專利名稱：腺病毒血清型34載體,核酸及其由此產(chǎn)生的病毒的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2003年3月28日遞交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)60/458,825的權(quán)益。
背景技術(shù)：
已在一些禽類和哺乳動(dòng)物中鑒定的腺病毒是無(wú)囊膜的二十面體病毒；Horne etal.，1959 J.Mol.Biol.184-86；Horwitz，1990 InVirology，eds.B.N.Fields and D.M.Knipe，pps.1679-1721。第一個(gè)人腺病毒(Ads)是在40多年以前分離的。自此以后，超過(guò)100種不同的腺病毒血清型被分離，其感染不同的哺乳動(dòng)物種類，其中51種是人源的；Straus，1984，In The Adenoviruses，ed.H.Ginsberg，pps.451-498，New YorkPlenus Press；Hierholzer etal.，1988J.Infect.Dis.158804-813；Schnurr and Dondero，1993，Intervirology；3679-83；Jong et al.，1999 J Clin Microbiol.，373940-5。人血清型按照生物學(xué)、化學(xué)、免疫學(xué)和結(jié)構(gòu)標(biāo)準(zhǔn)已被分類為6個(gè)亞屬(A-F)，這些標(biāo)準(zhǔn)包括大鼠和恒河猴紅細(xì)胞的血細(xì)胞凝集特性、DNA同源性、限制酶切割譜，G+C百分?jǐn)?shù)含量以及致癌性；Straus，同前；Horwitz，同前。
腺病毒基因組已得到非常好的表征。其由大約36,000堿基對(duì)的線性雙鏈DNA分子組成，盡管存在一些不同的血清型，但在腺病毒的基因組的整體結(jié)構(gòu)中有一些共同的保守區(qū)，特定的功能位于相類似的位置。
腺病毒是遞送外源基因的非常有吸引力的靶標(biāo)。對(duì)于腺病毒的生物學(xué)已有非常好的理解。在具有免疫能力的人群中，尚未發(fā)現(xiàn)腺病毒與嚴(yán)重的人類病理有關(guān)。病毒在將其DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞方面是非常有效的，并且能夠感染多種類型的細(xì)胞。而且，病毒能以較高滴度大量產(chǎn)生。此外，通過(guò)缺失病毒基因組的基本早期區(qū)域(E1)，可以使病毒復(fù)制缺陷；Brody et al，1994 Ann N YAcad Sci.，71690-101。
作為疫苗和基因治療目的的基因轉(zhuǎn)移載體，復(fù)制缺陷型腺病毒已被廣泛應(yīng)用。這些載體在提供反式E1基因產(chǎn)物的細(xì)胞系擴(kuò)增。當(dāng)載體來(lái)自相同或非常相似的血清型時(shí)，補(bǔ)充反式基本E1基因產(chǎn)物是非常有效的。例如，E1-缺失的血清型C(Ad1，Ad2，Ad5和Ad6)，在含有和表達(dá)Ad5 E1區(qū)的293或PER.C6細(xì)胞生長(zhǎng)良好。然而，293或PER.C6細(xì)胞Ad5 E1序列不能完全補(bǔ)充血清型C之外的所有血清型的復(fù)制。這可能是由于Ad5(血清型C)E1B 55K基因產(chǎn)物不能與非血清型C的E4基因產(chǎn)物功能性相互作用。盡管相互作用在同一亞組(subgroup)的成員內(nèi)是保守的，但尚未發(fā)現(xiàn)其在亞型之間也是保守的。為了成功和有效的挽救(rescue)備選的、非血清型C的腺病毒，必須產(chǎn)生表達(dá)目的血清型E1區(qū)的細(xì)胞系。備選地，可以對(duì)可得到的表達(dá)Ad5E1的細(xì)胞系進(jìn)行改進(jìn)來(lái)表達(dá)Ad5E4(或Orf6)以及Ad5E1。這些另外的有時(shí)冗長(zhǎng)和繁瑣的工作阻礙了重組非血清型C腺病毒載體的產(chǎn)生。
在Ad5E1-表達(dá)細(xì)胞系(例如PER.C6或293)繁殖和挽救其他血清型的有效方式公開(kāi)于懸而未決的U.S.臨時(shí)申請(qǐng)(系列號(hào)60/405,182，2002年8月22日遞交)。這一方法涉及將關(guān)鍵的E4區(qū)引入待繁殖的腺病毒。關(guān)鍵的E4區(qū)是互補(bǔ)細(xì)胞系的E1基因產(chǎn)物，尤其是E1B 55K區(qū)域的相同或高度相似血清型的病毒所固有的并包括至少編碼E4 Orf6的核酸。
目前，來(lái)自亞組C，Ad5和Ad2的兩個(gè)良好表征的腺病毒血清型是最廣泛使用的基因遞送載體。有必要開(kāi)發(fā)備選的Ad血清型作為基因轉(zhuǎn)移載體，因?yàn)槠胀ㄈ巳褐械闹泻涂贵w會(huì)限制同一血清型的引發(fā)劑量和再劑量。中和抗體的的流行因血清型不同而不同。一些血清型如Ad5的中和抗體很常見(jiàn)，而其他的抗體相對(duì)較少。此外，其他的血清型具有不同的親嗜性，當(dāng)用于疫苗或基因治療目的時(shí)會(huì)導(dǎo)致激發(fā)過(guò)度免疫反應(yīng)。
腺病毒血清型34，亞組B腺病毒最早在1972年分離，并于1975年將其作為已識(shí)別的參考菌株(J.C.Hierholzer etal.，1975 J.Clin.Microbiol.1366-376)。已經(jīng)討論了通過(guò)參照馬抗血清確定的其與46種其他人腺病毒的抗原關(guān)系；J.C.Hierholzer et al.，1991 Arch.Viral.121179-197?？梢缘玫紸d34的部分序列信息。有一些關(guān)于Ad34六鄰體的序列的公開(kāi)。Ad34六鄰體的完整序列以及5′和3′側(cè)翼序列(3358bp)已由Mukouyama保藏于GenBank(登錄號(hào)AB052911)。在Takeuchi et al.，1999 J.Clin.Microbiol.373392-33949和GenBank(登錄號(hào)QAB01842G)中公開(kāi)了Ad34六鄰體的部分序列(1449bp)。在Allard et al.，2001 J.Clin.Microbiol.39498-505中公開(kāi)了Ad34六鄰體的部分序列(253bp)，其還保藏于GenBank(登錄號(hào)AF161573)。Perera和Cardosa保藏了Ad34六鄰體的兩部分序列(571bp和301bp)，GenBank(登錄號(hào)AJ272610和AJ250786)。Ad34纖維基因的序列由Arun，Mukouyama和Inada保藏于GenBank(登錄號(hào)AB073168)。Ad34的病毒相關(guān)RNA區(qū)(VA RNA1&2)的序列(162bp)由Kidd et al.，1995 Virology 20732-45，和GenBank(登錄號(hào)U10677)公開(kāi)。而且，Ad34的病毒相關(guān)RNA區(qū)的序列以及前-端蛋白和52/55K蛋白的(354bp)部分序列公開(kāi)于Ma&Matthews，1996J.Virol.705083-99，和GenBank(登錄號(hào)No.U52571)。Adhikary，Mukouyama和Inada公開(kāi)了Ad34基因的L4100kDa，L4pVIII，E3 12.3kDa，E3 14.9kDa，E3gp18.5kDa，E3 20.3kDa，E320.5kDa，E3 10.2kDa，E3 15.2kDa1，E3 15.2kDa2，以及部分纖維序列(4828bp)并將序列保藏于GenBank(登錄號(hào)AB079724)。病毒基因組的右端序列(1038bp)公開(kāi)于Chen&Horwitz，1990 Virology 179567-75，和GenBank(登錄號(hào)M62712)。
疫苗和基因治療領(lǐng)域?qū)⒋蟠蟮靡嬗陉P(guān)于其他腺病毒血清型，尤其是例如Ad34的其他知識(shí)，Ad34在人群中的代表性不是很好。尤其感興趣的是基于其他腺病毒血清型的重組腺病毒載體以及獲得這些重組腺病毒載體的方式。該領(lǐng)域的這一需要通過(guò)關(guān)于基于腺病毒血清型34的本申請(qǐng)的公開(kāi)得到了滿足。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及血清型34，一種稀有的腺病毒血清型的重組、復(fù)制缺陷的腺病毒載體以及產(chǎn)生基于其他血清型的重組腺病毒的方法。另外，還提供了利用重組腺病毒遞送和表達(dá)外源基因的方式。因而，本發(fā)明包括血清型34的重組、復(fù)制缺陷的腺病毒載體，其包括一或多個(gè)可操作連接于調(diào)控序列的轉(zhuǎn)基因，所述調(diào)控序列促進(jìn)各自轉(zhuǎn)基因的有效表達(dá)。這樣的重組腺病毒血清型34載體施用于宿主，無(wú)論單獨(dú)施用還是以組合方式和/或引發(fā)加強(qiáng)方案施用，都會(huì)導(dǎo)致整合的轉(zhuǎn)基因的有效表達(dá)并且有效誘導(dǎo)能特異識(shí)別所施用的特別抗原(例如HIV)的免疫應(yīng)答。此外，重組病毒應(yīng)當(dāng)規(guī)避對(duì)在人群中更容易出現(xiàn)(例如Ad5和Ad2)的腺病毒血清型的既存免疫。因此，所公開(kāi)的方法提供誘導(dǎo)針對(duì)特定目的抗原(例如HIV)的免疫應(yīng)答增強(qiáng)的方式。從而，所獲得的免疫應(yīng)答應(yīng)當(dāng)對(duì)以前未感染的個(gè)體提供預(yù)防效應(yīng)和/或通過(guò)降低已感染的個(gè)體體內(nèi)的病毒載量水平而提供治療效應(yīng)，從而延長(zhǎng)感染的無(wú)癥狀期。
附圖簡(jiǎn)述

圖1描述用于得到pAd34ΔE1ΔE4AdSOrf6的同源重組方案。
圖2描述用于得到pMRKAd34ΔE1ΔE4Ad5 Orf6的同源重組方案。
圖3A-1到3A-9描述野生型腺病毒血清型34的核酸序列(SEQID NO1)。Ad34的ATCC產(chǎn)品編號(hào)是VR-716。
圖4描述用MRKAdS和Ad34載體在恒河短尾猿表達(dá)SEAP的時(shí)間過(guò)程。數(shù)據(jù)代表幾何群體方式。
圖5以表的方式描述用表達(dá)HIV-1 gag的MRKAd5和Ad34載體誘導(dǎo)的T細(xì)胞應(yīng)答。數(shù)據(jù)以每百萬(wàn)PBMC點(diǎn)形成細(xì)胞的數(shù)量表示(SFC/106PBMC)?！錫″代表具有10-aa重疊并包括完整HIV-1 CAM 1gag的20-mer肽庫(kù)。
圖6以表的方式描述周12時(shí)，在Ad34-免疫的短尾猿中CD4+和CD8+Gag-特異T細(xì)胞的水平?！錫″代表具有10-aa重疊并包括完整HIV-1 CAM 1 gag的20-mer肽庫(kù)。
圖7描述優(yōu)化的人HIV-1 gag開(kāi)放讀框的核酸序列(SEQ ID NO3)。
圖8描述編碼gag表達(dá)盒的核酸序列(SEQ ID NO4)。圖的各個(gè)區(qū)域如下(1)編碼人巨細(xì)胞病毒的立即早期基因啟動(dòng)子的核酸序列的第一下劃線區(qū)域；(2)沒(méi)有下劃線的小寫(xiě)字母的第一區(qū)域，該區(qū)域的DNA片段含有適宜的限制酶位點(diǎn)；(3)含有HIV-1 gag編碼序列的大寫(xiě)區(qū)域；(4)沒(méi)有下劃線的小寫(xiě)字母的第二區(qū)域，該區(qū)域的DNA片段含有適宜的限制酶位點(diǎn)以及(5)第二下劃線區(qū)域，該區(qū)域含有編碼牛生長(zhǎng)激素多聚腺苷酸化信號(hào)序列的核酸序列。
圖9描述編碼SEAP表達(dá)盒的核酸序列(SEQ ID NO5)。該圖的各個(gè)區(qū)域如下(1)編碼人巨細(xì)胞病毒的立即早期基因啟動(dòng)子的核酸序列的第一下劃線區(qū)域；(2)沒(méi)有下劃線的小寫(xiě)字母的第一區(qū)域，該區(qū)域的DNA片段含有適宜的限制酶位點(diǎn)；(3)含有人胎盤(pán)SEAP基因編碼序列的大寫(xiě)區(qū)域；(4)沒(méi)有下劃線的小寫(xiě)字母的第二區(qū)域，該區(qū)域的DNA片段含有適宜的限制酶位點(diǎn)；以及(5)第二下劃線區(qū)域，該區(qū)域含有編碼牛生長(zhǎng)激素多聚腺苷酸化信號(hào)序列的核酸序列。
圖10A-1到10A-47描述pMRIAd5 HIV-1 gag載體的核酸序列(SEQ ID NO6[編碼]和SEQ ID NO7[非編碼])。
圖11A-1到1 1A-10描述野生型腺病毒血清型35的核酸序列(SEQ ID NO13)。Ad35的ATCC產(chǎn)品編號(hào)是VR-718。
圖12以表的方式描述用外源Ad34引發(fā)/Ad35加強(qiáng)方案在短尾猿誘導(dǎo)的T細(xì)胞應(yīng)答。″a″代表具有10-aa重疊并包括完整HIV-1 CAM 1gag的20-mer肽庫(kù)。
圖13以表的方式描述周28時(shí)，在Ad34引發(fā)/Ad35加強(qiáng)的短尾猿中CD4+和CD8+Gag-特異T細(xì)胞的水平。″a″代表具有10-aa重疊并包括完整HIV-1 CAM 1 gag的20-mer肽庫(kù)。
發(fā)明詳述稀有腺病毒血清型比更常利用的腺病毒血清型(例如，腺病毒血清型2和5)具有固有的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)榧却婷庖卟豢赡芟拗扑鼈兿虬袠?biāo)位點(diǎn)的有效遞送和外源基因的表達(dá)。不同腺病毒血清型由于各自的不同殼體結(jié)構(gòu)也具有不同的親嗜性，因而表現(xiàn)出靶向不同組織的潛力，并且當(dāng)用于疫苗或基因治療時(shí)可能導(dǎo)致激發(fā)過(guò)度免疫應(yīng)答。然而，當(dāng)使得這些稀有的腺病毒血清型復(fù)制缺陷時(shí)，其在現(xiàn)有的腺病毒繁殖細(xì)胞系中的繁殖和挽救將會(huì)變得困難。
申請(qǐng)人最近已成功地挽救和繁殖一種稀有的復(fù)制缺陷的血清型-腺病毒血清型34，亞組B腺病毒，此處闡明了腺病毒在遞送和表達(dá)外源轉(zhuǎn)基因方面的有效功能。
因此，本發(fā)明涉及適于在基因治療或疫苗接種中應(yīng)用的血清型34重組腺病毒載體。野生型腺病毒血清型34的核酸序列(SEQ ID NO1)在圖3A-1到3A-9中闡明，盡管如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉的那樣，任何功能同源物或腺病毒血清型34的不同菌株均可以用于按照本發(fā)明的方法中。已注意到Ad34序列在一些區(qū)域是不同的。以下位點(diǎn)僅是可在Ad34觀察到的序列變異的取樣(1)在SEQ ID NO1的堿基對(duì)10640周圍，序列g(shù)tgagtccta(SEQ ID NO8)之后的一系列13(″13″)而非12(″12″)″T″；(2)在SEQ ID NO1的堿基對(duì)15372周圍，序列ccgcactttct(SEQ ID NO9)之后的一系列15(″15″)或17(″17″)而非16(″16″)″A″；(3)SEQ ID NO1的堿基對(duì)17325周圍，序列attgacattgg(SEQ ID NO10)之后的一系列13(″13″)而非12(″12″)″A″；以及(4)SEQ ID NO1的堿基對(duì)25717周圍，序列g(shù)gagga(SEQ ID NO12)之后的序列cagtctggagga(SEQ ID NO11)被刪除。通過(guò)本領(lǐng)域公認(rèn)的生物學(xué)、化學(xué)、免疫學(xué)和結(jié)構(gòu)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)區(qū)別腺病毒血清型，這些標(biāo)準(zhǔn)包括大鼠和恒河猴紅細(xì)胞的血細(xì)胞凝集特性、、DNA同源性、限制酶切割譜，G+C百分?jǐn)?shù)含量以及致癌性；Straus，同前；Horwitz，同前?？梢酝ㄟ^(guò)大量方法包括病毒DNA的限制酶譜；分析病毒DNA的遷移性；分析病毒體多肽電泳后在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上的遷移性；已知序列尤其是來(lái)自殼體基因(例如，六鄰體)的已知序列的序列信息比較，所述序列含有定義血清型的序列；將序列與來(lái)自ATCC的特定血清型的參照血清相比較。腺病毒血清型的SDS-PAGE分類在Wadell etal.，1980 Ann.N.Y Acad.Sci.35416-42中討論。腺病毒血清型的限制酶譜分類在Wadell et al.，Current Topics in Microbiology andImmunology 110191-220中討論。腺病毒血清型34，亞組B腺病毒最早在1972年分離，并于1975年將其作為已識(shí)別的參考菌株(J.C.Hierholzer etal.，1975 J.Clin.Microbiol.1366-376)。在本領(lǐng)域中，已經(jīng)討論了通過(guò)參照馬抗血清確定的其與46種其他人腺病毒的抗原關(guān)系；J.C.Hierholzer et al.，1991 Arch.Viral.121179-197。
按照本發(fā)明的腺病毒血清型34載體在E1至少部分缺失并缺乏(或基本缺乏)E1活性，使得載體不能在目的宿主中復(fù)制。優(yōu)選地，E1區(qū)完全缺失或失活。腺病毒可以在E3和其他早期區(qū)域含有另外的缺失，雖然當(dāng)E2和/或E4缺失時(shí)，E2和/或E4互補(bǔ)細(xì)胞系可以用來(lái)產(chǎn)生重組的復(fù)制缺陷的腺病毒載體。
本發(fā)明方法中使用的腺病毒載體可以用已知的技術(shù)進(jìn)行構(gòu)建，如Hitt etal.，1997″Human，Adenovirus Vectors for Gene Transfer intoMammalian Cells″Advances in Pharmacology 40137-206中所述，此處將其完整引用作為參考。通常，產(chǎn)生含有外源目的核酸的質(zhì)?；虼┧筝d體，所述核酸含有與特定目的腺病毒同源的序列。穿梭載體和病毒DNA或含有克隆的病毒DNA的第二質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞，在其中發(fā)生同源重組并導(dǎo)致異源核酸整合到病毒核酸。優(yōu)選的穿梭載體和克隆的病毒基因組含有腺病毒和質(zhì)粒部分。對(duì)于用于復(fù)制缺陷載體構(gòu)建的穿梭載體，腺病毒部分通常含有非功能或缺失的E1和E3區(qū)以及基因表達(dá)盒，側(cè)接適宜的限制位點(diǎn)。穿梭載體的質(zhì)粒部分通常含有在原核啟動(dòng)子控制下的抗生素抗性標(biāo)記?？梢允褂冒逼S抗性基因、新霉素抗性基因以及其他藥用可接受的抗生素抗性標(biāo)記。為了輔助原核生物發(fā)酵中核酸的高水平產(chǎn)生，對(duì)于穿梭載體來(lái)說(shuō)含有原核復(fù)制原點(diǎn)且具有高拷貝數(shù)是非常有利的。大量商業(yè)可利用的原核克隆載體都具有這樣的優(yōu)勢(shì)。優(yōu)選將非必須DNA序列去除。還優(yōu)選載體不能在真核細(xì)胞中復(fù)制。這可以最小化核酸疫苗整合到受體基因組的危險(xiǎn)。當(dāng)希望將核酸的表達(dá)限制到特定組織類型時(shí)，可以利用組織特異的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子。
穿梭載體和野生型腺病毒34病毒DNA的同源重組(Ad34骨架載體)導(dǎo)致腺病毒前質(zhì)粒的產(chǎn)生(參見(jiàn)，例如pAd34ΔE1ΔE4Ad50rf6、pMRKAd34ΔE1ΔE4Ad50rf6、pAd34ΔE1gagΔE4Ad50rf6，以及pAd34ΔE1SEAPΔE4Ad50rf6)。線性化時(shí)，前質(zhì)粒能在PER.C6細(xì)胞或其他E1-互補(bǔ)細(xì)胞系中復(fù)制。一旦復(fù)制完成，就可以收獲感染細(xì)胞和培養(yǎng)基。
為了產(chǎn)生足夠量的腺病毒，通常需要包裝細(xì)胞。包裝細(xì)胞應(yīng)當(dāng)含有特定目的腺病毒產(chǎn)生所需要的元件。優(yōu)選包裝細(xì)胞和載體不含有重疊元件，其通過(guò)重組將導(dǎo)致有復(fù)制能力的病毒。適于重組Ad34E1-缺失載體繁殖的特定細(xì)胞例子表達(dá)腺病毒34或另一血清型B的早期區(qū)域1(E1)。備選地，可利用表達(dá)腺病毒E1和E4區(qū)域的繁殖細(xì)胞系(特別是，E4開(kāi)放閱讀框6(″ORF6″))，其來(lái)自與Ad34相同的血清型但不同的亞組(例如，Ad5 E1和E4)；參見(jiàn)，例如Abrahamsen et al.，1997 J Virol.8946-8951，以及U.S.Patent No.5,849,561。另外，細(xì)胞系可以用來(lái)從Ad34表達(dá)E1B以及從不同亞組的血清型表達(dá)(1)E1A或(2)E1A和E1B。在2002年8月22日遞交的同時(shí)待審的U.S.臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/405,182中公開(kāi)了其他腺病毒血清型有效增殖和挽救的策略。該方法基于將與互補(bǔ)細(xì)胞系表達(dá)的E1基因產(chǎn)物，尤其是E1B相同或高度相似的血清型的E4區(qū)(或其部分，包括E4ORF6)整合到腺病毒載體基因組.實(shí)施例1-4通過(guò)Ad5E4區(qū)域的整合及其在PER.C6細(xì)胞(表達(dá)Ad5E1的細(xì)胞)的繁殖闡明該方法的有效性。野生型腺病毒血清型5的序列是已知的并在本領(lǐng)域中描述；參見(jiàn)Chroboozek et al.，1992 J.Virol.186280，此處完整引用作為參考。E4區(qū)或含有ORF6的部分不是關(guān)鍵的。關(guān)鍵的步驟是確保提供了啟動(dòng)子或基因是策略地排列以便其使載體固有的啟動(dòng)子(例如，E4啟動(dòng)子)失控。載體固有的E4區(qū)可以被替換、缺失或保持完整。因此，該方法適于用于本發(fā)明的腺病毒載體的增殖和挽救。
通常，增殖細(xì)胞是來(lái)自視網(wǎng)膜或腎的人細(xì)胞，盡管任何能夠表達(dá)合適的E1和/或E4區(qū)的細(xì)胞系都可用于本發(fā)明的。已表明胚胎細(xì)胞如羊膜細(xì)胞特別適于產(chǎn)生E1互補(bǔ)細(xì)胞系。可得到一些細(xì)胞系，包括但不限于PER.C6(ECACC保藏號(hào)96022940)，911，293，以及E1 A549。
本發(fā)明涉及在腺病毒E1互補(bǔ)細(xì)胞系產(chǎn)生重組、復(fù)制缺陷腺病毒血清型34的方法，其包括在腺病毒E1互補(bǔ)細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組、復(fù)制缺陷腺病毒血清型34載體并允許產(chǎn)生病毒顆粒。由此產(chǎn)生的顆粒形成本發(fā)明的另一方面。含有重組、復(fù)制缺陷腺病毒血清型34載體的宿主細(xì)胞形成本發(fā)明的另一方面；宿主細(xì)胞被定義為不包括轉(zhuǎn)基因人的一群細(xì)胞。按照本發(fā)明的方法收獲的重組、復(fù)制缺陷腺病毒也包括在本發(fā)明中。這些收獲的物質(zhì)可以在施用于宿主前被純化、配制和貯存。
本發(fā)明的腺病毒載體非常適于進(jìn)行目的蛋白的表達(dá)，尤其是當(dāng)個(gè)體的免疫應(yīng)答有效防止更通常施用的腺病毒血清型的施用或再施用時(shí)。從而，本發(fā)明的具體實(shí)施方案是重組的、復(fù)制缺陷的腺病毒血清型34載體，其包括異源目的核酸。目的核酸可以是基因或基因的功能部分。核酸可以是DNA和/或RNA，單鏈或雙鏈，可以以表達(dá)盒的形式存在。核酸可以E1平行(5′到3′轉(zhuǎn)錄)或反向平行(相對(duì)于載體的骨架3′到5′方向轉(zhuǎn)錄)插入。核酸可以進(jìn)行密碼子優(yōu)化用于在希望的宿主表達(dá)(例如哺乳動(dòng)物宿主)。異源核酸可以是表達(dá)盒的形式?；虮磉_(dá)盒通常含有(a)編碼蛋白或目的抗原的核酸；(b)可操作連接于編碼蛋白的核酸的異源啟動(dòng)子；和(c)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。
在具體實(shí)施方案中，異源啟動(dòng)子被真核RNA聚合酶識(shí)別。適于本發(fā)明的一個(gè)啟動(dòng)子的實(shí)例是立即早期人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(Chapman et al，1991Nucl.Acids Res.193979-3986)。雖然本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白任何能在目的宿主進(jìn)行表達(dá)的啟動(dòng)子均可以用于按照本發(fā)明的方法中，但是用于本發(fā)明的啟動(dòng)子的進(jìn)一步的例子是強(qiáng)免疫球蛋白啟動(dòng)子EF1α啟動(dòng)子，鼠CMV啟動(dòng)子，勞斯肉瘤病毒啟動(dòng)子，SV40早期/晚期啟動(dòng)子和β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以包含調(diào)控序列如Tet操縱子序列。當(dāng)尋求基因轉(zhuǎn)錄抑制時(shí)，例如提供轉(zhuǎn)錄和表達(dá)調(diào)控潛力的序列是有用的。腺病毒基因表達(dá)盒可以包括轉(zhuǎn)錄終止序列，具體的實(shí)施方案如牛生長(zhǎng)激素終止/聚腺苷酸化信號(hào)(bGHpA)或50個(gè)核苷酸的短的合成polyA信號(hào)(SPA)，定義如下AATAAAAGATCTTTATTTTCATTAGATCTGTGTGTT-GGTTTTTTGTGTG(SEQ ID NO2)。前導(dǎo)或信號(hào)肽也可以整合到轉(zhuǎn)基因。在具體的實(shí)施方案，前導(dǎo)區(qū)源自組織特異血漿酶原激活蛋白，tPA。
異源目的核酸是編碼免疫源和/或治療蛋白的基因(或其功能相應(yīng)部分)。優(yōu)選的治療蛋白是當(dāng)施用于個(gè)體宿主時(shí)，能激發(fā)可檢測(cè)的治療效果的蛋白。
優(yōu)選的免疫源性蛋白是能在個(gè)體激發(fā)免疫應(yīng)答的任何蛋白。申請(qǐng)人在本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)中示例了在非人靈長(zhǎng)類(恒河短尾猿)代表性免疫源性蛋白(HIV gag)的遞送，盡管按照本發(fā)明此處公開(kāi)的方法任何編碼治療或免疫源性蛋白的基因均可應(yīng)用。已發(fā)現(xiàn)腺病毒血清型34載體誘導(dǎo)gag-特異T細(xì)胞的有效水平；圖5。而且，結(jié)果表明所公開(kāi)的載體的免疫能夠激發(fā)HIV-特異CD4+和CD8+T細(xì)胞；圖6。
因此，本發(fā)明一方面涉及攜帶HIV轉(zhuǎn)基因的基于腺病毒血清型34的載體。在這些實(shí)施方案中，編碼任何HIV抗原的核酸均可應(yīng)用(具體實(shí)施例包括gag，pol，nef，gp160，gp41，gp 120，tat，和rev，以及上述基因的衍生物)。此處示例的實(shí)施方案應(yīng)用編碼密碼子優(yōu)化p55 gag抗原的核酸；參見(jiàn)圖7(SEQ ID NO3)。密碼子優(yōu)化的HIV-1 env基因公開(kāi)于PCT申請(qǐng)PCT/US97/02294和PCT/US97/10517，分別在1997年8月28日(WO97/31115)和1997年12月24日出版。密碼子優(yōu)化的HIV-1 pol基因公開(kāi)于U.S.申請(qǐng)系列號(hào)09/745,2219，2000年12月21日遞交以及PCT申請(qǐng)PCT/USOO/34724，2也在2000年12月21日遞交。密碼子優(yōu)化的HIV-1 nef基因公開(kāi)于U.S.申請(qǐng)系列號(hào)09/738,782，2000年12月15日遞交和PCT申請(qǐng)PCT/USOO/34162，也在2000年12月15日遞交。
在含有HIV-1基因的重組、復(fù)制缺陷的Ad34載體的具體實(shí)施方案中，基因可以來(lái)源于HIV-1菌株CAM-1；Myers et al，eds.″HumanRetroviruses and AIDS1995，IIA3-IIA19，此處完整引用作為參考。該基因與進(jìn)化枝B(北美/歐洲)一致氨基酸序列非常相象。HIV基因序列可以基于HIV-1的各個(gè)進(jìn)化枝；具體的例子為進(jìn)化枝B和C。許多HIV菌株的基因序列可以從GenBank得到，HIV的原始、現(xiàn)場(chǎng)(field)分離物可從the National Institute of Allergy and InfectiousDiseases(NIAID)得到，NIAID已與Quality Biological(Gaithersburg，MD)簽定合同使這些菌株可以得到。菌株還可以從瑞士日內(nèi)瓦世界衛(wèi)生組織(WHO)得到。選擇合適的編碼特異HIV抗原的核苷酸序列，或其免疫相關(guān)部分或修飾在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。此處定義的″免疫相關(guān)″指(1)關(guān)于病毒抗原，施用時(shí)蛋白能在個(gè)體內(nèi)激發(fā)足夠延遲病毒增殖和/或傳播的可檢測(cè)的免疫應(yīng)答和/或減少病毒載量；或(2)關(guān)于核苷酸序列，序列能夠編碼上述蛋白。
本發(fā)明包括如下的方法(1)在個(gè)體進(jìn)行治療應(yīng)答和(2)產(chǎn)生免疫應(yīng)答(包括細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答)，其包括施用給按照本發(fā)明的個(gè)體重組腺病毒血清型34載體。本發(fā)明一方面涉及產(chǎn)生針對(duì)一或多個(gè)抗原(細(xì)菌，病毒(例如HIV)，或其他(例如癌癥))的免疫應(yīng)答的方法，其包括施用表達(dá)目的抗原的重組腺病毒血清型34載體。以這種方式施用的重組Ad34載體提供了增強(qiáng)的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，尤其是當(dāng)給定宿主體內(nèi)有針對(duì)更有代表性的腺病毒血清型(例如Ad2和Ad5)的既存免疫時(shí)。改進(jìn)的疫苗施用效果應(yīng)當(dāng)是對(duì)以前未感染的個(gè)體的更低的傳染率(或發(fā)生率)(即預(yù)防應(yīng)用)和/或在感染的個(gè)體內(nèi)，病毒/細(xì)菌/外源劑的水平下降(即治療應(yīng)用)。至于HIV適應(yīng)癥，改進(jìn)的疫苗施用效果應(yīng)當(dāng)是對(duì)以前未感染的個(gè)體的更低的傳染率(或發(fā)生率)(即預(yù)防應(yīng)用)和/或在感染的個(gè)體內(nèi)，病毒/細(xì)菌/外源劑的水平下降(即治療應(yīng)用)以便延長(zhǎng)HIV感染的無(wú)癥狀期。重組Ad34載體的施用、細(xì)胞內(nèi)遞送和表達(dá)激發(fā)宿主CTL和Th應(yīng)答。
因此，本發(fā)明涉及關(guān)于施用重組Ad34病毒載體(或其免疫源組合物，此處稱為疫苗)以提供有效的免疫預(yù)防，防止暴露于病毒(例如，HIV)、細(xì)菌或其他劑之后的感染的建立，或者作為感染后治療疫苗來(lái)減輕感染，從而導(dǎo)致更低的病毒/細(xì)菌/其他載量的建立以獲得有益的長(zhǎng)期的效果。
本發(fā)明的重組腺病毒血清型34載體可以單獨(dú)施用或作為引發(fā)/加強(qiáng)施用方案的一部分。至少一種抗原(例如，HIV抗原)的引發(fā)劑量首先用重組腺病毒載體遞送。該劑量有效地引發(fā)免疫應(yīng)答以便在循環(huán)免疫系統(tǒng)的隨后識(shí)別中，免疫應(yīng)答能夠立即識(shí)別和應(yīng)答宿主內(nèi)的抗原。引發(fā)劑量之后給予加強(qiáng)劑量，其包括含有至少一種編碼抗原基因的重組腺病毒載體?；旌铣淌降囊l(fā)和加強(qiáng)接種方案將導(dǎo)致增強(qiáng)的免疫應(yīng)答，尤其是當(dāng)存在抗載體的既存免疫時(shí)。引發(fā)-增強(qiáng)施用通常涉及引發(fā)受試者至少一次(通過(guò)病毒載體、質(zhì)粒、蛋白等)，等預(yù)定的時(shí)間長(zhǎng)度過(guò)去后加強(qiáng)(通過(guò)病毒載體、質(zhì)粒、蛋白等)。通常使用多次引發(fā)，一般1-4次，盡管也可以更多。引發(fā)和加強(qiáng)之間的時(shí)間長(zhǎng)度通常為4個(gè)月到1年，不過(guò)如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉的也可以使用其他時(shí)間方案。
除單個(gè)蛋白或目的抗原被本發(fā)明的重組、復(fù)制缺陷腺病毒血清型34載體遞送之外，兩或多個(gè)蛋白或抗原也可以通過(guò)不同的載體或相同載體遞送。多個(gè)基因/功能類似物可以被連接到適當(dāng)?shù)拇┧筚|(zhì)粒以產(chǎn)生含有多個(gè)開(kāi)放閱讀框的前-腺病毒質(zhì)粒。多個(gè)基因/功能類似物的開(kāi)放閱讀框可以被可操作連接于不同的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列。在其他實(shí)施方案中，開(kāi)放閱讀框可以被可操作連接于單個(gè)啟動(dòng)子，開(kāi)放閱讀框被內(nèi)部核糖體進(jìn)入序列(IRES；如WO 95/24485中所公開(kāi))可操作連接，或合適的其他備選以允許多個(gè)開(kāi)放閱讀框轉(zhuǎn)錄從而失控單個(gè)啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方案中，開(kāi)放閱讀框可以通過(guò)逐步PCR或其他合適的將兩個(gè)開(kāi)放閱讀框融合在一起的備選方法融合。然而，對(duì)于病毒載體的有效包裝限制必須考慮。例如，已表明腺病毒5型顯示出大約105％的野生型Ad5序列上部克隆能力限制。
引發(fā)-加強(qiáng)方案可以使用不同的腺病毒血清型。這樣的方案的一個(gè)實(shí)施例是包括第一血清型的重組腺病毒載體的引發(fā)劑量，繼之以含有第二和不同血清型的重組腺病毒載體的加強(qiáng)劑量，參見(jiàn)，例如，實(shí)施例6和圖12和13。其中，一群猴在周0和4給予兩劑量的基于Ad34的HIV gag載體，并在周24用基于Ad35的HIV gag載體加強(qiáng)。與加強(qiáng)施用時(shí)的水平相比，施用基于Ad35的載體導(dǎo)致T細(xì)胞應(yīng)答的3倍增強(qiáng)。在一個(gè)備選的實(shí)施方案中，引發(fā)劑量可以包含不同的腺病毒載體的混合物，每個(gè)載體含有編碼不同蛋白/抗原的基因。在這種情況下，加強(qiáng)劑量也將包含載體的混合物，其中每個(gè)載體含有編碼不同蛋白/抗原的基因，條件是加強(qiáng)劑量施用重組病毒載體，其包含編碼與引發(fā)劑量中遞送的相同或相似抗原的遺傳物質(zhì)。這些多基因/載體施用程式可以進(jìn)一步合并。施行包括來(lái)自特定抗原的多個(gè)但不同組分的合并方案也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
含有本發(fā)明的腺病毒載體的組合物，包括疫苗組合物是本發(fā)明的一個(gè)重要方面。這些組合物可以通過(guò)預(yù)防或治療方式被施用于哺乳動(dòng)物宿主，優(yōu)選人宿主。潛在的宿主/疫苗包括但不限于靈長(zhǎng)類，尤其是人和非人靈長(zhǎng)類，并包括具有商業(yè)或家庭獸用價(jià)值的任何非人哺乳動(dòng)物。含有重組腺病毒血清型34載體的組合物可以單獨(dú)或與其他病毒或非病毒DNA/蛋白疫苗組合施用。它們也可以作為更廣的治療方案的部分施用。本發(fā)明還包括公開(kāi)的重組腺病毒血清型34與其他治療，例如HAART治療(在重組HIV載體的情況下)聯(lián)合施用的情況。
包括重組病毒載體的組合物可以含有生理可接受的組分，例如緩沖液、生理鹽水或磷酸鹽緩沖液、蔗糖、其他鹽和聚山梨醇酯。在一些實(shí)施方案，制劑含有2.5-10mM TRIS緩沖液，優(yōu)選約5mM TRIS緩沖液；25-100mM NaCl，優(yōu)選約75mM NaCl；2.5-10％蔗糖，優(yōu)選約5％蔗糖；0.01-2mM MgCl2；以及0.001％-0.01％聚山梨醇酯80(植物來(lái)源的)。PH范圍應(yīng)當(dāng)在約7.0-9.0，優(yōu)選約8.0。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉其他常規(guī)疫苗賦形劑也可以用于該配制中。在具體實(shí)施方案中，制劑含有5mM TRIS，75mMNaCl，5％蔗糖，1mM MgCl2，0.005％聚山梨醇酯80，pH8.0。這樣的制劑具有對(duì)于Ad5和Ad6的穩(wěn)定性最適的pH和二價(jià)陽(yáng)離子組合物并且最小化病毒吸附玻璃表面的可能性。其在肌內(nèi)注射時(shí)不引起組織激惹。優(yōu)選將其冷凍備用。
疫苗組合物中將被導(dǎo)入到疫苗接受體的病毒顆粒的量將依賴于所用的轉(zhuǎn)錄和翻譯啟動(dòng)子的強(qiáng)度以及所表達(dá)的基因產(chǎn)物的免疫原性。通常，免疫或預(yù)防有效劑量的l×107到1×1012顆粒和優(yōu)選地約1×1010到1×1011顆粒被直接施用于肌肉組織。皮下注射、皮內(nèi)導(dǎo)入、透皮壓入(impression)以及其他施用方式如腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或吸入遞送也可以考慮。本發(fā)明的疫苗組合物的胃腸外導(dǎo)入同時(shí)或之后進(jìn)行的白介素-12蛋白的胃腸外施用，如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下或其他施用方式也是有利的。
以下提供非限制性實(shí)施例來(lái)更好地闡釋本發(fā)明。
實(shí)施例1pAd34ΔE1ΔE4Ad50rf6的構(gòu)建為了產(chǎn)生能在現(xiàn)有的C/Ad5 E1互補(bǔ)細(xì)胞系(293，PER.C6)增殖的基于E1-Ad34的載體，將Ad5 Orf6插入到固有的E4區(qū)。為了構(gòu)建Ad34前-腺病毒質(zhì)粒，利用Ad34和Ad35之間的序列同源性。用純化的野生型Ad34病毒DNA和適當(dāng)構(gòu)建的Ad35 ITR表達(dá)盒共轉(zhuǎn)化BJ5183細(xì)菌導(dǎo)致因同源重組而產(chǎn)生的病毒基因組的環(huán)化。基于Ad34的preAd質(zhì)粒的構(gòu)建如下概述我們利用Ad35 ITR盒來(lái)構(gòu)建pAd34ΔE1ΔE4Ad50rf6(含有E1和E4缺失，而用Ad5 Orf6替換的Ad34前-Ad質(zhì)粒)。我們預(yù)料Ad34和Ad35之間的序列同源性將允許同源重組的發(fā)生。構(gòu)建的Ad35 ITR盒含有Ad35基因組的右端(bp 31599到31913和bp 34419到34793)和左端(bp4到456和bp3403到3886)序列(參見(jiàn)圖11A-1到11A-10)，中間被含有細(xì)菌復(fù)制原點(diǎn)和氨芐抗性基因的質(zhì)粒序列分隔。通過(guò)PCR產(chǎn)生4個(gè)片段并順序克隆到pNEB193，產(chǎn)生pNEBAd35-4。接著產(chǎn)生通過(guò)PCR產(chǎn)生Ad5 Orf6開(kāi)放閱讀框并克隆到Ad35bp31913和34419之間，產(chǎn)生pNEBAd35-4Ad50rf6(ITR盒)。PNEB193是通常使用的商業(yè)可獲得克隆質(zhì)粒(New England Biolabscat#N3051S)，其含有細(xì)菌復(fù)制原點(diǎn)、氨芐抗性基因和多克隆位點(diǎn)，將PCR產(chǎn)物導(dǎo)入PNEB193中。ITR盒含有Ad35bp 457到3402的E1缺失，缺失部位含有單一Swa I限制位點(diǎn)，還含有從Ad35bp 31914到34418的E4缺失，將Ad5 Orf6以E4平行方向?qū)朐撊笔Р课弧Ｔ谠摌?gòu)建體中，Ad50rf6的表達(dá)是Ad35 E4啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的。ITR盒中的Ad35序列(bp 31599到31913以及bp 3403到3886)提供與純化的Ad34病毒DNA同源的區(qū)域，共轉(zhuǎn)化到BJ 5183細(xì)菌(圖1)后，將在其中發(fā)生細(xì)菌重組。設(shè)計(jì)ITR盒以含有位于病毒ITR末端的限制酶位點(diǎn)(PmeI)，從而消化將會(huì)從質(zhì)粒序列釋放重組Ad34基因組。通過(guò)限制酶分析篩選潛在的克隆，將一個(gè)克隆選定為pAd34ΔE1ΔE4Ad50rf6。
實(shí)施例2將pAd34AE1AE4Ad50rf6挽救入病毒為了確定前-腺病毒質(zhì)粒pAd34ΔE1ΔE4Ad50rf6是否能被挽救成病毒并在組CE1互補(bǔ)細(xì)胞系中增殖，將質(zhì)粒用Pme I消化并用磷酸鈣共沉淀技術(shù)轉(zhuǎn)染到T-25瓶中的PER.C6細(xì)胞(Cell PhectTransfection Kit，AmershamPharmacia Biotech Inc)。在進(jìn)入細(xì)胞后，Pme I消化從質(zhì)粒序列釋放病毒基因組，允許病毒復(fù)制。轉(zhuǎn)染后，觀察到表明病毒復(fù)制和擴(kuò)增正在發(fā)生的病毒病變效應(yīng)(CPE)。轉(zhuǎn)染后大約7-10天后，CPE結(jié)束時(shí)，收獲感染細(xì)胞和培養(yǎng)基，凍融3次并將細(xì)胞殘骸用離心沉淀。將大約1ml的細(xì)胞裂解物用于感染T-225瓶中的80-90％匯合的PER.C6細(xì)胞。一旦出現(xiàn)CPE，就收獲感染細(xì)胞和培養(yǎng)基，凍融3次并將細(xì)胞殘骸用離心沉淀。然后，將澄清的細(xì)胞裂解物用于感染2-層NUNC細(xì)胞工廠的PER.C6細(xì)胞。CPE結(jié)束后，用CsCL密度梯度超速離心純化病毒。為了證實(shí)挽救病毒的基因結(jié)構(gòu)，用鏈酶蛋白酶處理，繼之以酚氯仿抽提和乙醇沉淀來(lái)提取病毒DNA。然后用HindIII消化病毒DNA，并用Klenow片段處理，用P33-dATP末端標(biāo)記限制片段。然后用凝膠電泳對(duì)末端標(biāo)記的限制片段進(jìn)行大小分離并用放射自顯影觀察。將所得消化產(chǎn)物與其來(lái)源的相應(yīng)前腺病毒質(zhì)粒(在標(biāo)記前已用PmeI/HindIII消化)的消化產(chǎn)物進(jìn)行比較。觀察到預(yù)期的大小表明病毒已被成功挽救。
實(shí)施例3將表達(dá)盒插入pAd34ΔE1ΔE4Ad50rf6為了將gag或SEAP表達(dá)盒(分別參見(jiàn)圖8和9)導(dǎo)入pAd34ΔE1ΔE4Ad50rf6的E1區(qū)，再次使用細(xì)菌重組。將由以下組成的Gag表達(dá)盒1)人巨細(xì)胞病毒立即早基因啟動(dòng)子，2)人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)gag(菌株CAM-1；1526bp)基因的編碼序列，和3)牛生長(zhǎng)激素多聚腺苷酸化信號(hào)序列，克隆至Ad35穿梭質(zhì)粒的E1缺失，pNEBAd35-2(上述Ad35ITR盒的前體)，產(chǎn)生pNEBAd35CMVgagBGHpA。pNEBAd35-2從基因組的左端含有Ad35序列(bp4-456以及bp3403-3886)，在缺失位點(diǎn)bp456-3403之間具有單一SwaI位點(diǎn)。從前面構(gòu)建的穿梭質(zhì)粒通過(guò)EcoRI消化得到gag表達(dá)盒。消化后，將目的片段凝膠純化，并用Klenow處理以得到鈍端并克隆到pNEBAd35-2的SwaI位點(diǎn)。克隆步驟導(dǎo)致gag表達(dá)盒以E1平行的方向被插入到bp456和3403之間的E1缺失。含有g(shù)ag轉(zhuǎn)基因的穿梭載體被消化以產(chǎn)生由gag表達(dá)盒組成的DNA片段，其中g(shù)ag表達(dá)盒側(cè)接Ad35bp 4到456以及bp 3403到3886，并在瓊脂糖凝膠上電泳后純化片段。用穿梭載體片段和用SwaI消化在E1區(qū)線性化的pAd34hE1SE4Ad50rf6共轉(zhuǎn)化BJ 5183細(xì)菌，通過(guò)同源重組產(chǎn)生含有Ad34 gag的前病毒質(zhì)粒pAd34ΔE1gagΔE4Ad50rf6。通過(guò)限制分析進(jìn)行潛在克隆篩選。
通過(guò)相似的策略來(lái)產(chǎn)生含有SEAP表達(dá)盒的Ad34前-Ad質(zhì)粒。在這種情況下將由以下組成的SEAP表達(dá)盒1)人巨細(xì)胞病毒立即早基因啟動(dòng)子，2)人胎盤(pán)SEAP基因的，和3)牛生長(zhǎng)激素多聚腺苷酸化信號(hào)序列，克隆到Ad35穿梭質(zhì)粒pNEBAd35-2的E1缺失，產(chǎn)生，pNEBAd35CMVSEAPBGHpA。通過(guò)EcoRI消化，從前面構(gòu)建的穿梭質(zhì)粒得到SEAP表達(dá)盒。消化后，用凝膠純化目的片段，用Klenow處理得到鈍端并克隆到pNEBAd35-2的SwaI位點(diǎn)。然后將轉(zhuǎn)基因重組到pAd34AE1AE4Ad50rf6，產(chǎn)生pAd34hE1SEAPSE4Ad50rf6，如同上面描述的gag轉(zhuǎn)基因。
將所有前-Ad挽救成病毒并擴(kuò)增以如上所述制備CsCl純化的貯備物。
實(shí)施例4 pMRKAd34ΔE1ΔE4Ad50rf6的構(gòu)建為構(gòu)建完全由Ad34序列構(gòu)成的前-Ad質(zhì)粒，制備Ad34 ITR盒。所制備的Ad34 ITR盒含有被含有細(xì)菌復(fù)制原點(diǎn)和氨芐青霉素抗性基因的質(zhì)粒序列分隔的Ad34基因組的右(bp 31584到31895和bp 34409到34772)和左端(bp 4到456和bp 3402到3885)序列。通過(guò)PCR產(chǎn)生這4個(gè)片段并順序克隆到pNEB193，產(chǎn)生pNEBAd34-4。接著，通過(guò)PCR產(chǎn)生Ad5 Orf6開(kāi)放讀框并克隆到Ad34的bp31895和34409之間，產(chǎn)生pNEBAd34-4Ad50rf6(ITR盒)。PNEB 193是通常使用的商業(yè)可獲得的克隆質(zhì)粒(New England Biolabs cat#N3051S)，其含有細(xì)菌復(fù)制原點(diǎn)、氨芐抗性基因和可導(dǎo)入PCR產(chǎn)物的多克隆位點(diǎn)。ITR盒含有從Ad34bp 457到3401的E1序列缺失，缺失部位含有單一Swa I限制位點(diǎn)，以及Ad34bp 31896到34408的E4缺失，按照E4平行方向向其中導(dǎo)入Ad5 Orf6。在該構(gòu)建體中，Ad50rf6的表達(dá)被Ad34 E4啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。ITR盒的Ad34序列(bp31584到31895和bp 3402到3885)提供與純化的Ad34病毒DNA同源的區(qū)域，在共轉(zhuǎn)化到BJ5183細(xì)菌后，在其中可以發(fā)生細(xì)菌重組(圖2)。還設(shè)計(jì)在病毒ITR的末端含有單一限制酶位點(diǎn)(PmeI)，以便消化將重組的Ad34基因組從質(zhì)粒序列釋放。通過(guò)限制酶分析篩選有效克隆并將一個(gè)克隆選擇作為pMRKAd34ΔE1ΔE4Ad50rf6。
實(shí)施例5體內(nèi)研究A.免疫給予一組3只恒河短尾猿單次肌內(nèi)注射兩種載體之一(1)10^11vpMRKAd5-SEAP(在2002年3月21日公開(kāi)的PCT/USO1/28861的圖10A-1到10A-45的MRKAd載體骨架中)；和(2)10^11vpAd34ΔE1SEAPΔE4Ad50rf6。恒河短尾猿的重量為3-10kg。在所有情況下，將每種疫苗的總劑量懸浮在1mL緩沖液中。將短尾猿麻醉(氯胺酮/鹽酸塞拉嗪)，將疫苗使用結(jié)核菌素注射器按照0.5ML的等份肌內(nèi)遞送到兩側(cè)的三角肌(Becton-Dickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)。在免疫過(guò)程中，在一些時(shí)間點(diǎn)，從采集的血樣中制備外周血單核細(xì)胞(PBMC)。所有的動(dòng)物關(guān)心和處理均按照Institutional AnimalCare and Use Committee根據(jù)Institute of Laboratory AnimalResources，National Research Council在Guide for Care and Use ofLaboratory Animals中的原則制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。
B.SEAP分析使用TROPIX磷光化學(xué)發(fā)光試劑盒(Applied Biosystems Inc)分析血清樣品中的循環(huán)人分泌堿性磷酸酶((SEAP)水平。在96-孔白DYNEX平板中，將每種血清的雙份5μL等分試樣與45μl試劑盒提供的稀釋緩沖液混合。用人胎盤(pán)堿性磷酸酶在10％天然猴血清中的系列稀釋液(Catalog no.M5905，Sigma，St.Louis，MO)提供標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)在65℃加熱孔30分鐘滅活樣品中的內(nèi)源SEAP活性。按照試劑盒中描述的方法確定樣品中的酶SEAP活性。用DYNEX光度計(jì)記錄化學(xué)發(fā)光讀數(shù)(以相對(duì)光單位)。用對(duì)數(shù)-對(duì)數(shù)回歸分析將RLU讀數(shù)轉(zhuǎn)換成ng/mL SEAP。
C.ELISPOT分析按照以前描述的方法，略作改動(dòng)，對(duì)恒河短尾猿進(jìn)行IFN-γELISPOT分析(Allen etal.，2001 J.Virol.75(2)738-749)。為了抗原特異刺激，從含有完整HIV-gag序列并具有10-aa重疊的20-aa肽制備肽庫(kù)(Synpep Corp.，Dublin，CA)。向每個(gè)孔中加入50μL 2-4×105外周血單核細(xì)胞(PBMCs)；用Beckman Coulter Z2顆粒分析儀，將其下限體積截留設(shè)置為80飛升(″fL″)，計(jì)數(shù)細(xì)胞。將50L培養(yǎng)基或gag肽庫(kù)以每肽8μg/mL濃度加入到PBMC。將樣品在37℃5％CO2中孵育20-24hrs。從而形成點(diǎn)，并將平板用定做的成像儀和基于ImagePro platform(Silver Spring，MD)的自動(dòng)計(jì)數(shù)子程序ImagePro platform(Silver Spring，MD)進(jìn)行處理。將計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化為106細(xì)胞輸入。
D.細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色(ICS)向完全RPMI培養(yǎng)基中的1ml 2×106PBMC/mL(17×100mm園底聚丙烯管(Sarstedt，Newton，NC))加入終濃度為1ug/mL的抗-hCD28(克隆L293，Becton-Dickinson)和抗-hCD49d(克隆L25，Becton-Dickinson)單克隆抗體。對(duì)于gag特異的刺激，加入10ul肽庫(kù)(0.4mg/mL每肽)。將管在37℃孵育1hr，之后加入20μL 5mg/mL布雷菲德菌素A(Sigma)。細(xì)胞在37℃5％CO2中90％濕度下孵育16hrs。將4mL冷PBS/2％FBS加入每個(gè)管中，并將細(xì)胞在1200rpm沉淀10min。將細(xì)胞重懸于PBS/2％FBS并用一些熒光標(biāo)記單克隆抗體20μL每管抗-hCD3-APC，克隆FN-18(Biosource)；20uL抗-hCD8-PerCP，克隆SKI(Becton Dickinson)；和20uL抗-hCD4-PE，克隆SK3(Becton Dickinson)對(duì)表面標(biāo)記進(jìn)行染色。這一階段的樣品處理在暗處進(jìn)行。將細(xì)胞洗滌并在750μL 1xFACS Perm緩沖液(Becton Dickinson)室溫下孵育10min。將細(xì)胞沉淀并重懸于PBS/2％FBS和加入0.1μg FITC-抗-hIFN-γ，克隆MD-1(Biosource)。30min孵育后，將細(xì)胞洗滌并重懸于PBS中。用Becton Dickinson FACSCalibur儀的所有4色通道分析樣品。為了分析數(shù)據(jù)，先將低側(cè)和前向-分散淋巴細(xì)胞群開(kāi)啟；對(duì)于CD4+和CD8+群體和模擬管以及樣品的gag-肽反應(yīng)管使用細(xì)胞因子陽(yáng)性事件的共同的熒光截留。
E.結(jié)果表達(dá)對(duì)注射前后的血清樣品分析循環(huán)SEAP活性，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明在10^11vp的相同高劑量水平，由其他的腺病毒血清型產(chǎn)生的SEAP蛋白的峰水平比MRKAd5所產(chǎn)生的低但在3倍的范圍內(nèi)(圖4)。血清SEAP的水平在10天后劇烈下降，在15天時(shí)接近背景。這一結(jié)果強(qiáng)力表明基于Ad34的載體在肌內(nèi)施用于靈長(zhǎng)類動(dòng)物后，在表達(dá)轉(zhuǎn)基因方面是有效的。
免疫原性針對(duì)20aa的肽庫(kù)用INF-γELISPOT分析來(lái)定量針對(duì)HIV-1 gag的疫苗誘導(dǎo)的T-細(xì)胞應(yīng)答，所述肽庫(kù)包含完整蛋白序列。結(jié)果如圖5所示；應(yīng)答于肽庫(kù)或模擬(無(wú)肽)對(duì)照的結(jié)果通過(guò)每百萬(wàn)外周血單核細(xì)胞(PBMC)的點(diǎn)形成細(xì)胞(SFC)數(shù)量來(lái)表示。
用表達(dá)gag的Ad34載體免疫在單劑量免疫后立刻誘導(dǎo)可檢測(cè)水平的循環(huán)gag-特異T細(xì)胞。在周4給予第二劑量后應(yīng)答增強(qiáng)。總之，對(duì)基于Ad34載體的應(yīng)答略低于相同劑量的MRKAd5-gag誘導(dǎo)的應(yīng)答。結(jié)果強(qiáng)力表明基于Ad34的載體能有效引發(fā)HIV-特異T細(xì)胞應(yīng)答。
來(lái)自Ad34免疫動(dòng)物的PBMC的IFN-γICS分析表明載體可誘導(dǎo)可檢測(cè)水平的CD4+和CD8+HIV特異T細(xì)胞(圖6)。
實(shí)施例6外源免疫將一群3只猴子用10^11vp Ad34ΔElgagΔE4Ad5Orf6免疫(在周0和4)，然后在周24用10^10vp Ad35ΔElgagΔE4Ad50rf6加強(qiáng)。針對(duì)20aa的肽庫(kù)用INF-γELISPOT分析來(lái)定量針對(duì)HIV-1 gag的疫苗誘導(dǎo)的T-細(xì)胞應(yīng)答，所述肽庫(kù)包含完整蛋白序列。結(jié)果如圖12所示；應(yīng)答于肽庫(kù)或模擬(無(wú)肽)對(duì)照的結(jié)果通過(guò)每百萬(wàn)外周血單核細(xì)胞(PBMC)的點(diǎn)形成細(xì)胞(SFC)數(shù)量來(lái)表示。
用表達(dá)gag的Ad34載體免疫誘導(dǎo)的循環(huán)gag-特異T細(xì)胞水平在加強(qiáng)時(shí)降低至94-139 SFC/10^6 PBMC。用基于Ad-35的HIV載體外源免疫導(dǎo)致T細(xì)胞應(yīng)答的3倍提高。
來(lái)自Ad34引發(fā)/Ad35加強(qiáng)的動(dòng)物的PBMC在周28的IFN-γICS分析表明載體可誘導(dǎo)可檢測(cè)水平的CD4+和CD8+HIV特異T細(xì)胞(圖13)。
權(quán)利要求
1.重組腺病毒血清型34載體，其在E1至少部分缺失并且缺乏E1活性。
2.一群細(xì)胞，其包含權(quán)利要求1的重組腺病毒載體。
3.產(chǎn)生重組、復(fù)制缺陷的腺病毒顆粒的方法，其包括(a)將權(quán)利要求1的重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染到一群細(xì)胞；和(b)收獲所得重組、復(fù)制缺陷的腺病毒。
4.純化的按照權(quán)利要求3的方法收獲的重組、復(fù)制缺陷的腺病毒顆粒。
5.組合物，其包含按照權(quán)利要求4的純化的重組腺病毒顆粒。
6.按照權(quán)利要求5的組合物，其包含生理可接受的載體。
7.重組腺病毒血清型34載體，其在E1至少部分缺失并且缺乏E1活性且含有異源核酸。
8.一群細(xì)胞，其含有權(quán)利要求7的重組腺病毒載體。
9.產(chǎn)生重組、復(fù)制缺陷的腺病毒顆粒的方法，其包括(a)將權(quán)利要求7的重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染到一群細(xì)胞；和(b)收獲所得重組、復(fù)制缺陷的腺病毒。
10.權(quán)利要求7的重組載體，其中載體含有基因表達(dá)盒，所述表達(dá)盒含有(a)編碼蛋白的核酸；(b)可操作連接于編碼蛋白的核酸的外源啟動(dòng)子；和(c)轉(zhuǎn)錄終止序列。
11.按照權(quán)利要求10的重組載體，其中基因表達(dá)盒被插入E1區(qū)。
12.按照權(quán)利要求7的重組載體，其中異源核酸含有優(yōu)化用于在人宿主表達(dá)的密碼子。
13.按照權(quán)利要求7的重組載體，其在E1缺失含有異源核酸。
14.按照權(quán)利要求7的重組載體，其在E3至少部分缺失。
15.純化的按照權(quán)利要求9的方法收獲的重組、復(fù)制缺陷的腺病毒顆粒。
16.組合物，其含有純化的按照權(quán)利要求9的重組腺病毒顆粒。
17.按照權(quán)利要求16的組合物，其含有生理可接受的載體。
18.實(shí)施異源核酸遞送和表達(dá)的方法，其包括在施用異源核酸之前或之后用相同或不同的載體施用權(quán)利要求16的組合物。
19.按照權(quán)利要求18的方法，其中在組合物之前或之后用不同血清型腺病毒施用異源核酸。
20.按照權(quán)利要求16的組合物，其中異源核酸編碼HIV抗原。
21.在個(gè)體產(chǎn)生針對(duì)HIV的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法，其包括給個(gè)體施用權(quán)利要求20的組合物。
22.按照權(quán)利要求21的組合物，其中HIV抗原是HIV-1 gag或其免疫學(xué)相關(guān)的修飾。
23.按照權(quán)利要求21的組合物，其中HIV抗原是HIV-1 nef或其免疫學(xué)相關(guān)的修飾。
24.按照權(quán)利要求21的組合物，其中其中HIV抗原是HIV-1 pol或其免疫學(xué)相關(guān)的修飾。
25.血清型34的重組腺病毒載體，其在E1至少部分缺失并且缺乏E1活性且含有HIV-1基因。
26.一群細(xì)胞，其含有權(quán)利要求25的重組腺病毒載體。
27.產(chǎn)生重組、復(fù)制缺陷的腺病毒顆粒的方法，其包括(a)將權(quán)利要求25的重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染到一群細(xì)胞；和(b)收獲所得重組、復(fù)制缺陷的腺病毒。
28.純化的按照權(quán)利要求27的方法收獲的重組、復(fù)制缺陷的腺病毒顆粒。
29.組合物，其含有純化的按照權(quán)利要求28的重組腺病毒顆粒。
30.按照權(quán)利要求29的組合物，其含有生理可接受的載體。
31.實(shí)施HIV-1基因遞送和表達(dá)的方法，其包括在施用HIV-1基因之前或之后用相同或不同的載體施用權(quán)利要求30的組合物。
32.按照權(quán)利要求31的方法，其中在組合物之前或之后用不同血清型腺病毒施用HIV-1基因。
33.在個(gè)體產(chǎn)生針對(duì)HIV的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法，其包括給個(gè)體施用權(quán)利要求29的組合物。
34.按照權(quán)利要求29的組合物，其中HIV抗原是HIV-1 gag或其免疫學(xué)相關(guān)的修飾。
35.按照權(quán)利要求29的組合物，其中HIV抗原是HIV-1 nef或其免疫學(xué)相關(guān)的修飾。
36.按照權(quán)利要求29的組合物，其中其中HIV抗原是HIV-1 pol或其免疫學(xué)相關(guān)的修飾。
全文摘要
腺病毒血清型的天然親嗜性不同。已發(fā)現(xiàn)腺病毒的各種血清型至少其殼體蛋白(例如，五鄰體和六鄰體)、負(fù)責(zé)細(xì)胞結(jié)合的蛋白(例如纖維蛋白)以及腺病毒復(fù)制相關(guān)的蛋白不同。血清型之間親嗜性和殼體蛋白的不同導(dǎo)致許多旨在通過(guò)殼體蛋白的修飾而重新控制腺病毒親嗜性的研究。本發(fā)明繞過(guò)了對(duì)殼體蛋白修飾的需要，因?yàn)槠涮峁┝酥亟M、復(fù)制缺陷的腺病毒血清型34(一種稀有的腺病毒血清型)，以及產(chǎn)生其他重組腺病毒的方法。另外還提供應(yīng)用重組腺病毒遞送和表達(dá)外源基因的方式。
文檔編號(hào)C12N15/01GK1759177SQ03826212
公開(kāi)日2006年4月12日 申請(qǐng)日期2003年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月28日
發(fā)明者E·A·埃米尼, J·W·希弗, A·J·貝特, D·R·卡西米羅, D·C·卡斯羅, M·查斯泰恩 申請(qǐng)人:麥克公司