專利名稱：一種耐高溫木聚糖酶的表達(dá)方法及其專用表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種耐高溫木聚糖酶的表達(dá)方法及其專用表達(dá)載體。
背景技術(shù)：
木聚糖酶主要由腐生真菌和細(xì)菌產(chǎn)生，它能降解植物細(xì)胞壁中的木聚糖成分，并被證實(shí)在農(nóng)業(yè)和工業(yè)各方面都具有重要的應(yīng)用價(jià)值。木聚糖是僅次于纖維素含量第二豐富的生物聚合物，并且是植物細(xì)胞壁中主要的半纖維素多糖，這種異源多糖是由D-吡喃木糖殘基通過β-1，4糖苷鍵連接而成，而這一殘基在不同的植物中可被乙?；?、阿糖醛酸基或葡糖醛酸基所替代。木聚糖的這種異源性使得完全降解木聚糖需要多種酶的共同作用，其中β-1，4-D-木聚糖酶是其中一種關(guān)鍵酶，它能打開主鏈上D-木糖殘基之間的β-1，4糖苷鍵，從而把多糖的骨架降解成短鏈的木寡糖。因此β-1，4-D-木聚糖酶在食品，飼料，和造紙工業(yè)中有著非常廣泛的應(yīng)用。木聚糖酶的熱穩(wěn)定性在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中是一個(gè)制約因素。但是耐熱的微生物往往培養(yǎng)困難，有的還需要在高溫厭氧條件下培養(yǎng)，產(chǎn)酶量低而且酶系復(fù)雜，很難得到純酶。
目前已發(fā)現(xiàn)的木聚糖酶基因有xynA、xynB、xynC、xynZ等。研究較多的是xynA，但主要局限于細(xì)菌的xynA的克隆和表達(dá)，xynA在大腸桿菌中表達(dá)但不分泌到細(xì)胞外。Donald等首次將嗜熱細(xì)菌的xynA克隆并在釀酒酵母菌表達(dá)，分泌至培養(yǎng)液中的具有活性的木聚糖酶達(dá)10mg/l。Bergquist等研究利用乳酸克魯維酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)Thermotoga strain FjSS3B.1的木聚糖酶XynA，在搖瓶培養(yǎng)水平上表達(dá)量為120mg/l。Berrin等研究利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)黑曲霉木聚糖酶基因XylA，酶活性為350U/mg(蛋白)。
1999年Karen E.Nelson和Claire M.Fraser等人完成了海棲熱袍菌MSB8(Thermotoga maritima MSB8)的基因全序列測(cè)定，開放閱讀框TM0061(xynA)和TM0070(xynB)分別控制合成兩個(gè)獨(dú)立的木聚糖酶XynA和XynB。海棲熱袍菌的xynA基因已克隆并在大腸桿菌中表達(dá)。該酶具有熱穩(wěn)定性，最適溫度為90℃，最適反應(yīng)pH值為6.2。
畢赤酵母異源基因表達(dá)系統(tǒng)是近年來應(yīng)用得較多的酵母表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)被認(rèn)為是表達(dá)外源蛋白的理想系統(tǒng)，具有很高的商業(yè)應(yīng)用價(jià)值。這個(gè)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)有以下幾個(gè)方面它具有AOX1強(qiáng)啟動(dòng)子，能有效的調(diào)節(jié)外源基因的表達(dá)；對(duì)該系統(tǒng)的分類特征及其分子生物學(xué)的研究已經(jīng)比較透徹，有利于基因工程的操作；該表達(dá)系統(tǒng)還可以進(jìn)行菌體高密度培養(yǎng)，有利于發(fā)酵生產(chǎn)。這些優(yōu)點(diǎn)都有利于畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)成為被廣泛利用的外源基因表達(dá)系統(tǒng)，用于表達(dá)各種外源蛋白。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種耐高溫木聚糖酶的表達(dá)載體。其表達(dá)產(chǎn)物可分泌到胞外，利于木聚糖酶的提取，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明所提供的耐高溫木聚糖酶的表達(dá)載體是含有耐高溫木聚糖酶基因xynB(64)的重組畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K-xynB(64)。
其中，mxynB(64)已在GenBank注冊(cè)，檢索編號(hào)為AY340789。
重組畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K-xynB(64)是通過下述步驟得到的(1)以海棲熱袍菌MSB8基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增出木聚糖酶基因mxynB(64)；(2)將步驟(1)中的擴(kuò)增產(chǎn)物回收連接到載體pGEM-T Easy上，挑選出陽性克隆pGEM-T-mxynB(64)；(3)將陽性克隆pGEM-T-mxynB(64)與畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K重組，得到重組畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K-xynB(64)。
其中，步驟(1)中的PCR擴(kuò)增引物可為序列表中的SEQ ID №1和SEQ ID №2，其中，SEQ ID №1和SEQ ID №2的自5’端第4位至第11位堿基為NotI的酶切位點(diǎn)。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種表達(dá)耐高溫木聚糖酶的方法。
一種表達(dá)耐高溫木聚糖酶的方法，是將重組畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K-xynB(64)轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中，得到陽性克隆，誘導(dǎo)培養(yǎng)所述陽性克隆，表達(dá)耐高溫木聚糖酶。
為了獲得更好的效果，畢赤酵母優(yōu)選為GS115菌株并用終濃度為0.25-1％的甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)陽性克隆，其中甲醇的終濃度優(yōu)選為0.5％。
所述陽性克隆可為含有外源基因xynB(64)，能在含有6.0mg/ml G418的YPD平板上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子GS115-9k-mxynB(64)I、GS115-9k-mxynB(64)II、GS115-9k-mxynB(64)III和GS115-9k-mxynB(64)IV，其中優(yōu)選為GS115-9k-mxynB(64)II。
本發(fā)明采用基因克隆技術(shù)，成功構(gòu)建了酵母表達(dá)載體pPIC9K-xynB(64)；利用電穿孔轉(zhuǎn)化方法，得到具有外源基因拷貝數(shù)約大于20的高拷貝數(shù)酵母轉(zhuǎn)化子，在5升發(fā)酵罐內(nèi)經(jīng)甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)260小時(shí)，細(xì)胞密度OD600達(dá)250，木聚糖酶分泌量達(dá)207mg/L培養(yǎng)液，木聚糖酶活性為522U/mg(蛋白)。該木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為90℃，在沸水浴中(100℃)處理30分鐘后，酶活力仍能保持最大酶活的70％，在90℃下測(cè)定分解木聚糖活性時(shí)，其pH值穩(wěn)定性在6.2-10.0范圍內(nèi)。本發(fā)明的方法在耐高溫木聚糖酶的生產(chǎn)中具有廣闊的工業(yè)前景。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、重組畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K-xynB(64)的構(gòu)建(1)木聚糖酶基因mxynB(64)的克隆根據(jù)海棲熱袍菌MSB8木聚糖酶基因xynB的全序列以及畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K上的多克隆位點(diǎn)的特征，設(shè)計(jì)合成引物FW5’-ATAgcggccgcTATGAAAATATTACCTTCTGTG-3’REV5’-ATAgcggccgcTCATTTTCTTTCTTCTATCTTTT-3’引物兩端設(shè)計(jì)合成NotI的酶切位點(diǎn)，以海棲熱孢菌MSB8基因組DNA作為模板，通過PCR方法擴(kuò)增出木聚糖酶基因xynB，擴(kuò)增條件為預(yù)變性94℃5分鐘，再進(jìn)行25個(gè)循環(huán)變性94℃，30秒、退火56℃，1分鐘、延伸72℃，1分30秒，72℃，延伸10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物(約1kb左右)回收連接到載體pGEM-T Easy上，經(jīng)菌落PCR挑選出陽性轉(zhuǎn)化子pGEM-T-mxynB(64)，并對(duì)陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行NotI酶切檢測(cè)。
通過對(duì)該基因進(jìn)行序列分析并與Karen E.Nelson和Claire M.Fraser等人公布的木聚糖酶基因(xynB)進(jìn)行序列同源性比較，得知該基因在第64位堿基發(fā)生了改變，由原來的腺嘌呤(A)改變?yōu)轼B嘌呤(G)，因此該基因產(chǎn)物木聚糖酶的第22位氨基酸也相應(yīng)的由天冬酰胺(Asn)轉(zhuǎn)變?yōu)樘於匪?Asp)。將該基因產(chǎn)物命名為mxynB(64)。該基因mxynB(64)已在GenBank注冊(cè)，檢索編號(hào)為AY340789。
(2)陽性克隆pGEM-T-mxynB(64)經(jīng)NotI酶切后與酵母表達(dá)載體pPIC9k(購自美國Invitrogen公司)重組，構(gòu)建重組畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K-xynB(64)，陽性克隆經(jīng)NotI酶切檢測(cè)，并通過序列測(cè)定的方法確定基因正向連接到表達(dá)質(zhì)粒上。
克隆到表達(dá)載體上的mxynB(64)基因，再次經(jīng)過DNA序列測(cè)定分析，結(jié)果表明序列正確。
實(shí)施例2、耐高溫木聚糖酶的表達(dá)(1)重組畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K-xynB(64)的轉(zhuǎn)化及高拷貝數(shù)轉(zhuǎn)化子的篩選重組畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K-xynB(64)經(jīng)SalI完全酶切線性化后，電擊法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115菌株，轉(zhuǎn)化在不含組氨酸(His)的基本培養(yǎng)基MD平板上篩選出發(fā)生同源重組的His+克隆，然后把陽性克隆分別點(diǎn)接在MD和MM平板上，進(jìn)行Mut+/Muts表型鑒定。
利用含有不同濃度G418的YPD平板，可以快速的篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，并可估測(cè)出整合至基因組的外源基因的拷貝數(shù)。用2ml的無菌水把在MD平板上的單菌落轉(zhuǎn)化子洗脫并懸浮，輕微振蕩后，稀釋適當(dāng)倍數(shù)，以105的細(xì)胞濃度分別在含G418濃度為0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0mg/ml的YPD平板上涂布，隨機(jī)挑選了能在含有4.0mg/ml G418的YPD平板上生長(zhǎng)的40個(gè)轉(zhuǎn)化子單菌落，點(diǎn)接在含有6.0mg/ml的G418的YPD平板上，這40個(gè)轉(zhuǎn)化子都能生長(zhǎng)。在隨后的篩選過程中發(fā)現(xiàn)，有4個(gè)轉(zhuǎn)化子GS115-9k-mxynB(64)I、II、III、IV能在含有10mg/ml的G418的YPD液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，表明這4個(gè)轉(zhuǎn)化子起碼含有40個(gè)拷貝的外源基因。其中GS115-9k-mxynB(64)II的長(zhǎng)勢(shì)最好，細(xì)胞濃度最大。因此，挑選GS115-9k-mxynB(64)II進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，表達(dá)重組蛋白。
(2)酵母陽性轉(zhuǎn)化子的誘導(dǎo)表達(dá)挑選具有高拷貝數(shù)的His+/Mut+的陽性轉(zhuǎn)化子GS115-9k-mxynB(64)II接種于25mlBMGY培養(yǎng)基[1％酵母抽提物，2％蛋白胨，100mmol/l，磷酸鉀pH6.0，1.34％YNB(YeastNitrogen Base)，1％甘油，(4×10-5)％生物素]于30℃搖床培養(yǎng)至OD600為2.0左右，離心收集菌體，轉(zhuǎn)接到100ml BMMY培養(yǎng)基[BMGY培養(yǎng)基中的1％甘油改為0.5％甲醇]，繼續(xù)培養(yǎng)，每24小時(shí)取樣1ml，并補(bǔ)加甲醇于培養(yǎng)基至終濃度為0.5％，誘導(dǎo)表達(dá)7天，離心收集上清。
上清培養(yǎng)液中含有酵母表達(dá)并分泌到胞外的木聚糖酶，將培養(yǎng)液在70℃水浴中處理10分鐘，除去雜蛋白。為了檢測(cè)酵母分泌表達(dá)的效率，將離心收集的細(xì)胞，經(jīng)酶解(Zymolyase)破壁，并于70℃水浴10分鐘后，離心收集上清即為酵母胞內(nèi)表達(dá)的粗酶提取液。胞內(nèi)與胞外的粗酶液都經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白表達(dá)量，電泳結(jié)果表明胞外與胞內(nèi)的粗酶液經(jīng)過70℃水浴10分鐘處理后都能得到電泳純的木聚糖酶XynB，其相對(duì)分子量為42kDa，與理論推算的分子量(42.067 KDa)相吻合。
實(shí)施例3、發(fā)酵培養(yǎng)GS115-9k-mxynB(64)II生產(chǎn)耐高溫木聚糖酶(1)木聚糖酶活性測(cè)定以0.25％的燕麥木聚糖(oat spelts xylan，Sigma Chemical St.Louis，MO.USA)為底物，采用對(duì)羥基苯甲酸酰肼法(p-hydroxybenzoic acid hydrazide，PHBAH法)測(cè)定耐高溫木聚糖酶活力。具體操作如下1).按順序分別取儲(chǔ)存液0.5M檸檬酸鈉，1M亞硫酸鈉，0.2M氯化鈣，5M氫氧化鈉各10ml，邊攪拌邊加入，用蒸餾水定容到100ml，再加入1.52克PHBAH，不停的攪拌，此溶液必須現(xiàn)用現(xiàn)配；2).稱量1克木聚糖底物溶于100ml 50mM MES緩沖液(pH 6.2)中，經(jīng)充分?jǐn)嚢韬?，離心除去沉淀，上清液約為0.25％的木聚糖酶反應(yīng)底物；3).取190μl 0.25％的木聚糖底物于50℃下保溫10min，加入10μl合理稀釋的酶溶液，于50℃下準(zhǔn)確反應(yīng)10min，再加入400μl PHBAH溶液，混勻后于沸水浴中保持6min；4).樣品冷卻后，用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值(OD405)。空白的操作與上述一樣，以10μl水代替合理稀釋的酶溶液。1個(gè)酶活力單位(unit)定義為在上述實(shí)驗(yàn)條件下，每分鐘產(chǎn)生1μmol木糖所需的酶量為1個(gè)酶活力單位，而OD405＝1時(shí)相當(dāng)于0.067μmol木糖。
(2)發(fā)酵培養(yǎng)(5L發(fā)酵罐)培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基BMGY(1％酵母抽提物；2％蛋白胨；100mM磷酸鉀，pH6.0；1.34％YNB(Yeast Nitrogen Base)；4×10(-5)％生物素；1％甘油)；發(fā)酵培養(yǎng)基FBS基礎(chǔ)鹽[甘油4％(w/v)+3.5ml/L PTM1]；補(bǔ)料培養(yǎng)基50％甘油(W/V，含12mL/L PTM1)補(bǔ)料液；誘導(dǎo)培養(yǎng)基100％甲醇(含12mL/L PTM1)誘導(dǎo)液。
FBS基礎(chǔ)鹽85％ H3PO4，26.7mL；CaSO4，0.93g；K2SO4，18.2g；MgSO4.7H2O，14.9g；KOH，4.13g；甘油，40.0g；水，1000ml。
PTM1trace salts(過濾滅菌)CuSO4.5H2O，6.0g；NaI，0.08g；MnSO4.H2O，3.0g；NaMoO4.2H2O，0.2g；硼酸，0.02g；CoCl2，0.5g；ZnCl2，20.0g；FeSO4.7H2O，65.0g；生物素，0.2g；H2SO4，5.0mL；水，1000ml。
種子培養(yǎng)從平板上挑單菌落，接入到種子培養(yǎng)基(100ml/500ml三角瓶)中，30℃，220r/min培養(yǎng)18h，OD600約8.0左右。
高密度發(fā)酵按10％接種量將種子罐菌種接入到裝2.5L分批發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，進(jìn)行分批培養(yǎng)(用25％氨水調(diào)pH至5.0左右)。約20小時(shí)后，開始流加補(bǔ)料生長(zhǎng)培養(yǎng)基(流加速率維持溶氧大于20％)。4小時(shí)后停止補(bǔ)料，甘油耗盡后補(bǔ)入發(fā)酵誘導(dǎo)培養(yǎng)基，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)(pH用25％NH3.H2O控制為6.0)，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、罐壓、空氣流量和流加甲醇速度使溶氧大于20％，誘導(dǎo)培養(yǎng)260h左右。培養(yǎng)過程中定時(shí)取樣測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)、分泌蛋白量及其酶活。最終木聚糖酶分泌量可達(dá)207mg/L培養(yǎng)液，酶活為522U/mg(蛋白)。
利用已知的蛋白質(zhì)化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定此木聚糖酶的基本特性，經(jīng)測(cè)定表明該木聚糖酶的最適作用溫度為90℃，分解木聚糖活性在pH值為6.2-8.0范圍內(nèi)穩(wěn)定。
序列表<160>2<210>1<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1atagcggccg ctatgaaaat attaccttct gtg 33<210>2<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2atagcggccg ctcattttct ttcttctatc tttt3權(quán)利要求
1.一種耐高溫木聚糖酶表達(dá)載體，是含有耐高溫木聚糖酶基因xynB(64)的重組畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K-xynB(64)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于所述重組畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K-xynB(64)是通過下述步驟得到的(1)以海棲熱袍菌MSB8基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增出木聚糖酶基因mxynB(64)；(2)將步驟(1)中的擴(kuò)增產(chǎn)物回收連接到載體pGEM-TEasy上，挑選出陽性克隆pGEM-T-mxynB(64)；(3)將陽性克隆pGEM-T-mxynB(64)與畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K重組，得到重組畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K-xynB(64)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于所述步驟(1)中的PCR擴(kuò)增引物為序列表中的SEQ ID №1和SEQ ID №2；所述SEQ ID №1和SEQ ID №2的自5’端第4位至第11位堿基為NotI的酶切位點(diǎn)。
4.一種表達(dá)耐高溫木聚糖酶的方法，是將重組畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K-xynB(64)轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中，得到陽性克隆，誘導(dǎo)培養(yǎng)所述陽性克隆，表達(dá)耐高溫木聚糖酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述畢赤酵母為GS115菌株。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于用終濃度為0.25-1％的甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)所述陽性克隆。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述甲醇的終濃度為0.5％。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述陽性克隆為GS115-9k-mxynB(64)I、GS115-9k-mxynB(64)II、GS115-9k-mxynB(64)III或GS115-9k-mxynB(64)IV。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述陽性克隆為GS115-9k-mxynB(64)II。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種耐高溫木聚糖酶的表達(dá)方法及其專用表達(dá)載體。本發(fā)明所提供的耐高溫木聚糖酶表達(dá)載體，是含有耐高溫木聚糖酶基因xynB
文檔編號(hào)C12N15/31GK1544640SQ20031011356
公開日2004年11月10日 申請(qǐng)日期2003年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月17日
發(fā)明者李穎, 楊夢(mèng)華, 關(guān)國華, 江正強(qiáng), 李里特, 李 穎 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)