專利名稱：分解源自海參的硫酸化脫氧半乳聚糖的酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種能降解在糖工程領(lǐng)域有用的硫酸化脫氧半乳聚糖的酶，制備該酶的方法和激活該酶的各種因子，以及用作糖工程的反應(yīng)物的硫酸化脫氧半乳聚糖低聚糖及其制備方法。
背景技術(shù)：
海參中含有幾種硫酸化多聚糖。它們包括一種其主要組分為硫酸化巖藻糖的多聚糖的硫酸化脫氧半乳聚糖。已經(jīng)報道了從海參來源的硫酸化脫氧半乳聚糖具有抑制AIDS病毒感染的活性和抗凝血活性。如果從海參來源的硫酸化脫氧半乳聚糖被開發(fā)用作藥物，就必須測定其結(jié)構(gòu)。已經(jīng)對源自海參的硫酸化脫氧半乳聚糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，但是目前只測定了該結(jié)構(gòu)的平均值。如果將一種能降解硫酸化脫氧半乳聚糖的酶用于測定該硫酸化脫氧半乳聚糖的結(jié)構(gòu)將是很有利的。但是，商業(yè)上沒有可購買的能降解源自海參的硫酸化脫氧半乳聚糖的酶。各種褐藻中也含有硫酸化脫氧半乳聚糖，而且在很多情況中它們的結(jié)構(gòu)是不同的，取決于它們被從其中分離出來的藻類。例如，從Fucus evanescens，Laminaria japonica和Nemacystus decipiens中提取的硫酸化脫氧半乳聚糖的結(jié)構(gòu)互不相同。已經(jīng)報道了幾種能降解從褐藻中分離的硫酸化脫氧半乳聚糖的酶(WO 96/34004，WO97/26896，WO 99/11797，WO 99/41288和EP 1306389)，但是它們中沒有一種能用于降解源自海參的硫酸化脫氧半乳聚糖。因此，認(rèn)為從海參中分離的硫酸化脫氧半乳聚糖的結(jié)構(gòu)與從褐藻中分離的硫酸化脫氧半乳聚糖的結(jié)構(gòu)不同。
如上所述，需要一種能降解源自海參的硫酸化脫氧半乳聚糖的酶，酶的制備以及結(jié)構(gòu)上同源的硫酸化脫氧半乳聚糖。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的主要目的是提供能降解源自海參的硫酸化脫氧半乳聚糖的硫酸化脫氧半乳聚糖降解酶和制備該酶的方法，以及通過使該酶對硫酸化脫氧半乳聚糖作用而獲得的較小的分子以及制備該分子的方法。本發(fā)明的更進(jìn)一步的目的是提供一種能激活硫酸化脫氧半乳聚糖降解酶的因子。
發(fā)明概述本發(fā)明的發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，一種屬于Fucoidanobacter屬的細(xì)菌菌株，F(xiàn)ucoidanobacter marinus SI-0098，能產(chǎn)生一種新的硫酸化脫氧半乳聚糖降解酶，并發(fā)現(xiàn)了制備該酶的方法。本發(fā)明的發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)利用該酶可從源自海參的硫酸化脫氧半乳聚糖制備一種新的硫酸化脫氧半乳聚糖低聚糖。從而，已經(jīng)完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的第一個方面涉及一種從Fucoidanobacter屬的細(xì)菌的培養(yǎng)物獲得的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶。
根據(jù)第一個方面，可以從能制備內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶的Fucoidanobacter屬細(xì)菌的培養(yǎng)物收集該酶。
本發(fā)明的第二個方面涉及一種能從Fucoidanobactet屬細(xì)菌的培養(yǎng)物獲得的硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶。
根據(jù)第二個方面，可以從能制備硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶的Fucoidanobacter屬細(xì)菌的培養(yǎng)物收集該酶。
本發(fā)明的第三個方面涉及一種硫酸化脫氧半乳聚糖低聚糖，其能通過使第一個方面的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶對源自海參的硫酸化脫氧半乳聚糖的級分作用來獲得。
第三個方面的硫酸化脫氧半乳聚糖低聚糖可以根據(jù)制備硫酸化脫氧半乳聚糖低聚糖的方法制備，包括使第一個方面的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶作用于源自海參的硫酸化脫氧半乳聚糖級分。該方法可以在氯化鈉的存在下進(jìn)行。
本發(fā)明的第四個方面涉及一種硫酸化脫氧半乳聚糖低聚糖，其可以通過使第一個方面的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶和第二個方面的硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶對源自海參的硫酸化脫氧半乳聚糖級分作用來獲得。
第四個方面的硫酸化脫氧半乳聚糖低聚糖可以根據(jù)制備硫酸化脫氧半乳聚糖低聚糖的方法制備，包括使第一個方面的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶和第二個方面的硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶對源自海參的硫酸化脫氧半乳聚糖級分作用。該方法可以在氯化鈉和/或氯化鈣的存在下進(jìn)行。
附圖簡述

圖1該圖說明了pH與本發(fā)明的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶的相對活性(％)之間的關(guān)系。
圖2該圖說明了溫度(℃)與本發(fā)明的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶的相對活性(％)之間的關(guān)系。
圖3該圖說明了鹽濃度(mM)與本發(fā)明的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶的相對活性(％)之間的關(guān)系。
圖4該圖說明了pH與本發(fā)明的硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶的相對活性(％)之間的關(guān)系。
圖5該圖說明了溫度(℃)與本發(fā)明的硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶的相對活性(％)之間的關(guān)系。
圖6該圖說明了鹽濃度(mM)與本發(fā)明的硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶的相對活性(％)之間的關(guān)系。
圖7該圖說明了使用本發(fā)明的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶通過降解硫酸化脫氧半乳聚糖獲得的硫酸化脫氧半乳聚糖低聚糖的凝膠過濾洗脫曲線。
圖8該圖說明了使用本發(fā)明的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶和硫酸化脫氧半乳聚糖通過降解硫酸化脫氧半乳聚糖獲得的硫酸化脫氧半乳聚糖低聚糖的HPLC分析結(jié)果。
發(fā)明詳述在下文中，將對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。
盡管其并不是對本發(fā)明的限制，但是例如，源自Apostichopusjaponicus的硫酸化脫氧半乳聚糖能被用作本發(fā)明的源自海參的硫酸化脫氧半乳聚糖。Apostichopus japonicus優(yōu)選作為原料，因為使用它能高效率的制備本發(fā)明的硫酸化脫氧半乳聚糖低聚糖。
本發(fā)明的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶是一種能對源自海參的硫酸化脫氧半乳聚糖作用從而產(chǎn)生一種在還原末端具有巖藻糖的低聚糖。
本發(fā)明的硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶是一種能在它對通過使本發(fā)明的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶對源自海參或Apostichopusjaponicus的硫酸化脫氧半乳聚糖作用而產(chǎn)生的低聚糖作用的基礎(chǔ)上釋放硫酸的酶。
本發(fā)明的硫酸化脫氧半乳聚糖低聚糖是一種低聚糖，其可通過使本發(fā)明的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶單獨或與本發(fā)明的硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶一起對源自海參的硫酸化脫氧半乳聚糖作用而獲得。它在還原末端具有巖藻糖。
首先通過把海參浸泡在水溶液中提取硫酸化多聚糖級分，從而產(chǎn)生源自本發(fā)明使用的海參的硫酸化脫氧半乳聚糖。在該情況下，優(yōu)選獲得pH4-9，溫度為100℃或以下的級分以防止硫酸化脫氧半乳聚糖轉(zhuǎn)化為較小的分子。此外，硫酸化多聚糖級分中的氨基酸，小分子色素或其類似物通過超濾可以有效的除去?；钚蕴继幚砘蝾愃铺幚韺Τナ杷镔|(zhì)是有效的。
海參的硫酸化多聚糖級分可如上所述獲得。該級分可用作硫酸化脫氧半乳聚糖級分，例如，作為測定本發(fā)明的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶或硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶活性的底物，或作為制備本發(fā)明的硫酸化脫氧半乳聚糖低聚糖的底物。更純的硫酸化脫氧半乳聚糖可以通過使用陰離子交換柱分離級分獲得。使用陰離子交換柱純化的硫酸化多聚糖級分和硫酸化脫氧半乳聚糖都能用作測定本發(fā)明的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶或硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶的底物，或用作制備本發(fā)明的硫酸化脫氧半乳聚糖低聚糖的底物。
關(guān)于用于制備本發(fā)明的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶或硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶的細(xì)菌沒有特殊的限定，只要它是能制備該酶的細(xì)菌。例如，可使用Fucoidanobacter marinus SI-0098。該細(xì)菌菌株是本發(fā)明的發(fā)明者分離的細(xì)菌。該菌株命名為Fucoidanobacter marinusSI-0098，并于1995年3月29日(原始保藏日期)保藏在國際專利微生物保藏單位，國家高等科學(xué)和技術(shù)研究所(AIST Tsukuba Central6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba，Ibaraki 305-8566，Japan)，保藏號為FERM P-14873，于1996年2月15日(要求轉(zhuǎn)為國際保藏機(jī)構(gòu)的日期)在布達(dá)佩斯條約下保藏于國際專利微生物保藏單位，國家高等科學(xué)和技術(shù)研究所，保藏號為FERM BP-5403。
本發(fā)明的發(fā)明者測定了該菌株的編碼16S rRNA的DNA的核苷酸序列，檢測了它與已知細(xì)菌的16S rRNA的同源性，并認(rèn)為該菌株屬于與Verrucomicrobia關(guān)系最近的新屬的細(xì)菌。
該菌株的編碼16S rRNA的DNA的序列如SEQ ID NO1所示。本發(fā)明的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶，或硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶，包括根據(jù)編碼16S rRNA的DNA序列，從被測定屬于Fucoidanobactermarinus SI-0098所屬的屬的細(xì)菌所獲得的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶，或硫酸化脫氧半乳聚糖酯酶。
可以添加任何營養(yǎng)源到培養(yǎng)基中，培養(yǎng)能制備本發(fā)明的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶或硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶的細(xì)菌，只要它在該營養(yǎng)源的存在下能通過微生物被利用而產(chǎn)生酶。例如，硫酸化脫氧半乳聚糖，海參，干海參，海藻，褐藻酸，海帶多糖，巖藻糖，葡萄糖，甘露醇，甘油，蔗糖，麥芽糖，淀粉或其類似物可被用作碳源。酵母提取物，蛋白胨，水解酪蛋白氨基酸，玉米漿，肉膏，脫脂大豆，硫酸銨，氯化銨，尿素，尿酸或其類似物適于用作氮源。此外，鈉，鉀，鎂，鈣，鋅的氯化物，磷酸鹽或硫酸鹽或其類似物都可以添加?？偟膩碇v，從海水中分離的微生物能很容易地在海水或商業(yè)可利用的人造海水中生長。
測定培養(yǎng)條件以便基于所使用的微生物，培養(yǎng)基的組分等等本發(fā)明的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶或硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶的產(chǎn)率能達(dá)到最大。通常，通過在培養(yǎng)溫度15到30℃，培養(yǎng)基pH5到9的條件下通氣攪動培養(yǎng)5到72小時能達(dá)到本發(fā)明的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶或硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶的最大的產(chǎn)率。本發(fā)明的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶或硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶可通過培養(yǎng)后進(jìn)行離心從各自分離到的細(xì)胞和培養(yǎng)物上清獲得。
通過在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)Fucoidanobacter marinus SI-0098，收集細(xì)胞，并使用細(xì)胞裂解的常規(guī)方法裂解細(xì)胞(例如，超聲處理)可獲得無細(xì)胞提取物。本發(fā)明的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶或硫酸化脫氧半乳聚糖酯酶可以使用純化的常規(guī)方法從提取物中純化。本發(fā)明的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶或硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶可以通過例如，鹽析，離子交換柱色譜，疏水柱色譜，凝膠過濾或類似的方法獲得其純化的形式。另外，與用于細(xì)胞內(nèi)的酶純化相似的方法可用于純化來自含有該酶的培養(yǎng)物上清的本發(fā)明的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶或硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶。
本發(fā)明的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶的物理和化學(xué)特性如下(I)作用于源自海參的硫酸化脫氧半乳聚糖從而水解α-L-巖藻糖基(fucosyl)鍵；(II)最適pH為大約7到9(圖1，該圖說明了反應(yīng)的pH與酶的相對活性之間的關(guān)系，其中縱軸表示相對活性(％)，橫軸表示pH)；和(III)最適溫度為大約25到45℃(圖2，該圖說明了反應(yīng)溫度和酶的相對活性之間的關(guān)系，其中縱軸表示相對活性(％)，橫軸表示溫度(℃))。
本發(fā)明的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶可通過測定降解硫酸化脫氧半乳聚糖的活性來鑒定。通過離心制備菌株的培養(yǎng)物獲得的上清，使用各種柱色譜純化后獲得無細(xì)胞提取物，或酶溶液可用于鑒定。
本發(fā)明的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶在氯化鈉存在下被激活。
含有氯化鈉的任何物質(zhì)如作為試劑的氯化鈉，精制食鹽，海水或人工海水都可用作氯化鈉。添加到本發(fā)明的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶的反應(yīng)混合物中的氯化鈉的濃度范圍可以從大約1mM到大約1M，優(yōu)選從大約5mM到大約900mM。
本發(fā)明的硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶的物理和化學(xué)性質(zhì)如下(I)作用于源自海參的硫酸化脫氧半乳聚糖從而釋放硫酸，而且與通過使本發(fā)明的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶單獨作用所獲得的轉(zhuǎn)化相比，其在內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶的存在下促進(jìn)源自海參的硫酸化脫氧半乳聚糖轉(zhuǎn)化為較小的分子；(II)其最適PH為大約6到8(圖4，該曲線圖說明了反應(yīng)PH與酶的相對活性之間的關(guān)系，其中縱軸表示相對活性(％)，橫軸表示PH)；和(III)其最適溫度為大約20到45℃(圖5，該曲線圖說明了反應(yīng)溫度與酶的相對活性之間的關(guān)系，其中縱軸表示相對活性(％)，橫軸表示溫度(℃)。
本發(fā)明的硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶可通過測定釋放的硫酸來測定。通過離心制備菌株的培養(yǎng)物獲得的上清，使用各種柱色譜純化后獲得無細(xì)胞提取物，或酶溶液可用于鑒定。
本發(fā)明的硫酸化脫氧半乳聚糖酯在氯化鈉和/或鈣離子的存在下被激活。
關(guān)于氯化鈉，含有氯化鈉的任何物質(zhì)如作為試劑的氯化鈉，精制食鹽，海水或人造海水都可用作氯化鈉。添加到本發(fā)明的硫酸化脫氧半乳聚糖酯酶的反應(yīng)混合物中的氯化鈉的濃度范圍可以從大約1mM到大約2M，優(yōu)選從大約5mM到大約1M。
關(guān)于鈣離子，含有鈣離子的任何物質(zhì)如作為試劑的氯化鈣或醋酸鈣可用作鈣離子。添加到本發(fā)明的硫酸化脫氧半乳聚糖酯酶的反應(yīng)混合物中的鈣離子的濃度范圍可以從大約0.1mM到大約1M，優(yōu)選從大約1mM到大約500mM。
Fucoidanobacter marinus SI-0098是一種能利用硫酸化脫氧半乳聚糖，并在細(xì)胞內(nèi)或外產(chǎn)生本發(fā)明的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶和硫酸化脫氧半乳聚糖酯酶以降解硫酸化脫氧半乳聚糖的微生物。
本發(fā)明的硫酸化脫氧半乳聚糖低聚糖是通過使本發(fā)明的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶單獨或與本發(fā)明的硫酸化脫氧半乳聚糖酯酶一起對源自海參的硫酸化脫氧半乳聚糖或含有硫酸化脫氧半乳聚糖的物質(zhì)作用而獲得的低聚糖。它在還原末端具有巖藻糖。例如，硫酸化脫氧半乳聚糖的部分純化制品，源自海參的硫酸化多聚糖級分，使用水溶液獲得的海參的提取物，干海參或未加工海參優(yōu)選用作含有硫酸化脫氧半乳聚糖的物質(zhì)。
為了制備本發(fā)明的硫酸化脫氧半乳聚糖低聚糖，硫酸化脫氧半乳聚糖或含硫酸化脫氧半乳聚糖的物質(zhì)可以根據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行溶解。硫酸化脫氧半乳聚糖或含硫酸化脫氧半乳聚糖的物質(zhì)可以最大的濃度溶解在溶液中。但是，濃度選擇通常要考慮其可操作性，以及反應(yīng)中使用的本發(fā)明的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶或硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶的量。硫酸化脫氧半乳聚糖的溶劑根據(jù)對象可以從水，緩沖液等中選擇。關(guān)于反應(yīng)條件沒有特別限定，只要使所用的酶能顯示其活性。一般，溶液的PH接近中性。酶反應(yīng)通常在大約30℃進(jìn)行?？梢酝ㄟ^調(diào)節(jié)反應(yīng)中使用的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶和硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶的比率或量，反應(yīng)混合物的組成，反應(yīng)時間等等來控制硫酸化脫氧半乳聚糖低聚糖的分子量。本發(fā)明的具有更多的相似分子量或電荷密度分布的硫酸化脫氧半乳聚糖低聚糖可以通過對如上所述獲得的本發(fā)明的硫酸化脫氧半乳聚糖低聚糖使用陰離子交換柱進(jìn)行分子量分餾或分餾來制備。分子量分餾的常規(guī)方法(例如，凝膠過濾或超濾)可以使用?？蛇x擇地，較小的分子可以進(jìn)一步的使用離子交換樹脂處理，活性碳處理或類似的方法進(jìn)行純化，或它們可以被脫鹽，滅菌或凍干。
本發(fā)明的硫酸化脫氧半乳聚糖低聚糖在分子里含有硫酸鹽基團(tuán)，該基團(tuán)與不同的堿形成鹽。本發(fā)明的硫酸化脫氧半乳聚糖低聚糖當(dāng)它們以鹽的形式存在時是穩(wěn)定的。它經(jīng)常以鈉和/或鉀和/或鈣鹽的形式提供。本發(fā)明的以游離形式存在的硫酸化脫氧半乳聚糖低聚糖可以使用陽離子交換樹脂如Dowex 50w從其鹽中分離?？蛇x擇地，它可以進(jìn)行常規(guī)的鹽交換來使其轉(zhuǎn)化為各種預(yù)期鹽的任何一種。
藥學(xué)上可接受的鹽可用作本發(fā)明的硫酸化脫氧半乳聚糖低聚糖的鹽。鹽的例子包括與堿金屬(例如，鈉和鉀)和堿土金屬(例如，鈣，鎂和鋅)以及銨鹽形成的鹽。
本發(fā)明的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶和硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶可用于硫酸化脫氧半乳聚糖的結(jié)構(gòu)分析，因為它們能把硫酸化脫氧半乳聚糖轉(zhuǎn)化為較小的分子。此外，本發(fā)明的硫酸化脫氧半乳聚糖低聚糖還能用作糖工程的反應(yīng)物。例如，可用作糖工程反應(yīng)物的物質(zhì)(例如，它可用作硫酸化脫氧半乳聚糖低聚糖的熒光標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn))可以通過使低聚糖與2-氨基吡啶一起根據(jù)JP-B 5-65108中所述的方法進(jìn)行氨化作用來制備PA-標(biāo)記的低聚糖來提供。另外，本發(fā)明的硫酸化脫氧半乳聚糖低聚糖可用作抗原根據(jù)已知的方法來制備能識別本發(fā)明的硫酸化脫氧半乳聚糖低聚糖的抗體。能識別本發(fā)明的硫酸化脫氧半乳聚糖低聚糖的抗體能用于分析硫酸化多聚糖的結(jié)構(gòu)，而且因此，它是很有用的。
實施例下面的實施例進(jìn)一步詳細(xì)說明了本發(fā)明，但不構(gòu)成對其范圍的限制。
參考實施例1海參來源的硫酸化多聚糖級分的制備35kg的商業(yè)海參的體壁部分被細(xì)微切割，并在勻漿器中以4體積的丙酮處理8000rpm 5分鐘。勻漿然后通過濾紙過濾來獲得濾渣。濾渣然后在勻漿器中用4體積的丙酮處理8000rpm 5分鐘。勻漿然后通過濾紙過濾來獲得濾渣。這樣獲得的濾渣通風(fēng)干燥，獲得1132g海參體壁的丙酮處理的制品。
400g的海參體壁丙酮處理制品懸浮于含有100mM氯化鈉和10mM氯化鈣的10L 30mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH6.5)中，添加2g肌動蛋白酶E到其中，混合物于45℃處理3小時，然后于95℃處理2小時。處理過的混合物過濾通過不銹鋼濾網(wǎng)(孔徑106μm)，添加20g活性碳到得到的濾出液中，混合物于室溫攪動30分鐘。然后離心混合物獲得上清，以10％終濃度添加乙醇到上清中。使用帶有排阻分子量100,000的空心纖維的超濾裝置將混合物濃縮到2L。對濃縮液進(jìn)行離心除去不溶性物質(zhì)。得到的上清使用超濾裝置與含有10％乙醇的100mM氯化鈉進(jìn)行溶劑交換。溶液于4℃或以下冷卻，然后用鹽酸調(diào)節(jié)PH到2.0。離心除去形成的沉淀物以獲得上清。上清的PH用氫氧化鈉調(diào)節(jié)到8.0。上清使用超濾裝置與20mM氯化鈉進(jìn)行溶劑交換。離心從溶液中除去不溶性物質(zhì)。然后上清被凍干獲得37g源自海參的硫酸化多聚糖級分的干產(chǎn)物。
參考實施例2硫酸化脫氧半乳聚糖級分的制備7g參考實施例1中所述的源自海參的硫酸化多聚糖級分的干產(chǎn)物被溶解于含有50mM氯化鈉和10％乙醇的700ml 20mM咪唑-鹽酸緩沖液中(PH7.0)，并離心除去不溶性物質(zhì)。得到的上清上樣到用相同緩沖液平衡過的5-L DEAE-Cellulofine A-800柱中。用相同的緩沖液洗滌后，用50mM到2.05M的氯化鈉梯度溶液進(jìn)行洗脫來收集級分，每個級分含有500ml洗出液。根據(jù)苯酚-硫酸方法和咔唑-硫酸方法分別測定每個級分的總糖含量和糖醛酸含量。收集用0.8到1.5M的氯化鈉洗脫的級分(級分nos.45-57)來獲得硫酸化脫氧半乳聚糖級分。
參考實施例3測定內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶活性的方法15μl硫酸化脫氧半乳聚糖級分1％溶液，75μl 50mM磷酸鈉緩沖液(PH8.5)，9μl 4M氯化鈉，41μl水和10μl本發(fā)明的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶溶液被混合到一起。于37℃反應(yīng)1小時后，反應(yīng)混合物于100℃處理10分鐘。離心混合物獲得的100μl上清使用HPLC進(jìn)行分析，來測定轉(zhuǎn)化為較小分子的程度。作為對照，通過其中用來溶解本發(fā)明的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶的緩沖液用于替代酶溶液的反應(yīng)獲得反應(yīng)混合物，以及通過其中的水用于替代硫酸化脫氧半乳聚糖級分的反應(yīng)獲得的反應(yīng)混合物使用HPLC以類似的方法進(jìn)行分析。
1個單位的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶活性定義為在上述的反應(yīng)系統(tǒng)中在1分鐘內(nèi)斷裂1μmol硫酸化脫氧半乳聚糖巖藻糖鍵所需的酶量。內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶活性根據(jù)下述等式計算
{(15×1000×1/100)/MG}×{(MG/M)-1}×{1/(60×0.01)}＝U/ml15×1000×1/100添加到反應(yīng)系統(tǒng)中的硫酸化脫氧半乳聚糖級分(μg)；MG作為底物的硫酸化脫氧半乳聚糖的平均分子量；M反應(yīng)產(chǎn)物的平均分子量；(MG/M)-11分子硫酸化脫氧半乳聚糖中被酶斷裂的位點數(shù)；60反應(yīng)時間(分鐘)；和0.01酶溶液(ml)的體積。
HPLC如下進(jìn)行。
設(shè)備L-6200(Hitachi)；柱OHpak SB-806HQ(8×300mm；Showa Denko)；洗脫液50mM含有5mM疊氮鈉的氯化鈉；檢測示差折光率檢測器(Shodex RI-71，Showa Denko)；流速1ml/分鐘；和柱溫25℃。
進(jìn)行以下步驟以測定反應(yīng)產(chǎn)物的平均分子量。商業(yè)可獲得的分子量已知的支鏈淀粉在與上述HPLC分析相同的條件下進(jìn)行分析。普魯蘭的分子量與保留時間之間的關(guān)系表示成一種曲線，該曲線用作測定反應(yīng)產(chǎn)物的分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過測定酶溶液在280nm處的吸收來測定蛋白質(zhì)的量。通過定義含有1mg/ml蛋白質(zhì)的溶液的吸收值為1.0來進(jìn)行計算。
參考實施例4測定硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶活性的方法15μl 1％的硫酸化脫氧半乳聚糖級分溶液，75μl 50mM咪唑-鹽酸緩沖液(PH7.0)，6μl 4M氯化鈉，3μl 1M氯化鈣，31μl水和20μl本發(fā)明的硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶溶液被混合在一起。于37℃反應(yīng)1小時后，反應(yīng)混合物于100℃處理10分鐘。使用HPLC對通過離心混合物獲得的100μl上清進(jìn)行分析來測定產(chǎn)生的硫酸的量。作為對照，通過其中用來溶解本發(fā)明的硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶的緩沖液用于代替酶溶液的反應(yīng)獲得的反應(yīng)混合物，以及通過其中水用于代替硫酸化脫氧半乳聚糖級分的反應(yīng)獲得的反應(yīng)混合物使用HPLC以類似的方法進(jìn)行分析。
1個單位的硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶活性定義為在上述反應(yīng)系統(tǒng)中1分鐘內(nèi)產(chǎn)生1μmol硫酸所需的酶量。硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶活性可根據(jù)下面的等式進(jìn)行計算S/(60×0.02)＝U/mlS反應(yīng)產(chǎn)生的硫酸(μmol)；60反應(yīng)時間(分鐘)；和0.02酶溶液的體積(ml)。
HPLC如下進(jìn)行。
設(shè)備L-6200(Hitachi)；柱OHpak SB-804HQ(8×300mm；Showa Denko)；洗脫液50mM含有5mM疊氮鈉的氯化鈉；檢測示差折光率檢測器(Shodex RI-71，Showa Denko)；流速1ml/分鐘；和柱溫35℃。
使用HPLC在同樣的條件下對1mM或0.5mM硫酸鈉進(jìn)行分析來測定作為反應(yīng)的結(jié)果所釋放的硫酸的量。硫酸鈉的濃度與峰高之間的關(guān)系以曲線圖表示，該曲線圖用作測定釋放的硫酸的量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
實施例1內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶的制備(1)Fucoidanobacter marinus SI-0098接種到5ml已經(jīng)于120℃高壓滅菌20分鐘的由含有如參考實施例1中所述制備的源自海參的硫酸化多聚糖級分的人造海水和蛋白胨組成的培養(yǎng)基(JamarineLaboratory)(PH8.2)中，其濃度分別為0.3％和1％，并于25℃培養(yǎng)2天。150μl的培養(yǎng)物被接種到100ml含有相同組分的培養(yǎng)基中，并于25℃培養(yǎng)3天。每個都裝有600ml含有相同組分的培養(yǎng)基和濃度為0.01％的消泡劑(KM70，Shin-EtsuChemical)的7個2-L錐形燒瓶于120℃高壓滅菌20分鐘。接種1ml培養(yǎng)物到每個培養(yǎng)基中，并于25℃培養(yǎng)3天。培養(yǎng)后，離心培養(yǎng)物獲得細(xì)胞和培養(yǎng)物上清。重復(fù)同樣的培養(yǎng)步驟，從12.6L培養(yǎng)物中獲得大約15g濕細(xì)胞。
細(xì)胞懸浮于200ml含有100mM氯化鈉和5mMβ-巰基乙醇的10mM咪唑-鹽酸緩沖液(PH7.5)中，通過超聲處理進(jìn)行裂解，并離心獲得上清。上清用相同緩沖液進(jìn)行充分透析，并離心獲得上清。
上清上樣到用相同緩沖液平衡過的500-ml DEAE-CellulofineA-800柱上。用相同緩沖液洗滌后，用100到500mM的氯化鈉梯度溶液進(jìn)行洗脫來收集級分，每個級分含有45ml洗出液。測定各個級分的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶活性并收集具有活性的級分。
用含有50mM氯化鈉和5mMβ-巰基乙醇的10mM咪唑-鹽酸緩沖液(PH7.5)對活性級分進(jìn)行充分透析以進(jìn)行溶劑交換。酶溶液上樣到用相同緩沖液平衡過的150-ml DEAE-Cellulofine A-800柱上。用相同的緩沖液洗滌后，用50到400mM的氯化鈉梯度溶液進(jìn)行洗脫來收集級分，每個級分含有20ml洗出液。測定各個級分的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶活性并收集具有活性的級分。
用含有50mM氯化鈉和5mMβ-巰基乙醇的10mM咪唑-鹽酸緩沖液(PH7.5)對活性級分進(jìn)行充分透析以進(jìn)行溶劑交換。酶溶液上樣到用相同緩沖液平衡過的80-ml硫酸化的Cellulofine A-800柱上。用相同的緩沖液洗滌后，用50到1500mM的氯化鈉梯度溶液進(jìn)行洗脫來收集每個含有5ml洗出液的級分。測定各個級分的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶活性并收集具有活性的級分。
用含有100mM氯化鈉和5mMβ-巰基乙醇的10mM咪唑-鹽酸緩沖液(PH7.5)對活性級分進(jìn)行充分透析，接著用含有150mM氯化鈉和5mMβ-巰基乙醇的磷酸鉀緩沖液進(jìn)行溶劑交換。酶溶液上樣到用相同緩沖液平衡過的40-ml羥磷灰石柱(Wako Pure ChemicalIndustries)上。用相同的緩沖液洗滌后，用40到250mM的磷酸鉀梯度溶液進(jìn)行洗脫來收集每個含有6ml洗出液的級分。測定各個級分的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶活性并收集具有活性的級分。
用含有100mM氯化鈉和5mMβ-巰基乙醇的10mM咪唑-鹽酸緩沖液(PH7.5)對活性級分進(jìn)行充分透析以進(jìn)行溶劑交換。酶溶液上樣到用同樣的緩沖液平衡過的1520-ml聚丙烯酰胺葡聚糖S-200柱(4.4×100cm，Pharmacia)上。用相同的緩沖液進(jìn)行洗脫來收集每個含有13.5ml洗出液的級分。測定各個級分的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶活性。
從而，獲得了本發(fā)明的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶的純化制品。測定了本發(fā)明的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶的分子量為大約32,000(分布狀態(tài)20,000到40,000，根據(jù)在聚丙烯酰胺葡聚糖S-200上凝膠過濾洗脫中的位置)或42,000(分布狀態(tài)30,000到50,000，根據(jù)其在電泳中的遷移率)。
純化步驟總結(jié)于下面的表1。
表1

實施例2內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶的制備(2)Fucoidanobacter marinus SI-0098如實施例所述的進(jìn)行培養(yǎng)，從4.2L培養(yǎng)物獲得大約6g濕細(xì)胞。
細(xì)胞懸浮于50ml含有50mM氯化鈉的10mM磷酸鈉緩沖液(PH7.5)中，通過超聲處理進(jìn)行裂解，并離心獲得上清。上清用相同緩沖液進(jìn)行充分透析，離心獲得上清。
上清上樣到用相同緩沖液平衡過的300-ml DEAE-CellulofineA-800柱上。用相同緩沖液洗滌后，用50到500mM的氯化鈉梯度溶液進(jìn)行洗脫來收集級分，每個級分含有25ml洗出液。測定各個級分的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶活性并收集具有活性的級分。
用含有100mM氯化鈉的磷酸鈉緩沖液(PH7.5)對活性級分進(jìn)行充分透析以進(jìn)行溶劑交換。酶溶液上樣到用同樣緩沖液平衡過的50-ml DEAE-Cellulofine A-800柱上。用相同的緩沖液洗滌后，用100到400mM的氯化鈉梯度溶液進(jìn)行洗脫來收集每個含有10ml洗出液的級分。測定各個級分的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶活性并收集具有活性的級分。
用含有50mM氯化鈉的50mM磷酸鉀緩沖液(PH7.5)對活性級分進(jìn)行充分透析以進(jìn)行溶劑交換。酶溶液上樣到用相同緩沖液平衡過的20-ml羥磷灰石柱上。用相同的緩沖液洗滌后，用50到200mM的磷酸鉀梯度溶液進(jìn)行洗脫來收集每個含有10ml洗出液的級分。測定各個級分的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶活性并收集具有活性的級分。
活性級分上樣到用含有100mM氯化鈉和5mM疊氮鈉的10mM咪唑-鹽酸緩沖液平衡過的1520-ml聚丙烯酰胺葡聚糖S-200柱(4.4×100cm，Pharmacia)上。用相同的緩沖液洗滌后，收集每個含有13.5ml洗出液的級分。測定各個級分的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶活性。
從而，獲得本發(fā)明的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶的純化制品。
純化步驟總結(jié)如下表2。
表2

對本發(fā)明的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶純化制品的最適pH，溫度和鹽濃度進(jìn)行了研究。結(jié)果分別如圖1，2和3所示。
實施例3使用內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶制備硫酸化脫氧半乳聚糖低聚糖如參考實施例2中所述的1.5g硫酸化脫氧半乳聚糖級分溶解于135ml含有250mM氯化鈉的50mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH8.2)中。添加144mU(15ml)的本發(fā)明的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶到其中?；旌衔镉?0℃搖動培養(yǎng)4天。每份由50ml混合物組成的3等份于1100-ml Cellulofine GCL-1000(4×87cm，Seikagaku Corporation)上進(jìn)行凝膠過濾從而進(jìn)行分子量分餾。根據(jù)苯酚-硫酸法測定每個洗脫級分的總糖含量。作為結(jié)果，觀察到了如圖7所示的分布狀態(tài)。圖7中，縱軸表示根據(jù)苯酚-硫酸法基于顯色觀察到的在480nm處的吸收，橫軸表示級分號。從而，在分子量大約為40,000的分布狀態(tài)的級分nos.50-75周圍洗脫到了本發(fā)明的硫酸化脫氧半乳聚糖低聚糖。分析低聚糖的糖組成以及還原末端的糖類。作為結(jié)果，發(fā)現(xiàn)基本上全部有巖藻糖。
本發(fā)明的具有不同分子量的硫酸化脫氧半乳聚糖低聚糖能通過使本發(fā)明的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶對源自海參的硫酸化脫氧半乳聚糖級分作用來制備。
實施例4硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶當(dāng)如實施例1或2所述制備的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶單獨使用時，不可能把源自海參的硫酸化脫氧半乳聚糖轉(zhuǎn)化成比實施例3所述的分子量分布狀態(tài)更小的分子。然后，觀察到與本發(fā)明的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶共同存在的級分能把源自海參的硫酸化脫氧半乳聚糖級分轉(zhuǎn)化成較小的分子。結(jié)果，在實施例1中用大約600mM氯化鈉從硫酸化Cellulofine柱洗脫的級分中發(fā)現(xiàn)了本發(fā)明的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶具有激活硫酸化脫氧半乳聚糖轉(zhuǎn)化成較小分子的活性。然后，使級分對源自海參的硫酸化脫氧半乳聚糖作用，并對在反應(yīng)混合物中產(chǎn)生的物質(zhì)進(jìn)行了檢測。首先，根據(jù)參考實施例4中所述的方法使用HPLC分析了反應(yīng)混合物，并觀察到了硫酸的產(chǎn)生。接著，根據(jù)苯酚-硫酸法測定了在Cellulofine GCL-25柱(4×90cm)上通過反應(yīng)混合物的凝膠過濾洗脫出來的每個級分的總糖量以檢測是否產(chǎn)生了含有較小分子的糖的組分。結(jié)果，沒有發(fā)現(xiàn)含有較小分子的糖的組分的產(chǎn)生?；谝陨纤觯瑥?qiáng)烈說明能通過本發(fā)明的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶激活硫酸化脫氧半乳聚糖轉(zhuǎn)化成較小分子的酶為硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶。然后，對根據(jù)參考實施例4中所述的方法測定了其活性的硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶進(jìn)行純化。
特定的，收集實施例1中用大約600mM氯化鈉從硫酸化Cellulofine洗脫出來的本發(fā)明硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶的活性級分，并上樣于用含有100mM氯化鈉，5mM疊氮鈉和5mMβ-巰基乙醇的10mM咪唑-鹽酸緩沖液平衡過的1520-ml聚丙烯酰胺葡聚糖S-200柱上。用相同的緩沖液進(jìn)行洗脫來收集級分，每個級分含有13.5ml洗出液。根據(jù)洗出液的位置，測定出本發(fā)明的硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶的分子量為大約84,000(分布狀態(tài)70,000到100,000)。
研究了本發(fā)明硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶的純化制品的最適pH，溫度和鹽濃度。結(jié)果分別如圖4，5和6所示。
實施例5鈉鹽濃度的影響對本發(fā)明的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶或硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶的相對活性與反應(yīng)系統(tǒng)中所含的氯化鈉的濃度之間的關(guān)系進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶和硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶被氯化鈉激活。
實施例6鈣鹽濃度的影響對本發(fā)明的硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶的相對活性與反應(yīng)系統(tǒng)中所含的氯化鈣的濃度之間的關(guān)系進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶被氯化鈣激活。發(fā)現(xiàn)使用醋酸鈣有相似的激活。
實施例7使用內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶和硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶制備硫酸化脫氧半乳聚糖低聚糖150μl 50mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH7.0)，14μl 4M氯化鈉，6μl 1M氯化鈣和64μl水與30μl參考實施例2中所述的源自海參的硫酸化脫氧半乳聚糖級分的1％水溶液進(jìn)行混合。添加424μU(16μ1)的本發(fā)明內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶和226μU(20μl)的本發(fā)明硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶到其中?；旌衔镉?0℃反應(yīng)2天。根據(jù)參考實施例4所述的方法使用HPLC對100μl反應(yīng)混合物進(jìn)行分析。結(jié)果如圖8所示。圖8中，縱軸表示示差折光率的相對強(qiáng)度，橫軸表示保留時間。產(chǎn)生的本發(fā)明的硫酸化脫氧半乳聚糖低聚糖分布于對應(yīng)分子量為大約9,000的7到10分鐘的位置。從而，可以獲得明顯比實施例3中所述的低聚糖小的低聚糖。對低聚糖進(jìn)行糖組成和還原末端的糖類分析。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)基本上全部有巖藻糖。
因此，本發(fā)明的具有不同分子量的硫酸化脫氧半乳聚糖低聚糖可以通過使本發(fā)明的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶和硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶作用于源自海參的硫酸化脫氧半乳聚糖級分來制備。
工業(yè)實用性本發(fā)明提供了一種新的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶和一種新的硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶，其能用于源自海參的硫酸化脫氧半乳聚糖的結(jié)構(gòu)分析或來自源自海參的硫酸化脫氧半乳聚糖的較小分子的可重復(fù)制備。本發(fā)明還提供了制備該酶的方法。更進(jìn)一步的，可使用該酶提供可用作糖工程的反應(yīng)物的具有不同分子量的源自海參的硫酸化脫氧半乳聚糖低聚糖。此外，還提供了使該酶有效利用的添加劑。
序列表<110>TAKARA BIO INC.
<120>分解源自海參的硫酸化脫氧半乳聚糖的酶<130>663848<150>JP 2002-180490<151>2002-06-20<150>JP 2002-239843<151>2002-08-20<160>1<210>1<211>1521<212>DNA<213>Fucoidanobacter marinuw SI-0098<400>1agagtttgat cctggctcag aatgaacgct ggcggcgtgg ttcagacatg caagtcgaac 60gggattgtct agttagcttg ctaattagac atgagagtgg cgaacgggtg cgtaacacgt 120aaagaaccta cccttatgtg ggggatagct caccgaangg tgaattaata ccgcatgtgg 180tctctcttca catgaagagt acactnaagc tggggacctt cgggcctggc gcatagggag 240ggctttgcgg cctatcagct tgttggtgag gtaacggctc accaaggcaa agacnggtag 300ctggtctgag aagatgatca gccacactgg aacttagaca cggtccagac acctacgggt 360ggcagcagtt tcgaatcttt cacaatgggc gaaagcctga tggagcaacg ccgcgtgggg 420gatgaaggcc ttcgggttgt aaacccctgt caccaaggat aaaacgtaat ctattaatac 480taggttgcct gatgtaactt ggagaggaag gagtggctaa ctctgtgcca gcagccgcgg 540taatacagag actccaagcg ttattcggat tcactgggcg taaagggagc gcaggcggcc 600agatgtgtca gaggtgaaat accgcagctt aactgtagaa ctgcctttga aactatctgg 660ctagagtatc ggagaggtaa gcggaattcc aggtgtagca gtgaaatgcg tagatatctg 720gaggaacacc aatggcgaag gcagcttact ggacgattac tgacgctcag gctcgaaagc 780atggggagcg aaagggatta gatacccctg tagtccatgc cgtaaacgtt gttcactagg 840tatcgggaca ttcgaccgtc tcggtgctca agctaacgcg ataagtgaac cgcctgagga 900ctacggccgc aaggctaaaa ctcaaaggaa ttgacgggag cctgcacaag cggtggagca 960tgtggcttaa ttcgatgcaa cgcgaagaac cttacctagg cttgacatgc agtggaccgg 1020ggcagagatg ccctttctct tcggagccgc tgcacaggtg ctgcatggct gtcgtcagct 1080cgtgtcgtga gatgtttggt taagtccagc aacgagcgca acccctgcca ctagttgcca 1140gcattaagtt ggggactcta gtgggacaaa ctctctctga gagtgggaag gtggggacga 1200cgtcaagtca gtatggccct tacgtctagg gctgcacacg tgctacaatg cccggtacag 1260agggacgcga taccgcgagg tggagcaaat ccttaaagcc gggcccagtt cagattggag 1320
tctgcaactc gactccatga agttggaatc gctagtaatg gcgcatcagc tatggcgccg 1380tgaatacgtt cccaggcctt gtacacaccg cccgtcacgt tatggaagcc ggttttgccc 1440gaagtatgtt agctaacccg caagggaggc gatgtcctaa ggtgaggctg gtaactggaa 1500cgaagtcgta acaaggtagc c152權(quán)利要求
1.具有下述物理和化學(xué)特性的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶(I)作用于源自海參的硫酸化脫氧半乳聚糖從而水解α-L-巖藻糖基鍵并把硫酸化脫氧半乳聚糖轉(zhuǎn)化成較小的分子；(II)最適pH為大約7到9；和(III)最適溫度為大約25到45℃。
2.制備權(quán)利要求1所定義的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶的方法，該方法包括培養(yǎng)能制備權(quán)利要求1所定義的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶的Fucoidanobacter屬細(xì)菌，并從培養(yǎng)物中收集酶。
3.一種具有下述物理和化學(xué)特性的硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶(I)作用于源自海參的硫酸化脫氧半乳聚糖從而水解硫酸酯鍵，釋放硫酸，并與用權(quán)利要求1所定義的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶單獨作用所獲得的轉(zhuǎn)化相比，其促進(jìn)在權(quán)利要求1所定義的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶的存在下源自海參的硫酸化脫氧半乳聚糖轉(zhuǎn)化成較小的分子；(II)最適pH為大約6到8；和(III)最適溫度為大約20到45℃。
4.一種制備權(quán)利要求3所定義的硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶的方法，該方法包括培養(yǎng)能制備權(quán)利要求3所定義的硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶的Fucoidanobacter屬細(xì)菌，并從培養(yǎng)物中收集該酶。
5.一種制備硫酸化脫氧半乳聚糖低聚糖的方法，該方法包括使權(quán)利要求1所定義的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶對硫酸化脫氧半乳聚糖作用，并從反應(yīng)中獲得硫酸化脫氧半乳聚糖低聚糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶可以在氯化鈉的存在下起作用。
7.硫酸化脫氧半乳聚糖低聚糖，其可通過權(quán)利要求5所定義的方法獲得。
8.一種制備硫酸化脫氧半乳聚糖低聚糖的方法，該方法包括使權(quán)利要求1所定義的內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶和權(quán)利要求3所定義的硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶對硫酸化脫氧半乳聚糖作用，并從反應(yīng)中獲得硫酸化脫氧半乳聚糖低聚糖。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中內(nèi)型α-L-巖藻糖苷酶和硫酸化脫氧半乳聚糖硫酸酯酶可以在氯化鈉和/或鈣離子的存在下起作用。
10.硫酸化脫氧半乳聚糖低聚糖，其可通過權(quán)利要求8所定義的方法獲得。
全文摘要
能分解源自海參的硫酸化脫氧半乳聚糖的硫酸化脫氧半乳聚糖裂解酶；制備該酶的方法；通過使該酶對硫酸化脫氧半乳聚糖作用所獲得的小分子化合物；制備該化合物的方法；和硫酸化脫氧半乳聚糖裂解酶的激活因子。
文檔編號C12N9/88GK1662648SQ0381432
公開日2005年8月31日 申請日期2003年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月20日
發(fā)明者酒井武, 石塚久美子, 加藤郁之進(jìn) 申請人:寶生物工程株式會社