專利名稱：檢測基因性疾病的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因性疾病的診斷方法。具體地講，本發(fā)明涉及使用試劑盒檢測基因性疾病的方法。本發(fā)明還涉及所述的方法使用的試劑盒。
現(xiàn)有技術(shù)免疫球蛋白E(IgE)在過敏性疾病(包括氣喘)的發(fā)展上扮演重要角色。高的血清IgE水平與過敏的臨床表現(xiàn)互有關(guān)聯(lián)。見Johansson etal.(1972)Prog.Clin.Immunol.1157-181，Burrows et al.(1989)N.Engl.J.Med.320271-277，Sears et al.(1991)，N.Engl.J.Med.3251067-1071，及Halonen et al.(1992)Am.Rev.Respir.Dis.146886-870。流行病學(xué)研究顯示，高IgE水平與支氣管的反應(yīng)過度有關(guān)，其系為氣喘表型的主要表征。見Sears et al.(1991)N.Engl.J.Med.3251067-1071，Hopp et al.(1984)J.Allergy Clin.Immunol.73(2)154-158，及Burrows et al.(1991)J.Allergy Chin.Immunol.88870-877。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及基因性疾病的診斷方法，其是以個(gè)體中微衛(wèi)星標(biāo)記及單一核苷酸多形性標(biāo)記的存在為基礎(chǔ)。
本發(fā)明一方面涉及一種發(fā)展可檢測個(gè)體基因性疾病工具的方法。該方法包括鑒定微衛(wèi)星標(biāo)記及單一核苷酸多形性標(biāo)記。個(gè)體中如存有微衛(wèi)星標(biāo)記及單一核苷酸多形性標(biāo)記則顯示該個(gè)體有基因性疾病或?yàn)槠涓呶ｋU(xiǎn)群。此微衛(wèi)星及單一核苷酸多形性標(biāo)記，可依據(jù)其物理相關(guān)性(如在相同或互相接近的染色體上)或功能的關(guān)聯(lián)性(皆均與特定疾病有關(guān))而鑒知。例如，頃發(fā)現(xiàn)D5S2011及CD14-rs2563310與高IgE型氣喘有關(guān)，因?yàn)楸舜嗽诘?號染色體上是相近的。在本發(fā)明范圍內(nèi)也包括檢測個(gè)體中基因性疾病的試劑盒。試劑盒中含有檢測微衛(wèi)星標(biāo)記的第一作用物，及檢測單一核苷酸多形性標(biāo)記的第二作用物。在一個(gè)體中如測知具有該二標(biāo)記，表示該個(gè)體罹患有基因性疾病，或有罹患該疾病的危險(xiǎn)性。
本發(fā)明另一方面涉及一種決定個(gè)體是否有基因性疾病或有罹患此疾病危險(xiǎn)性的方法。該方法系先取得個(gè)體的核酸樣品，再檢測微衛(wèi)星標(biāo)記及單一核苷酸多形性標(biāo)記。如測得此二者均存在者，表示該個(gè)體有基因性疾病或有發(fā)展此疾病的危險(xiǎn)性。
在一實(shí)施例中，微衛(wèi)星標(biāo)記是D5S2011E標(biāo)記，而單一核苷酸多形性標(biāo)記是CD14-rs2563310T標(biāo)記。如測得此二者均存在者，表示個(gè)體有過敏性疾病或有此疾病的危險(xiǎn)性，且其IgE血清濃度在1000IU/毫升或以上，或有此危險(xiǎn)性。D5S2011是一種人類5q31上的二-核苷酸重復(fù)子型微衛(wèi)星標(biāo)記。具有D5S2011E標(biāo)記的個(gè)體可有EE或EX基因型。CD14-rs2563310是一種人類單一核苷酸多形性標(biāo)記(T/C)，位在第5號染色體中CD14基因的加強(qiáng)子區(qū)域(位置-2984)。具有CD14-rs2563310T標(biāo)記的個(gè)體具有TT或TC基因型。過敏性疾病包括氣喘及非氣喘型異位癥(如異位性皮膚炎，I型糖尿病、骨質(zhì)疏松癥、發(fā)炎性腸疾及過敏性鼻炎)。接受診斷的個(gè)體可為來自蒙古人種(Mongoloid)，如臺灣人。本發(fā)明也提供檢測過敏性疾病的試劑盒。試劑盒中含有可檢測D5S2011E微衛(wèi)星標(biāo)記的第一作用物，及可檢測CD14-rs2563310T單一核苷酸多形性標(biāo)記的第二作用物。
再者，本發(fā)明有關(guān)于一種過敏性疾病再分類的方法。在一個(gè)實(shí)施例中，該方法系取得過敏性疾病的個(gè)體或其高危險(xiǎn)群個(gè)體的核酸樣品，并檢測D5S2011E微衛(wèi)星標(biāo)記。如檢測有D5S2011E標(biāo)記，則表示個(gè)體的血清IgE濃度在1000IU/毫升或以上，或有此危險(xiǎn)性。本發(fā)明也提供一種包裝產(chǎn)品，其中包括(1)一種容器，(2)可檢測D5S2011E微衛(wèi)星標(biāo)記的作用物，及(3)與容器有關(guān)的說明，其指明如個(gè)體中有D5S2011E標(biāo)記存在，表示該個(gè)體有過敏性疾病或有此危險(xiǎn)性，且其血清IgE濃度在1000IU/毫升或以上，或有此危險(xiǎn)性。
在另一實(shí)施例中，該方法系取得過敏性疾病個(gè)體或高危險(xiǎn)群個(gè)體的核酸樣品，并檢測D5S2011J微衛(wèi)星標(biāo)記。如檢測有D5S2011J標(biāo)記，則顯示個(gè)體的血清IgE濃度在200IU/毫升或以下，或有此危險(xiǎn)性。本發(fā)明也提供包裝產(chǎn)品，其中包括(1)一種容器，(2)一種可檢測D5S2011J微衛(wèi)星標(biāo)記的作用物，及(3)與容器有關(guān)的說明，其指明如個(gè)體中D5S2011J標(biāo)記存在，表示該個(gè)體有過敏性疾病或有此危險(xiǎn)性，且其血清IgE濃度在200IU/毫升或以下，或有此危險(xiǎn)性。
又另一實(shí)施例中，該方法系取得過敏性疾病個(gè)體或其危險(xiǎn)群個(gè)體的核酸樣品，再檢測CD14-rs2563310T單一核苷酸多形性標(biāo)記。如檢測有CD14-rs2563310T標(biāo)記，則顯示個(gè)體的血清IgE濃度在1000IU/毫升或以上，或有此危險(xiǎn)性。本發(fā)明也提供包裝產(chǎn)品，其中包括(1)一種容器，(2)可檢測CD14-rs2563310T單一核苷酸多形性標(biāo)記的作用物，及(3)與容器有關(guān)的說明，其指明如個(gè)體中有CD14-rs2563310T標(biāo)記存在，顯示該個(gè)體有過敏性疾病或有此危險(xiǎn)性，且其血清IgE濃度在1000IU/毫升或以上，或有此危險(xiǎn)性。
本發(fā)明的方法，試劑盒及包裝產(chǎn)品可用于基因性疾病的診斷、預(yù)防及治療。本發(fā)明一個(gè)以上具體實(shí)施例的詳細(xì)描述見下文所附的說明內(nèi)。本發(fā)明其它優(yōu)點(diǎn)、特色及目的，經(jīng)由以下詳細(xì)說明及所附的權(quán)利要求中顯示而易見。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的基礎(chǔ)在于意外發(fā)現(xiàn)個(gè)體中微衛(wèi)星標(biāo)記及單一核苷酸多形性標(biāo)記同時(shí)存在者顯示其具基因性疾病，其可信度更甚于各別標(biāo)記的存在。如以下實(shí)施例所示者，有D5S2011E微衛(wèi)星標(biāo)記存在的氣喘患者，其IgE血清濃度在1000IU/毫升或以上的可能性是無檢測出D5S2011E標(biāo)記存在者的約3倍。另一方面，有CD14-rs2563310T單一核苷酸多形性標(biāo)記的氣喘病人，其IgE血清濃度在1000IU/毫升或以上的機(jī)率則較無CD14-rs2563310T標(biāo)記者高出2倍。令人驚訝地，有D5S2011E標(biāo)記及CD14-rs2563310T標(biāo)記二者的氣喘病人，其IgE血清濃度在1000IU/毫升或以上的機(jī)率較此二標(biāo)記均無者高出5倍。因此，本發(fā)明涉及一種發(fā)展可檢測基因性疾病工具的方法，是檢測個(gè)體中的微衛(wèi)星標(biāo)記及單一核苷酸多形性標(biāo)記。此二標(biāo)記的存在可作為基因性疾病的表征。
微衛(wèi)星為2～6bps的短的縱列重復(fù)子，其廣泛分布在人體基因體中(Amos and Rubinsztein(1996)Nature Genetics 1213-14及Edwards et al.(1991)Am.J.Hum.Genet.49746-756)。其已被充分地應(yīng)用于染色體連鎖輿圖訂定，以及法醫(yī)學(xué)及群體研究(Bowcocket al.(1994)Nature 368455-457及Brinkmann et al.(1996)Hum.Genet.9860-64)。在這些位點(diǎn)上所觀察到的多形性是由于單一單位重復(fù)子數(shù)目的變化所致(Valdes，et al.(1993)Genetics 133737-749及Levinson and Gutman(1987)Mol.Biol.Evol.4203-221)，微衛(wèi)星標(biāo)記的檢測是先從個(gè)體中取得核酸，以引物對擴(kuò)大核酸片段，并鑒定已擴(kuò)大的片段。引物序列可由公開數(shù)據(jù)庫中找出，或根據(jù)寡核苷酸的特性由軟件程序所設(shè)計(jì)，如回冷溫度及內(nèi)部配對。核酸可依據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法自組織樣品或流體樣品中制備。核酸的擴(kuò)大，如經(jīng)由聚合酶連鎖反應(yīng)(PCR)，可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)步驟來進(jìn)行。如見，Ausubelet al.(1989)Current Protocols in Molecular Biology，John Wileyand Sons，New York；and Innis et al.(1990)PCR ProtocolsA Guideto Methods and Applications.Academic Press，Harcourt BraceJavanovich，New York.
利用標(biāo)準(zhǔn)方法可鑒定不同大小的經(jīng)擴(kuò)大的片段，此類標(biāo)準(zhǔn)方法如大小分級分離，以質(zhì)譜儀為基礎(chǔ)的檢測，或其它任何的片段大小篩選技術(shù)。大小分級分離是依據(jù)其大小來分離DNA分子，如經(jīng)由聚丙烯酰胺凝膠電泳。大小分級分離也可以層析法完成，如凝膠過濾法。溶液中的DNA片段經(jīng)過充填有層析凝膠的管柱時(shí)，可依其大小分離。質(zhì)譜儀則提供DNA分子″稱重″的方法，系將分子在真空下離子化，并利用揮發(fā)作用使其″飛揚(yáng)(fly)″。其可同時(shí)用來鑒定許多DNA分子。如見U.S.Pat.No.6,268,144。
為促進(jìn)經(jīng)擴(kuò)大的不同大小片段的鑒定，經(jīng)擴(kuò)大片段在擴(kuò)大作用過程或可予以標(biāo)記，如納入經(jīng)標(biāo)記的核苷酸，或利用經(jīng)標(biāo)記的引物。除了放射活性標(biāo)記外，可使用其它標(biāo)記如螢光素，化學(xué)發(fā)光及電化發(fā)光。見Kricka(1992)Nonisotopic DNA Probe Techniques Academic Press，San Diego，pp.3-28。螢光標(biāo)記的實(shí)施例包括螢光素，若丹明(rhodamines)(U.S.Pat.Nos.5,366,860、5,936,087及6,051,719)，花青類(U.S.Pat.No.6,080,868及WO97/45539)，及金屬卟啉復(fù)合物(WO88/04777)。特別地，螢光素如6-羧基螢光素(FAM)、2’，4’，1，4-四氯螢光素(TET)，2’，4’，5’，7’，1，4-六氯螢光素(HEX，U.S.Pat.No.5,654,442)2’，7’-二甲氧基-4’，5’-二氯-6-羧基若丹明(JOE)，2’-氯-5’-氟-7’，8’-稠合的苯基-1，4-二氯-6-羧基螢光素(U.S.Pat.Nos.5,188,934及5,885,778)，或2’-氯-7’-苯基-1，4-二氯-6-羧基螢光素6(U.S.Pat.No.6,008,379)。若丹明可為四甲基-6-羧基若丹明(TAMRA)或四丙烷-6-羧基若丹明(ROX)，且花青類可為蓖醌、孔雀綠、或硝基噻唑或硝基咪唑化合物。
經(jīng)標(biāo)記的擴(kuò)大片段可由放射自顯術(shù)或激光檢測直接鑒定，繼以計(jì)算機(jī)輔助的圖像顯示及分析。例如，當(dāng)使用不同的螢光標(biāo)記時(shí)，多種或匯集的PCR產(chǎn)物可利用CCD照相機(jī)GeneScan及Genotyper軟件(Applied Biosystem)同時(shí)分析。GeneScan及Genotyper軟件可進(jìn)一步處理數(shù)據(jù)，即將數(shù)據(jù)文件中的標(biāo)記名稱自動(dòng)輸入，再將其輸出至Excel或Text的資料格式。
單一核苷酸多形性(SNP)發(fā)生在為單一核苷酸所在的多形位置上，此為配對基因序列間變化的所在?！宥嘈涡浴迨侵冈趥€(gè)體族群中有二種以上遺傳上已定的不同序列或配對基因的發(fā)生。SNP通常因置換所致，如在多形性位置上一核苷酸被另一核苷酸轉(zhuǎn)移地(transition)或轉(zhuǎn)換地(transversion)置換。轉(zhuǎn)移是一嘌呤被另一嘌呤所取代，或一嘧啶被另一嘧啶所取代。轉(zhuǎn)換作用是嘌呤為嘧啶所取代，或反之亦然。相較于參考配對基因而言，SNPs也可始自核苷酸的刪除或核苷酸的嵌入。
各項(xiàng)本領(lǐng)域已知的適合步驟均可用來檢測SNP標(biāo)記。其中部分將詳述于下。
(1)配對基因-特異性探針可分析多形性的配對基因-特異性探針的設(shè)計(jì)及使用是本領(lǐng)域已知的(如見EP 235,726及WO89/11548)。配對基因特異性探針，可根據(jù)片段多形型式的存在經(jīng)設(shè)計(jì)為差別性雜交，如與一個(gè)體中的DNA片段雜交但另一個(gè)體中相當(dāng)?shù)钠蝿t不是這樣?？墒褂孟喈?dāng)嚴(yán)緊的雜交條件，使配對基因間的雜交強(qiáng)度有顯著差異，并可取得探針只與配對基因的一雜交的條件。探針經(jīng)設(shè)計(jì)可與DNA片段雜交，如此多形性位置與探針的中央部分排成一列。
配對基因一特異性探針可成對使用，其中此配對基因中的一成員可與目的序列的參考型式完美地符合，而另一成員則與目的序列的變型完美地符合。使用在相同載體上固化的許多探針對，可同時(shí)分析相同目的序列中多樣的多形性。
(2)鋪瓦數(shù)組(Tiling arrays)多形性也可由雜交至核酸數(shù)組而鑒定(如見WO95/11995)。WO95/11995中也描述子矩陣(subarray)，其是更加完善以檢測預(yù)特性化多形性的變型。此子矩陣中含經(jīng)過設(shè)計(jì)可與-第二參考序列的探針互補(bǔ)，其為第一參考序列的配對基因變型。第二組探針經(jīng)過設(shè)計(jì)則可與第二參考序列呈現(xiàn)互補(bǔ)性。在分析主要參考序列中短的子序列方面，第二組的納入(或進(jìn)一步的各組)特別有用，其中預(yù)期在與探針長度相稱的短距離內(nèi)可發(fā)生多重突變(即9至21個(gè)堿基內(nèi)有二個(gè)以上的突變)。
(3)配對基因-特異性引物配對基因-特異性引物可雜交至目的DNA多形性重疊位置，且只有該引物配對基因型的原始擴(kuò)大作用，才有完美互補(bǔ)的呈現(xiàn)。如見Gibbs(1989)Nucleic Acid Res.172427-2448。該引物可和雜交至末稍位置的第二引物配合使用。擴(kuò)大作用即由二種引物開始進(jìn)行，生成一可檢測產(chǎn)物表示有特殊的配對基因型式的存在。而對照組通常以第二組引物對來進(jìn)行，其中一者在多形性位置上有單一堿基的錯(cuò)配(mismatch)，而另一者呈現(xiàn)與末稍位置完美的互補(bǔ)。單一堿基錯(cuò)配可阻止擴(kuò)大作用，并未能形成可檢測產(chǎn)物。該方法更為完善可將與多形性對齊的寡核苷酸最3’位置的錯(cuò)配納入，因?yàn)榇宋恢脤τ谧砸锾幯娱L是最不穩(wěn)定的。如見，WO93/22456。
(4)直接測序本發(fā)明多形性序列的直接分析可利用二去氧鏈終止方法或MaxamGillbert方法中任一法來完成(見Sambrook et al(1989)MolecularCloning，A Laboratory Manual，2nd Ed.，CSHP，New York and Zyskindet al.(1988)Recombinant DNA Laboratory Manual，Acad.Press)。
(5)變性梯度凝膠電泳利用聚合酶連鎖反應(yīng)所產(chǎn)生的擴(kuò)大產(chǎn)物可利用變性梯度凝膠電泳加以分析。不同配對基因的鑒定系以不同的序列-相關(guān)熔化特性及DNA在溶液中的電泳移動(dòng)為基礎(chǔ)。見Erlich ed.(1992)PCR Technology，Chapter7Principles and Applications for DNA Amplification，W.H.Freeman and Co.，New York。
(6)單股構(gòu)型多形性分析目的序列的配對基因可利用單股構(gòu)型多形性分析加以區(qū)別，其中經(jīng)由單股PCR產(chǎn)物在電泳移動(dòng)上的變化來鑒定堿基的差異，如Orita etal.(1989)Proc.Nat.Acad.Sci.862766-2770所述。經(jīng)擴(kuò)大的PCR產(chǎn)物如上述般產(chǎn)生，并加熱或另外變性以形成單股擴(kuò)大產(chǎn)物。單股核酸可再折疊或形成二級結(jié)構(gòu)，其部份依堿基序列而定。單股擴(kuò)大產(chǎn)物不同的電泳移動(dòng)力與目的序列配對基因間的堿基-序列差異有關(guān)。
可利用本領(lǐng)域熟知的統(tǒng)計(jì)分析來發(fā)展確立微衛(wèi)星標(biāo)記、SNP標(biāo)記，或二者，與特異表型的結(jié)合。例如，若標(biāo)記的特異配對基因頻率在有基因性疾病族群中顯著較高，則可獲致以下結(jié)論標(biāo)記的特異配對基因可作為有基因性疾病的表征。換言之，攜有特異標(biāo)記配對基因的個(gè)體似乎會發(fā)展或呈現(xiàn)基因性疾病。例如可以連鎖不平衡(linkagedisequilibrium)為基礎(chǔ)，鑒定易感受基因的微衛(wèi)星標(biāo)記及SNP標(biāo)記間的關(guān)聯(lián)。
本發(fā)明的診斷方法涉及自個(gè)體中取得核酸樣品，并鑒定微衛(wèi)星標(biāo)記、SNP標(biāo)記，或二者都涉及。標(biāo)記的存在顯示個(gè)體罹患基因性疾病或有發(fā)展此疾病的危險(xiǎn)性。例如，D5S2011E標(biāo)記，CD14-rs2563310T標(biāo)記，或二者的存在，顯示個(gè)體有罹患過敏疾病或有發(fā)展此疾病的危險(xiǎn)，且似乎其IgE血清濃度在1000IU/毫升或以上。欲診斷的個(gè)體可為如呈現(xiàn)出與此疾病有關(guān)的癥狀的個(gè)體，或有此疾病家庭史的個(gè)體。對于上述實(shí)施例，個(gè)體可為有高IgE危險(xiǎn)群的家族成員或新生兒。本發(fā)明方法可利用其本身來應(yīng)用，或配合其它步驟在適合個(gè)體中診斷出基因性疾病。
本發(fā)明亦提供實(shí)施本發(fā)明的試劑盒。該試劑盒含有可檢測微衛(wèi)星標(biāo)記、SNP標(biāo)記，或二者的一種以上的作用物。作用物可為如雜交探針或PCR引物內(nèi)，其可共軛至可檢測的標(biāo)記。在某些例子中，作用物可加上卷標(biāo)或說明于容器包裝中，以指明作用物的目的用途，即診斷基因性疾病。
下示的特殊實(shí)施例僅供說明，不欲以任何方式限制此揭示內(nèi)容以外的部份。相信本領(lǐng)域技術(shù)人員依據(jù)此說明，可完全利用本發(fā)明。文中所示的所有刊物以其全文列為本案的參考文獻(xiàn)。
材料及方法(1)臨床樣品收集氣喘病人及年齡-相符的對照組，以其IgE血清水平分成兩組高IgE組(血清IgE濃度≥1000IU/毫升)及低IgE組(血清IgE濃度≤200IU/毫升)。在1988-2001年期間，于臺灣臺南國立成功大學(xué)氣喘及其它呼吸道阻塞疾病病人的區(qū)域轉(zhuǎn)診中心共收集200個(gè)樣品。有氣喘癥狀但目前無氣喘惡化的病人被送至此醫(yī)院，并在門診以標(biāo)準(zhǔn)化的完全評估法進(jìn)行檢查。于最初測試時(shí)，有氣喘癥狀的所有個(gè)體對組織胺均呈現(xiàn)過度反應(yīng)(PC20一秒鐘用力呼氣量(FEV1)，32毫克的組織胺/毫升，30秒方法)，且均小于16歲。
(2)臨床評估利用標(biāo)準(zhǔn)方法測試肺功能，包括吸入舒喘靈(salbutamol)(800毫克)的前及的后測定肺活量。利用De Vries et al.的方法進(jìn)行支氣管對組織胺的反應(yīng)性測試((1962)Int Arch Allergy 2093-101)，其曾用來評估1962-75年期間最初的參與者。反應(yīng)性-測試策略包括個(gè)體吸入漸增濃度的組織胺，經(jīng)30秒潮式呼吸，到最大的32毫克組織胺/毫升劑量。若個(gè)別的FEV1降低20％即停止測試。其它評估包括皮膚對16種一般過敏源的反應(yīng)測試(成人為角質(zhì)內(nèi)測試，而孩童為扎刺試驗(yàn))，血液分類計(jì)數(shù)(包括嗜伊紅血球總量計(jì)數(shù))，及血清IgE總數(shù)檢測，以及對家內(nèi)塵及混合的花粉具特異性的IgE總數(shù)。若有1個(gè)5毫米的疹塊直徑的反應(yīng)存在時(shí)，則可定義為陽性的皮膚測試。利用固相免疫分析法可檢測血清IgE總數(shù)(Pharmacia IgE EIA，PharmaciaDiagnostics)。
(3)STR基因型定型利用ABI PRISM Linkage Mapping Sets MD-10(400個(gè)標(biāo)記)進(jìn)行基因型定型。這些標(biāo)記排列在MD-10組中，提供人類基因體的范圍在10cM平均分辨率上。各標(biāo)記組包括有螢光標(biāo)記的前向引物，及尾部反向引物。使用反向引物尾部化學(xué)作用(將序列GTTTCTT置于反向引物的5’-端)，以增加擴(kuò)大作用過程中，非-模板指令的核苷酸加入，其會產(chǎn)生一致的配對基因信息傳輸(allele calls)及更精準(zhǔn)的資料輸出。PCR反應(yīng)中含有9.0微升的True Allele PCR Premix(包括dNTPs緩沖溶液，MgCl2，及Tag DNA聚合酶)，3.8微升無菌的去離子水，1.0微升引物對(各5μM引物)，1.2微升基因體DNA(50毫微克)，且裝置在96孔洞的微滴定盤上。在9700 PCR機(jī)器中(ABI)進(jìn)行擴(kuò)大作用，并有以下的熱反應(yīng)95℃，12分鐘歷1個(gè)循環(huán)；94℃下熔化15秒共10個(gè)循環(huán)，在55℃下15秒的回冷，及在72℃下30秒的擴(kuò)大；在89℃下15秒熔化20個(gè)循環(huán)，在55℃下15秒的回冷，及在72℃下30秒的擴(kuò)大；及最后在72℃下10分鐘的最終延展1個(gè)循環(huán)。
PCR的后，反應(yīng)產(chǎn)物與在1∶1∶2比例下的標(biāo)記(FAM∶VIC∶NED)匯集以做單一毛細(xì)管注射。0.5微升經(jīng)匯集的PCR產(chǎn)物與9微升甲酰胺大小標(biāo)準(zhǔn)混合物混合，后者的制備系將50微升Gene Scan-500 LIZ大小標(biāo)準(zhǔn)品與900微升Hi-Di甲酰胺混合。DNA的分配及PCR產(chǎn)物的匯集以吸量機(jī)械臂分別進(jìn)行，以確?？煽焖偾覠o誤地處理。PCR匯集物在ABI 3700 DNA分析儀上分離。以GeneScan 500 LIZ為內(nèi)部大小標(biāo)準(zhǔn)，以助多形片段長度的信息傳輸，使配對基因的信息傳輸更正確，并使不同實(shí)驗(yàn)條件間數(shù)據(jù)的比較更明確?；蛐蛣t利用GeneScan及Genotyper(ABI)軟件來計(jì)數(shù)，并在未先告知對應(yīng)表型前，由三個(gè)體獨(dú)立檢核。
STR標(biāo)記與IgE水平的相互關(guān)系，可利用蒙地卡羅法(Monte-Carloestimat ion)來鑒知(SAS10.0，SAS Inc.)。以列聯(lián)表分析，針對連鎖不平衡測試重要標(biāo)記的配對基因。再由奇比例(odd ratio)針對危險(xiǎn)因子測試有意義的配對基因。
(4)SNP基因型定型在CD14基因激活子區(qū)二側(cè)的DNA片段，以四種不相同的PCRs擴(kuò)大，其中使用四對前向及反向引物。所使用的引物如下SEQ ID NO1GTG CCA ACA GAT GAG GTT CAC，SEQ ID NO2CGC AGC GGA AAT CTT CATC，
SEQ ID NO3CTA GCT TCT AAG ACC CAC ACT TGG，SEQ ID NO4CTT TCA GAG AAC TCA GGC CAC TG，SEQ ID NO5ACA CCC ACC AGA GAA GGC TTA GG，SEQ ID NO6CCT ACC AGT AGC TGA GCA GGA ACC，SEQ ID NO7CTA GAC CTC AGC CAC AAC TCG，及SEQ ID NO8GGG AAG TGC ATA GGA GAG GAA A。
反應(yīng)混合物由Tris-HCl 100mM(pH8.3)，KCl 50mM，MgCl22.5mM，40毫微克基因體DNA，0.2mM dNTP，0.25M前向及反向引物，5U Taq DNA聚合酶，及0.05 U Pfu DNA聚合酶于50微升總量中組成。擴(kuò)大作用在9700 PCR機(jī)器上進(jìn)行(ABI)，其中有四種不同的熱循環(huán)參數(shù)。于SEQ ID NO1及SEQ ID NO2引物對中，應(yīng)用以下的熱條件94℃下4分鐘一次循環(huán)；94℃下40秒熔化共35個(gè)循環(huán)，65℃下40秒的回冷及72℃下1分30秒的擴(kuò)大；及72℃下10分鐘的最終擴(kuò)大一次循環(huán)。至于SEQ ID NOs3-8的引物使用touch-down程序。94℃下4分鐘的最初變性；94℃下40秒的熔化共10個(gè)循環(huán)，65℃下40秒的回冷，及72℃下1分30秒的擴(kuò)大；接下來25個(gè)循環(huán)，回冷溫度降低為每個(gè)循環(huán)少0.25℃；及72℃，10分鐘的最終擴(kuò)大一個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物以MultiScreen PCR盤(Millipore)經(jīng)過濾膜超過濾法而純化，此中依廠商指示進(jìn)行。
各經(jīng)擴(kuò)大及純化的反應(yīng)產(chǎn)物再利用前向或反向引物分別測序。測序反應(yīng)在PCR機(jī)器中進(jìn)行，而各反應(yīng)混合物由1-3微升經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物，Big Dye Terminator Ready-Reaction-Premix及10微微摩爾測序引物組成。反應(yīng)28個(gè)循環(huán)，即94℃下30秒，52℃下30秒，及58℃下2分鐘。反應(yīng)產(chǎn)物以乙醇沉淀純化，再懸浮于去離子化的甲酰胺中，之后填加至ABI 3700毛細(xì)管測序儀內(nèi)。
序列資料以PolyPhred軟件分析，以鑒定與IgE水平有關(guān)的候選SNPs。候選的SNPs人工檢查以確保確實(shí)SNPs及各個(gè)體配對基因的存在。針對所有序列資料進(jìn)行獨(dú)立的人工證實(shí)，且僅被證實(shí)者接受統(tǒng)計(jì)分析。
利用x2試驗(yàn)或Fisher’s精確檢定分析IgE的水平及CD14單一核苷酸多形性間的相互關(guān)聯(lián)性，包括配對基因頻率及基因型頻率。
結(jié)果(1)氣喘病人中D5S2011標(biāo)記與IgE血清濃度的相互關(guān)聯(lián)性在所有氣喘病人中鑒定12個(gè)D5S2011配對基因(A-L)。配對基因、基因型、及血清IgE水平的分布綜合于下表1-5中。頃發(fā)現(xiàn)D5S2011E配對基因及EE+EX基因型與高的IgE水平有關(guān)。相反的，D5S2011J配對基因及JJ+JX基因型與低的IgE水平有關(guān)。
表1 D5S2011配對基因與相關(guān)的血清IgE水平

aP-值區(qū)分高IgE及低IgE群病人間的蒙地卡羅精確檢定。
b異型接合性1-和(pi^2)表2 D5S2011 E配對基因與相關(guān)的血清IgE水平

OR(奇比率)＝2.38，95％CI(置信區(qū)間)＝(1.44，3.91)表3 D5S2011 EE+EX基因型及相關(guān)的血清IgE水平

OR＝2.90，95％CI＝(1.58，5.34)表4 D5S2011 J基因及相關(guān)的血清IgE水平

OR＝0.29，95％CI＝(0.12，0.71)表5 D5S2011 JJ+JX基因型及相關(guān)的血清IgE水平

OR＝0.29，95％CI＝(0.11，0.73)(2)在氣喘病人中，CD14-rs2563310T標(biāo)記與血清IgE濃度的相互關(guān)系CD14-rs2563310配對基因，基因型及血清IgE水平的分布綜合于下表6及7中。頃發(fā)現(xiàn)，CD14-rs2563310T配對基因及TT+CT基因型與高IgE水平有關(guān)。
表6 CD14-rs2563310配對基因及相關(guān)的血清IgE水平

x2＝3.93，P值＝0.0474，OR＝1.55，95％CI＝(1.004，2.394)表7 CD14-rs2563310基因型及相關(guān)的血清IgE水平

x2＝4.233，P組＝0.0396，OR＝2.245，95％CI＝(1.03，4.90)(3)氣喘病人中D5S2011 E標(biāo)記及CD14-rs2563310T標(biāo)記與血清IgE濃度的相互關(guān)聯(lián)性。
意外地，還發(fā)現(xiàn)D5S2011E標(biāo)記及CD14-rs2563310T標(biāo)記的組合，較各個(gè)別標(biāo)記更能有效的表示其為具高IgE血清水平(表8及9)。
表8 D5S2011及CD14-rs2563310基因型及相關(guān)的血清IgE水平

x2＝14.117，P值＝0.0027表9 D5S2011 EE+EX及CD14-rs2563310 TT+CT基因型及相關(guān)的血清IgE水平

OR＝5.257，95％CI＝(1.75，15.78)其它具體實(shí)施例在本說明書中揭示的所有說明均可以任何組合加以結(jié)合。在本說明書中揭示的各說明可就足供相同、相當(dāng)或相似目的而以不同特色取代的。因此，除非另有明白陳述，所揭示的各說明，僅為同等或類似說明的一般性實(shí)施例。
由上述說明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定本發(fā)明的基本特色，且只要不偏離其精神及范疇，可在其中進(jìn)行各種變化及修飾以適應(yīng)各種用途及條件者，均屬于本發(fā)明的范疇。因此，其它具體實(shí)施例也包括在以下權(quán)利要求的范疇內(nèi)。
序列表<110>賽亞基因科技股份有限公司<120>檢測基因性疾病的方法<140>TW 092100317<141>2003-01-08<160>8<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<400>1gtgccaacag atgaggttca c<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<400>2cgcagcggaa atcttcatc<210>3<211>24<212>DNA
<213>人工序列<220>
<400>3ctagcttcta agacccacac ttgg<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<400>4ctttcagaga actcaggcca ctg<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<400>5acacccacca gagaaggctt agg<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<400>6cctaccagta gctgagcagg aacc<210>7<211>21
<212>DNA<213>人工序列<220>
<400>7ctagacctca gccacaactc g<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<400>8gggaagtgca taggagagga aa
權(quán)利要求
1.一種發(fā)展檢測基因性疾病工具的方法，該方法包括鑒定微衛(wèi)星標(biāo)記及單核苷酸多形性標(biāo)記，其中個(gè)體中有微衛(wèi)星標(biāo)記及單核苷酸多形性標(biāo)記存在，顯示個(gè)體罹患基因性疾病或有罹患此疾病的危險(xiǎn)性。
2.一種檢測基因性疾病的試劑盒，其包含一種檢測微衛(wèi)星標(biāo)記的第一作用物，及一種檢測單核苷酸多形性標(biāo)記的第二作用物，其中個(gè)體中有微衛(wèi)星標(biāo)記及單核苷酸多形性標(biāo)記存在，顯示個(gè)體罹患基因性疾病或有罹患此疾病的危險(xiǎn)性。
3.一種決定個(gè)體是否罹患基因性疾病或發(fā)展此疾病危險(xiǎn)性的方法，該方法包括取得自個(gè)體的核酸樣品，及檢測微衛(wèi)星標(biāo)記及單核苷酸多形性標(biāo)記，其中如檢測有微衛(wèi)星標(biāo)記及單核苷酸多形性標(biāo)記存在，顯示個(gè)體罹患有基因性疾病或有罹患此疾病的危險(xiǎn)性。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中微衛(wèi)星標(biāo)記是D5S2011 E標(biāo)記，單核苷酸多形性標(biāo)記是CD14-rs563310 T標(biāo)記，且如檢測有D5S2011E標(biāo)記及CD14-rs2563310 T標(biāo)記二者的存在，顯示個(gè)體罹患過敏性疾病或有患此疾病的危險(xiǎn)性，且其IgE血清濃度在1000IU/毫升或以上，或此危險(xiǎn)性。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中過敏性疾病是氣喘。
6.一種檢測過敏性疾病的試劑盒，其包含一種檢測D5S2011 E微衛(wèi)星標(biāo)記的第一作用物，及一種檢測CD14-rs2563310 T單核苷酸多形性標(biāo)記的第二作用物，且其中如檢測有D5S2011 E標(biāo)記及CD14-rs2563310 T標(biāo)記在個(gè)體中存在，顯示個(gè)體罹患過敏性疾病或有罹患此疾病的危險(xiǎn)性，且其IgE血清濃度在1000IU/毫升或以上，或有此危險(xiǎn)性。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其中過敏性疾病是氣喘。
8.一種過敏性疾病的再分類方法，該方法包括取得核酸樣品，其來自罹患過敏性疾病或有罹患此疾病危險(xiǎn)性的個(gè)體，及檢測D5S2011 E微衛(wèi)星標(biāo)記，其中如檢測有D5S2011 E標(biāo)記則顯示個(gè)體IgE血清濃度在1000IU/毫升或以上，或有此危險(xiǎn)性。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中過敏性疾病是氣喘。
10.一種包裝產(chǎn)品，其包含一種容器，一種檢測D5S2011 E微衛(wèi)星標(biāo)記的作用物，及一種與容器有關(guān)的說明，其指明如個(gè)體中有D5S2011 E標(biāo)記存在，顯示該個(gè)體罹患過敏性疾病或有罹患此疾病的危險(xiǎn)性，且其IgE血清濃度在1000IU/毫升或以上，或有此危險(xiǎn)性。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的包裝產(chǎn)品，其中過敏性疾病是氣喘。
12.一種過敏性疾病的再分類方法，該方法包括自罹患有過敏性疾病或有罹患此疾病危險(xiǎn)性的個(gè)體中取得核酸樣品，及檢測D5S2011 J微衛(wèi)星標(biāo)記，其中如檢測有D5S2011 J標(biāo)記則顯示個(gè)體IgE血清濃度在200IU/毫升或以下，或有此危險(xiǎn)性。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中過敏性疾病是氣喘。
14.一種包裝產(chǎn)品，其包含一種容器，一種檢測D5S2011 J微衛(wèi)星標(biāo)記的作用物，及一種與容器有關(guān)的說明，其指明如檢測有D5S2011 J標(biāo)記在個(gè)體中存在，顯示該個(gè)體罹患過敏性疾病或有罹患此疾病的危險(xiǎn)性，或其IgE血清濃度在200IU/毫升或以下，或有此危險(xiǎn)性。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的包裝產(chǎn)品，其中過敏性疾病是氣喘。
16.一種過敏性疾病的再分類方法，該方法包括自罹患有過敏性疾病或有罹患此疾病危險(xiǎn)性的個(gè)體中取得核酸樣品，及檢測CD14-rs2563310 T單核苷酸多形性標(biāo)記，其中如檢測有CD14-rs2563310 T標(biāo)記則顯示個(gè)體IgE血清濃度在1000IU/毫升或以上，或有此危險(xiǎn)性。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中過敏性疾病是氣喘。
18.一種包裝產(chǎn)品，其包含一種容器，一種檢測CD14-rs2563310 T單核苷酸多形性標(biāo)記的作用物，及一種與容器有關(guān)的說明，其指明如個(gè)體中檢測有CD14-rs2563310 T標(biāo)記存在，顯示該個(gè)體罹患過敏性疾病或有罹患此疾病的危險(xiǎn)性，且其IgE血清濃度在1000IU/毫升或以上，或有此危險(xiǎn)性。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的包裝產(chǎn)品，其中過敏性疾病是氣喘。
全文摘要
本發(fā)明涉及發(fā)展檢測基因性疾病的方法。方法中鑒定微衛(wèi)星標(biāo)記及單一核苷酸多形性標(biāo)記。在個(gè)體中如果有微衛(wèi)星標(biāo)記及單一核苷酸多形現(xiàn)象標(biāo)記二者的存在，顯示個(gè)體罹患基因性失調(diào)癥或有罹患此疾的危險(xiǎn)性。
文檔編號C12Q1/68GK1530449SQ20041000016
公開日2004年9月22日 申請日期2004年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月8日
發(fā)明者吳世欣, 黃立志, 林冠如, 余桂廷, 陳瑞麟, 王志堯 申請人:賽亞基因科技股份有限公司