專利名稱：組織型纖溶酶原激活劑缺失突變體基因轉(zhuǎn)染細胞株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細胞生物學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域，其技術(shù)涉及細胞生物學(xué)與分子生物學(xué)的相關(guān)實驗方法與技術(shù)，特別是一種組織型纖溶酶原激活劑缺失突變體基因轉(zhuǎn)染細胞。
背景技術(shù)：
心血管疾病引發(fā)的血栓并發(fā)癥嚴重威脅人類的生命與健康，是導(dǎo)致死亡和病殘的主要疾病之一。全世界每年心血管病患者多達幾千萬；我國血栓性疾病的發(fā)生人數(shù)近年來也明顯上升，每年高達300萬，且治療后復(fù)發(fā)率較高，而由血栓造成的急性心肌梗塞(Acutemyocardial infarction，AMI)的死亡率可高達30％，對于許多AMI患者來說，溶栓治療是提高存活率及保持左心室功能的首選方法，故疾病發(fā)作時，進行及時有效的特效藥物治療以保證血液循環(huán)的正常暢通，對提高患者的生存率十分重要。
目前臨床上已正式批準(zhǔn)使用和試用的溶栓劑可劃分為三代，其中，作為第二代溶栓劑之一的組織型纖溶酶原激活劑(tissue-typeplasminogen activator，t-PA)是血中纖溶系統(tǒng)中天然存在的生理性激活劑，其能特異地激活纖溶酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶，而后者能在血栓局部有效地溶解血栓中的纖維蛋白，使血管再通，與其它溶栓劑相比，t-PA具有引起全身出血傾向小，溶栓后再凝趨勢弱的優(yōu)點；因此能夠發(fā)揮高效、特異的溶栓作用。但是，盡管t-PA在臨床上存在有很多的益處，其溶栓治療卻也常常受到限制，這主要是因為t-PA在血中的半衰期甚短(3～5分鐘)，使得在臨床治療中為維持其有效濃度而必須大劑量靜脈滴注，從而增加了引起系統(tǒng)性出血的危險。除此之外，溶栓治療時，大量t-PA的使用也使其價格令人難以接受。因此設(shè)計并研制延長半衰期，降低系統(tǒng)出血傾向，提高特異活性，簡化給藥途徑，價格便宜的新型t-PA愈發(fā)重要；基于此，人們努力開發(fā)研制新型第三代溶栓試劑。
作為第三代溶栓制劑之一的rPA(Reteplase，t-PA的V4～E175缺失突變體)，早在1996年就已通過FDA的認證，與野生型t-PA相比，其有許多的優(yōu)點，如半衰期相對延長；對患者用藥時，可以采用推注而非滴注的方式等等，但由于rPA為大腸桿菌的表達產(chǎn)物，需要進行大量的純化與復(fù)性方面的工作，從而增加了生產(chǎn)成本，使其在國內(nèi)臨床上難以得到廣泛的應(yīng)用。
而對于真核細胞表達系統(tǒng)來說，由于其不僅能夠正確剪接加工成熟的mRNA，提高產(chǎn)品正確構(gòu)型的幾率，且表達產(chǎn)物具有遺傳穩(wěn)定性和可重復(fù)性，可分泌到培養(yǎng)基中，提純工藝簡單，成本也較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種以真核細胞表達方法得到的組織型纖溶酶原激活劑缺失突變體基因轉(zhuǎn)染細胞株CHO-dhfr-pCSRA(保藏號CGMCC No.1093)。
本發(fā)明的目的按下述方案實現(xiàn)
一種組織型纖溶酶原激活劑缺失突變體基因轉(zhuǎn)染細胞株，它是將t-PA V4～E175缺失突變體cDNA的真核表達載體pCSRA轉(zhuǎn)染CHO-dhfr-細胞，經(jīng)G418及DMEM的雙重選擇后，首次獲得其穩(wěn)定表達細胞株CHO-dhfr-pCSRA(保藏號CGMCC No.1093)。
本發(fā)明對上述細胞株生物學(xué)特性進行了鑒定。其中，F(xiàn)APA檢測結(jié)果表明，表達產(chǎn)物具有良好的溶纖活性；80℃平板滅活實驗表明，產(chǎn)物具有特異活性；Western blotting結(jié)果表明，產(chǎn)物具有特異抗原性；穩(wěn)定性試驗表明，細胞株具有良好的穩(wěn)定性。實驗中，還對無血清培養(yǎng)基CHO-S-SFMII與常規(guī)培養(yǎng)基DMEM培養(yǎng)條件下的細胞株特性進行了比較，其中24h，48h，72h時，目的產(chǎn)物的表達量，前者均約為后者的2倍；SDS-PAGE顯示，前者僅有少量的蛋白質(zhì)條帶，而后者則存在有大量的蛋白質(zhì)條帶。
具體實施例方式本發(fā)明是以脂質(zhì)體介導(dǎo)法將自行構(gòu)建的t-PA V4～E175缺失突變體cDNA的真核表達載體pCSRA轉(zhuǎn)染CHO-dhfr-細胞，經(jīng)G418及DMEM的雙重選擇后，獲得其穩(wěn)定表達細胞株CHO-dhfr-pCSRA(保藏號CGMCC No.1093)。并對細胞株進行了一系列生物學(xué)特性鑒定。
實驗中還首次對無血清培養(yǎng)基(serum free medium，SFM)在rPA生產(chǎn)應(yīng)用方面進行了探索，從而進一步證明了SFM對于生產(chǎn)藥用性蛋白質(zhì)的廣闊前景。本發(fā)明為臨床上開發(fā)和應(yīng)用延長半衰期，降低系統(tǒng)出血傾向，提高特異活性，簡化給藥途徑和價格便宜的新型長效的t-PA奠定了良好基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
1.一種組織型纖溶酶原激活劑缺失突變體基因轉(zhuǎn)染細胞株，其特征在于它是t-PA V4～E175缺失突變體cDNA的真核表達載體pCSRA轉(zhuǎn)染CHO-dhfr-細胞，經(jīng)G418及DMEM的雙重選擇后，首次獲得其穩(wěn)定表達細胞株CHO-dhfr-pCSRA(保藏號CGMCC No.1093)。
全文摘要
本發(fā)明是一種組織型纖溶酶原激活劑缺失突變體基因轉(zhuǎn)染細胞株，它是以脂質(zhì)體介導(dǎo)法將含有t－PA經(jīng)G418及DMEM的雙重選擇后，獲得其穩(wěn)定表達細胞株CHO－dhfr
文檔編號C12N15/85GK1560240SQ20041000473
公開日2005年1月5日 申請日期2004年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月1日
發(fā)明者王玉炯, 李敏, 扈榮良, 羅惠霞 申請人:寧夏大學(xué)