專利名稱：：包含多不飽和脂肪酸的微生物油的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及到一種生產(chǎn)PUFA的方法，所述PUFA可以是微生物油中的，該方法包含采用兩階段法培養(yǎng)微生物，然后從該微生物中回收微生物油。本發(fā)明還涉及用該方法獲得的新穎的(例如微生物的)油。在所述的油中，50％或者更多的油脂類(或PUFA，例如在所述的油里)是花生四烯酸(arachidonicacid，ARA)。這種油可能具有低于2.5或2.0的低過氧化值(peroxidevalue，POV)和/或低于1.0的低茴香胺值(anisidinevalue，AnV)。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的微生物油或利用本發(fā)明的微生物油制造的食品和食物添加劑。
背景技術(shù)：
：多不飽和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacid)，或PUFA，可以在自然界中發(fā)現(xiàn)。各種各樣不同的PUFA產(chǎn)生自不同的單細(xì)胞生物(藻類、真菌等)。一種特別重要的PUFA是花生四烯酸(ARA)，它是若干種長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFAs)之一?；瘜W(xué)上，花生四烯酸是順式-5，8，11，14-二十碳四烯酸(20∶4)，屬于LC-PUFA的(n-6)族。花生四烯酸是多種具有生物活性的化合物的主要前體，這些化合物合稱為類二十烷酸(eicosanoid)，其中包括前列腺素(prostaglandin)、凝血噁烷(thromboxane)和白細(xì)胞三烯(leukotriene)?；ㄉ南┧徇€是人類母乳脂類成分(lipidfraction)的組分之一，并被認(rèn)為對(duì)嬰兒的理想神經(jīng)發(fā)育來說不可或缺?；ㄉ南┧峋哂懈鞣N各樣的不同應(yīng)用，包括用于嬰兒配方食品(infantformula)、食品和動(dòng)物飼料?；ㄉ南┧峥梢岳梦⑸锾貏e是利用絲狀真菌Mortierella來生產(chǎn)。然而，花生四烯酸在得到的微生物油中的百分比通常非常低。人們?yōu)榇诉M(jìn)行過很多嘗試，試圖提高M(jìn)ortierella的花生四烯酸產(chǎn)量，但是取得的成功卻程度各異。很多提高花生四烯酸水平的嘗試，都包括在工業(yè)環(huán)境中不易使用的步驟。例如，Broshinetal，ProcessBiochemistry(35)2000，pp1171-1175，將培養(yǎng)物在發(fā)酵結(jié)束后放置一周左右的時(shí)間。其中提到的ARA的量是基于生物量(biomass)(而不是基于從其中提取出來的油)的，因?yàn)樵撈墨I(xiàn)中沒有描述過任何油的提取。Totanietal，IndustrialApplicationsofsinglecelloils，AmericanOilChemists’SocietyCampaign，1992，Chapter4，pp52-60和Lipids，Vol.22No.12(1987)，pages1060-1062，提出了用罕見的低發(fā)酵溫度進(jìn)行發(fā)酵，這意味著發(fā)酵會(huì)相當(dāng)?shù)芈?。此處的ARA含量基于氯仿/甲醇溶劑混合物的萃取物。另一篇花生四烯酸制造領(lǐng)域的文獻(xiàn)是WO96/21037。EP-A-1035211(Suntory)描述了一種從M.alpina中生產(chǎn)ARA和雙高-γ-亞麻酸(dihomogamma-linolenicacid，DHGLA)油脂類的方法。然而，其ARA含量的計(jì)算基于生物量(而非從中提取的油)或由一種分析方法產(chǎn)生，其中多不飽和脂肪酸先被酯化，然后再用一種溶劑來萃取(而不是先行萃取，產(chǎn)生一種油，再在這種油的基礎(chǔ)上測(cè)定出ARA的含量)。一篇關(guān)于ARA的更高產(chǎn)量的報(bào)道宣稱，采用M.alpina的1S-4株系，在收獲的菌絲體中濃度接近70％(ShimizuS.，Oils-Fats-Lipids1995，Proc.WorldCongr.Int.Soc.FatRes.，21st(1996)，MeetingDate1995，Volume1，pages103-109和BiochemicalandBiophysicalResearchcommunications，Vol.150(1)，1988，pages335-441)。但是，這個(gè)百分比是基于細(xì)胞的，與微生物油中的ARA的百分比并不一樣。事實(shí)上，制成的油僅提供了39.0％的ARA含量(表27.2，第105頁)。(注意，本領(lǐng)域中使用了各種不同的方式來測(cè)量ARA的含量，它們與本說明書后面所提供的數(shù)據(jù)不一定具有相同的單位或基于相同的分析方案)。此外，這還僅僅是在M.alpina細(xì)胞于發(fā)酵后再在室溫中被多放置了六天才得到的，而對(duì)工業(yè)生產(chǎn)過程來說這明顯不是可行的選擇。因此，我們需要找到能提高微生物油中花生四烯酸的比例(及產(chǎn)量)的方法，特別是工業(yè)規(guī)模上能用到的方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了多種新穎的方法，以生產(chǎn)含有的花生四烯酸比例提高的(微生物)油。這意味著花生四烯酸可以以更低的成本以及更高的效率地被生產(chǎn)出來。此外，由于本發(fā)明并不依靠對(duì)涉及到的微生物進(jìn)行遺傳修飾來提高花生四烯酸的產(chǎn)量，因此本發(fā)明有助于滿足對(duì)天然的、未經(jīng)遺傳修飾的食物成分的日益增加的需求。而且這種油具有低氧化勢(shì)(OxidationPotential)，所以適合添加到毒性對(duì)之特別重要的人類食物中，例如嬰兒配方食品。因此，本發(fā)明的第一方面涉及到一種生產(chǎn)微生物油或多不飽和脂肪酸(PUFA)的方法。該方法包含在發(fā)酵容器中以合適的培養(yǎng)基發(fā)酵(或培養(yǎng))微生物，在發(fā)酵終點(diǎn)前(或在其之前的階段)；a)碳源被微生物消耗的速率大于其被添加到培養(yǎng)基中的速率；b)碳源以每小時(shí)≤0.30M碳/kg培養(yǎng)基的速率被添加；c)碳源使得微生物生長的速率被限制，或?qū)μ荚催M(jìn)行控制，從而使得微生物代謝(它自己的)脂肪(類)和/或油脂(類)；d)添加碳源的速率被降低至碳源被微生物消耗的速度，或低于碳源被微生物消耗的速率；e)在發(fā)酵終點(diǎn)或之前，碳源已經(jīng)被全部用光，或其在培養(yǎng)基中的濃度接近于零；f)碳源的添加被終止，但發(fā)酵可以繼續(xù)；和/或g)對(duì)微生物所處的條件進(jìn)行調(diào)節(jié)，使得它們優(yōu)先于ARA進(jìn)行脂肪(類)(舉例來說，在細(xì)胞內(nèi)，例如是PUFA)而不是ARA的代謝。本發(fā)明的第二方面涉及到含有至少50％(或至少50.5％、51％或52％)的花生四烯酸(ARA)的微生物油。它也可能含有高達(dá)55％、57％或60％的ARA。這種油可以具有a)含量為至少90％的甘油三酯；b)低于2.5的過氧化值；c)低于1.0的茴香胺值；和/或d)含量低于5％的磷脂。上述的油可以通過第一方面所述的方法來制備。它可以是被己烷萃取的。人們認(rèn)為，一旦碳源濃度降低或受控制，細(xì)胞將開始代謝那些胞內(nèi)的脂肪或油脂類。但是，這些細(xì)胞首先消耗脂肪而不是ARA。在這種情況下，ARA在細(xì)胞內(nèi)脂肪或油脂類中的比例得以增加。因此，通過這種方式，第一方面所述的方法能夠制得第二方面中所述的ARA含量更高的油。具體實(shí)施例方式微生物所用的微生物可以是細(xì)菌、酵母、藻類或真菌。優(yōu)選使用真菌，特別是使用絲狀真菌。優(yōu)選的真菌是Mucorales目的。所述的真菌可以是Mortierella、Phycomyces、Entomophthora、Pythium、Thraustochytrium、Blakeslea、Rhizomucor或Aspergillus屬的。優(yōu)選的真菌是Mortierellaalpina種的。優(yōu)選的酵母是Pichia或Saccharomyces屬的，例如Pichiaciferrii。細(xì)菌可以是Propionibacterium屬的。合適的藻類是甲藻(dinoflagellate)和/或?qū)儆贑rypthecodinium、Porphyridium或Nitschia屬的，例如是Crypthecodiniumcohnii種的。本發(fā)明所使用的微生物株系可以是自然界中存在的或是常用的工業(yè)株系。該株系可以是未經(jīng)過遺傳改造的，例如，它可以沒有被載體轉(zhuǎn)化過，或者不包含外源基因。由于目前在一些地區(qū)人們偏好那些不包含遺傳工程成分的食物，因此所采用的微生物可以是未經(jīng)修飾的株系。多不飽和脂肪酸(PUFAs)PUFA可以是一種PUFA，也可以是兩種或更多種的不同的PUFA。該P(yáng)UFA或每個(gè)PUFA可以是n-3或n-6族的。優(yōu)選的是C18、C20或C22的PUFA。它可以是至少具有18個(gè)碳原子和/或3或4個(gè)雙鍵的PUFA。所述的PUFA可以被分離成游離脂肪酸、鹽的形式，作為脂肪酸酯(例如甲酯或乙酯)，作為磷脂和/或甘油單、雙或三酯的形式。適合的(n-3和n-6)PUFA包括二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid，DHA，22∶6Ω3)，較為適合的是來自藻類或真菌，例如(甲藻)Crypthecodinium或(真菌)Thraustochytrium；γ-亞麻酸(γ-linolenicacid，GLA，18∶3Ω6)；α-亞麻酸(α-linolenicacid，ALA，18∶3Ω3)；共軛亞油酸(conjugatedlinoleicacid，十八碳二烯酸(octadecadienoicacid)，CLA)；雙高-γ-亞麻酸(dihomo-γ-linolenicacid，DGLA，20∶3Ω6)；花生四烯酸(ARA，20∶4Ω6)；和二十碳五烯酸(eicosapentaenoicacid，EPA，20∶5Ω3)。優(yōu)選的多不飽和脂肪酸包括花生四烯酸(ARA)，二十二碳六烯酸(DHA)，二十碳五烯酸(EPA)和/或γ-亞麻酸(GLA)。具體而言，優(yōu)選為花生四烯酸。發(fā)酵典型的發(fā)酵/培養(yǎng)是在含有(液體，通常為水性的)培養(yǎng)基的合適的發(fā)酵罐(或發(fā)酵容器)中進(jìn)行的。一般由小的進(jìn)料發(fā)酵罐(feedfermenter)向主發(fā)酵容器進(jìn)行無菌接種。典型采用的為深層(submerged)和/或需氧的發(fā)酵過程。這可以在深池(deeptank)發(fā)酵罐中進(jìn)行。發(fā)酵罐可以配備用以監(jiān)控和/或改變pH和溫度的設(shè)施。此外，這種容器還可以適于進(jìn)行、或能夠?qū)崿F(xiàn)通氣和/或細(xì)胞與液體的混合，比如，溶液的攪拌。上述操作可以是攪動(dòng)(stirring)，例如通過機(jī)械手段獲得的。發(fā)酵罐適合的體積為至少10、20、40或者甚至60立方米。高達(dá)100或者甚至150立方米的體積也是可以使用的。典型的發(fā)酵將持續(xù)10天或更短，優(yōu)選9天或更短，更優(yōu)選的是8天或更短。它可以是至少4、5、6或7天?？晒┻x擇地，發(fā)酵可以為150至200小時(shí)，例如160至190小時(shí)，舉例來說，170至180小時(shí)。發(fā)酵終點(diǎn)通常是攪拌振蕩和/或通氣停止的時(shí)刻。這可以是發(fā)酵容器和/或輔助設(shè)備被(有效地)關(guān)掉之時(shí)。然后微生物可以從發(fā)酵罐中被移走。發(fā)酵可以在20℃至40℃之間的溫度下進(jìn)行。碳源和氮源所有合適的培養(yǎng)基都可以用于發(fā)酵，例如，一種適用于所使用的微生物的培養(yǎng)基。碳源可以包含(復(fù)雜的來源，例如)麥芽糖糊精、燕麥粉、燕麥片、糖蜜、植物(例如大豆)油、麥芽提取物、淀粉、乙醇或大豆油。優(yōu)選的(不復(fù)雜的)碳源包括碳水化合物或糖，例如果糖、麥芽糖、蔗糖、木糖、甘露醇、葡萄糖或乳糖或甘油(glycerine)(例如，來自植物來源的)、檸檬酸、醋酸、丙三醇(glycerol)、乙醇或抗壞血酸(例如其鈉鹽)。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，碳源是葡萄糖或者包含葡萄糖的，特別地，是葡萄糖漿。適合的氮源包括酵母提取物、尿素以及蛋白胨。培養(yǎng)基可以不含瓊脂。優(yōu)選的氮源和/或碳源是水溶性的或者是易與水混合的。培養(yǎng)基中的個(gè)別成分(例如氮源和/或碳源)可以于發(fā)酵起點(diǎn)就(全部)存在，可以在發(fā)酵期間連續(xù)不斷地添加，也可以分批或逐步地添加。具體而言，培養(yǎng)基中存在的碳源的量，將會(huì)典型地按照如下所述的方式被控制，優(yōu)選是依靠控制添加碳源的速率。氮和/或碳源可以被單獨(dú)補(bǔ)充(或添加)，也可以被同時(shí)補(bǔ)充，還可以以整合在一起的制劑的形式(combinedpreparation)被補(bǔ)充。它們可以存在于同一組合物中(如果被認(rèn)為是必需的話)，該組合物優(yōu)選是一種液體。碳源和/或氮源(向發(fā)酵罐容器中)的添加，可以在真菌細(xì)胞被加入(到容器中)之前，換句話說是在接種之前進(jìn)行，也可以是在發(fā)酵期間；或者它們可以在發(fā)酵之前以及發(fā)酵期間被添加。培養(yǎng)基培養(yǎng)基優(yōu)選為一種水性液體。它還可以另外包括其它物質(zhì)在發(fā)酵中進(jìn)行輔助，例如，螯合試劑(比如檸檬酸)、消泡劑(比如大豆油)、維生素(比如硫胺素(thiamine)和/或核黃素(riboflavin))、任何必需的催化金屬(比如，鎂或鈣等堿土金屬，或者鋅或鐵和/或其它金屬諸如鈷和銅)、磷(比如磷酸鹽)和/或硫(比如硫酸鹽)。如果必要的話，該培養(yǎng)基可以包括一種附加的油，例如，橄欖或者大豆油，但是，優(yōu)選地，培養(yǎng)基不包括上述的油。(最適的)生長(或發(fā)酵)溫度可以根據(jù)所使用的微生物而變化。但是，優(yōu)選是20℃至40℃，更優(yōu)選的是22℃至30℃或32℃。特別地，進(jìn)行發(fā)酵的溫度是在≥22℃或者≤25℃，諸如22℃至30℃，舉例來說是23℃-28℃。發(fā)酵期間水性液體的pH可以是4至10，例如5至8，最適為6至7。發(fā)酵期間，典型做法是對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行攪動(dòng)或攪拌振蕩來幫助實(shí)現(xiàn)通氣。水性液體和細(xì)胞被適當(dāng)?shù)鼗旌匣驍嚢?。這可以通過進(jìn)行通氣來實(shí)現(xiàn)，例如將一種氣體，如空氣，向水性液體中鼓泡。這還可以達(dá)到一個(gè)附加的目的，即向真菌細(xì)胞提供氧氣因此發(fā)酵優(yōu)選為需氧發(fā)酵。攪拌或混合的其它手段包括攪動(dòng)，例如使用葉輪。它可以是水翼軸流式(hydrofoilaxialflow)設(shè)計(jì)，也可以被設(shè)計(jì)成使水性培養(yǎng)基從葉輪(例如渦輪)向外呈放射狀被推動(dòng)的形式。即使沒有攪動(dòng)，發(fā)酵過程中向微生物細(xì)胞提供氧氣也是優(yōu)選的，所以，在此處，通氣(例如，通過鼓入空氣、氧氣或其它包含氧氣的氣體)是有益的。通氣可以是0.1至2.0vvm，例如從0.5至1.0vvm。優(yōu)選的發(fā)酵罐體積為至少2升或5升，優(yōu)選為至少10升。然而，對(duì)于工業(yè)上使用的或達(dá)到工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵罐來說，容器體積優(yōu)選為至少50、100、500或者1000升。發(fā)酵的最后(或第二)階段發(fā)酵過程可以被分為至少兩個(gè)階段。第二或最后階段，可能馬上就要到達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)，其特征為微生物可用碳源的量降低或是第一方面中給出的(a)到(g)特征中的任意一項(xiàng)。典型地，該階段起始于發(fā)酵終點(diǎn)前15至2個(gè)小時(shí)，優(yōu)選是發(fā)酵終點(diǎn)前10小時(shí)或更短，更加優(yōu)選的是發(fā)酵終點(diǎn)前的3至5小時(shí)。優(yōu)選地，該階段典型地起始于發(fā)酵開始之后10天以內(nèi)，更加優(yōu)選的是起始于發(fā)酵開始之后的9天以內(nèi)，進(jìn)一步優(yōu)選的是發(fā)酵開始之后的8天以內(nèi)。在發(fā)酵的第一或是初期階段，碳源可能是過量的。因此可利用的碳源的量無法限制微生物的生長。添加碳源的速率可能會(huì)超過其被微生物消耗的速率。在發(fā)酵的第二或是最后階段，添加進(jìn)去的碳源的量可以被減少或完全停止。這意味著，在發(fā)酵的第二或是最后階段，可為微生物所用的碳源的量將會(huì)減少。典型地來說，在第二，最終或是最后階段，或者接近發(fā)酵終點(diǎn)之時(shí)，碳源可能被微生物消耗的速率大于其被添加到培養(yǎng)基中的速率(例如添加速率低于消耗速率)；以每小時(shí)≤0.30M碳/kg培養(yǎng)基的速率被添加，例如≤0.25或≤0.20M碳/kg培養(yǎng)基/hr，但是至少為0.01、0.02或0.05M碳/kg培養(yǎng)基/hr(此處的單位表示碳源中碳的摩爾數(shù)或摩爾量，而非碳源本身的重量或摩爾數(shù))；限制了微生物的生長和/或(多不飽和脂肪酸的)生產(chǎn)的速率。在第二階段，典型的碳源濃度為≤10g碳源/kg培養(yǎng)基，優(yōu)選為0.01g/kg或0.1g/kg至8g/kg或10g/kg，更優(yōu)選的是0.5g/kg至5g/kg，進(jìn)一步優(yōu)選為1g/kg或2g/kg至4g/kg或5g/kg。這意味著，在發(fā)酵的最后階段，平均起來，每kg培養(yǎng)基中會(huì)有≤0.30M的碳，優(yōu)選是每kg為0.003M至0.3M的碳。每kg0.015M至0.17M的碳是有益的，而進(jìn)一步優(yōu)選的是每kg0.03M至0.17M的碳。如果碳源包含葡萄糖，(在最后階段)葡萄糖的典型濃度平均為每kg培養(yǎng)基中≤10g，優(yōu)選是0.01g/kg或0.1g/kg至8g/kg或10g/kg。0.5g/kg至5g/kg是有益的，進(jìn)一步優(yōu)選為1g/kg或2g/kg至4g/kg或5g/kg培養(yǎng)基。在此種情況下，培養(yǎng)基中包含細(xì)胞及水性培養(yǎng)基，換句話說，就是“培養(yǎng)液”(細(xì)胞和周圍的液體)。在最后階段碳源添加速率優(yōu)選為不超過每kg0.03M碳，優(yōu)選的是不超過0.025或0.02M碳/kg(培養(yǎng)基)。優(yōu)選的添加速率在0.015M碳/kg左右。如果碳源是葡萄糖，那么葡萄糖添加速率優(yōu)選為每小時(shí)小于1.0g/kg培養(yǎng)基，例如小于0.8g/kg培養(yǎng)基，例如小于0.5g葡萄糖/kg培養(yǎng)基。最后階段中碳源添加速率優(yōu)選為碳源被微生物消耗的速率的一半左右。但是，添加速率∶消耗速率這個(gè)比率可以在1∶1-3中變化，例如從1∶1.5至2.5，最適的為從1∶1.8至2.2?；蛘?，添加速度可以是消耗速度的30％-70％，例如40％至60％，最適為45％至55％。在發(fā)酵的第二階段，適當(dāng)?shù)奶荚礉舛瓤梢酝ㄟ^仔細(xì)地控制碳源的添加速率來獲得。典型地，它將會(huì)在最后階段中適當(dāng)?shù)亟档停蛟谧詈箅A段的一開始就陡然下降。對(duì)培養(yǎng)物的定期采樣和分析被用來測(cè)定碳源的濃度，并對(duì)碳源的添加速率做出必要的調(diào)節(jié)。這可以通過使用一套計(jì)算機(jī)系統(tǒng)來自動(dòng)完成。巴氏消毒(Pasteurisation)過程巴氏消毒通常發(fā)生于發(fā)酵完成之后。在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，巴氏消毒將終止發(fā)酵，因?yàn)榘褪舷酒陂g的熱度會(huì)殺死細(xì)胞。巴氏消毒因此可以針對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)液(或液體(水性)培養(yǎng)基中的細(xì)胞)進(jìn)行，雖然其也能夠針對(duì)從培養(yǎng)液中獲得的微生物生物物質(zhì)(biomass)進(jìn)行。在前一種情況中，巴氏消毒可以發(fā)生于微生物細(xì)胞仍處于發(fā)酵罐中時(shí)。巴氏消毒優(yōu)選于微生物細(xì)胞受到更多的處理前進(jìn)行，例如微粒化(比如通過擠壓)、粉碎或者捏煉(kneading)。優(yōu)選地，巴氏消毒方案足以抑制或失活一種或多種能使多不飽和脂肪酸或微生物油降解或?qū)ζ洚a(chǎn)生不良影響的酶，例如脂肪酶。一旦發(fā)酵已被終止，就可以過濾發(fā)酵培養(yǎng)液，或者進(jìn)行其它處理以去除其中的水或水性液體。水分被移除之后，可以獲得一種生物物質(zhì)“壓濾渣(cake)”。如果巴氏消毒還未進(jìn)行，就會(huì)對(duì)這些去水的細(xì)胞(或生物物質(zhì)壓濾渣)進(jìn)行巴氏消毒。油的提取如果需要的話，例如，在發(fā)酵被終止之后，微生物可以被殺死或?qū)ζ溥M(jìn)行巴氏消毒。這可以用來失活任何不受歡迎的酶，例如那些可能使上述的油降解或降低PUFA產(chǎn)量的酶。在培養(yǎng)或發(fā)酵完成或已經(jīng)結(jié)束之后，發(fā)酵培養(yǎng)液(細(xì)胞和水性液體)就可以從發(fā)酵罐中被移出來，如果必要的話，可以將液體(通常是水)從其中移走。任何適合的固液分離技術(shù)都是可以使用的。其(去水)可以依靠離心和/或過濾。細(xì)胞可以被漂洗，比如說采用水溶液(例如水)，達(dá)到諸如去除細(xì)胞外水溶性或易分散于水中的化合物的目的。然后可以從微生物中回收得到油，例如使用溶劑使這種油得以被溶劑萃取，優(yōu)選是己烷萃取。這種油可能不含有(或基本去除了)GLA和/或DGLA。PUFA的提取過程所述的PUFA(或通常含有該P(yáng)UFA的微生物油)可以自包含細(xì)胞的(比如，·干燥的)微粒(例如，擠壓得到的)中提取。這種提取可以使用溶劑來進(jìn)行。優(yōu)選使用無極性溶劑，例如C1-8，比如C2-6，鏈烴，舉例來說是己烷。也可以使用二氧化碳(液態(tài)形式的，比如處于超臨界狀態(tài)的)。然后可以對(duì)上述細(xì)胞進(jìn)行提取，例如使用有機(jī)溶劑，優(yōu)選是在氮流中進(jìn)行的。其它可用的有機(jī)溶劑包括乙醚、甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷和/或石油醚。使用甲醇及石油醚和/或使用由氯仿、甲醇和水構(gòu)成的單層溶劑體系來萃取也是可行的。有機(jī)溶劑從萃取物中減壓蒸發(fā)，可以得到含有高濃度花生四烯酸的微生物油。優(yōu)選地，溶劑被允許從干燥微粒中濾出。適合的微生物微粒化和擠壓技術(shù)以及后續(xù)的含有PUFA的微生物油的提取，在WO-A-97/37032中進(jìn)行了描述。上述溶劑可以令我們獲得一種含有PUFA的粗制的(crude)油。這種油在此狀態(tài)即可使用，無需更多處理，它也可以再經(jīng)過一步或數(shù)步精煉。PCT/EP01/08902號(hào)國際專利申請(qǐng)(該文件的內(nèi)容和本文中所述及的其它所有文件的內(nèi)容通過引用的方式被包括在本文中)中描述了合適的精煉方案。例如，可以對(duì)所述的油進(jìn)行酸處理或脫膠(degumming)、堿處理或去除游離脂肪酸、脫色(bleaching)或去除色素、過濾、冬化(winterisation)(或冷卻，例如為了去除飽和的甘油三酯)、脫臭(或?qū)τ坞x脂肪酸的去除)和/或上光(polishing)(或?qū)τ筒蝗苄晕镔|(zhì)的去除)。由此得到的油特別適合營養(yǎng)上的用途，可以被添加到(人類的)食物或(動(dòng)物的)飼料中。例子包括奶、嬰兒配方食品、健康飲品、面包和動(dòng)物飼料。提純/精煉微生物油可以被精煉和提純。該過程可能涉及到去除下述組分中的一種或數(shù)種磷脂、痕量金屬、色素、碳水化合物、蛋白質(zhì)、游離脂肪酸(freefattyacid，F(xiàn)FA)、油溶性物質(zhì)、水溶性物質(zhì)、皂(soap)或皂化(saponified)物質(zhì)、氧化產(chǎn)物、硫、甘油單或雙酯、色素分解產(chǎn)物、溶劑和/或固醇。提純可以減少或去除“異味(off-flavours)”和/或增加油的穩(wěn)定性。為達(dá)到該目的，上述方法(例如提純)可以包括脫膠(或酸處理)、中和(或堿處理)、水洗、脫色、過濾、脫臭、上光和/或冷卻(或冬化)。提純優(yōu)選為包括酸處理和/或堿處理(脫膠和中和)?；蛘撸兓椒梢园撋?或脫臭。然而提純將優(yōu)選包括脫色和/或脫臭，另外，最優(yōu)地，還要加上酸和/或堿處理。油本發(fā)明的第二方面提供了微生物油，它包含至少35％或40％的至少一種PUFA，例如ARA。上述的油可以具有至少50％、55％或60％或更多的這種PUFA，例如ARA。它可以具有至少90％的甘油三酯。這種微生物油優(yōu)選包含50％、55％或60％至90％的花生四烯酸，更優(yōu)選的是60％至80％，進(jìn)一步優(yōu)選的是60％至70％的花生四烯酸。上述微生物油優(yōu)選含有90％至100％的甘油三酯，例如至少90％或96％，優(yōu)選為至少98％，更優(yōu)選的為至少99％，而最優(yōu)的超過99.5％。典型地，這種油中二十碳五烯酸(EPA)的含量低于5％，優(yōu)選為低于1％，而更優(yōu)選的是低于0.5％。該油中，C20、C20∶3、C22∶0和/或C24∶0多不飽和脂肪酸(PUFAs)中任何一種的含量可以少于5％，少于2％，少于1％。游離脂肪酸(FFA)的含量可以≤0.4％、0.2％或0.1％。甘油三酯中存在的PUFA中，優(yōu)選至少40％，例如至少50％，而更優(yōu)選為至少60％，都處于甘油的α位(出現(xiàn)于甘油三酯的主鏈(backbone))也就是所謂的1或3號(hào)位。上述PUFA中處于β(2)位的優(yōu)選為至少20％，例如至少30％，更優(yōu)選的為至少40％。上述油中的磷脂含量最大值適合為5％、3％或者2％和/或最小值可以是0.1％、0.5％或者1.0％。典型地，上述微生物油可以通過本發(fā)明第一方面中的方法得到。上述的油優(yōu)選從真菌中被分離出來，更優(yōu)選地，上述的油是從Mortierella特別是M.alpina中被分離出來的。上述的油被己烷適當(dāng)?shù)剌腿?。ARA的含量純粹為了清楚起見，ARA的百分含量的計(jì)算將被解釋一下，尤其是因?yàn)槲墨I(xiàn)中可能有時(shí)在不同的基礎(chǔ)上計(jì)算ARA的含量。所述ARA的百分比基于上述的油(即已經(jīng)從生物物質(zhì)中被提取出來的那些)，而不是生物物質(zhì)本身。其以重量/重量為基礎(chǔ)。該含量基于由己烷萃取出來的油，所以是基于己烷可萃取的油脂類(hexaneextractablelipids，HEL)的。其基于油的總量，而不是基于脂肪酸的總量(很多時(shí)候這會(huì)給出一個(gè)令人誤解的更高數(shù)值)。ARA的含量通過公知的FAME分析方案(使用脂肪酸甲酯)測(cè)定，細(xì)節(jié)參見AOCSCe1b89。不同的溶劑萃取不同的油脂。注意，在這種情況中，上述的油是先經(jīng)己烷萃取的，然后再通過FAME分析來測(cè)定ARA的含量。這和先行酯化花生四烯酸(例如還在細(xì)胞中的時(shí)候)然后再提取得到的甲酯做進(jìn)一步分析所給出的結(jié)果將會(huì)是不一樣的。過氧化值(POV)上述微生物油的POV優(yōu)選為不超過3.0、2.5或2.0。但是，使用本發(fā)明的方法，還可以獲得低得多的POV，這些數(shù)值可以低于1.5或低于1.0。低于0.8和甚至低于0.4的數(shù)值也能夠被得到。茴香胺值(AnV)上述微生物油的茴香胺值優(yōu)選為不超過1.0，例如不超過0.6、0.3或者甚至不超過0.1。用途和產(chǎn)品本發(fā)明的第三方面涉及到一種組合物，其中包含第二方面中所述的油，以及如果合適的話，其中還具有一種或多種(額外的)物質(zhì)。該組合物可以是為動(dòng)物或人類提供的食品和/或食物添加劑。在本發(fā)明的供人類消費(fèi)的多種實(shí)施方式中，上述的油可以經(jīng)過加工，使其適合人類消費(fèi)，典型的是對(duì)從微生物中獲得的油進(jìn)行精煉或提純。上述組合物可以是嬰兒配方食品或(人類)食品。此處的配方食品的成分可以經(jīng)過調(diào)節(jié)，使其含有的各種油脂或多不飽和脂肪酸的量與正常的母乳相似。上述調(diào)節(jié)可以包括將本發(fā)明的微生物油與其它油類混合，以獲得適當(dāng)?shù)慕M合物。上述的組合物可以是一種動(dòng)物或海產(chǎn)飼料組合物或添加劑。此類飼料和添加劑可以供給任何的養(yǎng)殖動(dòng)物，特別是綿羊、牛和家禽。此外，上述飼料或添加劑還可以供給被養(yǎng)殖的海洋生物，例如魚和有殼水生動(dòng)物。上述組合物因此還可以包含一種或多種適于上述動(dòng)物的飼料物質(zhì)或成分。本發(fā)明的油可以作為油直接售賣，也可以被包納于合適的包裝中，典型的是一種內(nèi)部涂上環(huán)氧酚紫膠漆(epoxyphenoliclacquer)并且經(jīng)過充氮(flushedwithnitrogen)的鋁瓶。上述的油可能含有一種或多種抗氧化劑(例如，生育酚，維生素E，棕櫚酸(palmitate))，每種的濃度例如為50至800ppm，舉例來說是100至700ppm。適當(dāng)?shù)慕M合物可以包括藥用或動(dòng)物治療用的(veterinary)組合物，例如，口服或化妝品用途的組合物。這種油可以按照上述方式被使用，或者還可以被裝入膠囊，例如在一種殼(shell)里，因此可以成為膠囊的形式。這種殼或膠囊可以包含明膠和/或甘油。上述組合物可以包含其它成分，例如調(diào)味料(比如檸檬或酸橙(lime)香料)或一種藥用的或動(dòng)物治療可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明的一個(gè)方面的優(yōu)選特征和特性在進(jìn)行必要的修正后同樣適用于另一個(gè)方面。下述的實(shí)施例只是被用來闡述本發(fā)明的，而非用來對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。對(duì)照實(shí)施例1和2以及實(shí)施例3和4花生四烯酸的生產(chǎn)裝有Mortierellaalpina菌株CBS168.95(由DSMN.V.，2600MADelft，荷蘭(該機(jī)構(gòu)已授權(quán)本申請(qǐng)人使用該被保藏的生物材料)于1995年2月20日提交至CentraalBureauvoorSchimmelcultures(CBS)，P.O.Box85167，3508ADUtrecht，荷蘭進(jìn)行保藏，保藏編號(hào)為DS30340)的1ml小瓶被貯藏于-80℃，并在無菌條件下打開。其內(nèi)容物被用來接種到含有100ml培養(yǎng)基的500ml搖瓶(flask)里，所述的培養(yǎng)基含有(g/l)葡萄糖，20；酵母提取物(Gistex糊狀物(固體80％，蛋白質(zhì)(Nx6.25)46％，NaCl16％，pH(2％溶液)5.6，灰分22％，細(xì)菌總數(shù)(totalplatecount)104/g，腸內(nèi)細(xì)菌(Enterobacteriaceae)＜10/g，大腸桿菌＜1/g，酵母菌及霉菌＜100/g，來自DSMN.V.，SavoryIngredientsPOBox1，2600MADelft))，12.5；消泡劑(Basildon86/013K硅/無硅消泡化合物，參照廠商說明書使用，BasildonChemicalCompany，KimberRoad，Abingdon，Oxford，EnglandOX14IRZ)，0.2。上述培養(yǎng)基的pH在高壓滅菌前被調(diào)至7.0。培養(yǎng)物在25℃以250rpm的搖速培育48小時(shí)，然后用于向四只含有500ml培養(yǎng)基的2000ml搖瓶中接種，所述的培養(yǎng)基包括(g/l)，葡萄糖，20；酵母提取物(Gistex糊狀物)，25；消泡劑(Basildon86/013K)，0.2。滅菌前的pH為7.0。上述培養(yǎng)物在25℃被培育24小時(shí)，然后被用來移種(seeding)至一只5m3的接種發(fā)酵罐(inoculaionfermentor)中，罐中有2400升與上述2000ml瓶中所用的成分相同的培養(yǎng)基(滅菌前的pH為6.0)。發(fā)酵溫度被設(shè)置在25℃，振蕩速度為150rpm，容器壓力是0.5bar，通氣率為0.5VVM。接種體發(fā)酵罐(inoculumfermenter)中的培養(yǎng)物在大約36小時(shí)后(氧氣吸收速率＞3mmol/kg/h)被轉(zhuǎn)移至主發(fā)酵罐中。主發(fā)酵罐含有(g/l)葡萄糖，35；酵母提取物(Expresa2200粉，低鈉啤酒酵母，蛋白胨(提取物)，固體＞96％，總氮量＞10％，氨基氮6-7％，NaCl＜1％，pH(2％溶液)5.3-6.3，灰分＜12.5％，均勻粉末，來源為DSMN.V.，SavoryIngredients)，5.0；NaH2PO4·2H2O，1.0；KH2PO4，2.0；MgSO4·7H2O，0.5；Basildon86/013K，0.3；檸檬酸·1H2O，0.6；ZnCl2，0.010；Fe2(SO4)320％H2O，0.025；MnSO4·1H2O，0.010；(滅菌前的pH5.0)。葡萄糖單獨(dú)滅菌，在滅菌后加入到主發(fā)酵罐中。發(fā)酵持續(xù)175小時(shí)。培養(yǎng)基的pH持續(xù)在pH6(+/-0.1)左右，伴隨0.5VVM的通氣(空氣流)，空氣壓力為0.8bar，以70rpm振蕩。通過連續(xù)增加振蕩速率至100rpm及連續(xù)增加空氣流至0.9VVM，使氧氣水平保持在D.O.≥30％。已滅菌的50％(質(zhì)量/質(zhì)量)左右的葡萄糖溶液被添加至發(fā)酵罐中，以使葡萄糖濃度保持在10g/l以上，另外，從大約30至78小時(shí)，625kg的25％的酵母提取物溶液也被進(jìn)料至發(fā)酵罐，添加速率被加以控制使得氨濃度＜30mg/l。上述實(shí)驗(yàn)被進(jìn)行了四次(實(shí)施例1至4)，培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度被隨時(shí)間監(jiān)控。圖1顯示了以g/kg表示的葡萄糖濃度相對(duì)于進(jìn)入發(fā)酵的小時(shí)數(shù)的圖表。其中顯示，實(shí)施例4的最后一個(gè)數(shù)值為在172小時(shí)，2.2g/kg。這是發(fā)酵終點(diǎn)(endoffermentation，EoF)前3小時(shí)。葡萄糖水平在發(fā)酵終點(diǎn)前一小時(shí)左右為零。在對(duì)照實(shí)施例1和2中，發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)，碳源(葡萄糖)的濃度大大超過5g/kg。事實(shí)上，在發(fā)酵終點(diǎn)前10小時(shí)，葡萄糖濃度在20g/kg左右。因此，在實(shí)施例1和2中，葡萄糖濃度不會(huì)對(duì)微生物群或?qū)RA的生產(chǎn)加以限制的水平。在實(shí)施例3和4中，發(fā)酵的最后階段即將達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)，葡萄糖的濃度被控制，使得在發(fā)酵終點(diǎn)前約10小時(shí)，葡萄糖濃度為5g/kg左右。在該最后階段，超過10小時(shí)，葡萄糖以每小時(shí)0.5g/kg的速度被添加。在發(fā)酵終點(diǎn)葡萄糖濃度實(shí)質(zhì)上為零。在此階段，葡萄糖的消耗速率大約是添加速率的兩倍，即約1g/kg/hr。表1至4(與實(shí)施例1至4對(duì)應(yīng))顯示了發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基內(nèi)的葡萄糖濃度(g/kg)隨時(shí)間的變化。表1表2表3表4在發(fā)酵終點(diǎn)，微生物和周圍的水性液體(發(fā)酵培養(yǎng)液)都從發(fā)酵罐中被移出。培養(yǎng)液經(jīng)過固液分離來去除一些水分。然后，剩下的細(xì)胞被擠壓，再用己烷進(jìn)行溶劑萃取。從而，由分別經(jīng)歷了上述四個(gè)不同的發(fā)酵方案的細(xì)胞中，獲得了含有微生物油(己烷可萃取的油脂類)的花生四烯酸。使用公知的FAME分析方案(細(xì)節(jié)在AOCSCe1b89中)來測(cè)定ARA在油中的百分含量(基于質(zhì)量/質(zhì)量基礎(chǔ)的)。在實(shí)施例3中，微生物油中ARA的濃度為508g/kg(50.8％)。例4中相應(yīng)的數(shù)據(jù)為545g/kg(54.5％的ARA)。作為比較，在對(duì)照例1和2中，從細(xì)胞中提取出來的微生物油要少得多，分別為36.8％和36.7％。荷蘭真菌保藏中心真菌生物多樣性中心荷蘭皇家科學(xué)院研究所(KNAW)DSMN.V.Postbus12600MADELFTNederland烏德勒支(Utrecht)，2003年5月12日我方編號(hào)0183/12mei2003安全保藏聲明荷蘭真菌保藏中心(CBS)，烏德勒支，荷蘭特此聲明，下述微生物CBS168.95MortierellaalpinaDS30340于1995年2月20日被保藏至荷蘭真菌保藏中心，其將作為CBS收到的安全保藏物被保密地貯藏，在最近一次交納年度維持費(fèi)后至少一年的時(shí)間內(nèi)，其會(huì)被妥善地保持存活及不受污染。在作為安全保藏物被貯藏的期間，所述的微生物將只提供給保藏者或經(jīng)由保藏者授權(quán)的人。只要保藏者通知CBS被保藏的菌株不應(yīng)再被繼續(xù)維持，在收到保藏者請(qǐng)求后，CBS就將毀滅所述的株系。CBS需在當(dāng)年度結(jié)束前收到上述請(qǐng)求。CBS專利管理部J.A.Stalpers博士(館長)被保藏的生物材料僅可被專家獲得的要求“對(duì)上述行為可行的所有指定國而言，在上述行為可行的范圍以內(nèi)，并在該指定國法律所允許的范圍以內(nèi)，根據(jù)相關(guān)的專利法規(guī)，例如歐洲專利公約細(xì)則28(4)、英國專利條例1995第2部分第3段、澳大利亞規(guī)則3.25(3)以及其它任何指定國的略有差別但基本類似的規(guī)定，要求所述被保藏的生物材料的樣品僅可由獨(dú)立專家獲得。”權(quán)利要求1.一種生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的方法，所述的方法包含在發(fā)酵容器里的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，由此在發(fā)酵終點(diǎn)之前的階段a)碳源被微生物消耗的速率大于其被添加到培養(yǎng)基中的速率；b)碳源以每小時(shí)≤0.30M碳/kg培養(yǎng)基的速率被添加；c)碳源使得微生物生長的速率被限制，或?qū)μ荚催M(jìn)行控制，從而使得微生物代謝脂肪(類)和/或油脂(類)；d)添加碳源的速率被降低至碳源被微生物消耗的速率，或低于碳源被微生物消耗的速率；或e)在發(fā)酵終點(diǎn)或之前，碳源已經(jīng)被全部用光，或其在培養(yǎng)基中的濃度接近于零；f)碳源的添加被終止，但發(fā)酵可以繼續(xù)；和/或g)對(duì)微生物所處的條件進(jìn)行調(diào)節(jié)，令其優(yōu)先于花生四烯酸(ARA)，代謝或消耗一種或多種脂肪(類)或油脂(類)。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中h)在所述階段，碳源的濃度平均≤10g/kg和/或≤0.17M碳/kg培養(yǎng)基；i)所述的碳源是葡萄糖；和/或j)所述的多不飽和脂肪酸出現(xiàn)于微生物油中。3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中k)第二階段起始于發(fā)酵終點(diǎn)前15至2小時(shí)，或在發(fā)酵起點(diǎn)后的10天之內(nèi)。4.如前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中l(wèi))所述的(整個(gè))發(fā)酵進(jìn)行的溫度為≥22℃和/或≤30℃；m)是在沒有附加的油的情況下進(jìn)行的；和/或n)所述的發(fā)酵過程不長于9天。5.如前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中n)所述的多不飽和脂肪酸包括花生四烯酸(ARA)；和/或o)所述的容器具有至少10升的容量。6.如前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所說的微生物是Mortierella，可以是Mortierellaalpina，和/或是未經(jīng)過遺傳修飾的。7.一種微生物油，包含至少50％的花生四烯酸(ARA)，和a)至少含有90％的甘油三酯；b)過氧化值(POV)不高于2.5；c)茴香胺值(AnV)不高于1.0；d)是己烷萃取的；和/或e)磷脂含量低于5％。8.如權(quán)利要求7所述的油，包含f)少于5％的C20和/或C24多不飽和脂肪酸(PUFAs)；和/或g)少于5％的C22+多不飽和脂肪酸。9.如權(quán)利要求7或8所述的油，其中h)所述游離脂肪酸的含量≤0.4％；i)所述甘油三酯的含量為至少95％或98％，和/或j)所述的油可以通過如權(quán)利要求1至6中任意一項(xiàng)所述的方法進(jìn)行制備。10.一種組合物，包括可以通過如權(quán)利要求1至6中任意一項(xiàng)所述的方法獲得的微生物油，和/或如權(quán)利要求7至9中任意一項(xiàng)所述的微生物油。11.如權(quán)利要求10所述的組合物，所述組合物是食品(例如嬰兒配方食品)、食物、飼料或飼料添加劑，藥用的、動(dòng)物治療用的或化妝品用的組合物。全文摘要本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)微生物油的方法，包含用兩階段發(fā)酵法培養(yǎng)微生物，其中，在發(fā)酵終點(diǎn)前的最后階段，碳源被微生物消耗的速率大于其被添加到培養(yǎng)基中的速率；添加速率為≤0.30M碳/kg培養(yǎng)基；或者其限制了微生物生長的速率。微生物因此只有有限的碳源，以致它們優(yōu)先地代謝各種脂肪或油脂類，而不是花生四烯酸(ARA)，故而增加了ARA在細(xì)胞中的比例。然后可以以己烷為溶劑，從微生物中回收微生物油，其中含有至少50％的ARA和至少90％的甘油三酯。文檔編號(hào)C12N1/20GK1662654SQ03814383公開日2005年8月31日申請(qǐng)日期2003年6月20日優(yōu)先權(quán)日2002年6月19日發(fā)明者胡戈·斯特里科斯特羅,彼得呂斯·約瑟夫·瑪麗亞·布羅肯申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司