專利名稱：表皮干細(xì)胞構(gòu)建組織工程化角膜上皮植片的制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于組織工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以皮膚來源的表皮干細(xì)胞為種子細(xì)胞所構(gòu)建的組織工程化角膜上皮植片的制備方法，并將該表皮干細(xì)胞構(gòu)建組織工程化角膜上皮植片用于移植修復(fù)因角膜緣干細(xì)胞缺損而失明的眼表的用途。
背景技術(shù)：
正常眼表覆蓋著高度分化的角膜和結(jié)膜上皮，兩者分別由形態(tài)學(xué)上不同的兩類上皮細(xì)胞構(gòu)成。結(jié)膜上皮由能分泌粘蛋白的杯狀細(xì)胞組成，且高度血管化。角膜由未角質(zhì)化的扁平上皮組成，維持眼表完整性和正常視力。角膜上皮細(xì)胞來源于角膜緣的角膜干細(xì)胞[Schermer A et al，1986.J Cell Biol.10349-62.Cotsarelis G.1989.Cell，57201-209]，在臨床上各種熱、化學(xué)燒傷、史蒂文斯-約翰遜綜合征(Stevens-Johnson Syndvome，SJS)，眼表瘢痕化天皰瘡(Ocular cicatricial pemphigoid.OCP)，在角膜緣進(jìn)行的各種外科手術(shù)及冷療，角膜接觸鏡的磨損，以及嚴(yán)重的細(xì)菌感染等因素，都會導(dǎo)致角膜和角膜上皮干細(xì)胞缺損。鄰近的結(jié)膜上皮就會侵入角膜引發(fā)慢性炎癥，基質(zhì)疤痕化，血管增生，嚴(yán)重影響視力，甚至失明。臨床上已有通過手術(shù)療法治療嚴(yán)重眼表疾病的許多嘗試。如羊膜負(fù)載角膜上皮細(xì)胞植片移植，能有效提高眼表重建效果。近年來，角膜上皮干細(xì)胞羊膜植片移植重建由于角膜緣干細(xì)胞缺損引發(fā)的眼表疾病也多有報道(Pellegrini，G，et al 1997.Lancet，349990-993；Tsai RJE et al.2000；N Engl J Med.34386-93，Schwab IR et al，2000，Cornea.19421-426)。然而，角膜緣干細(xì)胞移植仍面臨以下難題1.自體移植時供體組織不足。2.異體移植時會有免疫排斥，術(shù)后需使用大量免疫抑制劑。大量免疫抑制劑的使用會引發(fā)機(jī)體的并發(fā)癥，嚴(yán)重影響病人生活質(zhì)量。自體角膜干細(xì)胞羊膜植片移植重建受損角膜，雖有成功報道，但對SJS和OCP常導(dǎo)致患者兩側(cè)的眼角膜受損，自體角膜上皮干細(xì)胞移植則無法進(jìn)行。日本學(xué)者，以兔為模型動物進(jìn)行了用口腔粘膜上皮羊膜植片重建受損角膜的研究，試圖解決這一難題，但只有移植后10天的結(jié)果報道，其結(jié)果顯示口腔粘膜上皮羊膜植片能重建角膜上皮，但長期移植效果有待進(jìn)一步觀察(Nakamura T et al.2003.Invest Ophthalmol Vis Sci；37523-533)；Yuan等(2002)將皮膚表皮細(xì)胞和角膜上皮細(xì)胞在羊膜上共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)表皮細(xì)胞在羊膜上培養(yǎng)一定時間后，表達(dá)角膜上皮特異性標(biāo)志蛋白K3，提示可用表皮細(xì)胞替代角膜上皮細(xì)胞構(gòu)建人工角膜，但未進(jìn)行進(jìn)一步試驗。本發(fā)明首次公開一種用皮膚表皮干細(xì)胞構(gòu)建組織工程化角膜上皮的成功方法，并以關(guān)中奶山羊為實驗動物制作角膜緣干細(xì)胞缺損模型，將構(gòu)建的組織工程化角膜上皮進(jìn)行自體和同種異體移植。移植后八個月后，效果明顯。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種用表皮干細(xì)胞替代角膜緣干細(xì)胞構(gòu)建組織工程化角膜上皮及其用于重建角膜緣干細(xì)胞缺損眼表的用途，以解決臨床上因兩側(cè)眼晴受損無法進(jìn)行自體角膜緣干細(xì)胞移植的難題，是一種采用表皮干細(xì)胞構(gòu)建組織工程化角膜上皮，治療角膜緣干細(xì)胞缺損的成功方法。
實現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)解決方案是，表皮干細(xì)胞構(gòu)建組織工程化角膜上皮植片的制備方法，采用來源于成體皮膚組織的表皮干細(xì)胞進(jìn)行制備，其特征在于，包括以下步驟1.表皮干細(xì)胞來源于成體皮膚組織。
無菌采取約0.5×0.6cm2大小的成人頸部皮膚或哺乳動物(主要包括寵物，家畜和珍稀野生動物)耳緣皮膚，用組織塊培養(yǎng)法和克隆篩選法分離純化表皮干細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)增，并對所獲得干細(xì)胞進(jìn)行CK19、P63、integrin-β1等表皮干細(xì)胞的標(biāo)志蛋白免疫組織化學(xué)檢測，均為陽性，證明所使用的細(xì)胞具表皮干細(xì)胞特征。
2.以一種去上皮細(xì)胞的人羊膜支架負(fù)載表皮干細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，第一周為浸沒培養(yǎng)(37℃，5％CO2，飽和濕度)，每兩天換液；第2-3周氣-液界面培養(yǎng)(37℃，5％CO2，飽和濕度)，每天換液。培養(yǎng)21天后，表皮干細(xì)胞在羊膜上分化形成復(fù)層，即為可用于移植的表皮干細(xì)胞羊膜植片。所制做的表皮干細(xì)胞羊膜植片經(jīng)透射電鏡觀察，表皮干細(xì)胞分為5-6層細(xì)胞?；讓蛹?xì)胞呈柱狀為祖細(xì)胞特征，細(xì)胞形態(tài)正常。細(xì)胞間有橋粒結(jié)構(gòu)，細(xì)胞與基底膜之間有半橋粒結(jié)構(gòu)，表明表皮干細(xì)胞羊膜植片具有正常角膜上皮的相似結(jié)構(gòu)。
1)無血清培養(yǎng)基的制備包括以下步驟(1)成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基A.無菌采取關(guān)中奶山羊頸部皮膚，用0.25％Trypsin+0.02％EDTA處理皮膚塊，4℃過夜，使表皮與真皮分離；B.將真皮與表皮間細(xì)胞沖洗干凈，將真皮切成小塊貼于玻璃皿中，每皿3-4塊，加培養(yǎng)基F12+1％BSA+10ng/ml EGF+10ug/ml insulin+10ng/ml IGF-1+青霉素100u/ml+鏈霉素100ug/ml進(jìn)行培養(yǎng)；C.當(dāng)成纖維細(xì)胞鋪滿平皿后，去組織塊，將成纖維細(xì)胞消化傳代，以1×105/ml，接種在50mm平皿中，培養(yǎng)48小時后收集培養(yǎng)基，在4000r/分條件下離心30分鐘，0.22um濾膜過濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆茫瑯?biāo)為GSFCM；(2)IGF-1、EGF、GSFCM適宜添加濃度的篩選在F12+1～1.2％BSA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加EGF，IGF-1，GSFCM的不同設(shè)計濃度梯度，按正交試驗進(jìn)行分組，培養(yǎng)所分離純化的表皮干細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)測其生長曲線，克隆形成率和細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，比較不同組合的優(yōu)缺點；(3)最后確定培養(yǎng)基配方為F12+1～1.2％BSA+20～25％GSFCM+20～25ng/mlEGF+5ug/ml insulin+15～20ng/ml IGF-1+0.4～0.6μg/ml氫化可的松+100u/ml青霉素+100ug/ml鏈霉素。
上述無血清培養(yǎng)基的制備方法已申請國家專利，專利申請?zhí)枮?00410025938.5。
2)人羊膜(Human amniotic membrane，HAM)支架的制作。
羊膜取自經(jīng)家屬同意的且HIV、甲肝、乙肝以及梅毒等血清學(xué)反應(yīng)顯示為陰性的剖腹產(chǎn)分娩產(chǎn)婦的胎兒胎盤。在無菌間內(nèi)，將帶有羊膜的胎膜囊放入加有青霉素、鏈霉素的生理鹽水中，頓性剝離附著在胎膜囊上的羊膜；將剝離下的羊膜用生理鹽水反復(fù)沖洗，直至血液及其他污物被徹底清洗掉；再用含青霉素、鏈霉素的PBS沖洗3-5遍；用細(xì)胞刮以及角膜鑷頓性剝離海綿層。將去除海綿層的羊膜用PBS沖洗，然后用眼科剪分成數(shù)小塊，分別平鋪于玻璃平皿內(nèi)，加入0.1-0.4％的胰酶(含0.05-0.2％的EDTA)，經(jīng)8-24小時消化去除上皮細(xì)胞；將去除上皮細(xì)胞的羊膜基底面向上平鋪于玻璃皿內(nèi)，將醋酸纖維素膜(NC膜)剪成中空的正方形(根據(jù)所需確定邊長)附于其上，然后翻轉(zhuǎn)，使其羊膜上皮面向上放入另一培養(yǎng)皿內(nèi)；于恒溫箱內(nèi)放置30-120分鐘，即可使用。
本發(fā)明所制作的組織工程化角膜上皮，具有透明度良好，彈性好，可操作性強(qiáng)等特點，可用于移植修復(fù)人類或動物因角膜緣干細(xì)胞缺損導(dǎo)致視力嚴(yán)重下降或失明的眼表，用于因角膜緣干細(xì)胞缺損而失明的動物模型的自體移植和同種異體移植均能取得良好的效果。所使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)表皮干細(xì)胞及組織工程化角膜上皮，可減弱種子細(xì)胞的免疫記憶，降低同種異體移植時的免疫排斥反應(yīng)，術(shù)后不需使用大量免疫抑制劑，拓寬了本發(fā)明在臨床上的應(yīng)用范圍，不僅可用于自體移植，也可用于同種異體移植。本發(fā)明的最大優(yōu)點是皮膚表皮干細(xì)胞來源豐富、取材方便。


圖1是移植前的堿燒傷模型羊眼睛的圖片；圖2是純化的表皮干細(xì)胞的圖片；
圖3是表皮干細(xì)胞在羊膜上正常增殖分化的圖片；圖4是表皮干細(xì)胞羊膜植片的圖片；圖5是表皮干細(xì)胞羊膜植片透射電鏡照片；圖6是表皮干細(xì)胞羊膜植片縫合于植床的圖片；圖7是移植245天后羊模型1眼表重建良好的圖片；圖8是移植240天后模型2羊眼表重建良好的圖片。
具體實施例方式
以下結(jié)合關(guān)中奶山羊為實驗?zāi)Ｐ蛯Πl(fā)明內(nèi)容作進(jìn)一步說明。
1.模型動物制作選3-4歲健康無眼疾的成年關(guān)中奶山羊，肌注獸用846合劑2.4ml～2.6ml全麻，眼周用碘酒消毒。側(cè)臥保定，鋪手術(shù)洞巾，開瞼器開瞼，雙抗生理鹽水(硫酸青霉素2×105u/L、鏈霉素200mg/L)沖洗眼表和結(jié)膜囊，2％鹽酸利多卡因和1.3％鹽酸布比卡因各5ml，球后麻醉。在眼科手術(shù)顯微鏡下，沿術(shù)眼角膜緣環(huán)形剪開球結(jié)膜和結(jié)膜下筋膜，暴露鞏膜。環(huán)形去除角膜緣外1mm的鞏膜和殘留的結(jié)膜及角膜緣和角膜緣內(nèi)2mm的角膜上皮組織(深約200um)。燒灼止血。然后，用蘸有1N NaOH棉簽擦除中央角膜上皮，并燒傷至角膜基質(zhì)發(fā)白。立即用生理鹽水沖洗5min。術(shù)后術(shù)眼用氯霉素眼水滴眼，每日兩次。術(shù)后每天觀察，并詳細(xì)記錄結(jié)膜炎癥，瞼球粘連，角膜基質(zhì)溶解、穿孔等情況。處理后4周，角膜表面血管化、結(jié)膜化，未發(fā)生瞼球粘連和潰瘍性穿孔。并根據(jù)角膜混濁度和表面新生血管化、結(jié)膜化(細(xì)胞壓跡學(xué)檢查出現(xiàn)杯細(xì)胞)等指標(biāo)，來判定屬角膜緣干細(xì)胞完全缺失病理模型，作為移植的實驗動物模型(圖1)。
2.表皮干細(xì)胞分離擴(kuò)增與羊膜植片制作培養(yǎng)無菌采取關(guān)中奶山羊耳緣皮膚，在無菌間用PBS沖洗數(shù)遍，去污物，在解剖鏡下將皮膚與軟骨分離，將皮膚切成0.1×0.1cm2大小的小塊，按表皮面朝上貼于3.5cm塑料皿中，加適量培養(yǎng)液(M199+15～20％NBS+5～8μg/ml insulin+0.5μg/ml氫化可的松+100u/ml青鏈霉素+100ug/ml鏈霉素)，兩天換液一次，3-4天后皮膚組織塊四周有上皮樣細(xì)胞鋪層生長，7-12d后在上皮層上有表皮干細(xì)胞克隆生長，待這些克隆直徑達(dá)100-150μm時，在解剖鏡下挑取這些克隆，用0.2％Trypsin和0.02％EDTA適當(dāng)處理，用玻璃針(自制)將這些細(xì)胞分離并吸入鋪有明膠的3.5cm塑料皿中，用自行設(shè)計的無血清培養(yǎng)基，待細(xì)胞增殖達(dá)75％融合時，用0.25％Trypsin+0.02％EDTA進(jìn)行消化，傳代培養(yǎng)。
分離純化皮膚表皮干細(xì)胞的制作包括以下步驟1)首先取一塊皮膚，置于含青鏈霉素的生理鹽水中，用含青鏈霉素的PBS(一)沖洗，去血污及毛發(fā)；2)在解剖鏡下將皮膚與皮下組織分開，將皮膚切成0.1～0.2×0.1～0.2cm2大小的小塊，按表皮面朝上貼于玻璃平皿中，每皿3-4塊，加培養(yǎng)基；培養(yǎng)基的配方為Medium199+15～20％NBS(新生牛血清)+5～8μg/ml insulin(胰島素)+0.5μg/ml氫化可的松+100u/ml青鏈霉素+100ug/ml鏈霉素；3)置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱內(nèi)的條件為5％CO2，飽和濕度，37℃，每兩天換液一次；4)經(jīng)3天-4天后，從組織塊邊緣長出上皮樣細(xì)胞鋪路石樣生長，7天-12天后，在上皮樣細(xì)胞層上有小圓形細(xì)胞聚集呈克隆樣生長，待這些克隆直徑達(dá)100-150μm時，在解剖鏡下挑取這些克隆，用0.20％Trypsin即胰蛋白酶和0.02％EDTA適當(dāng)處理，用玻璃針將這些細(xì)胞吸入鋪有明膠的3.5cm塑料皿中，用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)；無血清培養(yǎng)基的配方為F12+1～1.2％BSA(牛血清白蛋白)+20～25％GSFCM+20～25ng/ml EGF+5ug/ml insulin+20ng/ml IGF-1+0.4～0.6ug/ml氫化可的松+100u/ml青鏈霉素+100ug/ml鏈霉素。
5)待細(xì)胞增殖達(dá)75％融合時，用0.25％Trypsin+0.02％EDTA進(jìn)行消化，傳代培養(yǎng)，用無血清培養(yǎng)基將關(guān)中奶山羊表皮干細(xì)胞傳25代凍存，將人類表皮干細(xì)胞傳5代凍存；6)對所獲得細(xì)胞進(jìn)行當(dāng)前同行公認(rèn)的表皮干細(xì)胞分子標(biāo)志的檢測CK19，integrin-β1P63，integrin-α6均為陽性，即證明所分選的是純化的表皮干細(xì)胞。
上述分離純化皮膚表皮干細(xì)胞的方法，申請人已申請國家專利，申請?zhí)枮?00410025939.X。
無血清培養(yǎng)基的配方為F12(Initrogen Corporation Lot1116568)+1～1.2％BSA(牛血清白蛋白Sigma，LOT 716H9310)+20～25％GSFCM(goat skin fibroblast conditionalmedium，GSFCM，山羊成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基)+20～25ng/ml EGF(表皮細(xì)胞生長因子，Sigma，E-mailtechserv@sial.com，Product Number E9644)+5ug/ml insulin(胰島素)+15～20ng/ml IGF-1胰島素類生長因子-1，SigmaE-mailtechserv@sial.com，product Number I3769)+0.4～0.6μg/ml氫化可的松+100u/ml青鏈霉素+100ug/ml鏈霉素；本發(fā)明將3-4代純化的表皮干細(xì)胞(圖2)接種在去上皮細(xì)胞的人類羊膜支架上，用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)(37℃，5％CO2，飽和濕度)。第一周為浸沒培養(yǎng)(37℃，5％CO2，飽和濕度)，每兩天換液；第2-3周氣-液界面培養(yǎng)(37℃，5％CO2，飽和濕度)，每天換液。
表皮干細(xì)胞在羊膜上正常增殖分化(圖3)。培養(yǎng)21天后，表皮干細(xì)胞在羊膜上分化形成復(fù)層，即為可用于移植的表皮干細(xì)胞羊膜植片。所制做的表皮干細(xì)胞羊膜植片具有透明度良好，彈性好，可操作性強(qiáng)等特點(圖4)。經(jīng)透射電鏡觀察，表皮干細(xì)胞分為5-6層細(xì)胞，基底層細(xì)胞呈柱狀為祖細(xì)胞特征，細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞間有橋粒結(jié)構(gòu)，細(xì)胞與基底膜之間有橋粒結(jié)構(gòu)，表明表皮干細(xì)胞羊膜植片具有正常角膜上皮的相似結(jié)構(gòu)(圖5)。
3.移植實驗羊移植前絕食一天。手術(shù)時846合劑2.4-2.6ml，肌注全麻，側(cè)臥保定于手術(shù)床，剪去眼睫毛，碘酒消毒術(shù)眼外周皮毛，酒精脫碘。鋪羊眼創(chuàng)布、開瞼器開瞼，雙抗生理鹽水(硫酸青霉素2×105u/L、鏈霉素200mg/L)沖洗眼表和結(jié)膜囊，2％鹽酸利多卡因和1.3％鹽酸布比卡因各5ml，球后麻醉眼球。剪開球結(jié)膜，暴露鞏膜，0.05％絲裂霉素棉花條置結(jié)膜下的鞏膜上作用5min，用生理鹽水反復(fù)沖洗。剪除整個角膜和角膜緣表面病變、增生組織，盡量使角膜基質(zhì)恢復(fù)透明、植床平整，并燒灼止血，完全清除淤血，生理鹽水反復(fù)沖洗后準(zhǔn)備移植。移植前，將已培養(yǎng)好的表皮干細(xì)胞羊膜植片使用生理鹽水沖洗3-5遍，每次5min，消除培養(yǎng)基中異原蛋白對植片的影響。將表皮干細(xì)胞羊膜植片上皮面向下覆蓋于術(shù)部，羊膜四角先縫四針，固定于鞏膜上若術(shù)眼暴露不良，應(yīng)于上、下直肌處各固定一根引線，至少每個鐘點位結(jié)節(jié)縫合一針，將羊膜固定于術(shù)部(如圖6)。用角膜切開刀在已固定粘附好的羊膜上輕輕劃開2-4個垂直切口，切口的大小應(yīng)以不撕裂羊膜為度。2mg地塞米松、40萬單位慶大霉素各一支混合結(jié)膜囊下注射。角膜寧眼藥水點眼，術(shù)眼眼瞼復(fù)位，并用無菌紗布暫時覆蓋。術(shù)后第一周每天肌肉注射青霉素、鏈霉素、地塞米松，術(shù)后三周內(nèi)每天0.3％氧氟沙星、地塞米松眼藥水點眼2次，并按時觀察照相，極時處理不良反應(yīng)，第二周末拆除部分固定線。此后滴潤舒眼藥水至第6周，定期觀察記錄術(shù)眼 變化情況。八個月后有3/4的實驗羊眼表修復(fù)重建效果明顯，其中有1號，2號模型羊眼表有明顯透明區(qū)，并不斷擴(kuò)大(圖7-8)。
實驗結(jié)果顯示，以羊膜負(fù)載皮膚表皮干細(xì)胞構(gòu)建羊膜植片，能有效重建干細(xì)胞缺損的角膜緣，并重建受損眼表，這一發(fā)明一旦應(yīng)用于人類眼科臨床能給無數(shù)因角膜緣干細(xì)胞缺損而致盲的人帶來光明，造福于人類社會。同時可用于寵物，珍稀野生動物，珍貴家畜角膜緣干細(xì)胞缺損眼表修復(fù)。
權(quán)利要求
1.一種表皮干細(xì)胞構(gòu)建的人工角膜上皮植片的制備方法，采用來源于成體皮膚組織的表皮干細(xì)胞進(jìn)行制備，其特征在于，包括以下步驟1)無菌采取0.5×0.6cm2大小的成人頸部皮膚或哺乳動物(主要包括寵物，家畜和珍稀野生動物)耳緣皮膚，用組織塊培養(yǎng)法和克隆篩選法分離純化表皮干細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)增，并對所獲得干細(xì)胞進(jìn)行CK19、P63、integrin-β1等表皮干細(xì)胞的標(biāo)志蛋白免疫組織化學(xué)檢測，均為陽性，證明所使用的細(xì)胞具表皮干細(xì)胞特征；2)將3-4代的純化的表皮干細(xì)胞接種在去上皮細(xì)胞的人羊膜支架上，用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，第一周為浸沒培養(yǎng)，培養(yǎng)條件37℃，5％CO2，飽和濕度，每兩天換液；第2-3周采用氣-液界面培養(yǎng)，培養(yǎng)條件37℃，5％CO2，飽和濕度，每天換液；培養(yǎng)21天后，表皮干細(xì)胞在羊膜上分化形成復(fù)層，即為可用于移植的表皮干細(xì)胞羊膜植片；3)所制作的表皮干細(xì)胞羊膜植片經(jīng)透射電鏡觀察，表皮干細(xì)胞分為5-6層細(xì)胞；基底層細(xì)胞呈柱狀為祖細(xì)胞特征，細(xì)胞形態(tài)正常；細(xì)胞間有橋粒結(jié)構(gòu)，細(xì)胞與基底膜之間有半橋粒結(jié)構(gòu)，具有正常角膜上皮相似結(jié)構(gòu)。
2.如權(quán)利要求1所述的表皮干細(xì)胞構(gòu)建的人工角膜上皮植片，其特征在于，人羊膜支架的制備包括以下步驟1)羊膜取HIV、甲肝、乙肝、以及梅毒等血清學(xué)反應(yīng)顯示為陰性的剖腹產(chǎn)分娩產(chǎn)婦的胎兒胎盤，在無菌間內(nèi)，將帶有羊膜的胎膜囊放入加有青霉素、鏈霉素的生理鹽水中，頓性剝離附著在胎膜囊上的羊膜；2)將剝離下的羊膜用生理鹽水反復(fù)沖洗，直至血液及其他污物被徹底清洗掉；再用含青霉素、鏈霉素的PBS沖洗3-5遍；用細(xì)胞刮以及角膜鑷頓性剝離海綿層；3)將去除海綿層的羊膜用含青霉素、鏈霉素的PBS沖洗，然后用眼科剪分成數(shù)小塊，分別平鋪于玻璃平皿內(nèi)，加入0.1-0.4％的胰酶，其中含0.05-0.2％的EDTA，經(jīng)8-24小時消化去除上皮細(xì)胞；4)將去除上皮細(xì)胞的羊膜基底面向上平鋪于玻璃皿內(nèi)，將醋酸纖維素膜(NC膜)剪成中空的正方形(根據(jù)所需確定邊長)附于其上，然后翻轉(zhuǎn)，使其羊膜上皮面向上放入另一培養(yǎng)皿內(nèi)；于恒溫箱內(nèi)放置30～120分鐘，即可用于表皮干細(xì)胞羊膜植片的培養(yǎng)。
3.如權(quán)利要求1所述的表皮干細(xì)胞構(gòu)建的人工角膜上皮植片，其特征在于，所述無血清培養(yǎng)基的配方為F12+1～1.2％BSA+20～25％GSFCM+20～25ng/mlEGF+5ug/mlinsulin+15～20ng/mlIGF-1+0.4～0.6μg/ml氫化可的松+100u/ml青霉素+100ug/ml鏈霉素；
4.表皮干細(xì)胞構(gòu)建人工角膜上皮植片用于移植修復(fù)人類或動物因角膜緣干細(xì)胞缺損導(dǎo)致視力嚴(yán)重下降或失明的眼表的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用表皮干細(xì)胞構(gòu)建的人工角膜上皮植片的制備及用于移植修復(fù)因角膜緣干細(xì)胞缺損而失明的眼表的用途。表皮干細(xì)胞構(gòu)建的人工角膜上皮植片，無菌采取成人頸部或關(guān)中奶山羊耳緣皮膚，用組塊培養(yǎng)法和克隆篩選法分離純化表皮干細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)增，并對所獲干細(xì)胞進(jìn)行CK
文檔編號C12N5/08GK1563366SQ20041002603
公開日2005年1月12日 申請日期2004年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月9日
發(fā)明者楊學(xué)義, 屈雷, 王馨, 竇忠英 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)