(也就是說錐蟲藍(lán)染色方法)，在一定的時間間隔，在計數(shù)室中計算活細(xì)胞數(shù)目。
結(jié)果表明含硫酸巖藻糖多糖-F的上述凍干的降解產(chǎn)物誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，這樣就抑制細(xì)胞增殖速率。
實施例35將人前髓細(xì)胞白血病細(xì)胞HL-60(ATCC CCL-240)懸浮在含有10％胎牛血清(由JRH Bioscience制造)的RPMI 1640培養(yǎng)基(由Gibco制造)中(所說的胎牛血清在56℃下處理30分鐘)，使最終濃度為5×104細(xì)胞/900μl。向6份所說的懸液中加入100μl濃度為10mg/ml實施例19(2)中描述的含硫酸巖藻糖多糖-F、F-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3和F-Fd-4溶液(所說的溶液溶解在含有120mM氯化鈉的30mM Hepes緩沖液中溶解(pH7)中)，然后通過濾膜處理，之后在5％的CO2存在下，37℃下溫育46小時。
培養(yǎng)開始22和46小時后，對培養(yǎng)基中的活細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。
另外，將人前髓細(xì)胞白血病細(xì)胞HL-60(ATCC CCL-240)懸浮在ASF104培養(yǎng)基(由味之素有限公司制造)，使最終濃度為5×104細(xì)胞/900μl。向6份所說的懸液中加入100μl濃度為10mg/ml實施例19(2)中描述的含硫酸巖藻糖多糖-F、F-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3和F-Fd-4溶液(所說的溶液溶解在含有120mM氯化鈉的30mM Hepes緩沖液中溶解(pH7)中)，然后通過濾膜處理，之后在5％的CO2存在下，37℃下溫育40小時。
培養(yǎng)開始16和40小時后，對培養(yǎng)基中的活細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。
在顯微鏡下觀察這兩種方式所培養(yǎng)的細(xì)胞，以檢驗細(xì)胞的生長程度和形態(tài)學(xué)特征。
結(jié)果，在ASF104培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞中，加入了含硫酸巖藻糖多糖-F、F-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3和F-Fd-4的培養(yǎng)基培養(yǎng)的所有細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞凋亡的特征(例如細(xì)胞的收縮和斷裂)。在這些情況下，觀察到了活細(xì)胞數(shù)量稍有增加或者細(xì)胞幾乎完全死亡。相反，在只加入緩沖液的培養(yǎng)基的活細(xì)胞數(shù)量幾乎增加了3倍。另一方面，對于培養(yǎng)在RPMI1640培養(yǎng)基中的細(xì)胞來說，培養(yǎng)在加入F-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3和F-Fd-4的培養(yǎng)基中的所有細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞凋亡的特征(例如細(xì)胞收縮和斷裂)。此時，細(xì)胞幾乎完全死亡。相反，在只加入緩沖液的培養(yǎng)基的活細(xì)胞數(shù)量幾乎增加了3倍，而培養(yǎng)在加入含硫酸巖藻糖多糖-F的培養(yǎng)基中的細(xì)胞大約增加了2.5倍。
基于這些結(jié)果，表明含硫酸巖藻糖多糖-F對不含血清的培養(yǎng)基中的癌細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)大的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡效應(yīng)，而F-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3和F-Fd-4對不含血清的培養(yǎng)基和含有血清的培養(yǎng)基中的癌細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)大的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡效應(yīng)。
為了進(jìn)一步證實上述結(jié)果，將人前髓細(xì)胞白血病細(xì)胞HL-60懸浮在含有10％胎牛血清(由JRH Bioscience制造)的RPMI 1640培養(yǎng)基(由Gibco制造)中(所說的胎牛血清在56℃下處理30分鐘)，使最終濃度為5×104細(xì)胞/900μl。向2份9ml所說的懸液中加入1ml含有120mM氯化鈉的30mM Hepes緩沖液和溶于上述緩沖液的10mg/ml F-Fd-4溶液，并通過濾膜處理。在5％的CO2存在下，37℃下溫育16小時后，通過離心從上清液中分離細(xì)胞。
將這樣獲得的細(xì)胞懸浮在20μl 50mM Tris鹽酸緩沖液(Ph7.8)，所說的緩沖液含有10mM乙二胺四乙酸鹽和0.5％的月桂酰肌氨酸鈉。然后加入1μl的10mg/ml的核糖核酸酶A(由Sigma制造)，在50℃下將混合物處理30分鐘。加入1μl濃度為10mg/ml蛋白酶K后，在50℃下處理混合物30分鐘。將所處理的細(xì)胞作為樣品，并在100V恒壓下，在2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。將此凝膠浸沒在溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓溶液中30分鐘，然后通過使用透照器檢測凝膠中的DNA狀態(tài)。結(jié)果觀察到了代表細(xì)胞凋亡的DNA梯度。為了進(jìn)一步證實，使用放線菌素D(被認(rèn)為是誘導(dǎo)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的試劑)代替上述的F-Fd-4來重復(fù)上述的過程。結(jié)果，觀察到與F-Fd-4所得的結(jié)果相似的DNA梯度。
基于這些結(jié)果，說明使用本發(fā)明的含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶降解含硫酸巖藻糖多糖-F時可以改進(jìn)這種多糖誘導(dǎo)癌細(xì)胞細(xì)胞凋亡的作用。
實施例36從健康女性(21歲)和健康男性(32)體內(nèi)收集靜脈血并用，下列溶液稀釋兩倍，所說的溶液每升含有100mg葡萄糖、0.74mg CaCl2·H2O、19.92mg MgCl2、40.26mg KCl、7371mg NaCl和1756.5mg Tris鹽酸。接下來，將靜脈血以兩倍于用于分離淋巴細(xì)胞的溶液(大日本制藥公司出售，該溶液已預(yù)先置于離心管中)的體積輕輕地置于該溶液上，然后在18-20℃下以400×g離心30分鐘。離心后，取出用于分離淋巴細(xì)胞的溶液的上層淋巴細(xì)胞組分。
將上述獲得的正常淋巴細(xì)胞加入到24-孔平板上，每孔1.9×105個細(xì)胞，之后向其中加入1.8ml含有10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(所說的胎牛血清在56℃下處理30分鐘)和0.2ml 5mg/ml上述實施例獲得的每種含硫酸巖藻糖多糖及其降解產(chǎn)物。然后，在37℃下溫育這些淋巴細(xì)胞。作為對照，只加入生理鹽水代替含硫酸巖藻糖多糖的溶液。在培養(yǎng)開始后，在顯微鏡下檢測每個孔中細(xì)胞的形態(tài)變化和活細(xì)胞數(shù)。結(jié)果，在包含各種含硫酸巖藻糖多糖的孔、含有這些多糖的降解產(chǎn)物孔中和對照孔中沒有觀察到這些細(xì)胞的形態(tài)具有差別。另外，在活細(xì)胞數(shù)上也無差別。在第13天，每個孔中的幾乎所有細(xì)胞都已死亡。基于這些結(jié)果，表明含硫酸巖藻糖多糖和其降解產(chǎn)物即使在足以誘導(dǎo)癌細(xì)胞細(xì)胞凋亡的濃度下，對正常的細(xì)胞無任何毒性。
實施例37含硫酸巖藻糖多糖-U對固形癌的抗腫瘤效應(yīng)將小鼠固形癌MethA(4×106細(xì)胞/鼠)皮下注射到雄性BALB/c小鼠(8周齡，體重大約20g)的腹部中。其后，將實施例6中所描述的含硫酸巖藻糖多糖-U以100mg/kg/天的劑量注射到相同的部位，共注射10天。在對照組中，以相同的方式注射生理鹽水。2周后，在小鼠的腹部取出形成的癌組織，并稱重。結(jié)果如表2所示。也就是說，對照組的腫瘤重量平均為1.25g，而施用含硫酸巖藻糖多糖-U的組的腫瘤重量平均為0.28G，這表明其具有顯著(和對照相比，P＜0.01)的抗腫瘤作用。抑制率為77.6％。
表2
實施例38含硫酸巖藻糖多糖的制癌作用(1)向十九只雄性Spragure-Dawley大鼠(6周)的背部皮下施用7.4mg/kg的氧化偶氮甲烷(由Nacalai Tesque制造)。其后，將所說的化學(xué)藥品皮下施用到這些動物的背部，每周一次共10周。施用時，將氧化偶氮甲烷溶解在含有0.9％氯化鈉的0.1M磷酸酸緩沖液(pH6.5)中，控制溶液的濃度使每次給藥量為100μl。
第一次施用氧化偶氮甲烷的同時，將按照實施例1中所描述的方法制備的Kjellmaniella crassifolia 70ml熱水提取物以飲水的方式施用給十九只大鼠中的五只，如上所述每天施用至第30周。所說的熱水提取物含有2mg/ml的含硫酸巖藻糖多糖混合物。這樣，就將含硫酸巖藻糖多糖混合物以140mg/kg/天的劑量每天口服施用。
對于上述十九中大鼠中的十四只而言，以自來水而不是含硫酸巖藻糖多糖作為飲用水，這些動物稱為對照組。
直到第30周，在對照組所有十四只大鼠中都觀察到了外耳病灶癌的發(fā)生。與此相反，在施用含硫酸巖藻糖多糖混合物的組中，五只大鼠中只有一只患有癌癥，這表明所說的多糖具有顯著的制癌作用。
到第30周時，在對照組中有三只大鼠死亡，而施用了含硫酸巖藻糖多糖混合物的組中所有的動物都存活下來。在第30周，對照組和施用了含硫酸巖藻糖多糖混合物的組的平均體重分別為716g和817g。另一方面，沒有施用氧化偶氮甲烷組(五只大鼠)的平均體重為788g。這就是說，施用含硫酸巖藻糖多糖混合物組的體重的增加相當(dāng)于沒有施用氧化偶氮甲烷的組的體重。
接下來，從對照組中選擇四只大鼠，每天將40ml上述的Kjellmaniellacrassifolia熱水提取物的(包含80mg含硫酸巖藻糖多糖的混合物)作為飲用水從第30周起口服施用給這些大鼠。在第36周，在四個中有兩只大鼠表現(xiàn)出外耳病灶癌萎縮，這表明含硫酸巖藻糖多糖具有抗腫瘤作用。
如上所述，已發(fā)現(xiàn)口頭施用含硫酸巖藻糖多糖對于防治由致癌化學(xué)藥物引起的癌癥、防止由致癌化學(xué)藥物引起的體重下降和消退癌組織方面是有效的。
實施例39注射液將實施例1中所產(chǎn)生的含硫酸巖藻糖多糖混合物溶解在注射用蒸餾水中，以得到用于注射的5％溶液。將這些溶液以每瓶50mg含硫酸巖藻糖多糖的量分裝冷凍干燥用小瓶冷凍干燥中。另將2ml生理鹽水作為溶劑分別加入到瓶中。
實施例40注射液根據(jù)下列配方制備注射液含硫酸巖藻糖多糖-U(實施例12) 40mg生理鹽水 q.s.
2ml/安瓿同樣，使用實施例12的含硫酸巖藻糖多糖-F制備另一種注射液。
實施例41片劑根據(jù)下列配方制備片劑含硫酸巖藻糖多糖制劑(實施例1) 10mg玉米淀粉 65mg羧甲基纖維素 20mg聚乙烯吡咯烷酮 3mg硬脂酸鎂 2mg100mg/片實施例42注射液將F-Fd-1溶解在水中，以得到用于注射的5％溶液。將這些溶液以每瓶50mg含硫酸巖藻糖多糖的量分裝冷凍干燥用的小瓶中冷卻干燥。將2ml生理鹽水作為溶劑分別加入到瓶中。
實施例43注射液根據(jù)下列配方制備注射液含硫酸巖藻糖多糖-F的冷凍干燥降解產(chǎn)物(在實施例19(6)中獲得)40mg生理鹽水 q.s.
2ml/安瓿實施例44片劑根據(jù)下列配方產(chǎn)生片劑含硫酸巖藻糖多糖-F的冷凍干燥的降解產(chǎn)物(在實施例19(6)中獲得) 10mg玉米淀粉 65mg羧甲基纖維素 20mg聚乙烯吡咯烷酮 3mg硬脂酸鎂 2mg100mg/片本發(fā)明的效果本發(fā)明提供了對無用的或病原細(xì)胞具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用的藥物，這種藥物能夠誘導(dǎo)和細(xì)胞反常增殖有關(guān)的疾病(例如癌)和病毒性疾病中的病變細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，因此它對于預(yù)防和治療上述各種疾病是有用的。特別是，在消化系統(tǒng)的癌癥(如大腸癌和胃癌)中，通過口服施用本發(fā)明的藥物可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。因此，本發(fā)明的藥物中包含來源于天然食品的含硫酸巖藻糖多糖和/或其降解產(chǎn)物作為活性成分，這種藥物是非常適合于消化系統(tǒng)癌癥的抗癌藥物。本發(fā)明的藥物還具有制癌作用，因此能夠防止致癌的化學(xué)藥品引起的致癌作用。由于本發(fā)明的藥物來源于可食用的物質(zhì)(如可食用的褐藻和海參)，因此能夠以較低的價格大量得到它們，并且這種藥物具有高度的安全性。此外，日常攝取包含含硫酸巖藻糖多糖和/或其降解產(chǎn)物的食品和飲料有助于維持和改善人的健康狀況。本發(fā)明還提供了用于方便地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法(此方法適用于揭示細(xì)胞凋亡機(jī)理的研究)和開發(fā)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)抑制劑的方法，等等。
本發(fā)明還提供了在糖鏈工程領(lǐng)域和醫(yī)藥等等領(lǐng)域有用的含硫酸巖藻糖多糖-U和其降解產(chǎn)物，這些物質(zhì)實質(zhì)上不含含硫酸巖藻糖多糖-F，并且其中已經(jīng)除去了具有高度反應(yīng)活性的著色物質(zhì)。另外，本發(fā)明也提供了有效產(chǎn)生這些物質(zhì)的方法。
本發(fā)明還提供了在糖鏈工程領(lǐng)域和醫(yī)藥等等領(lǐng)域有用的含硫酸巖藻糖多糖-F和其降解產(chǎn)物，這些物質(zhì)實質(zhì)上不含含硫酸巖藻糖多糖-U，并且其中已經(jīng)除去了具有高度反應(yīng)活性的著色物質(zhì)。另外，本發(fā)明也提供了有效產(chǎn)生這些物質(zhì)的方法。
本發(fā)明還提供了含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶，這種酶在分析含硫酸巖藻糖多糖-F的結(jié)構(gòu)、降解含硫酸巖藻糖多糖-F、產(chǎn)生在檢測含硫酸巖藻糖多糖-F的生物活性方面有用的含硫酸巖藻糖多糖-F的降解產(chǎn)物方面是有用；本發(fā)明還通過了產(chǎn)生這種酶的過程；具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)癌細(xì)胞細(xì)胞凋亡作用的含硫酸巖藻糖多糖的降解產(chǎn)物，所說的產(chǎn)物是通過使用這種酶產(chǎn)生的。
根據(jù)本發(fā)明，還可以在鈣離子存在下，以極高穩(wěn)定性生產(chǎn)含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖-F的降解酶，通過常規(guī)方法不能穩(wěn)定地生產(chǎn)這種酶。此外，按照本發(fā)明，含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶在鈣離子存在下可以有效地發(fā)揮作用。
權(quán)利要求
1.具有下列理化性質(zhì)的含硫酸巖藻糖多糖(1)組成糖類實際上不含有糖醛酸；和(2)實際上不能被黃桿菌Flavobacterium sp.SA-0082(FERM BP-5402)產(chǎn)生的巖藻依聚糖分解酶降解而低分子化。
2.權(quán)利要求1中所述的含硫酸巖藻糖多糖的制造方法，其特征在于，包括使用能夠降解包含糖醛酸的含硫酸巖藻糖多糖的降解酶或者以具有所述的降解酶的微生物處理含硫酸巖藻糖多糖的混合物，以及收集目的物多糖的步驟。
3.權(quán)利要求1中所述的含硫酸巖藻糖多糖的制造方法，其特征在于包括用能夠凝聚酸性多糖的藥物在鹽的存在下處理含硫酸巖藻糖多糖的混合物并沉淀出目的多糖的步驟。
4.權(quán)利要求1中所述的含硫酸巖藻糖多糖的制造方法，其特征在于包括用陰離子交換樹脂在二價陽離子存在下處理含硫酸巖藻糖多糖的混合物，并收集目的多糖的步驟。
5.權(quán)利要求1中所述的含硫酸巖藻糖多糖的制造方法，其特征在于包括在生產(chǎn)權(quán)利要求1中所述的含硫酸巖藻糖多糖的過程中通過使用多糖物質(zhì)或者具有陰離子交換基團(tuán)的物質(zhì)除去共存的著色物質(zhì)的步驟。
6.權(quán)利要求2、3或4記載的含硫酸巖藻糖多糖混合物的制造方法，其特征在于提取含硫酸巖藻糖多糖的混合物時，是在乙酸根離子和鈣離子存在下進(jìn)行的。
7.具有下列理化性質(zhì)的含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶(i)功能作用于具有下列理化性質(zhì)的含硫酸巖藻糖多糖并降解該含硫酸巖藻糖多糖，使之低分子化(a)組成糖類實質(zhì)上不含有糖醛酸；和(b)實質(zhì)上不能被黃桿菌Flavobacterium sp.SA-0082(FERM BP-5402)產(chǎn)生的巖藻依聚糖分解酶降解而低分子化；不作用于具有下列理化性質(zhì)的含硫酸巖藻糖多糖(c)組成糖類含有糖醛酸；和(d)能被黃桿Flavobacterium sp.SA-0082(FERM BP-5402)產(chǎn)生的巖藻依聚糖分解酶降解低分子化以形成至少一種由下列化學(xué)式(I)、(II)和(III)代表的化合物 (ii)最適pH值大約pH7-8；和(iii)最適溫度大約30-35℃。
8.酶組合物，含有鈣源和如權(quán)利要求7中所述的含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶。
9.產(chǎn)生如權(quán)利要求7中所述的含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶的方法，其特征在于培養(yǎng)能夠產(chǎn)生如權(quán)利要求7中所述的含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶的交替單胞菌屬細(xì)菌并從培養(yǎng)物中回收所說的酶。
10.含硫酸巖藻糖多糖的降解產(chǎn)物，其特征在于是通過使用如權(quán)利要求7中所述的含內(nèi)-硫酸巖藻糖多糖的降解酶處理如權(quán)利要求1中所述的含硫酸巖藻糖多糖獲得的。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含含硫酸巖藻糖多糖和/或其降解產(chǎn)物的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物、抗癌藥物和防癌藥物；以及使用含硫酸巖藻糖多糖和/或其降解產(chǎn)物作為活性成分來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法。本發(fā)明還涉及一種降解酶，這種酶在產(chǎn)生含硫酸巖藻糖多糖的降解產(chǎn)物時是有用的。
文檔編號C12P19/14GK1528340SQ200410039690
公開日2004年9月15日 申請日期1997年1月21日 優(yōu)先權(quán)日1996年1月26日
發(fā)明者酒井武, 北野秀夫, 于福功, 司, 中山信司, 邦, 兒島薰, 生, 夫, 木村瞳, 中西芳邦, 重, 之進(jìn), 片山薰, 富永隆生, 嶼中一夫, 豬飼勝重, 加藤郁之進(jìn) 申請人:寶酒造株式會社, 株式會社糖鎖工學(xué)研究所