專利名稱：營養(yǎng)組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可用于營養(yǎng)管理和肝病患者治療的營養(yǎng)組合物。本發(fā)明也涉及可用于對經(jīng)歷如手術(shù)、感染和燙傷等外來刺激的病人進行代謝和營養(yǎng)調(diào)控(metabolic and nutritional management)的營養(yǎng)組合物。另外，本發(fā)明涉及可用于炎癥病人的病理改善的營養(yǎng)組合物。
背景技術(shù)：
在肝病營養(yǎng)病理學(xué)中，與碳水化合物代謝有關(guān)的異常葡萄糖耐受是常見的，這通常歸因于糖酵解酶的活性和外周胰蛋白酶敏感性的降低。尤其是在肝硬化中更是如此，肝硬化時能量消耗增加，作為能源物質(zhì)的碳水化合物的可用性降低。對肝炎和肝硬化時蛋白質(zhì)代謝的觀察顯示了由負氮平衡所致的血漿氨基酸失衡(支鏈氨基酸/芳香氨基酸代謝速率降低(Fischer速率)、蛋白質(zhì)異化作用增強、高氨血癥(hyperammonemia)、以及低蛋白血癥(hypoproteinemia)。另外，在脂代謝方面，也觀察到了多聚飽和脂肪酸和脂溶性維生素的減少。
肝硬化包括代償性(compensated)和代償失調(diào)性(decompensated)肝硬化，其在病理學(xué)上的差異同樣在于代謝和營養(yǎng)調(diào)控的不同。代償性肝硬化可以采用與慢性肝炎非常類似的方法來調(diào)控。然而代償失調(diào)性肝硬化是一種慢性肝衰(liver failure)狀態(tài)，由于蛋白質(zhì)代謝增強，過量的蛋白質(zhì)攝入會導(dǎo)致高氨血癥?？诜ф湴被?BCAAs)纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸能夠抑制外周組織的蛋白質(zhì)代謝并增強肝內(nèi)蛋白質(zhì)合成。另外，BCAAs在肌肉內(nèi)代謝生成丙氨酸，丙氨酸激活肝內(nèi)葡萄糖合成作用(葡萄糖-丙氨酸循環(huán))，并且提高碳水化合物作為能源物質(zhì)的效率。因此，BCAA產(chǎn)品(HepanEDR，Aminoleban ENR50-150g/天)被用來彌補骨骼肌中能量的不足。
另一方面，當(dāng)活體經(jīng)歷如手術(shù)、感染、或者燙傷等過度的外來刺激時，局部和全身的炎癥介導(dǎo)物質(zhì)的產(chǎn)生增強。特別是細胞因子是包括循環(huán)、內(nèi)分泌、免疫和代謝等系統(tǒng)中多種反應(yīng)的重要介導(dǎo)物質(zhì)。
通常，經(jīng)歷外來刺激時的代謝反應(yīng)在特征上包括機體尤其是骨骼肌蛋白質(zhì)分解增強，由于脂質(zhì)分解所致的甘油和脂肪酸的產(chǎn)生增加，肝臟中糖再生作用、應(yīng)急蛋白和清蛋白生產(chǎn)的增強。在外來入侵時細胞免疫和體液免疫被抑制，預(yù)期免疫相關(guān)蛋白的合成減少而蛋白質(zhì)代謝相當(dāng)程度地增強。
在遭受外來刺激的機體中，不同細胞因子在代謝變化中的作用已經(jīng)在阻斷細胞因子的生產(chǎn)或活動等的試驗中得到揭示，在這些試驗中細胞因子本身被給予機體。特別地，由TNF-α、IL-1、和IL-6引起的代謝變化為(1)與葡萄糖代謝相關(guān)的肝糖分解作用增強、高血糖癥和低血糖癥，(例如，Meszaros K等″Tumor necrosis factor increases invivo glucose utilization ofmacrophage-rich tissues″Biochem.Biophys.Res.Commun.，Vol.149，No.1pp.1-6，1987 November 30；Tracey，KJ等″Shock and tissue injury induced byrecombinant human cachectin″Science，Vol.234，No.4775pp.470-474，1986October 24；Fukushima，R等″Different roles of IL-1 and TNF onhemodynamics and interorgan amino acid metabolism in awake dogs″Am.J.Physiol.，Vol.262，No.3，Pt.1pp.E275-E281，1992 March)，(2)與氨基酸和蛋白質(zhì)代謝相關(guān)的肌肉退化和氨基酸釋放增加、谷氨酸鹽的腸吸收增加、丙氨酸腸釋放增加、肝氨基酸吸收增加、以及急性期蛋白合成增強，(例如，F(xiàn)ukushima，R等″Different roles of IL-1 and TNF on hemodynamics andinterorgan amino acid metabolism in awake dogs″Am.J.Physiol.，Vol.262，No.3，Pt.1pp.E275-E281，1992 March；Moldawer，LL等″Interleukin 1 andtumor necrosis factor do not regulate protein balance in skeletal muscle″Am.J.Physiol.，Vol.253，No.6，Pt.1pp.C766-C773，1987 December)，和(3)與脂代謝相關(guān)的脂肪酸降解增強和脂蛋白脂肪酶活性增強(例如，F(xiàn)eingold，KR等″Multiple cytokines stimulate hepatic lipid synthesis in vivo″Endocrinology，Vol.125，No.1pp.267-274，1989 July；Grunfeld，C等″Tumor necrosis factorimmunologic，antitumor，metabolic，and cardiovascular activities″Adv.Intern.Med.，Vol.35pp.45-71，1990；Feingold，KR等′Tumor necrosis factorstimulates hepatic lipid synthesis andsecretion″Endocrinology，Vol.124，No.5pp.2336-2342，1989 May)。
一種阻止遭受外來刺激時由細胞因子引起的代謝異常和器官損傷合理途徑就是局部地使細胞因子生產(chǎn)正常，同時阻止細胞因子向全身擴散。這樣的方法包括使用腸營養(yǎng)、ω-3脂肪酸、或生長激素的。
有幾篇關(guān)于在遭受外來刺激時，由于營養(yǎng)給予方式的不同而導(dǎo)致細胞因子的生產(chǎn)產(chǎn)生差異的報導(dǎo)。通過腸或靜脈途徑給予營養(yǎng)一周時間，在未遭受外來刺激的成年人體內(nèi)沒有發(fā)生任何明顯的TNF-α和IL-6血液水平差異(如，Lowry，SF等″Nutrient modification of inflammatory mediatorproduction″New Horiz.，Vol.2，No.2pp.164-174，1994 May)。然而據(jù)報導(dǎo)，當(dāng)通過腸或靜脈途徑給予營養(yǎng)7天然后靜脈注射內(nèi)毒素時，腸途徑給予營養(yǎng)要比靜脈途徑給予營養(yǎng)時的全身性反應(yīng)包括發(fā)燒以及TNF-α與緊張性刺激激素釋放作用溫和(如，F(xiàn)ong，YM等″Total parenteral nutrition and bowelrest modify the metabolic response to endotoxin in humans″Ann.Surgery.，Vol.210，No.4pp.456-457，1989 October)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供營養(yǎng)組合物用于肝衰的營養(yǎng)調(diào)控和治療。此外，本發(fā)明的另外一個目的是提供用于對遭受強烈外來刺激(highly invasivestresses)如手術(shù)、感染和燙傷的病人進行代謝和營養(yǎng)調(diào)控的營養(yǎng)組合物。進一步，本發(fā)明的另一個目的是用于炎癥病人病理學(xué)改善的營養(yǎng)組合物。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)半乳糖胺(galactosamine)誘導(dǎo)的大鼠肝損傷的發(fā)作能夠被由包含乳清蛋白水解產(chǎn)物、卵磷脂(lecithin)、富含油酸的油、和帕拉金糖(palatinose)等基本成分組成的營養(yǎng)組合物所抑制。另外，他們還發(fā)現(xiàn)乳清蛋白水解產(chǎn)物抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α和白介素6(IL-6)在體內(nèi)的生產(chǎn)。這些結(jié)果顯示本發(fā)明的營養(yǎng)組合物對肝病患者的營養(yǎng)調(diào)控與治療，對遭受強烈外來刺激如手術(shù)、感染或燙傷的病人的代謝和營養(yǎng)調(diào)控，以及對炎癥疾病的病理改善等方面是有用的。
具體地，本發(fā)明包括(1)用于肝病患者的營養(yǎng)組合物包含作為蛋白質(zhì)成分的奶蛋白水解產(chǎn)物和源于發(fā)酵奶的蛋白質(zhì)；作為脂質(zhì)成分的富含油酸的油和奶卵磷脂和/或大豆卵磷脂；和作為碳水化合物成分的帕拉金糖；(2)根據(jù)(1)的營養(yǎng)組合物，其中所述的奶蛋白選自由酪蛋白、奶蛋白濃縮物(MPC)、乳清蛋白濃縮物(WPC)、乳清蛋白分離物(WPI)，α-乳清蛋白(α-lactoalbumin)、β-乳球蛋白(β-lactoglobulin)、和乳鐵蛋白(lactoferrin)所組成的組中的蛋白；(3)根據(jù)(1)的營養(yǎng)組合物，其中所述的源于發(fā)酵奶的蛋白質(zhì)源于一種發(fā)酵奶中乳清減少的組合物；(4)根據(jù)(1)的營養(yǎng)組合物，其中所述的源于發(fā)酵奶的蛋白質(zhì)源于新鮮干酪(5)根據(jù)(4)的營養(yǎng)組合物，其中所述的新鮮干酪是夸克(quark)；(6)根據(jù)(1)的營養(yǎng)組合物，其中所述的奶蛋白水解產(chǎn)物可以通過用源于地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformus)的alkalase和源于豬胰腺的胰蛋白酶(trypsin)來水解乳清蛋白分離物(WPI)而獲得；(7)根據(jù)(6)的營養(yǎng)組合物是使用分級分子量為10,000的超濾膜進一步處理而獲得的濾過液；(8)根據(jù)(7)的營養(yǎng)組合物，其中反相HPLC分離層析譜如

圖1所示；(9)用于處于高度外來刺激水平的病人的營養(yǎng)組合物，其中所述的營養(yǎng)組合物包含作為蛋白質(zhì)成分的奶蛋白水解產(chǎn)物和源于發(fā)酵奶的蛋白質(zhì)；作為脂質(zhì)成分的富含油酸的油和奶卵磷脂和/或大豆卵磷脂；和作為碳水化合物成分的帕拉金糖；(10)根據(jù)(9)的營養(yǎng)組合物，其中所述的奶蛋白選自由酪蛋白、奶蛋白濃縮物(MPC)、乳清蛋白濃縮物(WPC)、乳清蛋白分離物(WPI)，α-乳清蛋白、β-乳球蛋白、和乳鐵蛋白所組成的組中的蛋白；(11)根據(jù)(9)的營養(yǎng)組合物，其中所述的源于發(fā)酵奶的蛋白質(zhì)源于一種乳清減少的組合物；(12)根據(jù)(9)的營養(yǎng)組合物，其中所述的源于發(fā)酵奶的蛋白質(zhì)源于新鮮干酪；(13)根據(jù)(12)的營養(yǎng)組合物，其中所述的新鮮干酪是夸克；(14)根據(jù)(9)的營養(yǎng)組合物，其中所述的奶蛋白水解產(chǎn)物可以通過用源于地衣芽孢桿菌的alkalase和源于豬胰腺的胰蛋白酶來水解乳清蛋白分離物(WPI)而獲得；(15)根據(jù)(14)的營養(yǎng)組合物是使用分級分子量為10,000的超濾膜進一步處理而獲得的濾過液；和(16)根據(jù)(15)的營養(yǎng)組合物，其中反相HPLC分離層析譜如圖1所示。
1.蛋白質(zhì)1-1.奶蛋白水解產(chǎn)物(Milk protein hydrolysate)酪蛋白，乳清蛋白(乳清蛋白濃縮物(WPC)，乳清蛋白分離物(WPI)，α-乳清蛋白(α-La)、β-乳球蛋白(β-Lg)、奶蛋白濃縮物(MPC或總奶蛋白(TMP))，等這些蛋白可以作為蛋白質(zhì)來源。
正常情況下用于水解乳清蛋白的酶為例如胃蛋白酶、胰蛋白酶、和糜蛋白酶。然而也有將植物來源的木瓜蛋白酶以及細菌和真菌來源的蛋白酶用于研究的報道(Food Technol.，4868-71，1994；Trends Food Sci.Technol.，7120-125，1996；Food Proteins and Their Applicationspp.443-472，1997)。乳清蛋白水解酶活性差異很大。胃蛋白酶降解已變性的α-La和α-La，但不能降解天然的β-Lg(Neth.Milk dairy J.，4715-22，1993)。胰蛋白酶緩慢水解α-La但很難降解β-Lg(Neth.Milk dairy J.，45225-240，1991)。糜蛋白酶快速降解α-La，然而降解β-Lg緩慢。木瓜蛋白酶水解牛血清白蛋白(BSA)和β-Lg，但α-La對其顯示抗性(Int.Dairy Journal 613-31，1996a)。然而，在酸性pH條件下，未結(jié)合Ca的α-La被木瓜蛋白酶完全降解(J.Dairy Sci.，76311-320，1993)。
通過控制奶蛋白的酶學(xué)降解和修飾奶蛋白，可以在較寬pH范圍和處理條件下改變該蛋白的功能性特征(Enzyme and Chemical Modification ofproteins in Food proteins and their Applications pp.393-423，1997 MarcelDekker，Inc.，New York，1997；Food Technol.，4868-71，1994)。
肽鏈的水解增加帶電基團的數(shù)目和疏水性，減小分子量，并且改變分子結(jié)構(gòu)(J.Dairy Sci.，76311-320，1993)。功能性特征的變化很大程度上依賴于水解程度。通常所觀察到的乳清蛋白功能的最大變化是溶解性增加和粘性減小。通常，在水解程度較高時，水解產(chǎn)物不發(fā)生沉淀，即使在加熱情況下也是如此，在3.5-4.0的pH值條件下高度可溶。水解產(chǎn)物具有比完整蛋白質(zhì)低得多的粘性。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度高時這種差異尤其明顯。其他的效應(yīng)包括膠凝特性改變、熱穩(wěn)定性增加、乳化和泡沫化能力增強、乳液和泡沫穩(wěn)定性降低(Int.Dairy journal，613-31，1996a；Dairy Chemistry 4，pp.347-376，1989；J.Dairy Sci.，79782-790，1996)。
已經(jīng)知道多種源于奶蛋白的生物活性寡肽((Yoshikawa，M，″NewHorizon in Milk Science″，Yoshikawa，M.ed.，pp.188-195，Kougaku Shuppan，1998；Otani，H.，″New Horizon in Milk Science″，Yoshikawa，M.ed.，pp.97-99，Kougaku Shuppan，1998；Otani，H.，Milk Science，47183，1998；Trends inFood Science and Technology，9307-319，1998)。一個這樣的例子是具有血管緊縮素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制劑活性(高血壓效應(yīng))的肽。
有一些關(guān)于多種可能具有ACE抑制劑活性的肽的報道，這些報道是通過體外檢測來推測的(例如，J.Dairy Res.，6753-64，2000；Br.J.Nutr.，84S33-S37，2000)。也有一些采用不同層析技術(shù)純化和鑒定源于水解產(chǎn)物的ACE抑制性肽的研究報告(for example，Maruyama，S.，& Suzuki，H.，Agricultural and Biological Chemistry，461393-1394，1982；Miyoshi S.etal.，Agri.Biol.Chem.，551313-1318，1991；Food Science and Biotechnology，8172-178，1999；Biosci.Biotech.Biochem.，57922-925，1993)。
根據(jù)這些報道，認為ACE抑制劑活性存在于基于柱分離的許多分級成分中。因此，ACE抑制性物質(zhì)的分子特征是多種多樣的。事實上，發(fā)現(xiàn)ACE抑制可見于多種蛋白質(zhì)、蛋白酶以及在水解條件下產(chǎn)生的水解產(chǎn)物。這個事實提示，具有不同氨基酸序列的多種肽都可以具有ACE抑制活性。由于這些肽的化學(xué)多樣性，層析法純化水解產(chǎn)物經(jīng)常伴隨著一部分活性肽的損失。在水解過程中，ACE抑制活性不斷地產(chǎn)生和降解。當(dāng)這兩種進程達到最優(yōu)化時，獲得最大的水解產(chǎn)物活性。ACE抑制活性通過測定所有的水解產(chǎn)物肽組合物來獲得，它依賴于水解酶的特異性和處理條件。
有一篇報道涉及乳清蛋白水解產(chǎn)物最佳化(采用表面響應(yīng)方法學(xué)，response surface methodology)以使ACE抑制活性最大化并且使所需的水解保持在最小程度(International Dairy Journal 12813-820，2002)。
本發(fā)明首次揭示了奶蛋白水解產(chǎn)物抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α和IL-6的體內(nèi)生產(chǎn)。有一些關(guān)于來源于奶蛋白的肽對細胞因子生產(chǎn)的影響的報道。有文獻報道，源于牛酪蛋白的肽增強LPS誘導(dǎo)的TNF-α和IL-6在鼠骨髓巨噬細胞中的生產(chǎn)(J.Sci.Food Agric.，8l300-304，2000)。還有文獻報道，響應(yīng)LPS刺激而誘導(dǎo)IL-6生產(chǎn)的肽存在于由益生菌乳桿菌發(fā)酵的奶的上清(Milchwissenschaft，57(2)66-70，2002)。然而，就發(fā)明人所知，目前尚無有關(guān)奶衍生蛋白抑制炎癥細胞因子生產(chǎn)的報道。除了具有上述的ACE抑制活性的肽外，抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α和IL-6生產(chǎn)的肽也可能存在于不同柱分離方法中所獲得的許多分級成分中。
因此，以對LPS誘導(dǎo)的TNF-α和/或IL-6生產(chǎn)的抑制效應(yīng)為指針，可以參考上述的文獻來優(yōu)化奶蛋白水解的條件(變性溫度、pH、溫度、水解時間和酶/底物比)(International Dairy Journal 12813-820，2002)。因此，本發(fā)明包括由此獲得的優(yōu)化的水解條件。
除了上述引用的文獻，還存在許多有關(guān)奶蛋白水解產(chǎn)物的專利(出版的專利申請和專利)。例子包括涉及酪蛋白和乳清蛋白的分別水解、繼而吸附去除疏水成分、然后將酪蛋白和乳清蛋白以指定比例混合的專利(JP2,986,764)；用芽孢桿菌和放線菌蛋白酶水解乳清蛋白、繼而去除酶和不溶性水解產(chǎn)物的專利(JP 3,222,638)；有關(guān)肽混合物的專利，其中由β-Lg降解產(chǎn)生的支鏈氨基酸/芳香氨基酸的摩爾比為10％或更高，其中芳香氨基酸少于2.0％，混合物的平均分子量為幾百到幾千(JP 3,183,945)；有關(guān)乳清蛋白中β-Lg的選擇性酶學(xué)降解的專利(JP 2,794,305)；使用來自地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)和/或枯草芽孢桿菌(B.subtilis)的蛋白酶，采用non-pH-stat技術(shù)水解乳清蛋白至15％～30％(葡萄糖當(dāng)量；DE)，然后獲得截留分子量值大于10,000的超濾膜濾過液(JP 3,167,723)；本發(fā)明包括除這些專利和專利申請之外的專利和未審公開專利。
上述文獻、專利和專利申請中所述的水解產(chǎn)物是否抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α和IL-6的生產(chǎn)可以使用已知的檢測系統(tǒng)來測定(如，ExperimentalMedicine Supplementary Vol.″Bio Manual UP Experiment Series″，CytokineExperiment Methods，Miyajima，A.，Yamamoto，M.ed.，Yodosha，(1997))。因此，本發(fā)明包括具有抑制TNF-α和IL-6生產(chǎn)的活性的水解產(chǎn)物。
選擇例如預(yù)熱、酶底物比(E/S)、pH、水解溫度和水解時間作為條件優(yōu)化的五個參數(shù)。
預(yù)熱65-90℃E/S0.01-0.2pH2-10水解溫度30-65℃水解時間3小時至不足20小時所使用的酶包括下述來自Nova Nordisk的酶1)內(nèi)切蛋白酶地衣芽孢桿菌來源的Alcalase
遲緩芽孢桿菌來源的Esperase枯草芽孢桿菌來源的Neutrase細菌來源的Protamex豬胰腺來源PTN(胰蛋白酶)2)外切蛋白酶米曲霉來源的Flavorzyme豬或牛內(nèi)臟來源羧肽酶除上述之外的酶的例子包括動物來源的胰酶制劑(pancreastin)、胃蛋白酶、植物來源的木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、微生物(如，乳桿菌、酵母、霉菌、分支桿菌)來源的內(nèi)切蛋白酶和外切蛋白酶、以及它們的粗制純化物和細菌勻漿物。另外，在聯(lián)合用酶時也經(jīng)常使用地衣芽孢桿菌來源的Alcalase和豬胰腺來源的PTN(胰蛋白酶)的酶混合物。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物包括本身抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α和/或IL-6生產(chǎn)的酶水解產(chǎn)物；超濾所得的殘余溶液或濾液；以及顯示類似活性的商業(yè)奶蛋白水解產(chǎn)物。
奶蛋白水解產(chǎn)物的含量估計為每100mL產(chǎn)品0.9至3g，或者優(yōu)選1.2至2g。最適范圍可用實驗確定(如，用對TNF-α生產(chǎn)的抑制作為指標(biāo))。
1-2.發(fā)酵奶來源的蛋白質(zhì)(Fermented milk-derived proteins)發(fā)酵奶(酸牛奶(yogurt))來源的蛋白質(zhì)的氨基酸值為100，其被消化吸收的能力通過發(fā)酵得到提高，具備較高營養(yǎng)價值。成分包括去除發(fā)酵奶中含水部分(乳清)后的成分(如，JP 3,179,555)。
盡管有許多種的新鮮干酪，包括農(nóng)家干酪(cottage)、夸克、string、紐沙特爾干酪(neuchatel)、奶油干酪(cream cheese)、mozzarella、意大利乳清干酪(ricotta)、以及意大利牛奶軟干酪(mascarpone)，而夸克是最適宜的來源。生產(chǎn)夸克的方法是熟知的(如，特開平6-228013)。
每100mL產(chǎn)品中源于發(fā)酵奶的蛋白質(zhì)的含量可以為2-6g或優(yōu)選2.5-4.5g蛋白質(zhì)。
2.脂類2-1.磷脂奶來源的卵磷脂與大豆或蛋黃來源的卵磷脂聯(lián)合用作磷脂。也可單獨使用奶來源的卵磷脂。在如生化、藥學(xué)和藥理學(xué)領(lǐng)域，術(shù)語“卵磷脂(1ecithin)”僅用于指“磷脂酰膽堿”。然而在商業(yè)或工業(yè)領(lǐng)域，卵磷脂(lecithin)是作為磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酸、以及其他磷脂(phospholipid)的混合物的通稱來使用的。在“Japan’s Specifications andStandards for Food Additives”，7th edition(1999)中，卵磷脂是指“從油籽或動物來源獲得的物質(zhì)，主要成分是磷脂”。本發(fā)明中，奶來源的磷脂也統(tǒng)稱“奶來源的卵磷脂”。
奶來源的卵磷脂奶磷脂(奶卵磷脂)包括鞘磷脂(SM)、磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine，PC)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)、磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol，PI)、磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)和溶血磷脂酰膽堿(lysophosphatidylcholine，LPC)，它們只存在于乳脂球膜(milk fatglobule membranes，MFGM)。MFGM磷脂分級成分的組成列于表1(Bulletinof Japan Dairy Technical Association，Vol.50pp.58-91，2000)。
如表1所示，奶磷脂特征性地包含大量SM，大豆卵磷脂中不含SM。對大鼠給予奶卵磷脂時腦和肝中DHA含量的增加程度遠大于對大鼠給予大豆卵磷脂時的增加程度。而且，與大豆卵磷脂或蛋黃卵磷脂相比，奶卵磷脂在改善高血脂和脂肪肝方面更為有效。另外，已知SM與膽固醇代謝有關(guān)，例如，SM調(diào)節(jié)膽固醇合成中的HMG-CoA還原酶的活性，也與腸道膽固醇的吸收調(diào)節(jié)有關(guān)。從而認為SM可以進一步增強PC和PE改善脂質(zhì)代謝的能力(Sasaki，H.，Milk Science 51(2)93-94，2002)。
表1

富含MFGM的物質(zhì)的例子包括，聯(lián)合進行超濾(UF)和微過濾(MF)產(chǎn)生的凍干WPI副產(chǎn)品(MF殘留液)、從奶油或黃油中去除脫水乳脂肪(AMF)后得到的分級成分(黃油乳清，butter serum)、從奶油乳清中去除AMF得到的分級成分(奶油乳清，whey cream serum)。以這些物質(zhì)為原料制備磷脂濃縮物的方法是已知的(如，JP-AHei7-173182包含于本發(fā)明)。
大豆卵磷脂大豆卵磷脂被廣泛用作食物和食品領(lǐng)域的天然食物添加劑，而多烯卵磷脂酰膽堿也被用作藥物(用途用于改善肝功能、脂肪肝和慢性肝病的高血脂)。大豆卵磷脂的生理功能的例子包括調(diào)節(jié)生物膜的形態(tài)和功能，改善肺功能、動脈硬化、脂代謝、肝脂代謝，改善和促進神經(jīng)功能(Food Processingand Ingredients，Vol.29(3)18-21，1994)。
“天然”卵磷脂產(chǎn)品正常情況下按照他們的PC含量歸類。根據(jù)其用途產(chǎn)生了不同類型卵磷脂的等級。如表2所示，以大豆卵磷脂純化和分級分離為基礎(chǔ)，根據(jù)大豆卵磷脂產(chǎn)品中主要成分PC的差異很方便地對其進行了分類(Fujikawa，T.，Oil Chemistry，Vol.40(10)951-958，1991)。
表2

奶卵磷脂和大豆卵磷脂可以單獨使用或聯(lián)合使用。每100mL產(chǎn)品的總含量可以為0.1-0.5g，或優(yōu)選0.2-0.3g。油酸含量可以為2-3g，或優(yōu)選2.1-2.5g。
2-2.其他脂類健康、勞動與福利部推薦的飽和脂肪酸(SFA棕櫚酸，硬脂酸等)∶單價不飽和脂肪酸(MUFA油酸等)∶多價不飽和脂肪酸(PUFA亞油酸、亞麻酸等)優(yōu)選攝入比率從先前的1∶1.5∶1改變?yōu)?∶4∶3，n-6脂肪酸∶n-3脂肪酸為4∶1。這樣推薦的一個原因是在日本，實踐MUFA攝入比為SFA和PUFA的1.5倍的飲食標(biāo)準(zhǔn)是困難的。因此，在脂質(zhì)的脂肪酸組合物中，提高了MUFA含量。單價不飽和脂肪酸油酸混合到脂肪酸組合物中，其在混合物中的含量超過30％，優(yōu)選30-60％。含有大量油酸的脂質(zhì)來源包括富含油酸的向日葵油、油菜籽油、橄欖油、富含油酸的紅花油、大豆油、谷物油和棕櫚油。此外，經(jīng)營養(yǎng)調(diào)整的油和脂肪(NOF公司)也是一種含油酸的脂質(zhì)原料?？梢允褂孟蛉湛?、油菜籽油、橄欖油和含橄欖油的混合物。每100g產(chǎn)品中適宜的油酸含量為1-6g。另外，添加多價不飽和脂肪酸如DHA、EPA、花生四烯酸、以及中等鏈長的脂肪酸如辛酸、癸酸、月桂酸來調(diào)整SFA∶MUFA∶PUFA至3∶4∶3。
3.碳水化合物和食用纖維本發(fā)明所涉及的主要碳水化合物是帕拉金糖。其他碳水化合物的例子包括糖醇(山梨糖醇、木糖醇、麥芽糖醇(maltitol)等)、蜂蜜、砂糖、葡萄糖、果糖和轉(zhuǎn)化糖。
帕拉金糖包括帕拉金糖漿、還原性帕拉金糖或帕拉金糖淀粉糖漿。帕拉金糖淀粉糖漿是一種淀粉糖漿形式的液體物質(zhì)，其含有的主要成分為帕拉金糖脫水聚合時產(chǎn)生的低聚糖如四糖、六糖和十糖。與蔗糖類似，帕拉金糖消化為葡萄糖和果糖后被吸收(Goda，T.等，Journal of Japanese Societyof Nutrition and Food Science，Vol.36(3)169-173，1983)。然而，由于帕拉金糖水解速度緩慢，只有蔗糖的1/5(Tsuji，Y.et al.，J.Nutr.Sci.Vitaminol.，3293-100，1986)，因而其被攝入后血液中葡萄糖和胰島素的濃度長時間保持在一個穩(wěn)定的水平(Kawai，K.etal.，Endocrinol，Japan，32(6)933-936，1985)。
每100mL產(chǎn)品中帕拉金糖的含量可以為4-15g，優(yōu)選5-6g。
蛋白質(zhì)、脂類和碳水化合物的能量比率與“第6版日本人能量需求”中基本相同，認為蛋白質(zhì)為15-25千卡，脂類為20-30千卡，碳水化合物為45-65千卡。
食用纖維可以分為水溶性食用纖維和不溶性食用纖維。不可吸收的低聚糖、乳糖、乳糖醇(lactitol)或棉子糖可用作水溶性食用纖維。不可吸收的低聚糖未經(jīng)消化就到達大腸，使腸道雙歧桿菌活化并生長，從而改善腸道環(huán)境。乳糖是由半乳糖和果糖組成的合成二糖，用作治療高氨血癥的基礎(chǔ)藥物制劑(Bircher，J.et al.，Lancet890，1965)。起因于慢性肝衰的慢性復(fù)發(fā)性肝性腦病對乳糖治療、灌輸肝衰特異性氨基酸(Fischer溶液)等治療反應(yīng)良好。乳糖醇(β-半乳糖基-山梨糖醇)被認為是第二代半乳糖基果糖(lactulose)，具有與半乳糖基果糖相似的臨床效果(Lanthier，PL.and Morgan，M.，Gut，26415，1985；Uribe，M.，等，Dig.Dis.Sci.，321345，1987；Heredia，D.等，J.Hepatol，7106，1988；Riggio，O.，等，Dig.Dis.Sci.，34823，1989)，目前被用作高氨血癥的治療劑。
其他候選水溶性食用纖維包括改善脂類代謝(降解膽固醇和甘油三酯)的產(chǎn)品如果膠(原果膠、果膠酯酸、果膠酸)、瓜爾豆膠(guar gum)酶降解產(chǎn)物和羅望子(tamarind)膠。瓜爾豆膠降解產(chǎn)物抑制血液葡萄糖水平的升高和胰島素的減少(Yamatoya，K.等，Journal of Japanese Society of Nutrition andFood Science，Vol.46199，1993)。此外，候選水溶性食用纖維還包括高分子量水溶性食用纖維魔芋(konjac)葡甘露聚糖、褐藻酸、低分子量褐藻酸、psyllium、阿拉伯樹膠、海藻多聚糖(纖維素、木質(zhì)素樣物質(zhì)、瓊脂、角叉膠、褐藻酸、fucodine和昆布多糖)、微生物產(chǎn)生的膠(威倫膠(welan gum)、可德膠(curdlan)、黃原膠、gellan膠、葡聚糖、短梗霉多糖(pullulan)和拉姆珊(rhamsan)膠)、其他樹膠(種子來源的刺槐豆(locust bean)膠、羅望子膠、塔拉(tara)膠、來自汁液的刺梧桐(karaya)樹膠和西黃蓍膠)；低分子量的水溶性食用纖維葡聚糖、不吸收的糊精、麥芽糖醇等。
不溶性食用纖維增加大腸中未消化物質(zhì)的量且縮短其通過時間。這增加了通便頻率和大便量。候選不溶性食用纖維的例子包括纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、殼多糖、脫乙酰殼多糖、大豆食用纖維、麥麩、松木纖維、谷物纖維和甜菜纖維。
4.維生素目前已知的維生素有13種。其中，已知維生素A、K、和維生素B復(fù)合體(B1、B2、煙酸、B6、泛酸、葉酸、B12和生物素)與肝密切相關(guān)。與肝病的主要關(guān)系是維生素A的缺乏與過量、維生素B復(fù)合體的缺乏和維生素K的過量。
當(dāng)阻塞性黃疸或類似疾病導(dǎo)致腸道膽汁不足時，維生素A吸收速率降低、導(dǎo)致維生素A缺乏。此處，在低蛋白營養(yǎng)條件下，維生素A結(jié)合蛋白(RBP)生產(chǎn)減少。這樣，維生素A沒有被運送到目標(biāo)器官、維生素A缺乏癥狀就表現(xiàn)出來了。在代償失調(diào)性肝硬化中，維生素A稍微過量就表現(xiàn)出中毒癥狀。在慢性肝病中可觀察到維生素B復(fù)合體的利用發(fā)生紊亂。由于腸細菌合成的維生素K也可以被利用，因而維生素K缺乏現(xiàn)象不常見。然而，當(dāng)由于阻塞性黃疸導(dǎo)致腸道膽汁不足時會導(dǎo)致維生素K吸收速率降低。
因此，基于上述維生素與肝的關(guān)系，本發(fā)明的營養(yǎng)組合物可以包括適當(dāng)量的每種維生素。
5.礦物質(zhì)在體液調(diào)節(jié)中通常討論的電解質(zhì)為鈉、氯、鉀、磷、鈣和鎂。當(dāng)制備礦物質(zhì)配方時需考慮三種個因素(1)攝入細胞的礦物質(zhì)是否供應(yīng)充足；(2)病人的內(nèi)分泌環(huán)境是否足以應(yīng)付所服用的各類營養(yǎng)物質(zhì)及其用量；和(3)所給予的水的量是否足夠用于測量腎的滲透負荷，是否足夠用于維持適當(dāng)?shù)哪驖B透壓。
也可以包括鐵和天然來源的痕量元素如礦物酵母如銅酵母、鋅酵母、硒酵母、錳酵母和鉻酵母。葡萄糖酸銅、葡萄糖酸鋅等也可以使用。
所述營養(yǎng)組合物具有約300-1000mOsm/L的滲透壓，如約300-750mOsm/L的滲透壓。室溫測量時，所述營養(yǎng)組合物具有約5-40cp(1cp＝0.001Pa？s)，或者優(yōu)選低于20的粘性。
所述營養(yǎng)組合物的熱量為大約1-2千卡/ml，或者優(yōu)選1-1.5千卡/ml。
所述營養(yǎng)組合物優(yōu)選為直接可用形式。這種形式的營養(yǎng)組合物可以使用一管子從鼻子給藥直至胃和空腸(小腸的一部分)，或者口服攝入。這樣的營養(yǎng)組合物可以采用不同的形式，例如，果汁或奶昔型飲料。所述營養(yǎng)組合物也可以是臨用前重配的可溶性粉末。
所述營養(yǎng)組合物可以含有不同的香料(如，香草)、甜味劑和其他添加物?？梢允褂萌嗽焯鹞秳┤缣於奖孽?aspartame)。
此外，可以添加5mg至500mg(0.005％至0.5％)的食用傘菌提取物以減小排泄物的氣味，添加10μg至200μg(0.00001％至0.0002％)類胡蘿卜素類物質(zhì)(如，α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、番茄色素(licopine)和葉黃素)用于營養(yǎng)強化。
另外，兒茶酚、多酚之類也可以作為抗氧化劑包括在內(nèi)。
營養(yǎng)組合物可以通過如表3所示的將蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂類混合在一起來制備。此時，可以在混合物中放入乳化劑。
本發(fā)明的營養(yǎng)組合物的制備可以采用本領(lǐng)域熟知的方法來進行。例如，這些方法包括，液體營養(yǎng)組合物的預(yù)熱殺菌，然后在無菌條件下將其填充到容器中(例如，既使用UHT殺菌又使用無菌包裝的方法)，或者將液體營養(yǎng)組合物注入容器，然后對容器加熱滅菌(例如，使用高壓滅菌器)。
當(dāng)本發(fā)明的營養(yǎng)組合物以液體形式使用時，可以將均勻的物質(zhì)注入一個罐狀的容器中，然后壓熱(retort)滅菌，或者可選地約140-145℃加熱約5-8秒再次滅菌、冷卻，然后無菌填充。當(dāng)以粉末形式使用時，均勻的物質(zhì)可以例如噴霧干燥。
本發(fā)明的營養(yǎng)組合物可以用作食物對急性肝炎(暴發(fā)型肝炎)、慢性肝炎、代償性肝硬化和代償失調(diào)型肝硬化進行營養(yǎng)調(diào)控。本發(fā)明的營養(yǎng)組合物尤其可用于對有可能發(fā)展為肝性腦病的慢性肝衰進行營養(yǎng)調(diào)控。尤其是，本發(fā)明營養(yǎng)組合物可用來對能攝入食物的慢性肝衰患者進行營養(yǎng)補充。
此外，本發(fā)明的營養(yǎng)組合物可用于為遭受外界刺激如手術(shù)、感染和燙傷的患者進行營養(yǎng)調(diào)控。
本發(fā)明的營養(yǎng)組合物可用作肝病患者的治療性食物(肝病飲食)，或者插管或腸道輸入的營養(yǎng)組合物。
給予患者營養(yǎng)組合物依賴于病人的身體狀況、體重、年齡以及所述營養(yǎng)組合物是否唯一的營養(yǎng)來源。由主管醫(yī)師決定給予量。
附圖簡述圖1是乳清分離物(WPI)水解產(chǎn)物的UF濾過液(截止分子量10,000)的反相層析。
圖2顯示在半乳糖胺肝病模型大鼠中營養(yǎng)組合物和Meibalance C對GOT和GPT升高的抑制效應(yīng)。
圖3顯示給予半乳糖胺后血液GOT和GPT濃度的變化。
圖4顯示給予ConA后血液GOT濃度的變化。
圖5顯示給予ConA后血液GPT濃度的變化。
圖6顯示給予ConA后血液TNF-α濃度的變化。
圖7顯示乳清蛋白水解產(chǎn)物對抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α生產(chǎn)的影響。
圖8顯示乳清蛋白水解產(chǎn)物對抑制IL-6生產(chǎn)的影向。
圖9顯示乳清蛋白水解產(chǎn)物劑量對抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α生產(chǎn)的影響。
實施本發(fā)明的最佳方式下面將參考實施例和試驗例詳細解釋本發(fā)明，但不能將其理解為對本發(fā)明的限制。
乳清蛋白水解產(chǎn)物的制備將含有約90％干蛋白的乳清蛋白分離物(WPI，Davisco)溶于蒸餾水中得到濃度為8％(w/v)的蛋白溶液。將溶液85℃加熱2分鐘使蛋白質(zhì)變性。加熱之后溶液的pH值大約為7.5。加入相對于底物濃度為2.0％的Alcalase(酶，Novozymes)2.4L進行水解，此混合物于55℃反應(yīng)3小時。加入相對于底物濃度為3.0％的豬源胰蛋白酶PTN 6.0S(Novozymes Japan)，55℃反應(yīng)3小時。完全水解用時6小時。反應(yīng)完成時的pH值為約7.0。離心乳清蛋白水解產(chǎn)物(20,000×g，10min)，然后用分級分子量為10,000的UF膜(Millipore，Ultrafree-MC)過濾。
濾出液進行反相HPLC層析(層析譜見圖1)。
條件樣品乳清蛋白水解產(chǎn)物UF濾液柱C18SG120(Shiseido)4.6mmΦ×250mm洗脫液A；0.1％三氟乙酸水溶液/乙腈 5/95B；0.1％三氟乙酸水溶液/乙腈 32/68A-->B60分鐘線性濃度梯度流速1mL/min檢測215nm(UV/可視檢測器)[實施例2]營養(yǎng)組合物的制備使用標(biāo)準(zhǔn)方法制備含有表3成分的營養(yǎng)組合物。使用實施例1中制備的乳清蛋白水解產(chǎn)物?？梢詮腟hin Mitsui Sugar Co.獲得帕拉金糖，從NOF公司獲得新制備的油和脂肪。奶源磷脂可由如JP-A Hei7-173182的方法獲得。示例如下將2000mL 99.5％的乙醇加至800g的緩沖血清(BAEF)(Corman)，攪動5小時，然后吸濾。濾出液減壓濃縮得到160g粗脂。將480mL丙酮加至粗脂，混合物攪動0.5小時然后吸濾。480mL丙酮加至濾渣，混合物攪動0.5小時然后吸濾，將濾渣真空干燥得到50g磷脂濃縮物。
表3

制得的油和脂肪包含93％的高油酸向日葵油和7％紫蘇(perila)油，n-6/n-3為1.54。此組合物列于表4。
表4

奶源磷脂組合物列于表5。
表5
半乳糖胺肝病抑制效應(yīng)(1)測定了本發(fā)明的營養(yǎng)組合物和作為對照的Meibalance C的抑制大鼠半乳糖胺肝病的能力。Meibalance C[Meiji Dairies Corp.]是一種半消化形式的全營養(yǎng)流體食品。
材料與方法雄性Sprague-Dawley大鼠(六周齡，日本SLC)先飼養(yǎng)一周，然后根據(jù)體重分為兩組一組用表3所示的營養(yǎng)組合物喂養(yǎng)(n＝8)；另外一組用Meibalance C喂養(yǎng)(n＝8)。
將D-半乳糖胺？HCl(Wako Pure Chemicals)溶于生理鹽水至200mg/mL，然后以300mg/kg的劑量腹腔內(nèi)給予每組大鼠。這一天視為第0天。給予后，鼠的食物變?yōu)闋I養(yǎng)組合物或Meibalance C。第7天，以600mg/kg的劑量腹腔內(nèi)給予每組鼠半乳糖胺鹽酸。第9天，禁食4小時后二乙基乙醚麻醉，從腹大動脈取血。離心(3,000rpm，10min)獲取血清，然后-20℃存儲直至檢測(隨后一天)。在收集血液的當(dāng)天測量血清中氨濃度。另外，取下肝和胰稱重。使用Fuji Dry Chem進行血清AST(GOT)、ALT(GPT)、總蛋白、白蛋白、氨、膽固醇、甘油三酯的生化測試。稱量肝重和胰重、解剖尸體。實驗期間，動物可以自由進食進水。測量體重和進食量。
生化測試結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。統(tǒng)計處理時，使用Student′s t檢驗得到偶數(shù)分布，使用Mann-Whitney檢驗獲得奇數(shù)分布。顯著性水平設(shè)定為5％以下。
圖2顯示GOT和GPT檢測結(jié)果。表6對體重、進食量、肝重、胰重、總蛋白、白蛋白、氨、膽固醇和甘油三酯水平測量結(jié)果進行了總結(jié)。
表6

*p＜0.05如圖2所示，在半乳糖胺肝病模型中，取食Meibalance C的組血清GOT和GPT水平升高，而取食營養(yǎng)組合物的組被顯著抑制。另外，營養(yǎng)組合物組的血清總蛋白、白蛋白、膽固醇和甘油三酯水平相對于Meibalance C組顯著升高，而氨水平被顯著(p＜0.05)抑制。
雖然兩個組的進食量幾乎相同，但與Meibalance C組相比，營養(yǎng)組合物組的體重、肝重和胰重顯著(p＜0.05)增加。
測定血清GOT和GPT活性主要是為了理解器官紊亂的程度，因為當(dāng)肝細胞惡化或壞死時GOT和GPT進入血液。雖然總血清蛋白、白蛋白、膽固醇和甘油三酯水平并非必然指示相應(yīng)器官的失調(diào)，但它們可以用來評估對肝功能，包括如蛋白質(zhì)合成和脂類代謝等基礎(chǔ)功能的影響。
根據(jù)這些結(jié)果，可預(yù)期本發(fā)明營養(yǎng)組合物對慢性肝衰的治療是有效的。
半乳糖胺肝病抑制效應(yīng)(2)六周齡Balb/c鼠(日本SLC)先用AIN-93M(oriental Yeast)飼養(yǎng)一周，然后根據(jù)體重分為每組8只鼠的多個組。再用Hepas(Morinaga Clinico)培養(yǎng)8天，將依照表7混合而得的營養(yǎng)組合物裝入罐狀容器后壓熱滅菌然后凍干。在飼養(yǎng)的第8天，將溶于PBS的D-半乳糖胺(Wako Pure Chemicals)以每kg體重400mg的劑量給予每只鼠。然后以每kg體重10μg的劑量腹腔內(nèi)給予LPS(Wako Pure Chemicals)。給予后8小時從尾靜脈收集血液。第二天在醚麻醉條件下從動脈收集血液。動物可以自由進食進水。離心血液分離血清，通過Fuji Dry Chem測量GOT和GPT。以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示結(jié)果，使用Mann-Whitney檢驗(*p＜0.05)來進行差異顯著性測定。
表7用于肝病的流體食物組合物

目前，Hepas是唯一可在市場上得到的用于肝病的流體食物。將Hepas的效果與依照表7的組合物制備的用于肝病的流體食物的效果進行比較。將半乳糖胺和LPS腹腔內(nèi)給予小鼠，8小時和24小時后測定GOT和GPT的水平。如圖3所示，Hepas使GOT和GPT升高，引發(fā)肝炎。另一方面，與Hepas相比，本發(fā)明用于肝病的流體食物明顯抑制GOT和GPT的升高。
上述結(jié)果中，沒有觀察到Hepas對肝炎的抑制效應(yīng)。另一方面，在半乳糖胺/LPS誘導(dǎo)的鼠肝炎模型中，可以確定本發(fā)明的治療肝病的流體食物對于抑制肝炎是有效的。
病毒性和自身免疫性肝病抑制效應(yīng)六周齡Balb/c鼠(日本SLC)先用AIN-93M(oriental Yeast)飼養(yǎng)一周，然后根據(jù)體重分為每組10只鼠的多個組。然后其食物改為WPI(Davisco)，或者改為實驗食物，其中AIN-93M(含14％酪蛋白)的酪蛋白被實施例1中制備的乳清蛋白水解產(chǎn)物取代，致使乳清蛋白水解產(chǎn)物的含量為食物蛋白含量的25％和50％。將鼠飼養(yǎng)14天。在第14天，以每kg體重15mg的劑量靜脈注射溶于PBS的ConA(Sigma)。注射后2、4和8小時從尾靜脈收集血液。第二天在麻醉狀態(tài)下，從動脈收集血液。動物可以自由進食進水。離心血液分離血清，用Fuji Dry Chem測量GOT和GPT。用ELISA(Amersham Bioscience)測定TNF-α細胞因子水平。以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示結(jié)果，使用Mann-Whitney氏U檢驗(*p＜0.05)來進行差異顯著性測定。
在酪蛋白組，肝炎的指示物質(zhì)GOT和GPT在給予ConA后8至24小時升高。另一方面，在WPI和乳清蛋白水解產(chǎn)物組，GOT和GPT的升高被顯著抑制(圖4和5)。確認25％乳清蛋白水解產(chǎn)物組顯示與50％WPI組等同或更強的效應(yīng)。因此，預(yù)期源于WPI的乳清蛋白水解產(chǎn)物具有比WPI更強的效應(yīng)。也同時測定了這些相同個體中細胞因子的生產(chǎn)。在酪蛋白組，血清TNF-α濃度在給予ConA后兩小時升高，4小時后降低(圖6)。給予ConA后兩小時，WPI組和乳清蛋白水解產(chǎn)物組的TNF-α濃度顯著低于酪蛋白組。證實WPI和乳清蛋白水解產(chǎn)物對抑制TNF-α的分泌是有效的。抑制細胞因子的生產(chǎn)也可以抑制肝炎的誘發(fā)，并因此抑制GOT和GPT的升高。如上所述，在ConA誘導(dǎo)的肝病模型中，證實WPI來源的乳清蛋白水解產(chǎn)物可抑制肝病。
乳清蛋白水解產(chǎn)物的抗炎效應(yīng)
<方法>
六周齡雄性ICR鼠(日本SLC)飼養(yǎng)一周，然后分成每組6只鼠的三個組，每組的平均體重相同。通過向純化食物(AIN-93M)中添加按重量計算14％的如下成分制得的實驗食物作為蛋白來源10％酪蛋白(對照組)、50％酪蛋白+50％WPI(Davisco Foods)、或50％酪蛋白+50％乳清蛋白水解產(chǎn)物(實施例1中制備的)。然后將小鼠飼養(yǎng)7天。
飼養(yǎng)后，以1.4μg/g體重的劑量腹腔內(nèi)給予脂多糖(LPS)。90分鐘后從眼窩取血，離心(10,000xg，15分鐘)得到血清。用ELISA試劑盒(Amershambioscience)測定血清TNF-α和IL-6。用Fisher氏PLSD檢驗組間差異顯著性。血清TNF-α濃度和IL-6濃度分別如圖7和圖8所示。
<結(jié)果>
與酪蛋白組(對照組)相比，WPI組在給予LPS后TNF-α的生產(chǎn)趨向于被抑制，而在乳清蛋白水解產(chǎn)物組中被顯著抑制(p＝0.033)(圖7)。
與酪蛋白組(對照組)相比，WPI組在給予LPS后IL-6的生產(chǎn)也趨向于被抑制，而在乳清蛋白水解產(chǎn)物組中被顯著抑制(p＝0.0002)(圖8)。
上述結(jié)果顯示，口服乳清蛋白水解產(chǎn)物后，由LPS刺激的TNF-α和IL-6的生產(chǎn)被顯著抑制。通過改變?nèi)榍宓鞍椎暮窟M一步檢測到這樣的TNF-α生產(chǎn)抑制。
更特別地，以100％酪蛋白、80％酪蛋白+20％乳清蛋白水解產(chǎn)物、70％酪蛋白+30％乳清蛋白水解產(chǎn)物、以及50％酪蛋白+50％乳清蛋白水解產(chǎn)物作為蛋白質(zhì)來源做了一些相似的實驗。經(jīng)F檢驗后，用Bonferroni/Dunn檢驗證實組間差異顯著性。這些結(jié)果列于圖9。
與酪蛋白組相比，20％乳清蛋白水解產(chǎn)物組中給予LPS后的TNF-α生產(chǎn)趨向于被抑制，而在30％和50％乳清蛋白水解產(chǎn)物組中被顯著抑制(p＝0.0496和p＝0.0479)。
<討論>
1.關(guān)于肝病和TNF-α之間的關(guān)系在炎癥和免疫反應(yīng)期間，TNF-α、IL-1和IL-6主要在巨噬細胞和內(nèi)皮細胞中生產(chǎn)，作為致熱原發(fā)揮功能，也直接對肝細胞起作用以促進產(chǎn)生急性期蛋白(acute phase proteins)(C-反應(yīng)蛋白；CRP)(Hepatology 23909-916，1996；J.Immunol.，1463032-3037，1991；Intensive Care Med.，24224-229，1998；Hepatology 9497-499，1989)。
急性肝炎(尤其是爆發(fā)性肝炎)和酒精性肝損害中，炎癥細胞因子的介入表現(xiàn)為發(fā)燒、白細胞增多、CRP陽性等。
TNF-α在內(nèi)毒素刺激后由巨噬細胞生產(chǎn)，可以引起多種器官障礙(″Hepatic Failure-Fundamental and Clinical″，Japan Nedical Journal，Tokyo，1994，pp.30-46；″Hepatic Failure-Fundamental and Clinical″，Japan MedicalJournal，Tokyo，1994，pp.123-137)。事實上，在暴發(fā)型肝炎患者中，網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的功能降低、也時常可以觀測到高內(nèi)毒素血癥的連續(xù)出現(xiàn)。因此認為TNF-α和IL-1的生產(chǎn)在體內(nèi)得到推動(Lancet，272-74，1988)。與急性肝炎相比，暴發(fā)型肝炎患者血液中大多數(shù)炎癥細胞因子的濃度顯著上升，尤其是，TNF-α和IL-6的濃度與人肝細胞生長因子(HGF)高度相關(guān)，HGF是肝再生的指標(biāo)(Clin.Exp.Immunol.，9871-77，1994)。
另一方面，作為慢性肝病的肝硬化的患者血液中炎癥細胞因子的濃度顯著高于未發(fā)生肝硬化的患者。不考慮疾病的原因，這反映的是肝功能紊亂而非炎癥(Gastroenterology，103264-274，1992)。在慢性乙型肝炎患者中，IL-1的生產(chǎn)增強并與肝纖維化程度相關(guān)，據(jù)報道IL-1在肝硬化進程中是重要的(Gastroenterology，94999-1005，1988)。
關(guān)于肝病和IL-6之間的關(guān)系在酒精性肝硬化中，IL-6血液水平的升高和外周血單核細胞中IL-6的生產(chǎn)與IgA水平正相關(guān)，與IL-2和IFN-γ的生產(chǎn)負相關(guān)(Clin.Exp.Immunol.，77221-225，1989)。血液IL-6的活性在慢性肝炎急劇惡化期間也有所升高(Am.J.Gastroenterol.，861804-1808，1991)。IL-6血液水平以及未經(jīng)刺激的外周血單核細胞產(chǎn)生IL-6被認為反映個體肝臟炎癥的程度。
急性病毒性肝炎中，在竇狀小管內(nèi)皮細胞、枯否(Kupffer)細胞和侵入性單核細胞中探測到了IL-6(J.Clin.Pathol.，45408-411，1992)。慢性肝炎中，IL-6主要在侵入性淋巴細胞和門靜脈區(qū)成纖維細胞中被探測到。因此，在急慢性肝病中，預(yù)期IL-6的表達與炎癥和免疫反應(yīng)緊密相關(guān)，此時不考慮這些疾病的病因。IL-6促進肝細胞再生，其過量生產(chǎn)可能引起組織損傷和纖維化。
2.營養(yǎng)給予途徑和細胞因子的生產(chǎn)在外來刺激期間，為阻止細胞因子引起的代謝和器官功能紊亂，誘導(dǎo)細胞因子在局部的正常生產(chǎn)并阻止其向全身擴散是可能是合理的。因此，考慮到在外來刺激時改變細胞因子生產(chǎn)的可能性，討論了不同營養(yǎng)給予方法之間的差異。對于未遭受外來刺激的健康成年人，腸或靜脈內(nèi)給予營養(yǎng)一周不會導(dǎo)致出現(xiàn)TNF和IL-6血液水平的明顯差異(New Horizon，2164-174，1994)。然而據(jù)報道，當(dāng)對健康成年人提供腸或靜脈內(nèi)營養(yǎng)7天后靜脈注射內(nèi)毒素時，就所引起的全身性生物反應(yīng)如發(fā)燒以及TNF和應(yīng)激性激素的釋放而言，腸營養(yǎng)要比靜脈營養(yǎng)輕微(Ann.Surg.，210449-457，1989)。Saito等也對鼠由腸途徑給予細菌并經(jīng)不同途徑給予營養(yǎng)來研究營養(yǎng)給予途徑和細胞因子生產(chǎn)之間的關(guān)系。其結(jié)果證實通過腸營養(yǎng)來改變細胞因子的生產(chǎn)在生物反應(yīng)方面比靜脈營養(yǎng)更加有利(Ann.Surg.，22384-93，1996)。
3.關(guān)于營養(yǎng)組合物和肝病抑制效應(yīng)之間的關(guān)系當(dāng)本發(fā)明的營養(yǎng)組合物被口服攝入時，內(nèi)毒素誘導(dǎo)的TNF-α和IL-6在血液中濃度的升高被顯著抑制。此抑制效應(yīng)主要歸因于營養(yǎng)組合物中所含的乳清蛋白水解產(chǎn)物。血液TNF-α和IL-6濃度升高的抑制可能歸因于TNF-α和IL-6生產(chǎn)的改變，此改變的發(fā)生是由于營養(yǎng)組合物的口服攝入。
工業(yè)實用性本發(fā)明的營養(yǎng)組合物可用于急性肝炎(暴發(fā)型肝炎)、慢性肝炎、代償性肝硬化、代償失調(diào)性肝硬化的營養(yǎng)調(diào)控。本發(fā)明的尤其可用于有發(fā)展為肝性腦病的慢性肝衰。在慢性肝衰中，如果能夠攝取食物，標(biāo)準(zhǔn)是限制蛋白質(zhì)攝入量。然而，當(dāng)較高程度的蛋白質(zhì)限制持續(xù)一個較長的時間時，食欲降低，蛋白質(zhì)分解代謝增強，營養(yǎng)匱乏狀況加劇。因此，多少有些營養(yǎng)補充是必要的。每餐都補充一些本發(fā)明的食物型營養(yǎng)組合物可以改善慢性肝衰病人的營養(yǎng)狀況。
此外，本發(fā)明的營養(yǎng)組合物還可用來對經(jīng)歷手術(shù)、感染、燙傷等外來刺激的病人進行營養(yǎng)調(diào)控。
權(quán)利要求
1.一種用于肝病患者的營養(yǎng)組合物，包含奶蛋白水解產(chǎn)物和源于發(fā)酵奶的蛋白質(zhì)，作為蛋白質(zhì)成分；富含油酸的油和奶卵磷脂和/或大豆卵磷脂，作為脂類成分；帕拉金糖，作為碳水化合物成分。
2.權(quán)利要求1的營養(yǎng)組合物，其中所述的奶蛋白選自由酪蛋白、奶蛋白濃縮物(MPC)、乳清蛋白濃縮物(WPC)、乳清蛋白分離物(WPI)，α-乳清蛋白、β-乳球蛋白、和乳鐵蛋白所組成的組中的蛋白。
3.權(quán)利要求1的營養(yǎng)組合物，其中所述的源于發(fā)酵奶的蛋白質(zhì)源于發(fā)酵奶中乳清減少的組合物。
4.權(quán)利要求1的營養(yǎng)組合物，其中所述的源于發(fā)酵奶的蛋白質(zhì)源于新鮮干酪。
5.權(quán)利要求4的營養(yǎng)組合物，其中所述的新鮮干酪是夸克。
6.權(quán)利要求1的營養(yǎng)組合物，其中所述的奶蛋白水解產(chǎn)物可以通過用源于地衣芽孢桿菌的alkalase和源于豬胰腺的胰蛋白酶來水解乳清蛋白分離物(WPI)而獲得。
7.權(quán)利要求6的營養(yǎng)組合物，其是一種使用分級分子量為10,000的超濾膜進一步處理而獲得的濾過液。
8.權(quán)利要求7的營養(yǎng)組合物，其中反相HPLC分離層析譜如圖1所示。
9.用于遭受強烈外來刺激的病人的營養(yǎng)組合物，其中所述的營養(yǎng)組合物包含作為蛋白質(zhì)成分的奶蛋白水解產(chǎn)物和源于發(fā)酵奶的蛋白質(zhì)；作為脂質(zhì)成分的富含油酸的油和奶卵磷脂和/或大豆卵磷脂；和作為碳水化合物成分的帕拉金糖。
10.權(quán)利要求9的營養(yǎng)組合物，其中所述的奶蛋白選自由酪蛋白、奶蛋白濃縮物(MPC)、乳清蛋白濃縮物(WPC)、乳清蛋白分離物(WPI)，α-乳清蛋白、β-乳球蛋白、和乳鐵蛋白所組成的組中的蛋白。
11.權(quán)利要求9的營養(yǎng)組合物，其中所述的源于發(fā)酵奶的蛋白質(zhì)源于發(fā)酵奶中乳清減少的組合物。
12.權(quán)利要求9的營養(yǎng)組合物，其中所述的源于發(fā)酵奶的蛋白質(zhì)源于新鮮干酪。
13.權(quán)利要求12的營養(yǎng)組合物，其中所述的新鮮干酪是夸克。
14.權(quán)利要求9的營養(yǎng)組合物，其中所述的奶蛋白水解產(chǎn)物可以通過用源于地衣芽孢桿菌的alkalase和源于豬胰腺的胰蛋白酶來水解乳清蛋白分離物(WPI)而獲得。
15.權(quán)利要求14營養(yǎng)組合物，其是一種使用分級分子量為10,000的超濾膜進一步處理而獲得的濾過液。
16.權(quán)利要求15的營養(yǎng)組合物，其中反相HPLC分離層析譜如圖1所示。
全文摘要
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)半乳糖胺肝病的發(fā)作可由包含下述基本成分的營養(yǎng)組合物所抑制乳清蛋白水解產(chǎn)物；可以改善脂類代謝的卵磷脂、油和高油酸脂肪；以及具有胰蛋白酶節(jié)省效應(yīng)的帕拉金糖。另外還發(fā)現(xiàn)該營養(yǎng)組合物中所包含的乳清蛋白水解產(chǎn)物可以抑制巨噬細胞中內(nèi)毒素誘導(dǎo)的TNF－α和白介素6(IL－6)的生產(chǎn)。
文檔編號A23L1/09GK1741749SQ20038010910
公開日2006年3月1日 申請日期2003年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月22日
發(fā)明者粂久枝, 山口真, 水本憲司, 佐佐木一 申請人:明治乳業(yè)株式會社