專利名稱:利用n-糖苷酶f制備蛋黃寡糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及生物制藥,具體地是關(guān)于利用酶法從雞蛋蛋黃中提取唾液酸寡糖的方法。
背景技術(shù):
研究證明,唾液酸寡糖在細(xì)胞識(shí)別、病毒感染和中和毒素等生命活動(dòng)中起著非常重要的作用,其糖鏈末端的唾液酸殘基是多種病原體和毒素侵染細(xì)胞的識(shí)別結(jié)合位點(diǎn),如流感病毒和造成幼兒腹瀉的輪狀病毒;同時(shí),對(duì)肝廓清機(jī)制的研究表明,能夠清除血液中異源復(fù)合物的肝凝集素,是去唾液酸糖蛋白受體(ASGR),它能夠識(shí)別去掉唾液酸的半乳糖殘基,因此帶有唾液酸寡糖重組蛋白藥物可明顯提高藥物在血液中的穩(wěn)定性和半衰期;日本科學(xué)家(L.R.Juneja等)飼喂小鼠的實(shí)驗(yàn)中也證明,日糧中添加一定比例的蛋黃唾液酸寡糖,可明顯提高幼鼠的智力[1]。因此寡糖,尤其是唾液酸寡糖在醫(yī)藥、食品等行業(yè)中有很大的應(yīng)用開(kāi)發(fā)潛力。目前,在人乳、牛乳、雞蛋等物質(zhì)中,已成功地分離出游離的唾液酸寡糖成分,并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析和其生物學(xué)活性試驗(yàn);唾液酸寡糖化學(xué)合成的研究也是糖合成研究的熱點(diǎn)之一;利用肼解法已成功地從雞蛋蛋黃中分離出蛋黃唾液酸寡糖[2],但由于受原料和成本的限制,以上所得到的唾液酸寡糖只是用于分析鑒定,日本Taiyo Kagaku公司用蛋白酶水解法制備帶有唾液酸寡糖的糖肽產(chǎn)品(SunsialTM)已廣泛地應(yīng)用于各類功能食品[3],利用酸水解法從蛋黃中制備唾液酸的工藝已投入了應(yīng)用[4],我國(guó)江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室利用酸水解法從蛋黃中制備高唾液酸含量的水解清液[5]。但截止于目前,還未見(jiàn)利用雞蛋蛋黃進(jìn)行規(guī)?;苽渫僖核峁烟堑膱?bào)道。
雞蛋是人們公認(rèn)的具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的食品,作為生命起源的基礎(chǔ),雞蛋中貯有大量的各類功能化合物,從雞蛋中提取制備的蛋黃抗體(IgY)、卵磷脂等產(chǎn)品目前已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和化妝品等行業(yè)。近年來(lái)的研究證明,雞蛋蛋黃中的唾液酸含量可高達(dá)0.2%,而且還含有2.8umol/egg yolk(8.0mg/egg yolk,蛋黃干重為9.6克)的帶有唾液酸寡糖的游離糖肽,雞蛋蛋黃是一個(gè)具有高含量酸性寡糖的物質(zhì)庫(kù)。同時(shí),在蛋黃抗體的制備中,其生產(chǎn)廢液中還存有大量的糖蛋白,游離糖肽也未損失,而且蛋白未被變性處理,利于進(jìn)行后續(xù)的酶解操作,將此廢液作為蛋黃寡糖提取制備的原料,原料成本極為低廉,適于進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化操作。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用在釀酒酵母細(xì)胞表面表達(dá)的N-糖苷酶F(PNGase F),對(duì)雞蛋蛋黃中所含有的糖蛋白和糖肽上所帶有的N-糖鏈(N-glycans)進(jìn)行酶解制備蛋黃寡糖。本發(fā)明所涉及的蛋黃寡糖主要是存在于雞蛋黃中糖蛋白和糖肽攜帶的N-糖鏈,所述酸性寡糖的主要結(jié)構(gòu)為N連接雙天線唾液酸寡糖鏈(N-linked disialylbiantennary glycan chain),其主要結(jié)構(gòu)式如下所示 N-糖苷酶F(Peptide-N4-(N-acetyl-β-D-glucosaminyl)asparigiene amidase;EC3.5.1.52),由314個(gè)氨基酸組成,分子量為34779Da。能夠從糖肽和糖蛋白表面完整地切下N-糖苷,其作用位點(diǎn)是N-乙酰葡萄胺殘基和天冬酰胺之間的價(jià)鍵結(jié)構(gòu)。本發(fā)明所用N-糖苷酶F是將來(lái)源于腦膜炎膿桿菌(Flavobacteriummeningoseptium)的N-糖苷酶F基因重組到釀酒酵母(S.cerevisiae)細(xì)胞表面進(jìn)行表達(dá)的,酶活測(cè)定結(jié)果為20U/l發(fā)酵液(1個(gè)酶活單位定義為每分鐘能夠完全水解1μmol核糖核酸酶B)。本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明是一種適于進(jìn)行規(guī)?;僮鞯模蒙锩阜ㄌ崛≈苽潆u蛋蛋黃寡糖的工藝流程,如下所示蛋黃原料——→脫脂——→蛋白酶水解——→變性處理——→離心后取上清液——→N-糖苷酶F酶解——→離心后取上清液——→超濾(分子量截留為10kD)——→脫鹽——→離子交換柱——→減壓干燥——→蛋黃寡糖產(chǎn)品——→產(chǎn)品檢測(cè)——→包裝——→成品工藝說(shuō)明1、本發(fā)明所指蛋黃原料主要為A.新鮮雞蛋中的蛋黃;B.商品化的蛋黃粉;C.蛋黃抗體生產(chǎn)的下腳料廢液。
以上原料中,原料A和原料C收率較高,從成本考慮,我們認(rèn)為原料C為最佳原材料。
2、本發(fā)明所涉及的脫脂工藝主要有有機(jī)溶劑脫脂法(適于蛋黃粉)和低溫離心脫脂法(適于液體原料),從環(huán)保和操作安全考慮,本發(fā)明推薦使用后者。低溫離心脫脂的條件為4℃,3000*g,1hr。
3、本發(fā)明所用蛋白酶為木瓜蛋白酶或胃蛋白酶。
4、變性處理是指加熱(90℃,20min)處理,使蛋白酶滅活,并增加N-糖苷酶F的酶解效率。
5、本發(fā)明所指N-糖苷酶F酶解工藝,是利用在釀酒酵母表面表達(dá)的N-糖苷酶F,直接加入水解液進(jìn)行酶解,或利用固定化細(xì)胞的方法,水解液過(guò)柱進(jìn)行酶解。酶解條件為25-42℃,2-48hr,最佳條件為30-37℃,20-36hr。
6、本發(fā)明涉及的超濾工藝為截留分子量為10000的膜過(guò)濾,操作壓力為0.4Mpa,操作溫度為40-55℃,最佳溫度條件為45-50℃。
7、本發(fā)明所涉及的脫鹽工藝為通過(guò)Sephadex G25的脫鹽柱或納濾進(jìn)行脫鹽,脫鹽后電導(dǎo)率低于200μs/cm,其中,納濾在脫鹽的同時(shí)還起到了濃縮的作用,可減低后續(xù)工藝的負(fù)擔(dān)。
8、本發(fā)明所指產(chǎn)品檢測(cè)方法是指純度和含量測(cè)定,可用薄層層析法(TLC)或高效薄層層析法(HPTLC)進(jìn)行純度檢測(cè),酸性寡糖可通過(guò)間苯二酚法測(cè)定的唾液酸含量來(lái)確定酸性寡糖的含量,蛋黃寡糖總含量的測(cè)定可利用酸水解后測(cè)定還原糖的含量來(lái)確定。還原糖測(cè)定儀器為山東省科學(xué)院生物中心出品的SGD-III型自動(dòng)還原糖測(cè)定儀。
本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)為利用在釀酒酵母表面高效表達(dá)的PNGase,通過(guò)酶法水解雞蛋蛋黃中糖蛋白和糖肽,提取制備蛋黃N-寡糖,尤其是提取制備N-唾液酸寡糖的技術(shù)路線,它可利用低廉的生物材料,大量提取制備某些具有重要生物學(xué)功能和應(yīng)用價(jià)值的寡糖,與合成法相比,本發(fā)明的寡糖制造成本大大降低,有利于產(chǎn)業(yè)化操作。
實(shí)例1利用蛋黃粉制備蛋黃寡糖1.1蛋黃粉的脫脂1.1.1丙酮萃取取蛋黃粉2000克(購(gòu)自大連生化制藥公司),加入10升丙酮,加熱至回流(57-58℃),回流2小時(shí)后,停止加熱,靜止30分鐘,棄去上清液(橙黃色),重復(fù)上述操作2次。
1.1.2甲醇萃取丙酮萃取結(jié)束后,用相同體積的甲醇按上述方法萃取三次。
1.1.3脫脂蛋黃粉(DEY,dilapidated egg yolk)的制備萃取結(jié)束后,45℃干燥過(guò)夜,將干燥產(chǎn)品稱重結(jié)果為813克,將DEY至于干燥處室溫放置備用。
1.2蛋白酶處理DEY將制備的800克DEY溶于8000ml 0.01mol/l的磷酸鈉緩沖液(pH7.0),并加入32克木瓜蛋白酶(Fisher Scientific Ltd.),在攪拌狀態(tài)下65℃酶解反應(yīng)4小時(shí)后,90℃減壓濃縮至2000ml.
濃縮后的酶水解液離心處理(3000g,30分鐘,室溫),上清液用0.22μm濾膜過(guò)濾,收集體積為1220ml,放置已滅菌的2000ml三角瓶中備用。
1.3 PNGase F酶解1.3.1 PNGase F的制備培養(yǎng)細(xì)胞表面表達(dá)PNGase F的釀酒酵母細(xì)胞(Saccharomyces cereviae,此重組酵母菌種為本課題組構(gòu)建)2000ml,誘導(dǎo)表達(dá)后,離心收集濕菌體26克,備用。
1.3.2酶解條件在上述收集的1220ml水解液中加入乙酸鈉1.09克,SDS 1.2克,用濃乙酸調(diào)pH至5.5。在旋轉(zhuǎn)震蕩條件下(80rpm),37℃,酶解24小時(shí)。
1.3.3酶解液后處理酶解結(jié)束后,水解液離心處理(4℃,6000g,10min),收集上清液約1250ml備用。
1.4寡糖分離1.4.1超濾處理用攪拌杯式超濾器,選用截留分子量為10000的濾膜,氮?dú)饧訅哼^(guò)濾,濾層用去離子水洗滌(30ml/次)4次,收集濾過(guò)液,共1300ml,70℃減壓濃縮至200ml,4℃放置備用。
1.4.2納濾濃縮、除鹽在納濾過(guò)程中,由DS-11型電導(dǎo)儀檢測(cè)透過(guò)液的電導(dǎo)率,并不斷用去離子水進(jìn)行洗滌,直至電導(dǎo)率降至180μs/cm,收集納濾后的濃縮液,共50ml,4℃放置備用。
14.3離子交換柱分離寡糖選用東洋曹達(dá)DEAE-Toyopearl 650M陰離子交換樹(shù)脂,5mM Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)平衡交換柱,用NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫(0-0.1M),流速30ml/min,10ml/收集管,HPTLC檢測(cè),最后收集第10-18管(檢測(cè)陽(yáng)性),合并,按1.4.2所述方法,再次進(jìn)行納濾脫鹽,直至透過(guò)液電導(dǎo)率恒定至150μs/cm,共收集得到50ml脫鹽濃縮液。
1.4.4減壓、冷凍干燥用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE 52A,上海亞榮生化儀器廠)先將50ml脫鹽濃縮液在60℃條件下,減壓濃縮至20ml體積,再利用冷凍干燥去出剩余水分,共得到2.1克干品。
1.5產(chǎn)品檢測(cè)結(jié)果間苯二酚法檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)品唾液酸含量為0.19克;還原糖檢測(cè)結(jié)果為產(chǎn)品還原糖含量為93%(以葡萄糖為基準(zhǔn))。
實(shí)例2利用新鮮雞蛋制備蛋黃寡糖2.1脫脂蛋黃的制備取100個(gè)新鮮雞蛋,破碎后取蛋黃,得到1.6升蛋黃液,將此蛋黃液冰浴冷凍至4℃,加入5倍體積的等離子水(4℃),劇烈攪拌1小時(shí)(整個(gè)操作過(guò)程中,溶液溫度不高于4℃),離心處理(4℃,4000g,1hr)后,收集上清液,共9.2升,即為脫脂蛋黃溶液。
2.2蛋白酶酶解在制備蛋黃溶液中,并加入30克木瓜蛋白酶(Fisher Scientific Ltd.),在攪拌狀態(tài)下65℃酶解反應(yīng)4小時(shí)后,90℃減壓濃縮至2000ml.
濃縮后的酶水解液離心處理(8000g,30分鐘,4℃),上清液用0.22μm濾膜過(guò)濾,收集體積為1850ml,放置已滅菌的2000ml三角瓶中備用。
2.3 PNGase F酶解2.3.1 PNGase F的制備培養(yǎng)重組釀酒酵母細(xì)胞1500ml,誘導(dǎo)表達(dá)后,離心收集濕菌體20克,備用。
2.3.2酶解條件.
在上述收集的1850ml水解液中加入乙酸鈉1.65克,SDS 1.85克,用濃乙酸調(diào)pH至5.5。在旋轉(zhuǎn)震蕩條件下(80rpm),37℃,酶解24小時(shí)。
2.3.3酶解液后處理酶解結(jié)束后,水解液離心處理(4℃,6000g,10min),收集上清液約1800ml備用。
2.4寡糖分離2.4.1超濾處理用攪拌杯式超濾器,選用截留分子量為10000的濾膜,氮?dú)饧訅哼^(guò)濾,濾層用去離子水洗滌(30ml/次)3次,收集濾過(guò)液,共1900ml,70℃減壓濃縮至400ml,4℃放置備用。
2.4.2納濾濃縮、除鹽在納濾過(guò)程中,由DS-11型電導(dǎo)儀檢測(cè)透過(guò)液的電導(dǎo)率,并不斷用去離子水進(jìn)行洗滌,直至電導(dǎo)率降至180μs/cm,收集納濾后的濃縮液,共30ml,4℃放置備用。
2.4.3離子交換柱分離寡糖選用東洋曹達(dá)DEAE-Toyopearl 650M陰離子交換樹(shù)脂,5mM Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)平衡交換柱,用NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫(0-0.1M),流速30ml/min,10ml/收集管,HPTLC檢測(cè),最后收集第10-18管(檢測(cè)陽(yáng)性),合并,按2.4.2所述方法,再次進(jìn)行納濾脫鹽,直至透過(guò)液電導(dǎo)率恒定至150μs/cm,共收集得到50ml脫鹽濃縮液。
2.4.4冷凍干燥利用冷凍干燥去出剩余水分,共得到3.3克蛋黃寡糖產(chǎn)品。
2.5產(chǎn)品檢測(cè)間苯二酚法檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)品唾液酸含量為0.31克;還原糖檢測(cè)結(jié)果為產(chǎn)品還原糖含量為91%(以葡萄糖為基準(zhǔn))。
實(shí)例3利用蛋黃抗體制備廢液制備蛋黃寡糖3.1原料脫脂取9升原料液(山東省農(nóng)科院家禽研究所提供),1000克冰塊,劇烈攪拌1小時(shí)(整個(gè)操作過(guò)程中,溶液溫度不高于4℃),離心處理(4℃,4000g,1hr)后,收集上清液,共9.6升,即為脫脂蛋黃溶液。
3.2蛋白酶酶解在制備蛋黃溶液中,并加入20克木瓜蛋白酶(Fisher Scientific Ltd.),在攪拌狀態(tài)下65℃酶解反應(yīng)4小時(shí)后,90℃減壓濃縮至2000ml.
濃縮后的酶水解液離心處理(8000g,30分鐘,4℃),上清液用0.22μm濾膜過(guò)濾,收集體積為1920ml,放置已滅菌的2000ml三角瓶中備用。
3.3 PNGase F酶解3.3.1 PNGase F的制備培養(yǎng)重組釀酒酵母細(xì)胞1000ml,誘導(dǎo)表達(dá)后,離心收集濕菌體13克,備用。
3.3.2酶解條件在上述收集的1900ml水解液中加入乙酸鈉1.70克,SDS 1.90克,用濃乙酸調(diào)pH至5∶5。在旋轉(zhuǎn)震蕩條件下(80rpm),37℃,酶解24小時(shí)。
3.3.3酶解液后處理酶解結(jié)束后,水解液離心處理(4℃,6000g,10min),收集上清液約1850ml備用。
3.4寡糖分離3.4.1超濾處理用攪拌杯式超濾器,選用截留分子量為10000的濾膜,氮?dú)饧訅哼^(guò)濾,濾層用去離子水洗滌(50ml/次)3次,收集濾過(guò)液,共2000ml,70℃減壓濃縮至300ml,4℃放置備用。
3.4.2納濾濃縮.、除鹽在納濾過(guò)程中,由DS-11型電導(dǎo)儀檢測(cè)透過(guò)液的電導(dǎo)率,并不斷用去離子水進(jìn)行洗滌,直至電導(dǎo)率降至180μs/cm,收集納濾后的濃縮液,共30ml,4℃放置備用。
3.4.3離子交換柱分離寡糖選用東洋曹達(dá)DEAE-Toyopearl 650M陰離子交換樹(shù)脂,5mM Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)平衡交換柱,用NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫(0-0.1M),流速30ml/min,10ml/收集管,HPTLC檢測(cè),最后收集第10-18管(檢測(cè)陽(yáng)性),合并,按2.4.2所述方法,再次進(jìn)行納濾脫鹽,直至透過(guò)液電導(dǎo)率恒定至150μs/cm,共收集得到50ml脫鹽濃縮液。
3.4.4冷凍干燥利用冷凍干燥去出剩余水分,共得到1.45克蛋黃寡糖產(chǎn)品。
3.5產(chǎn)品檢測(cè)間苯二酚法檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)品唾液酸含量為0.13克;還原糖檢測(cè)結(jié)果為產(chǎn)品還原糖含量為94%(以葡萄糖為基準(zhǔn))。
通過(guò)以上實(shí)例可以看出,本發(fā)明利用重組PNGase F,采用不同的蛋黃原料進(jìn)行蛋黃寡糖的制備,并取得了較高純度的蛋黃N-寡糖的混合物,證明本發(fā)明的制備方法是可行的。從已發(fā)表的報(bào)道分析,蛋黃N-酸性寡糖的含量大于0.5%,但本發(fā)明在蛋黃粉中制備的蛋黃寡糖僅占原料的0.1%左右,收率較低,利用SDS蛋白電泳分析可知,市售蛋黃粉的可溶性較差,影響了蛋白酶的處理效果,從而大大降低了產(chǎn)品的收率,而且蛋黃粉的價(jià)格較高(30元/公斤),利用此原料制備的產(chǎn)品成本較高,不利于產(chǎn)業(yè)化操作;而原料C為蛋黃抗體生產(chǎn)的廢料,價(jià)格極為低廉(所用原料價(jià)格約為0.5元/升),制備的產(chǎn)品成本較低,適于進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化,但此原料的缺點(diǎn)為各廠家的抗體制備工藝不同,原料質(zhì)量略有差別,制備前需做一定的預(yù)處理,以保證后續(xù)工藝的穩(wěn)定性;原料B為新鮮雞蛋,價(jià)格適中,而且寡糖資源無(wú)任何損失,產(chǎn)品收率高,如果能綜合利用此原料資源,其產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)的潛力很大。
本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)在于利用在釀酒酵母表面表達(dá)的PNGase F,酶發(fā)水解制備蛋黃糖蛋白中的酸性N-糖鏈,研究結(jié)果表明,此制品可抑制輪狀病毒對(duì)嬰幼兒的侵染,防治嬰幼兒的腹瀉癥狀;同時(shí),此寡糖的非還原端還可作為流感病毒的吸附位點(diǎn),減緩病毒對(duì)人體的侵染;另外,目前的糖合成技術(shù)還無(wú)法得到完整的N-糖鏈,利用本發(fā)明制備的完整N-糖鏈產(chǎn)品,在糖科學(xué)的研究中也具有廣闊的應(yīng)用前景。
參考文獻(xiàn)[1]Yamamoto,T.,et al,Oyotosbitsu Kagaku 9,15-18。
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1.一種利用N-糖苷酶F制備蛋黃寡糖的方法,其特征在于其工藝流程是蛋黃原料→脫脂→蛋白酶水解→變性處理→離心后取上清液→N-糖苷酶F酶解→離心后取上清液→超濾(分子量截留為10kD)→脫鹽→離子交換柱→減壓干燥→蛋黃寡糖產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用N-糖苷酶F制備蛋黃寡糖的方法,其特征在于所述的N-糖苷酶F水解是利用在釀酒酵母細(xì)胞表面表達(dá)的N-糖苷酶F直接加入水解液進(jìn)行酶解。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用N-糖苷酶F制備蛋黃寡糖的方法,其特征在于所述的N-糖苷酶F水解是利用固定化細(xì)胞的方法,水解液過(guò)柱進(jìn)行酶解。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用N-糖苷酶F制備蛋黃寡糖的方法,其特征在于所述的蛋黃原料是新鮮雞蛋中的蛋黃。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用N-糖苷酶F制備蛋黃寡糖的方法,其特征在于所述的蛋黃原料是市售的蛋黃粉。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用N-糖苷酶F制備蛋黃寡糖的方法,其特征在于所述蛋黃原料最好是蛋黃抗體制備過(guò)程中的廢液。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用在釀酒酵母細(xì)胞表面高效表達(dá)的N-糖苷酶F通過(guò)酶法水解雞蛋蛋黃中糖蛋白和糖酞,提取制備蛋黃N-寡糖的方法,其工藝流程為蛋黃原料→脫脂→蛋白酶水解→變性處理→離心后取上清液→N-糖苷酶F酶解→離心后取上清液→超濾(分子量截留為10kD)→脫鹽→離子交換柱→減壓干燥→蛋黃寡糖產(chǎn)品。本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)在于利用在釀酒酵母表面表達(dá)的PNGase F,酶發(fā)水解制備蛋黃糖蛋白中的酸性N-糖鏈,研究結(jié)果表明,此制品可抑制輪狀病毒對(duì)嬰幼兒的侵染,防治嬰幼兒的腹瀉癥狀;同時(shí),此寡糖的非還原端還可作為流感病毒的吸附位點(diǎn),減緩病毒對(duì)人體的侵染;另外,目前的糖合成技術(shù)還無(wú)法得到完整的N-糖鏈,利用本發(fā)明制備的完整N-糖鏈產(chǎn)品,在糖科學(xué)的研究中也具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12P1/00GK1641037SQ20041003591
公開(kāi)日2005年7月20日 申請(qǐng)日期2004年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月13日
發(fā)明者王鵬, 張大偉 申請(qǐng)人:山東大學(xué)