專利名稱：具有催淚成分合成酶活性的蛋白質(zhì)或多肽、編碼該蛋白質(zhì)或多肽的 DNA、利用該 DNA制造 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及表現(xiàn)出使與粉碎或切洋蔥等植物時(shí)發(fā)生的催淚成分的生成有關(guān)的1-丙烯次磺酸轉(zhuǎn)變?yōu)榇邷I成分的作用的蛋白質(zhì)或多肽、編碼該蛋白質(zhì)或多肽的DNA(催淚成分合成酶基因)。
本發(fā)明的催淚成分合成酶基因可用于例如，控制催淚成分的生成、在使破碎或切斷時(shí)發(fā)生的催淚成分的量減少的植物的開發(fā)中作為材料或交配物等的篩選指標(biāo)使用、提供用于抑制該酶表達(dá)量的信息，實(shí)現(xiàn)大量生產(chǎn)該酶、大量生產(chǎn)催淚成分等。
在本說明書中、“催淚成分”指的是Lachrymatory Factor(以下、記為LF)，具體來說，是硫代丙醛-S-氧化物。而所謂具有催淚成分合成酶活性與表現(xiàn)出將催淚成分合成酶的推定底物反-1-丙烯次磺酸轉(zhuǎn)變?yōu)榇邷I成分的作用，或在蒜氨酸酶存在下具有由存在于洋蔥等的反-S-1-丙烯基-半胱氨酸亞砜(PeCSO)生成催淚成分的作用是同義的。
背景技術(shù)：
關(guān)于粉碎或切斷洋蔥時(shí)發(fā)生的催淚成分，到目前為止已報(bào)道了許多研究成果，有關(guān)存在于洋蔥等的催淚成分(Lachrymatory FactorLF)的形成及其的分解，人們一直認(rèn)為是S-1-丙烯基-半胱氨酸亞砜(PeCSO)被蒜氨酸酶一分解，就生成催淚成分。即認(rèn)為蒜氨酸酶作用于上述前體物質(zhì)PeCSO，經(jīng)1-丙烯次磺酸不經(jīng)酶反應(yīng)就轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的催淚成分。
然而，根據(jù)本發(fā)明人的研究，PeCSO只是被蒜氨酸酶分解，并不產(chǎn)生催淚成分，判明必須有其它酶(催淚成分合成酶)參與。因此，本發(fā)明人等不斷進(jìn)行深入研究，發(fā)現(xiàn)存在一種新酶(催淚成分合成酶)，該酶可使上述次磺酸異構(gòu)化后生成催淚成分，由此可知，上述前駆物質(zhì)通過該酶的某種作用變成了催淚成分或與此不同的別的風(fēng)味成分。另外，在對該催淚成分合成酶(催淚性物質(zhì)合成酶)的制造方法進(jìn)行開發(fā)的同時(shí)，也弄清了催淚成分合成酶的理化性質(zhì)，提出了專利申請(特開平10-295373號公報(bào))。
另外，本發(fā)明人等為了闡明在蒜氨酸酶存在下，具有由存在于洋蔥等中的PeCSO生成催淚成分的作用的催淚成分合成酶的構(gòu)造為目標(biāo)，不斷進(jìn)行深入研究，結(jié)果在催淚成分合成酶的多個(gè)同功酶、其氨基酸序列以及編碼來自洋蔥的該酶的基因序列的闡明中獲得成功，提出了專利申請(國際公開第02/20808號公報(bào))。
這樣的催淚成分合成酶通常也存在于蔥屬(Allium蔥屬)植物，編碼該酶的DNA信息在這些植物等品種開發(fā)中可用于基因重組或變異的誘導(dǎo)或交配等，可以在即使粉碎或切斷時(shí)也難于產(chǎn)生催淚成分的植物的制作等中起作用。另外在生理活性物質(zhì)硫代亞磺酸鹽(thiosulfinates)乃至其反應(yīng)物的生成量增大的植物制作等中也起到作用。
另外，如果利用編碼具有催淚成分合成酶活性的蛋白質(zhì)的DNA信息，可以通過基因重組技術(shù)大量生產(chǎn)該酶，例如，在有效制造在淚缺乏癥(干眼癥)等治療有作用的催淚成分的技術(shù)開發(fā)中也有用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供催淚成分合成酶基因、特別是蔥屬植物中含有的催淚成分合成酶基因。
另外，本發(fā)明的目的在于提供具有催淚成分合成酶活性的蛋白質(zhì)或多肽、特別是蔥屬植物中含有的具有催淚成分合成酶活性的蛋白質(zhì)或多肽。
此外，本發(fā)明的目的在于提供通過基因重組技術(shù)實(shí)現(xiàn)更有效地制造出催淚成分合成酶的同功酶的方法。
另一個(gè)目的是提供實(shí)現(xiàn)對由催淚成分的前體物質(zhì)生成催淚成分的酶基因的表達(dá)進(jìn)行抑制的手段。
用于達(dá)到上述目的的本發(fā)明由以下技術(shù)手段構(gòu)成。
(1)編碼表現(xiàn)出使1-丙烯次磺酸轉(zhuǎn)變?yōu)榇邷I成分的作用的蛋白質(zhì)或多肽的DNA。
(2)上述DNA是由序列1、5、7、9、13或15所示堿基序列構(gòu)成的或由以下(a)～(c)中任一個(gè)構(gòu)成的DNA。
(a)由在序列1、5、7、9、13或15所示堿基序列中付加、缺失、或置換1或多個(gè)堿基后的堿基序列構(gòu)成的DNA。
(b)在嚴(yán)格條件下，可與由序列1、5、7、9、13或15所示堿基序列構(gòu)成的DNA進(jìn)行雜交的DNA。
(c)由與序列1、5、7、9、13或15所示堿基序列的同源性在60％以上的堿基序列構(gòu)成的DNA。
(3)序列25所示的用于屬于蔥屬植物的催淚成分合成酶基因的分離所使用的引物以及使用該引物分離該基因的方法。
(4)含有上述DNA的重組載體。
(5)包含含有上述DNA的重組載體的轉(zhuǎn)化體。
(6)具有催淚成分合成酶活性的蛋白質(zhì)或多肽的制造方法，其特征是對用含有上述DNA重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，然后對產(chǎn)生在培養(yǎng)基中或細(xì)胞中的具有催淚成分合成酶活性的蛋白質(zhì)或多肽進(jìn)行分離。
(7)具有催淚成分合成酶活性的蛋白質(zhì)或多肽，包含以下任一個(gè)序列(a)序列2、6、8、10、14或16所示的氨基酸序列、(b)在序列2、6、8、10、14或16所示的氨基酸序列中付加、缺失或置換1或多個(gè)氨基酸后的氨基酸序列、或
(c)與序列2、6、8、10、14或16所示氨基酸序列的同源性在65％以上的氨基酸序列。
(8)具有抑制mRNA翻譯的功能的核酸分子，該mRNA是具有催淚成分合成酶活性的蛋白質(zhì)或多肽的mRNA。
另外，在本發(fā)明中，關(guān)于以上的技術(shù)手段，包括DNA是除去由序列11所示堿基序列構(gòu)成的DNA的情形。
另外，在本發(fā)明中，關(guān)于以上技術(shù)手段，包括DNA是除去編碼含有序列12所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)或多肽的DNA的情形。
另外，在本發(fā)明中，關(guān)于以上技術(shù)手段，包括蛋白質(zhì)或多肽是除去含有序列12所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或多肽的情形。
在本發(fā)明中，提取蔥屬植物的總RNA，以該總RNA中含有的mRNA為模板通過RT-PCR法合成cDNA，以國際公開第02/20808號公報(bào)中已經(jīng)得到的編碼洋蔥催淚成分合成酶蛋白質(zhì)或多肽的DNA(序列11)堿基序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)引物，以上述cDNA為模板，通過PCR法有選擇地合成催淚成分合成酶基因。另外，對于通過以來自上述洋蔥的堿基序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的引物不能有選擇地合成催淚成分合成酶基因的蔥屬植物，設(shè)計(jì)對其分離有效的其它引物，同樣有選擇地合成該基因。
由PeCSO的蒜氨酸酶的分解物使催淚成分(硫代丙醛-S-氧化物)生成的催淚成分合成酶是與植物風(fēng)味改質(zhì)或加工適應(yīng)性提高有關(guān)的重要的成分。因此，在催淚成分合成酶的生產(chǎn)和植物育種領(lǐng)域中，該催淚成分合成酶基因的確定極其有意義。
作為獲得催淚成分合成酶基因的序列的具體方法，例如以下的方法。
(1)(總RNA的提取、cDNA的合成)由各蔥屬植物的總RNA合成cDNA。用于該目的方法只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任一方法都可以，例如、在下面敘述的實(shí)施例中采用使用RNeasy Plant Mini試劑盒(QIAGEN Cat.no.74903)提取總RNA，使用Ready-To-Go T-Primed First-Strand試劑盒(AmerchamBiosciences code no.27-9263-01)合成cDNA的方法。
(2)(RACE法)通過使用一個(gè)以上含有洋蔥催淚成分合成酶基因3′側(cè)區(qū)域的序列的引物，對該蔥屬植物催淚成分合成酶基因的3′側(cè)區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用一個(gè)以上含有洋蔥催淚成分合成酶基因5′側(cè)區(qū)域序列的引物，對該蔥屬植物催淚成分合成酶基因5′側(cè)區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以確定蔥屬植物的催淚成分合成酶基因序列。作為含有上述洋蔥催淚成分合成酶基因3′側(cè)區(qū)域的序列的引物，如序列17所示寡核苷酸，作為含有上述洋蔥催淚成分合成酶基因5′側(cè)區(qū)域的序列的引物，如序列19所示的寡核苷酸，但不限定于這些。
(3)(TA克隆法)對于韭蔥(A.ampeloprasum L.)，只從來自洋蔥催淚成分合成酶基因序列的信息不能得到RACE產(chǎn)物。因此，需要洋蔥、野薤、大蔥3種催淚成分合成酶基因中均序列保守的區(qū)域，通過在有義引物中使用以該序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的引物E2/uni/f/298(序列25)，初次實(shí)現(xiàn)對該cDNA的3′側(cè)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增成為可能。上述引物可以作為通用引物，在屬于蔥屬植物的催淚成分合成酶基因的分離中使用(圖5給出了通用引物的區(qū)域)。
另外，使用由洋蔥序列設(shè)計(jì)的引物不能得到擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)果在5′RACE中也同樣。因此，通過由使用上述E2/uni/f/298得到的韭蔥3′RACE產(chǎn)物的堿基序列設(shè)計(jì)引物E2/r/580-Le(序列28)，用作5′RACE法的反義引物，初次實(shí)現(xiàn)對該cDNA的5′側(cè)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增成為可能。
另外，通過使用上述3′側(cè)區(qū)域的引物E2/uni/f/298，能夠確定韭蔥催淚成分合成酶基因的cDNA全長序列這一點(diǎn)是新的認(rèn)識(shí)。
本發(fā)明催淚成分合成酶基因是編碼表現(xiàn)出將1-丙烯次磺酸轉(zhuǎn)變?yōu)榇邷I成分的作用的蛋白質(zhì)或多肽的DNA。
作為具有催化使催淚成分前體物質(zhì)PeCSO轉(zhuǎn)變?yōu)榇邷I成分的反應(yīng)的性能的蛋白質(zhì)，如有蒜氨酸酶和催淚成分合成酶。這些酶存在于由于切斷等物理損傷而生成催淚成分的蔥屬植物洋蔥、大蔥、野薤、韭蔥、亞實(shí)基隆蔥(échalot)、大頭蒜、細(xì)香蔥等植物中。作為催淚成分合成酶基因如序列1的來自大蔥的DNA、序列5的來自野薤的DNA、序列7的來自亞實(shí)基隆蔥的DNA、序列9、13的來自韭蔥的DNA、序列11的來自洋蔥的DNA、序列15的來自大頭蒜的DNA，但不限定于這些。也可以是在上述各個(gè)堿基序列中付加、缺失、或置換1或多個(gè)堿基后的DNA。例如，即使是編碼在對應(yīng)于上述各個(gè)DNA的序列2、6、8、10、12、14以及16所示的氨基酸序列中付加、缺失、或置換1或多個(gè)氨基酸后表現(xiàn)出使1-丙烯次磺酸轉(zhuǎn)變?yōu)榇邷I成分作用的蛋白質(zhì)或多肽的DNA也可以。
一般都知道在氨基酸序列中，對其功能沒有影響的差別可以存在于株間或近緣種間等，在這些序列間，可觀察到90％以上、或95％以上的氨基酸是一致的。該值通常相當(dāng)于每100個(gè)氨基酸個(gè)有10個(gè)以下或5個(gè)以下氨基酸變異(付加、缺失、置換)。
另外，在本發(fā)明的催淚成分純化酶蛋白質(zhì)中，確定了蔥屬數(shù)種植物的催淚成分純化酶基因的序列，由其推定氨基酸序列結(jié)果表明即使每100個(gè)氨基酸中存在相當(dāng)于35個(gè)的變異，也具有催淚成分純化酶活性，可以容許到氨基酸序列的35％變異。
另外，催淚成分合成酶基因是可與例如上述序列1、5、7、9、13或15所示堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交的DNA。而上述可進(jìn)行雜交的DNA中既包括與各序列所示堿基序列的DNA雜交的DNA，也包括與其互補(bǔ)的DNA。換言之，是由與上述序列1、5、7、9、13或15所示堿基序列的同源性在60％以上、更好的是在70％以上、最好是在75％以上的堿基序列構(gòu)成的DNA。
(堿基序列的雜交條件)本發(fā)明中所謂“嚴(yán)格條件”是指序列1、5、7、9、13、15所示的堿基序列或其一部分與DNA進(jìn)行特異性雜交，而且不會(huì)形成·檢測到非特異性的雜化體形成的條件。明確將嚴(yán)格條件數(shù)值化是困難的，如果舉一例的話，在使用42℃、30％(v/v)去離子化甲酰胺、0.6M的NaCl、0.04M的NaH2PO4、2.5mM的EDTA、7％的SDS組成的雜交緩沖液的雜交條件下形成雜化體，即使進(jìn)一步用2×SSC、0.1％的SDS清洗也能維持雜化體的條件。有關(guān)核酸的雜交可以參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊》Molecular CloningA laboratory manual(1989)ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York，USA等。
(堿基序列的同源性)堿基序列的同源性象以下那樣進(jìn)行判定。在對序列間的堿基的同源性進(jìn)行判定的前段階進(jìn)行堿基序列的比對使用日本DNA數(shù)據(jù)庫的Internet解析服務(wù)的CLUSTAL W 1.81 DDBJ擴(kuò)展版(算法源于Gene 73，(1988)237-244。CLUSTAL W by DDBJ)(http://www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/homology.html)。解析參數(shù)直接缺省進(jìn)行(gapdist8、maxdiv40、gapopen15、gapext6.66)。使用得到的比對結(jié)果，通過計(jì)算ORF內(nèi)一致的堿基數(shù)的對ORF總堿基數(shù)(除去由于比對產(chǎn)生的gap區(qū)域)的百分率，算出ORF內(nèi)堿基的同源性。


圖1給出了有關(guān)序列1、3、5、7、9、11、13以及15所示的堿基序列間的堿基序列同源性。其結(jié)果表明，堿基序列的同源性在序列15(大頭蒜)和序列13(韭蔥)間最低，為78.5％。這樣一來，催淚成分合成酶基因的堿基序列相互間堿基同源性高，形成一個(gè)家族。而序列3的DNA與序列1的DNA之間表現(xiàn)出99.8％的高同源性，是來自大蔥的DNA。另外關(guān)于序列1、3、5、7、9、11、13以及15所示的任一個(gè)催淚成分合成酶基因的堿基序列利用來自BLAST檢索(算法，J.Mol.Biol.Vol.215，(1990)pp.403-410。直接使用解析參數(shù)缺省設(shè)定(Expect10、Word size11、Low complexity filterON))，對登錄GenBank的基因序列進(jìn)行同源性檢索，在上述催淚成分合成酶基因以外沒有找到表現(xiàn)出高同源性的基因序列(對擬南芥或果蠅、人的基因序列數(shù)據(jù)的一部分有4％左右的堿基同源性)。由此可知催淚成分合成酶基因的堿基序列是與至今為止報(bào)道的所有的基因序列沒有親緣關(guān)系的完全不同的序列。
而具有催淚成分合成酶活性的蛋白質(zhì)或多肽是含有與例如序列2、6、8、10、14或16所示氨基酸序列的同源性為65％以上的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或多肽。
(氨基酸序列的同源性)氨基酸序列的同源性象以下那樣進(jìn)行判定。在對序列間的氨基酸的同源性進(jìn)行判定的前段階進(jìn)行的氨基酸序列的比對使用日本DNA數(shù)據(jù)庫(DNA data bank of Japan，DDBJ)的Internet解析服務(wù)的CLUSTAL W 1.81 DDBJ擴(kuò)展版(算法源于Gene 73，(1988)237-244。CLUSTAL W by DDBJ)(http://www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/homology.html)。解析參數(shù)直接缺省進(jìn)行(gapdist8、maxdiv40、gapopen10、gapext0.2)。使用得到的比對結(jié)果，通過計(jì)算一致的氨基酸數(shù)對總氨基酸數(shù)(除去由于比對產(chǎn)生的gap區(qū)域)的百分率，算出氨基酸的同源性。
圖2給出了有關(guān)序列2、4、6、8、10、12、14以及16所示各個(gè)推定氨基酸序列間的各個(gè)推定氨基酸序列間的同源性。其結(jié)果表明，推定氨基酸序列的同源性，序列16(大頭蒜)和序列10(韭蔥)間最低，為65.9％。這樣一來，催淚成分合成酶蛋白質(zhì)等氨基酸序列相互間同源性高，形成一個(gè)家族。而序列4的氨基酸序列是對應(yīng)于上述序列3的來自大蔥DNA的氨基酸序列。
另外，有關(guān)序列2、4、6、8、10、12、14以及16所示的任一個(gè)催淚成分合成酶基因的推定氨基酸序列來自BLAST檢索(算法源于J.Mol.Biol.Vol.215，(1990)pp.403-410。直接使用解析參數(shù)缺省設(shè)定(Expect10、Word size3、Low complexity filterON))，對登錄在GenBank的氨基酸序列進(jìn)行同源性檢索，除了催淚成分合成酶基因的推定氨基酸序列之間以外，即使是表現(xiàn)出最高同源性的氨基酸序列同源性也是35％以下的同源性(擬南芥和水稻(イネ)的功能不明基因的推定氨基酸序列)。由此可知催淚成分合成酶基因的推定氨基酸序列是與到目前為止報(bào)道的所有氨基酸序列沒有高的親緣關(guān)系、差異很大的序列。
通常在編碼具有特定功能或生理活性的蛋白質(zhì)或多肽的氨基酸序列中，即使是付加、缺失、或置換1個(gè)或多個(gè)氨基酸，有時(shí)也能維持其功能或生理活性的現(xiàn)象，本領(lǐng)域技術(shù)人員都廣泛認(rèn)識(shí)到。本發(fā)明也包括編碼加上這樣的修飾、而且具有催淚成分合成酶活性的蛋白質(zhì)的DNA片段。
圖3A～3C給出了上述序列1、3、5、7、9、11、13以及15的堿基序列的比對數(shù)據(jù)，圖4A、4B給出了序列2、4、6、8、10、12、14以及16的氨基酸序列的比對數(shù)據(jù)。圖3A～3C表示從ORF的5′末端開始的約50個(gè)堿基的區(qū)域存在著堿基保守性低的傾向。特別是在韭蔥中，其中的15個(gè)堿基缺失了。另外，人們也知道在洋蔥中存在著翻譯成氨基酸后，來自該區(qū)域的肽被除去了的同功酶。而在該區(qū)域以外，對于催淚成分合成酶基因的cDNA找不到保守性特別低的區(qū)域。
本發(fā)明的催淚成分合成酶基因作為使例如控制催淚成分的生成的方法，以這些基因作為指標(biāo)，對供交配的植物進(jìn)行選拔的方法，制作降低催淚成分合成酶活性的植物和增大生理活性物質(zhì)的植物品種的方法，通過基因重組技術(shù)大量生產(chǎn)催淚成分合成酶的方法等實(shí)現(xiàn)的基因是有用的。
在本發(fā)明中，通過RT-PCR由催淚成分合成酶基因的mRNA合成cDNA，確定其有義鏈的序列。反義鏈的序列從根本意義上講是由有義鏈的序列確定的。因此，本發(fā)明的DNA包括有義鏈以及反義鏈兩方的序列。即，包括上述具有序列1、3、5、7、9、13以及5的堿基序列的反義鏈序列的DNA或其片段。
作為本發(fā)明的催淚成分合成酶基因的應(yīng)用例子，如以下給出的例子。
(1)催淚成分合成酶的生產(chǎn)將本發(fā)明的催淚成分合成酶基因整合到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，可以制作重組載體。
使用的載體可以在宿主細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制，只要是具有可以整合上述DNA、即催淚成分合成酶基因的插入部位，以及可以使該整合DNA在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的區(qū)域的載體，其種類沒有特別限制。作為表達(dá)載體可以使用在谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)基因的序列下游具有多克隆位點(diǎn)的pGEX-4T-3(Amersham Bioscience公司生產(chǎn))等。
另外為了促進(jìn)在整合的生物種中的表達(dá)，有時(shí)配合整合生物種，改變密碼子，不用說，這些密碼子被改變的DNA也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。以這樣的氨基酸序列為基礎(chǔ)的基因合成例如可以通過利用DNA自動(dòng)合成儀，合成的寡核苷酸退火后進(jìn)行連接等方法適當(dāng)實(shí)施。
另外，就象國際公開第02/20808號公報(bào)也闡明的那樣，催淚成分合成酶蛋白質(zhì)即使付加、缺失1或多個(gè)一部分氨基酸，也有可能獲得同樣酶的性質(zhì)。另外，即使置換一部分氨基酸殘基，結(jié)果也有可能獲得同樣酶的性質(zhì)。這樣的基因改変可以通過使用市售基因部位特異的變異導(dǎo)入試劑盒，或插入合成基因等方法很容易實(shí)現(xiàn)。事實(shí)上，大蔥、野薤、亞實(shí)基隆蔥、韭蔥、大頭蒜中，已經(jīng)證明即使相互間有一部分氨基酸不同，也可獲得催淚成分合成酶活性。因此，作為整合到載體的催淚成分合成酶基因只要維持同樣酶的性質(zhì)，即使是其變異體也可以。然后將上述重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，得到轉(zhuǎn)化體。重組表達(dá)載體向宿主細(xì)胞的導(dǎo)入可以通過慣用的方法進(jìn)行。作為這樣的方法，例如感受態(tài)細(xì)胞法、原生質(zhì)體法、磷酸鈣共沉淀法、電穿孔法、微注射法、微脂粒融合法等各種方法，可以根據(jù)相應(yīng)的宿主采用任意方法。作為產(chǎn)生本發(fā)明催淚成分合成酶的宿主，如大腸桿菌、枯草桿菌、酵母、曲霉菌等微生物、蠶培養(yǎng)細(xì)胞等細(xì)胞比較合適。
通過培養(yǎng)象上述那樣得到的轉(zhuǎn)化體，可以使催淚成分合成酶生產(chǎn)在培養(yǎng)物中。然后利用眾所周知的方法對其進(jìn)行分離，純化，可以穩(wěn)定獲得催淚成分合成酶。
(2)抑制基因表達(dá)的手段(具有抑制催淚成分合成酶蛋白質(zhì)或多肽的mRNA翻譯功能的核酸分子)催淚成分合成酶在生成催淚成分上作為必需因子通過本發(fā)明人的研究已證實(shí)(特開平10-295373號公報(bào))。因此，如果抑制該酶的作用，當(dāng)然就不生成催淚成分了。
以抑制催淚成分生成為目的的各種研究迄今一直在進(jìn)行，這些研究為了減少蒜氨酸酶底物S-1-丙烯基-半胱氨酸亞砜(PeCSO)的蓄積量，在將含有硫成分的肥料減少等栽培方法上動(dòng)了腦筋，雖然可以通過將蒜氨酸酶鈍化達(dá)到了目的，但還不是維持品質(zhì)上的解決對策。
因此，在制作品質(zhì)高、抑制催淚性的蔥屬植物上，抑制由編碼催淚成分合成酶基因的轉(zhuǎn)錄到翻譯的方法是非常有用的，這在酶的基因序列闡明后方可開始實(shí)施。
對于抑制催淚成分合成酶基因表達(dá)的方法可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員都知道的各種方法。其中基因表達(dá)的抑制包括基因轉(zhuǎn)錄的抑制、向蛋白質(zhì)的翻譯的抑制。要有效抑制基因的表達(dá)，對蔥屬植物的內(nèi)在的催淚成分合成酶的mRNA翻譯進(jìn)行抑制是有效果的。
作為針對上述那樣目標(biāo)的技術(shù)，如熟知的通過導(dǎo)入基因與內(nèi)源性催淚成分合成酶mRNA的全長或一部分雜交，使雙鏈RNA形成，使得以下的翻譯不發(fā)生的反義鏈法；以及通過導(dǎo)入基因預(yù)先使酶全序列、或其一部分序列生成雙鏈RNA，使得內(nèi)源性催淚成分合成酶mRNA被分解的現(xiàn)象發(fā)生的RNAi法。另外，通過導(dǎo)入基因使得催淚成分合成酶有義鏈或類似序列的全長或其一部分過量表達(dá)，利用與該基因存在同源性的基因可抑制表達(dá)的共抑制方法也有效。
即，只要是通過這些機(jī)制等使內(nèi)源性mRNA的功能喪失的核酸分子，不管其長度，以及單鏈還是雙鏈、有無與催淚成分合成酶基因的雜交都沒關(guān)系，全部有效。而核酸分子的長度在18個(gè)核苷酸以上是合適的，最好是在22個(gè)核苷酸以上。反過來說，這樣的核酸分子之所以可以設(shè)計(jì)或?qū)嵤┦怯捎诖邷I成分合成酶的基因序列已闡明，考慮到可以將該序列作為基礎(chǔ)的緣故。
本發(fā)明中使用的有義、反義核苷酸的序列最好是與進(jìn)行轉(zhuǎn)化的植物帶有的內(nèi)源性基因(或其相同基因)或與其一部分互補(bǔ)的序列，只要是能有效抑制基因表達(dá)的，即使完全不互補(bǔ)的也可以。例如，優(yōu)選由含有從本發(fā)明DNA序列中選出來的一個(gè)以上的DNA轉(zhuǎn)錄的RNA，或者是與由催淚成分合成酶基因、其上游的調(diào)節(jié)序列、以及其間的DNA序列轉(zhuǎn)錄的RNA進(jìn)行雜交的序列。而該RNA無論是單鏈還是雙鏈都可以。
(核酸分子抑制內(nèi)源性mRNA翻譯的效果的鑒定)某種核酸分子是否抑制內(nèi)源性的催淚成分合成酶的mRNA翻譯，有效的方法是對導(dǎo)入基因使該核酸分子翻譯為RNA的植物組織的催淚成分合成酶活性或該酶蛋白質(zhì)量進(jìn)行測定，直接確認(rèn)效果。如果催淚成分合成酶活性降低，或該酶蛋白質(zhì)量降低，通過導(dǎo)入的核酸分子，出現(xiàn)內(nèi)源性mRNA的翻譯被抑制的現(xiàn)象，由此可以判定導(dǎo)入的核酸分子的有效性。
例如，催淚成分合成酶活性可以通過向不含有從蒜提取的該酶的蒜氨酸酶和蒜氨酸酶的底物PeCSO的反應(yīng)體系中加入測定對象的植物組織提取物，對產(chǎn)生的催淚成分(LF)用HPLC等測定。更具體講，轉(zhuǎn)化的植物是否存在催淚成分合成酶活性，可以根據(jù)下面實(shí)施例所述的國際專利申請PCT/JP01/07465記載的方法進(jìn)行確認(rèn)。
另外，催淚成分合成酶蛋白質(zhì)量減少的判定可以使用以該酶作為抗原做成的該酶的抗體的蛋白質(zhì)印跡(Western Blotting)法。即，可以是將從測定對象的植物組織提取的級分經(jīng)SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺電泳法)分級后、印跡于PVDF膜上，用催淚成分合成酶抗體有選擇地進(jìn)行檢測的通常進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡(Western Blotting)法。催淚成分合成酶的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)可以使用從各種蔥屬植物提取、純化的蛋白質(zhì)，也可以使用以酶的DNA序列為基礎(chǔ)，在大腸桿菌等表達(dá)獲得的重組催淚成分合成酶。酶活性的測定以及催淚成分合成酶的蛋白質(zhì)量的測定方法不限于這里給出的一般的方法，可以使用任一種方法。
(2-1)利用反義鏈RNA不生成催淚成分的植物的生產(chǎn)將本發(fā)明的具有催淚成分合成酶基因的反向互補(bǔ)鏈序列的DNA導(dǎo)入蔥屬植物，使反義鏈RNA在植物內(nèi)表達(dá)，可以抑制催淚成分合成酶基因的表達(dá)。反義鏈RNA由于帶有對來自催淚成分合成酶基因的mRNA互補(bǔ)的堿基序列，通過與該mRNA形成堿基對，抑制作為最終產(chǎn)物的催淚成分合成酶蛋白質(zhì)的合成。在本發(fā)明中可以使用的反義鏈RNA是可以與可翻譯成催淚成分合成酶的mRNA進(jìn)行特異雜交的寡核苷酸。
另外，以除去上述堿基序列的比對數(shù)據(jù)中保守性低的區(qū)域的部分堿基序列為基礎(chǔ)可以設(shè)計(jì)反義鏈RNA序列。催淚成分合成酶基因在保守性低的區(qū)域以外由于在所有蔥屬植物中堿基序列被保存的傾向強(qiáng)，所以也可以進(jìn)行使由大蔥催淚成分合成酶基因序列的反向互補(bǔ)鏈設(shè)計(jì)的反義鏈RNA在洋蔥內(nèi)表達(dá)的所謂不同植物間的轉(zhuǎn)用。
反義鏈RNA靶部位由于基因不同而各種各樣，不存在所說的哪一個(gè)部位都可以的共有序列。然而，一般來說，ATG起始位點(diǎn)等可以作為靶部位的候補(bǔ)。另外，最近，由于有數(shù)種用于設(shè)計(jì)靶部位和反義鏈RNA的計(jì)算機(jī)解析軟件(HYB simulator等)正在銷售，利用這些軟件，也可以設(shè)計(jì)反義鏈RNA。而反義鏈RNA的長度最好在18～23mer以上、GC含量最好在50％以上。
另外，除了上述反義鏈RNA法之外，也可以使用整合有義鏈的方法以及RNAi(RNA干擾，RNA interferense)法。上述有義、反義核苷酸的序列最好是與進(jìn)行轉(zhuǎn)化的植物帶有的內(nèi)源性基因(或其相同基因)或其一部分互補(bǔ)的序列，只要是有效抑制基因表達(dá)，即使完全不互補(bǔ)的也可以。
作為使上述反義鏈RNA在植物內(nèi)發(fā)揮功能的方法，例如將cDNA反向整合到在真核生物表達(dá)的啟動(dòng)子的下游后，導(dǎo)入宿主細(xì)胞使反義鏈RNA合成的方法。
作為導(dǎo)入外來基因的方法可以使用利用土壤桿菌的轉(zhuǎn)化方法，以及通過直接導(dǎo)入的轉(zhuǎn)化法。
而在象上述那樣抑制了催淚成分合成酶基因表達(dá)的植物中，由于1-丙烯次磺酸沒有轉(zhuǎn)變?yōu)榇邷I成分，所以硫代亞磺酸鹽的生成量增大。洋蔥的主要?dú)馕冻煞至虼鷣喕撬狨ケ淮_認(rèn)在體內(nèi)具有抗哮喘作用，而在體外，也是環(huán)氧合酶(cyclooxygenase)和5-脂氧酶(5-lipooxygenase)的抑制劑(Wagner，H.，Dorsch，W.，Bayer，T.，Breu，W.和Willer，F(xiàn).，Antiasthmatic effects of onionsinhibition of5-lipoxygenase and cyclooxygenase in vitro by thiosulfinates and″Cepaenes″.Prost.Leuk.Essential Fatty Acids 39，59-62(1990))。另外有報(bào)道說硫代亞磺酸鹽可以轉(zhuǎn)變?yōu)槎蚧?disulfides)、三硫化物(trisulfides)，這些化合物都具有使血液中脂質(zhì)降低(Adamu，I.，Joseph，P.K.和Augusti，K.T.，Hypolipidemic action of onion andgarlic unsaturated oils in sucrose fed rats over a two-month period.Experientia 38，899-901(1982))、抑制血小板凝集作用(Ariga，T.，Oshiba，S.和Tamada，T.，Platelet aggregation inhibitor in garlic.Lancet 1，150-151(1981)以及Makheja，A.N.和Bailey，J.M.，Antiplatelet constituents of garlic and onion.Agents Actions 29，360-363(1990))。因此，制作上述硫代亞磺酸鹽乃至其反應(yīng)物生成量增大的轉(zhuǎn)化植物也是有可能的。
(3)催淚成分合成酶蛋白質(zhì)的大量生產(chǎn)作為整合cDNA的質(zhì)粒如來自大腸桿菌的pBR322(Gene，2，95(1977))、pBR325(Gene，4，121(1978)、來自枯草桿菌的pUB110(Biochemical and Biophysical Research Communication)，112，678(1983))等，其它的只要是可保持在宿主內(nèi)復(fù)制的質(zhì)粒無論哪一種都可以使用。作為整合到質(zhì)粒的方法，通常都是制備載體與插入片段的摩爾比為1∶1至1∶10的混合液，用T4連接酶進(jìn)行處理的方法(細(xì)胞工學(xué)別冊、生物實(shí)驗(yàn)提示(バイオ実験イラストレイテツド)(2)基因解析基礎(chǔ)、p78、秀潤社)。這樣獲得的質(zhì)粒導(dǎo)入到適當(dāng)?shù)乃拗鳌⒗绨ＯＪ?Escherichia)屬菌、芽孢桿菌(Bacillus)屬菌等。
作為上述埃希氏(Escherichia)屬菌的例子，如大腸桿菌(大腸埃希氏菌，Escherichia coli)(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.60，160(1968))等。作為上述芽孢桿菌屬菌如枯草桿菌(枯草芽孢桿菌，Bacillus subtilis)MI114(Gene，24，255(1983))等。作為轉(zhuǎn)化方法如氯化鈣法(Biochemical and Biophysical ResearchCommunication，49，1568(1972))等。從這樣得到的轉(zhuǎn)化體中使用眾所周知的方法、例如菌落雜交法(Gene，10，63(1980))以及DNA堿基序列確定法(Proc.Natl.Acad.Sci.74，560(1977))等選出需要的菌落。這樣操作后，可以得到克隆的保持含有編碼催淚成分合成酶堿基序列的DNA的載體的微生物。
然后從該微生物分離質(zhì)粒。作為分離法如堿法(Nucleic AcidsResearch，1513(1979))等。上述克隆的含有編碼催淚成分合成酶的堿基序列的質(zhì)?？梢灾苯永没蚋鶕?jù)要求用限制性內(nèi)切酶切出。被克隆的基因連接在適于表達(dá)的載體中啟動(dòng)子的下游后可以得到表達(dá)型載體。
作為載體如來自大腸桿菌的質(zhì)粒(例如pBR322)、來自枯草桿菌的質(zhì)粒(例如pUB110)、來自酵母的質(zhì)粒(例如pSH19)或λ噬菌體等噬菌體以及逆轉(zhuǎn)錄病毒、牛痘病毒等動(dòng)物病毒等。該基因可以在其5′末端含有翻譯起始密碼子ATG，而在3′末端含有翻譯終止密碼子TAA、TGA、或TAG。另外使該基因的5′末端結(jié)合在編碼已知蛋白質(zhì)的基因的3′末端，作為融合蛋白質(zhì)表達(dá)時(shí)，不是必須要翻譯起始密碼子。另外為了使該基因表達(dá)，在其上流連接啟動(dòng)子。作為本發(fā)明使用的啟動(dòng)子只要是適合于基因表達(dá)，對應(yīng)于宿主的啟動(dòng)子可以使用任一種。另外轉(zhuǎn)化時(shí)的宿主為埃希氏菌屬菌時(shí)，最好是trp啟動(dòng)子、lac啟動(dòng)子、recA啟動(dòng)子等，當(dāng)宿主為芽孢桿菌屬菌時(shí)，最好是SPO1啟動(dòng)子、SPO2啟動(dòng)子、penP啟動(dòng)子等，宿主為酵母時(shí)最好是PHO5啟動(dòng)子、PGK啟動(dòng)子、GAP啟動(dòng)子等。特別是當(dāng)宿主埃希氏菌屬菌時(shí)，啟動(dòng)子最好是lac啟動(dòng)子。在宿主為動(dòng)物細(xì)胞時(shí)是來自SV40的啟動(dòng)子、逆轉(zhuǎn)錄病毒的啟動(dòng)子等，特別是來自SV40的啟動(dòng)子最好。
用含有這樣構(gòu)建的DNA的載體制造轉(zhuǎn)化體。作為宿主如埃希氏菌屬菌、芽孢桿菌屬菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞等。作為述埃希氏菌屬菌、芽孢桿菌屬菌的具體例子如與上述同樣的菌。作為上述酵母如釀酒酵母(Saccaromyces cerevisiae)AH22R等。作為動(dòng)物細(xì)胞如猴細(xì)胞COS-7、Vero、中國倉鼠細(xì)胞CHO等。經(jīng)這樣操作，可以得到用含有DNA的載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體。
作為一個(gè)例子，對宿主為埃希氏菌屬菌、芽孢桿菌屬菌的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基合適，其中可以含有該轉(zhuǎn)化體生育所必需的碳源、氮源、無機(jī)物等。
作為培養(yǎng)埃希氏菌屬菌時(shí)的培養(yǎng)基，例如LB培養(yǎng)基或SOC培養(yǎng)基(細(xì)胞工學(xué)別冊 生物指南(バイオイラストレイテツド)1.分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)、P98-99、秀潤社)最好。其中，根據(jù)需要為了使啟動(dòng)子有效地發(fā)揮作用，可以加入例如異丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)那樣的試劑。宿主為埃希氏菌屬菌時(shí)，培養(yǎng)通常于15～43℃下進(jìn)行3～24小時(shí)，根據(jù)需要，也可以加上通氣或攪拌。宿主為芽孢桿菌屬菌時(shí)，培養(yǎng)通常在約30～40℃下進(jìn)行約6～24小時(shí)，根據(jù)需要，也可以加上通氣或攪拌。對宿主為酵母的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，作為培養(yǎng)基如バ一クホルダ一最小培養(yǎng)基(Proc.Natl.Acad.Sci..77，4505(1980))。培養(yǎng)基的pH最好調(diào)整到約5～8。培養(yǎng)通常于20℃～35℃下進(jìn)行約24～72小時(shí)，根據(jù)需要，也可以加上通氣或攪拌。對宿主為動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，作為培養(yǎng)基如含有約5～20％的胎牛血清的MEN培養(yǎng)基(Science 122，501(1952)DMEM培養(yǎng)基(Virology，8，396(1959))等。pH最好是約6～8。培養(yǎng)通常于約30℃至40℃下進(jìn)行約15小時(shí)至60小時(shí)，根據(jù)需要，可以提高二氧化碳濃度。
從上述培養(yǎng)物分離純化催淚成分合成酶蛋白可以通過例如下面的方法進(jìn)行。當(dāng)從培養(yǎng)菌體或細(xì)胞提取催淚成分合成酶蛋白時(shí)，可以適當(dāng)采用培養(yǎng)后、通過眾所周知的方法收集菌體或細(xì)胞，然后懸浮于含有鹽酸胍等蛋白變性劑的緩沖液中，通過超聲波、溶菌酶以及(或凍融)破碎菌體或細(xì)胞后，通過離心分離，得到催淚成分合成酶蛋白的方法等。要從上述上清液純化催淚成分合成酶蛋白，可以將眾所周知的分離、純化方法適當(dāng)組合進(jìn)行純化。作為這些眾所周知的分離、純化方法例如利用鹽析或溶劑沉淀法等利用溶解性的方法、透析法、凝膠過濾法等利用分子量的差別的方法、離子交換層析等利用電荷差別的方法、親和層析等利用特異親和性的方法、反相高效液相層析等利用疏水性的差別的方法等。
如上所述，本發(fā)明的催淚成分合成酶基因可以作為在篩選、酶或蛋白質(zhì)的生產(chǎn)、轉(zhuǎn)化植物的生產(chǎn)等中的基因工程的工具廣泛運(yùn)用。這樣的場合下，本發(fā)明的催淚成分合成酶基因在蔥屬植物相互之間，堿基序列類似性高。因此，例如來自大蔥的DNA不能說只能應(yīng)用于與大蔥有關(guān)系的技術(shù)中，可以將基因在植物間相互轉(zhuǎn)用。
附圖的簡要說明圖1表示序列1、3、5、7、9、11、13以及15所示的各個(gè)堿基序列間的堿基序列同源性。
圖2表示序列2、4、6、8、10、12、14以及16所示的各個(gè)推定氨基酸序列間的推定氨基酸序列同源性。
圖3A表示序列1、3、5、7、9、11、13以及15的堿基序列的比對數(shù)據(jù)。
圖3B表示序列1、3、5、7、9、11、13以及15的堿基序列的比對數(shù)據(jù)(圖3A的續(xù))。
圖3C表示序列1、3、5、7、9、11、13以及15的堿基序列的比對數(shù)據(jù)(圖3B的續(xù))。
圖4A表示序列2、4、6、8、10、12、14以及16的氨基酸序列的比對數(shù)據(jù)。
圖4B表示序列2、4、6、8、10、12、14以及16的氨基酸序列的比對數(shù)據(jù)。(圖4A的續(xù))。
圖5表示就E2/uni/f/298區(qū)域和其前后10堿基的區(qū)域，給出了對應(yīng)于通用引物E2/uni/f/298序列的序列一覽。
圖6表示E2-AF、E3-AC以及E2-AA的cDNA制作以及亞克隆的步驟。
圖7表示表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化體的制作步驟。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1(來自大蔥的催淚成分合成酶基因)(1)總RNA的提取用液氮將新鮮的大蔥(A.fistulosum L.)瞬間冷凍后，用木槌敲碎。將敲碎的冷凍材料放入到經(jīng)干熱滅菌的乳缽中，用乳棒研磨成粉狀。將100mg的成為粉狀的冷凍材料按照RNeasy Plant Mini試劑盒(QIAGEN Cat.no.74903)的程序進(jìn)行處理，得到總RNA。
得到的總RNA的產(chǎn)量是13μg。
(2)cDNA的合成以得到的總RNA為材料，使用Ready-To-Go T-PrimedFirst-Strand試劑盒(Amercham Biosciences code no.27-9263-01)，按照試劑盒附帶的程序，以5′末端銜接序列附帶的寡(dT)(序列30)作為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成1st strand cDNA。
(3)利用3′RACE法進(jìn)行該cDNA的3′側(cè)區(qū)域的擴(kuò)增為了解析目的基因(cDNA)3′區(qū)域的堿基序列，以表1的組成進(jìn)行3′RACE實(shí)驗(yàn)。通過(2)得到的1st strand cDNA具有在5′末端帶有銜接序列的構(gòu)造。因此，為了要通過PCR由1st strand cDNA只使目的cDNA擴(kuò)增，使用由洋蔥催淚成分合成酶基因(序列11)的3′側(cè)區(qū)域的序列設(shè)計(jì)的ACE02f引物和與銜接序列互補(bǔ)的NotI引物進(jìn)行PCR。
有義鏈(ACE02f)5′-TGG AGG GTC CTG AGC ACA AG-3′(序列17)反義鏈(NotI)5′-TGG AAG AAT TCG CGG CCG CAG-3′(序列18)
表1

PCR條件如下。
①94℃、9分→②94℃、1分→③54℃、1分→④72℃、1分→⑤72℃、5分→⑥4℃、保持反復(fù)進(jìn)行②～④45次。
PCR后的反應(yīng)液進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳(溴化乙錠檢測)，判定有無目的大小的PCR產(chǎn)物。
(4)通過5′RACE法進(jìn)行該cDNA的5’側(cè)區(qū)域的擴(kuò)增為了解析目的基因(cDNA)的5’區(qū)域的堿基序列，用表2的組成進(jìn)行5′RACE實(shí)驗(yàn)。5’RACE實(shí)驗(yàn)是用5’RACE System forAmplification of cDNA Ends，Version 2.0(InVirtogen life technologiesCat.no.18374-058)實(shí)施。
對(2)得到的1st strand cDNA進(jìn)行RNaseH處理，變成單鏈cDNA后，在其3′末端使用末端轉(zhuǎn)脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶(以下TdT)付加核苷酸均聚物(dC的聚合物)。以付加了PolyC的cDNA為模板，使用在3′末端帶有與PolyC序列互補(bǔ)序列的銜接引物(AAP)和由洋蔥催淚成分合成酶基因的5′側(cè)區(qū)域的序列設(shè)計(jì)的引物(ACE02r)進(jìn)行PCR，由5′末端付加了dC的聚合物的1st strand cDNA只擴(kuò)增目的cDNA。
有義鏈(AAP)5′-GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGIIGG GII GGG IIG-3′(序列19)反義鏈(ACE02r)5′-CTC TTC GAT TTT CTG ACC TAT CTCAGT AGC-3′(序列20)表2

PCR條件如下。
①95℃、10分→②94℃、1分→③55℃、1分→④72℃、1分→⑤72℃、7分→⑥4℃、保持反復(fù)進(jìn)行②～④步驟40次。
PCR后的反應(yīng)液進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳(溴乙錠檢測)，判定有無目的大小的PCR產(chǎn)物。
(5)通過3′RACE法、5′RACE法得到擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基序列解析和全長序列的確定以及氨基酸序列的推定對得到的3′RACE產(chǎn)物、5′RACE產(chǎn)物直接測序，進(jìn)行堿基序列解析。對3′RACE產(chǎn)物的堿基序列和5′RACE產(chǎn)物的堿基序列進(jìn)行組合，確定樣品中催淚成分合成酶基因的cDNA全長序列(如序列1所示)。由cDNA全長序列確定開放讀框(ORF)，推定對應(yīng)于各個(gè)密碼子的氨基酸序列(如序列2所示)。
(6)通過ORF區(qū)域的PCR擴(kuò)增和其產(chǎn)物的TA克隆確定大蔥催淚成分合成酶基因的堿基序列由上述(5)的堿基序列解析結(jié)果推測到序列1所示的cDNA的第244位的腺嘌呤(A)變?yōu)轼B嘌呤(G)的cDNA的存在(通過腺嘌呤(A)為高峰、而鳥嘌呤(G)低峰可以檢測)。
根據(jù)ORF序列的推定，做成從其起始密碼子(ATG)開始的正向引物E2-AF-F(ATGGAGCTAAATCCTGGTGCGC(序列21))。
使用做成的引物E2-AF-F和NotI引物，以大蔥cDNA為模板進(jìn)行PCR，將得到的擴(kuò)增產(chǎn)物插入到pGEM-T Easy Vector(Promegu公司生產(chǎn))后、導(dǎo)入大腸桿菌(XL1-Blue MRF′)，對堿基序列進(jìn)行解析。結(jié)果確認(rèn)了序列1的第244位變成了鳥嘌呤(G)的cDNA的存在。序列3給出了確定的序列。由序列推定了對應(yīng)于各個(gè)密碼子的氨基酸序列(如序列4所示)。
實(shí)施例2(來自野薤的催淚成分合成酶基因的cDNA全長序列)以新鮮的野薤(A.chinense L.)作為提取材料?？俁NA的提取方法以及cDNA的合成、利用3′RACE法進(jìn)行的該cDNA 3′側(cè)區(qū)域的擴(kuò)增、利用5′RACE法進(jìn)行的該cDNA 5′側(cè)區(qū)域的擴(kuò)增、堿基序列的解析和氨基酸序列的推定用與實(shí)施例1同樣的方法進(jìn)行。序列5給出了解析的來自野薤的催淚成分合成酶基因的cDNA全長序列，序列6給出了對應(yīng)于其密碼子的氨基酸序列。
實(shí)施例3(來自亞實(shí)基隆蔥的催淚成分合成酶基因的cDNA全長序列)以新鮮的亞實(shí)基隆蔥(A.cepa L.)為提取材料?？俁NA的提取方法以及cDNA的合成、利用5′RACE法進(jìn)行的該cDNA 5′側(cè)區(qū)域的擴(kuò)增、堿基序列的解析和氨基酸序列的推定用與實(shí)施例1相同的方法進(jìn)行。
但是，在利用3′RACE法進(jìn)行的該cDNA 3′側(cè)區(qū)域的擴(kuò)增中，利用nested PCR法進(jìn)行2次PCR。在第1次PCR中，將實(shí)施例1的有義引物由ACE02f變?yōu)镋2-1-N(GGIGCI(A/C)GIAA(A/G)TGG(序列23))，PCR條件③的54℃、1分鐘也變?yōu)?3℃、1分。以這樣獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板進(jìn)行第2次PCR，這第2次的PCR條件和使用的引物與實(shí)施例1給出的利用3′RACE法進(jìn)行該cDNA的3′側(cè)區(qū)域的擴(kuò)增用的一樣。
序列7給出了解析的來自亞實(shí)基隆蔥的催淚成分合成酶基因的cDNA全長序列，序列8給出了對應(yīng)于其密碼子的氨基酸序列。
實(shí)施例4(來自韭蔥的催淚成分合成酶基因的cDNA序列)將新鮮的韭蔥(A.ampeloprasum L.)作為提取材料?？俁NA的提取方法以及cDNA的合成、堿基序列的解析和氨基酸序列確定用與實(shí)施例1相同的方法進(jìn)行。
但是在利用3′RACE法對該cDNA 3′側(cè)區(qū)域的擴(kuò)增中，不但通過實(shí)施例1的有義引物ACE02f，而且僅以洋蔥催淚成分合成酶基因的序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的其它有義引物也不能獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。因此，找到洋蔥、野薤、大蔥3種催淚成分合成酶基因中序列保守的區(qū)域(圖5)，通過在有義引物使用由該序列設(shè)計(jì)的E2/uni/f/298(GAATTTTGGGCCAAGGAGAAGCTGG(序列25))，才初次擴(kuò)增該cDNA的3′側(cè)區(qū)域。
用由洋蔥序列設(shè)計(jì)的引物不能得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)果在5′RACE中也同樣得不到。因此，通過由作為有義引物使用E2/uni/f/298得到的韭蔥3′RACE產(chǎn)物的堿基序列設(shè)計(jì)E2/r/580-Le(CACACAGCATCACA AATTGAC(序列28))，用作5′RACE法的反義引物，才初次擴(kuò)增該cDNA的5′側(cè)區(qū)域。
得到的3′RACE產(chǎn)物、5′RACE產(chǎn)物通過直接測序進(jìn)行堿基序列解析。將3′RACE產(chǎn)物的堿基序列和5′RACE產(chǎn)物的堿基序列匯總，推定出韭蔥催淚成分合成酶基因的cDNA全長序列。然而，由堿基序列解析結(jié)果判定韭蔥中存在堿基序列不同的多個(gè)催淚成分合成酶基因cDNA，但韭蔥的cDNA序列只通過RACE法還不能確定。
因此，做成從最靠近由RACE結(jié)果推定的cDNA全長序列的5′末端ATG開始的正向引物E2-AP-F2(ATGGCGCAAAATCCTGGTGTGC(序列29))。
使用做成的引物E2-AP-F2和NotI引物，以韭蔥cDNA為模板進(jìn)行PCR，將得到的擴(kuò)增產(chǎn)物插pGEM-T Easy Vector后、導(dǎo)入大腸桿菌(XL1-Blue MRF′)中，對堿基序列進(jìn)行解析。結(jié)果確定了2種cDNA序列。序列9、13給出了確定的韭蔥的2種序列。就各個(gè)序列推定出對應(yīng)于各個(gè)密碼子的氨基酸序列(如序列10、14所示)。
實(shí)施例5(來自大頭蒜的催淚成分合成酶基因的cDNA全長序列)以新鮮的大頭蒜(A.ampeloprasum L.)為提取材料?？俁NA的提取方法以及cDNA的合成、堿基序列的解析和氨基酸序列的推定用與實(shí)施例1相同的方法進(jìn)行。
但是，利用3′RACE法進(jìn)行該cDNA3′側(cè)區(qū)域的擴(kuò)增中，將實(shí)施例1的有義引物由ACE02f變?yōu)橛善渌[屬植物(洋蔥、野薤、大蔥)的催淚成分合成酶基因的3′側(cè)區(qū)域找到的所有植物共通的序列設(shè)計(jì)的E2/uni/f/298(GAATTTTGGGCCAAGGAGAAGCTGG(序列25))。
另外，在利用5′RACE法進(jìn)行的該cDNA的5′側(cè)區(qū)域的擴(kuò)增中，將實(shí)施例1的反義引物由ACE02f變?yōu)橛裳笫[的堿基序列設(shè)計(jì)的引物(E2-1-5R-1)(TCCTCGTACCCTGTAAAACACTCAG(序列26))。
序列15給出了解析的來自大頭蒜的催淚成分合成酶基因的cDNA全長序列，序列16給出了對應(yīng)于其密碼子的氨基酸序列。
實(shí)施例6(蛋白質(zhì)的制造方法)(1)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建(野薤、亞實(shí)基隆蔥、大頭蒜)使用由序列5、7以及15所示的催淚成分合成酶的基因序列的開放讀框5′末端設(shè)計(jì)的正向引物和與附在寡dT引物的錨部分互補(bǔ)的反向引物，以來自各個(gè)蔥屬植物的cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到約700bp的產(chǎn)物。作為蔥屬植物使用野薤、亞實(shí)基隆蔥、大頭蒜，作為正向引物，對于野薤使用E2-AC-F(ATGGAGCAAAATTCTGGTACGC(序列22))，對于亞實(shí)基隆蔥使用E2-AA-F(ATGGAGCTAAATCCTGGTGCAC(序列24))、對于大頭蒜使用E2-APEG-F(ATGATGACATATCCTGGAAATCG(序列27))，對于反向引物，所有場合下都使用與附著在寡dT引物的錨部分互補(bǔ)的引物。
將得到的產(chǎn)物按照先前敘述的堿基序列確定方法亞克隆到pGEM-T Easy Vector后，導(dǎo)入大腸桿菌(XL1-Blue)，解析堿基序列。圖6給出了亞克隆的步驟。
從帶有整合產(chǎn)物的pGEM-T-Easy Vector的大腸桿菌中得到了具有序列5、7、15所示的編碼各多肽的堿基序列的大腸桿菌(XL-1 BlueMRF′/pGEM-T-E2-AC(野薤)、XL-1 Blue MRF′/pGEM-T-E2-AA(亞實(shí)基隆蔥)、XL-1 Blue MRF′/pGEM-T-E2-APEG(大頭蒜))。
(大蔥、韭蔥)對于大蔥、韭蔥使用實(shí)施例1、4制作的序列3、9、13所示具有編碼各多肽的堿基序列的大腸桿菌(XL-1 Blue MRF′/pGEM-T-E2-AF(大蔥)、XL-1 Blue MRF′/pGEM-T-E2-LK29A(韭蔥29A)、XL-1 Blue MRF′/pGEM-T-E2-LK58E(韭蔥58E))。
作為蛋白質(zhì)的表達(dá)用載體使用在谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)基因序列的下游帶有蛋白酶識(shí)別部位和多克隆位點(diǎn)的pGEX-4T(Amersham Pharmacia生產(chǎn))(圖7)。
將pGEX-4T用EcoRI(Takara公司生產(chǎn))和NotI(Takara公司生產(chǎn))切斷得到的大片段和上述pGEM-T-E2-AF(大蔥)用EcoRI和NotI切斷得到的約700bp片段連接，構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-E2-AF(大蔥)。
將pGEX-4T用EcoRI(Takara公司生產(chǎn))和NotI(Takara公司生產(chǎn))切斷得到的大片段和上述pGEM-T-E2-AC(野薤)用EcoRI和NotI切斷得到的約700bp的片段連接，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-E2-AC(野薤)。
將pGEX-4T用EcoRI(Takara公司生產(chǎn))和NotI(Takara公司生產(chǎn))切斷后得到的大片段和上述pGEM-T-E2-AA(亞實(shí)基隆蔥)用EcoRI和NotI切斷得到約700bp的片段連接，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-E2-AA(亞實(shí)基隆蔥)。
將pGEX-4T用EcoRI(Takara公司生產(chǎn))和NotI(Takara公司生產(chǎn))切斷得到的大片段和上述pGEM-T-E2-APEG(大頭蒜)用EcoRI和NotI切斷得到的約700bp片段連接，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-E2-APEG(大頭蒜)。
將pGEX-4T用EcoRI(Takara公司生產(chǎn))和NotI(Takara公司生產(chǎn))切斷后得到的大片段和上述pGEM-T-E2-LK29A(韭蔥序列9)用EcoRI和NotI切斷得到的約700bp片段連接，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-E2-LK29A(韭蔥序列9)。
將pGEX-4T用EcoRI(Takara公司生產(chǎn))和NotI(Takara公司生產(chǎn))切斷得到的大片段和上述pGEM-T-E2-LK58EA(韭蔥序列13)用EcoRI和NotI切斷得到的約700bp片段連接，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-E2-LK58E(韭蔥序列13)。
(2)使用表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體制作和培養(yǎng)利用感受態(tài)細(xì)胞法將上述的pGEX-4T-E2-AF(大蔥)導(dǎo)入大腸桿菌BL21-Gold(STRATAGENE公司生產(chǎn))，得到轉(zhuǎn)化體BL21-Gold/pGEX-4T-E2-AF(大蔥)(圖7)。
同樣將上述的pGEX-4T-E2-AC(野薤)導(dǎo)入大腸桿菌BL21-Gold(STRATAGENE公司生產(chǎn))得到轉(zhuǎn)化體BL21-Gold/pGEX-4T-E2-AC(野薤)(圖7)。
同樣將上述的pGEX-4T-E2-AA(亞實(shí)基隆蔥))導(dǎo)入大腸桿菌BL21-Gold(STRATAGENE公司生產(chǎn))得到轉(zhuǎn)化體BL21-Gold/pGEX-4T-E2-AA(亞實(shí)基隆蔥)(圖7)。
同樣將上述的pGEX-4T-E2-APEG(大頭蒜)導(dǎo)入大腸桿菌BL21-GOLD(STRATAGENE公司生產(chǎn)))，得到轉(zhuǎn)化體BL21-GOLD/pGEX-4T-E2-APEG(大頭蒜)。
同樣將上述的pGEX-4T-E2-LK29A(韭蔥序列9)導(dǎo)入大腸桿菌BL21-GOLD(STRATAGENE公司生產(chǎn)))，得到轉(zhuǎn)化體BL21-GOLD/pGEX-4T-E2-LK29A(韭蔥序列9)。
同樣將上述的pGEX-4T-E2-LK58E(韭蔥序列13)導(dǎo)入大腸桿菌BL21-GOLD(STRATAGENE公司生產(chǎn)))得到轉(zhuǎn)化體BL21-GOLD/pGEX-4T-E2-LK58E(韭蔥序列13)。
將得到的轉(zhuǎn)化體于含有100μg/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中在37℃下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。向培養(yǎng)基添加異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)生產(chǎn)，GST和各催淚成分合成酶蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)(以下，關(guān)于大蔥的融合蛋白稱為GST-E2-AF、關(guān)于野薤的融合蛋白稱為GST-E2-AC、關(guān)于亞實(shí)基隆蔥的融合蛋白稱為GST-E2-AA、關(guān)于大頭蒜的融合蛋白稱為GST-E2-APEG、關(guān)于韭蔥(序列9)的融合蛋白稱為GST-E2-LK29A、關(guān)于韭蔥(序列13)的融合蛋白稱為GST-E2-LK58E)蓄積在菌體內(nèi)。
(3)蛋白質(zhì)的分離(純化)象上述那樣操作，對于所有的植物進(jìn)行轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)，通過離心分離收集菌體后、進(jìn)行超聲破碎。對于大蔥、野薤、亞實(shí)基隆蔥，將通過離心回収的上清流過谷胱甘肽瓊脂糖4 Fast Flow柱(AmershamPharmacia)，使GST融合蛋白質(zhì)吸附于柱上。洗凈柱子后，用含有還原型谷胱甘肽的洗脫緩沖液將融合蛋白質(zhì)洗出，得到3種融合蛋白質(zhì)樣品(GST-E2-AF、GST-E2-AC、GST-E2-AA)的純化物。
將2種融合蛋白質(zhì)樣品流過HiTrap Desalting柱(AmershamPharmacia)，除去還原型谷胱甘肽，再度吸附于谷胱甘肽瓊脂糖4 FastFlow柱。洗浄柱后，用含有凝血酶的緩沖液充滿柱，于室溫下進(jìn)行2小時(shí)蛋白酶處理，將GST標(biāo)記從融合蛋白質(zhì)切下來。將除去GST標(biāo)記的重組GST-E2-AF、GST-E2-AC以及GST-E2-AA從柱上洗脫下來，再向該洗脫液中加入Benzamidine Sepharose 6 B進(jìn)行混合，通過離心分離，除去洗脫液的凝血酶，得到3種重組樣品(RC-E2-AF(大蔥)、RC-E2-AC(野薤)、RC-E2-AA(亞實(shí)基隆蔥))。
(4)重組蛋白質(zhì)的催淚成分合成酶活性對融合蛋白質(zhì)樣品GST-E2-AF、GST-E2-AC、GST-E2-AA以及除去GST標(biāo)記的重組樣品RC-E2-AF、RC-E2-AC、RC-E2-AA 6樣品測定催淚成分合成酶活性。對于大頭蒜和韭蔥，測定上述(3)中菌體超聲破碎后的離心上清(GST-E2-APEG/sup(大頭蒜)、GST-E2-LK29A/sup(韭蔥序列9)、GST-E2-LK58E/sup(韭蔥序列13))的催淚成分酶活性。
測定按照國際專利申請PCT/JP01/07465所述的以下方法進(jìn)行。
即，將上述重組蛋白質(zhì)樣品用稀釋用緩沖液(50mM磷酸鉀緩沖液pH6.5)稀釋，向10μl稀釋樣品中加入40μl大蒜蒜氨酸酶(50units/ml)和PeCSO溶液(20mg/ml)20μl，于室溫下反應(yīng)3分鐘后、將1μl反應(yīng)液注入HPLC，測定催淚成分的生成量。在分析中使用ODS柱(4.6φ×250mm)(センシユウ科學(xué)公司生產(chǎn))。此外，流動(dòng)相為30％(v/v)的酸性MeOH、流速為0.6ml/min、柱溫為35℃、檢測波長為254nm。
測定結(jié)果表明，在所有的融合蛋白質(zhì)樣品中都檢測到催淚成分合成酶活性。另外，對用沒有導(dǎo)入催淚成分合成酶基因的表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T制作的轉(zhuǎn)化體(BL21-Gold/pGEX-4T-GST)進(jìn)行培養(yǎng)，即使進(jìn)行谷胱甘肽瓊脂糖柱處理也沒有檢測到催淚成分合成酶活性。而取代樣品使用磷酸緩沖液的空白中也沒有催淚成分合成酶活性。
由以上結(jié)果可以確認(rèn)即使在催淚成分合成酶基因的N末端結(jié)合了象GST(分子量約27000)那樣的大蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)也具有催淚成分合成酶活性。
另外在RC-E2-AF、RC-E2-AC以及RC-E2-AA中也檢測到催淚成分合成酶活性。
實(shí)施例7(轉(zhuǎn)化植物的做成)(1)載體的制作載體的制作是通過在調(diào)節(jié)區(qū)域(啟動(dòng)子)的下游接上催淚成分合成酶基因的全長、或其一部分(最好是18bp以上)序列的有義取向序列、反義取向序列或含有兩方取向序列的任一個(gè)，通過在其下游連上終止子，整合到質(zhì)粒制作的。接上催淚成分合成酶基因序列的有義取向和反義取向的兩方序列，在其下游接上終止子整合到質(zhì)粒時(shí)，在有義和反義序列間最好插入“間隔”(spacer)(另外的堿基序列)。通過這樣連接，會(huì)使在大腸桿菌內(nèi)的穩(wěn)定性提高。另外在上述間隔中，最好是含有“內(nèi)含子”(非翻譯區(qū)域的堿基序列)的序列。由此在個(gè)體中的表達(dá)抑制的左右變高，另外表達(dá)被抑制的個(gè)體的回收率上升。以下操作可以使用一般的基因克隆技術(shù)進(jìn)行。
①將亞克隆了催淚成分合成酶基因的質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌(例如、XL1-Blue)后使其增殖，以該質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，使催淚成分合成酶基因的全長、或其一部分序列擴(kuò)增。擴(kuò)增的序列按照目的取向與啟動(dòng)子連接，付加終止子后整合到質(zhì)粒中。含有有義取向和反義取向兩方序列時(shí)，兩者之間插入含有內(nèi)含子的間隔。
作為啟動(dòng)子可以使用例如菜花樣花葉病毒的35S啟動(dòng)子，只要是在植物細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，也可以使用其它的啟動(dòng)子。而作為終止子可以使用例如正纈氨酸合酶(ノパリンシンテ一ス)的終止子，也可以使用其他的終止子。
作為整合基因的中間載體質(zhì)?？梢允褂胮BI101等一般的質(zhì)粒，對此沒有特別限定。而作為整合基因的質(zhì)粒通過使用加入適當(dāng)?shù)倪x擇標(biāo)記(潮霉素或卡那霉素等抗生素抗性標(biāo)記)的質(zhì)粒，可以使得篩選轉(zhuǎn)化個(gè)體變得容易。
②將①的質(zhì)粒整合到大腸桿菌(例如HB101、SURE2)后使其增殖，該大腸桿菌和帶有輔助質(zhì)粒的大腸桿菌(例如HB101(pRK2013))、以及帶有輔助Ti質(zhì)粒(例如、pAL4404)的土壤桿菌(例如根癌土壤桿菌LBA4404最好，此外也可以使用EHA105或EHA101等那樣系統(tǒng)的土壤桿菌)進(jìn)行三親株交配、①的質(zhì)粒內(nèi)的插入基因被重組到土壤桿菌內(nèi)。另外，即使不借助于輔助質(zhì)粒的三親株交配，也可以通過電穿孔法直接將整合了導(dǎo)入基因序列的質(zhì)粒導(dǎo)入土壤桿菌中。
(2)在重組中使用的洋蔥等植物材料的制作。
①植物材料只要是具有再分化能力(再生植物體的能力)的植物可以使用任一種。使用洋蔥等蔥屬植物時(shí)，最好是使用從植物體誘導(dǎo)具有再分化能力的愈傷組織。對于洋蔥等蔥屬植物，作為誘導(dǎo)愈傷組織的植物器官，可以使用來自種子的成熟或未熟胚、來自種子的發(fā)芽初生根、鱗片葉生長點(diǎn)、盤莖部等。
②誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基組成最好是使用植物培養(yǎng)中通常可以使用的MS培養(yǎng)基的組成，也可以使用其它培養(yǎng)基的組成。誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基中的必需成分是植物激素的植物生長激素。植物生長激素的濃度最好是1-100μM。作為植物生長激素如4-FPA(4-氟苯氧乙酸)、Picrolam(4-氨基-3，5，6-三氯-2-吡啶羧酸)、2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)等誘導(dǎo)愈傷組織的比較好，也可以使用其它的植物生長激素。
③愈傷組織的培養(yǎng)可以在適于培養(yǎng)的條件下進(jìn)行，最好是在25℃、1000-3000lux左右的熒光燈照射下進(jìn)行。誘導(dǎo)的愈傷組織可以通過繼代培養(yǎng)進(jìn)行維持。但是為了使用保持再分化能力的愈傷組織，最好是將用于愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)期間縮短，減少繼代培養(yǎng)的次數(shù)。具體來說，用于愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)期間為3～4個(gè)月左右，繼代培養(yǎng)的次數(shù)在3次以下為好。④對于洋蔥等，由于品種不同，愈傷組織的再分化能力上存在很大的差距，最好使用再分化能力大的品種。例如泉州中甲高黃、紅花(くれない)、紅葉(もみじ)、天壽等。
(3)基因?qū)胼d體對愈傷組織的感染①使帶有(1)中得到的基因?qū)胼d體的土壤桿菌菌體增殖，將愈傷組織浸入該菌液。此時(shí)，重要的是添加為了使土壤桿菌感染單子葉植物所需要的化合物乙酰丁香酮。乙酰丁香酮的濃度最好是100-200μM。
②對菌和愈傷組織進(jìn)行共存培養(yǎng)3日以上、最好是4～6日左右后、使用頭孢噻肟或羧芐青霉素抗生素，除去土壤桿菌。
(4)從受感染的愈傷組織挑選轉(zhuǎn)化個(gè)體在與預(yù)先整合到載體的潮霉素或卡那霉素等抗生素抗性標(biāo)記對應(yīng)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)愈傷組織，使其發(fā)育生長后、再分化。存活的是轉(zhuǎn)化成功的個(gè)體。由愈傷組織再分化中使用的培養(yǎng)基組成可以使用植物培養(yǎng)通常使用的MS培養(yǎng)基組成，也可以使用其它組成的培養(yǎng)基。重要的是要從再分化培養(yǎng)基中除去植物生長激素。
(5)轉(zhuǎn)化個(gè)體的確認(rèn)目的基因是否導(dǎo)入再分化植物中可以利用從植物體提取DNA，Southern雜交法(中山広樹等著、生物實(shí)驗(yàn)提示(バイオ実験イラストレイテツド)②基因解析的基礎(chǔ)，p137-151(1995))進(jìn)行確認(rèn)。
(6)轉(zhuǎn)化個(gè)體的特性的評價(jià)可以確認(rèn)再分化植物含有的硫代亞磺酸鹽及其反應(yīng)物的量。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明的催淚成分生成基因抑制催淚成分合成酶的表達(dá)量，在為了增大具有抗哮喘作用等的硫代亞磺酸鹽及其反應(yīng)物的生成量所需要的反義核苷酸的設(shè)計(jì)等中是有用的，利用基因重組技術(shù)也可以有效地制造出催淚成分合成酶、可以實(shí)現(xiàn)有效地生產(chǎn)在淚缺乏癥(干眼癥)等的治療起作用的催淚成分方面起到顯著效果。
序列表<110>好侍食品株式會(huì)社<120>具有催淚成分合成酶活性的蛋白質(zhì)或多肽、編碼該蛋白質(zhì)或多肽的DNA、利用該DNA制造具有催淚成分合成酶活性的蛋白質(zhì)或多肽的制造方法以及具有抑制該蛋白質(zhì)或多肽的mRNA翻譯的功能的核酸分子<130>Y1K0092<150>JP 2002-56523<151>2002-03-01<150>JP 2002-56558<151>2002-03-01<150>JP 2002-275799<151>2002-09-20<160>30<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>739<212>DNA<213>Allium fistulosum L.
<220>
<221>CDS<222>(58)..(564)<223>P<220>
<221>polyA位點(diǎn)<222>(723)..(739)<223>P<400>1cacaaattca aaactcacat ttcgttaaat ttagaagaat tattcaatcg ggaaaaa 57
atg gag cta aat cct ggt gcg cct gct gta gtc act gat ggt gct aac105Met Glu Leu Asn Pro Gly Ala Pro Ala Val Val Thr Asp Gly Ala Asn1 5 10 15gga gct cga aaa tgg agc ggc aaa gtc cat gct ttg ctt cca aat tca153Gly Ala Arg Lys Trp Ser Gly Lys Val His Ala Leu Leu Pro Asn Ser20 25 30aag cca gag caa gca tgg agg cta cta aag gac ttt att aac ctt cac201Lys Pro Glu Gln Ala Trp Arg Leu Leu Lys Asp Phe Ile Asn Leu His35 40 45aag atc atg cct tcg ttg tca gtc tgt gaa ctg gta gaa ggt aag gcc249Lys Ile Met Pro Ser Leu Ser Val Cys Glu Leu Val Glu Gly Lys Ala50 55 60aat gtt gtt ggt tgt gtt cgc cac gtt aaa ggt ata atg cac cca ata297Asn Val Val Gly Cys Val Arg His Val Lys Gly Ile Met His Pro Ile65 70 75 80gaa gag gaa ttt tgg gcc aag gag aag ctg gtg gca ctg gat aat aag345Glu Glu Glu Phe Trp Ala Lys Glu Lys Leu Val Ala Leu Asp Asn Lys85 90 95aac atg agc tac agt tat att ttt act gag tgt ttt aca ggg ttc gag393Asn Met Ser Tyr Ser Tyr Ile Phe Thr Glu Cys Phe Thr Gly Phe Glu100 105 110gat tac acg gct acc atg caa ata gtg gag gga cct gag cac aag gga441Asp Tyr Thr Ala Thr Met Gln Ile Val Glu Gly Pro Glu His Lys Gly115 120 125tgt aga ttt gac tgg tct ttt cag tgc aag tat atc gag ggt atg act489Cys Arg Phe Asp Trp Ser Phe Gln Cys Lys Tyr Ile Glu Gly Met Thr130 135 140gaa tct gca ttc gcc gag att ctg cag cat tgg gct act gaa att ggt537Glu Ser Ala Phe Ala Glu Ile Leu Gln His Trp Ala Thr Glu Ile Gly145 150 155 160cag aaa atc gaa gag att tgc aat gct tgattatgaa tatcggttat 584Gln Lys Ile Glu Glu Ile Cys Asn Ala165
ggtttggtgc attgtgtgtg ttttaaaccg tatcttgtga tgtaataaag taacgtaata 644tgtgcacgta ataagtaagc ctgagtgttg tgtgttcaat aaaaaagaac ttgctttttg 704catgttctaa tgcttttcaa aaaaaaaaaa aaaaa 739<210>2<211>169<212>PRT<213>Allium fistulosum L.
<400>2Met Glu Leu Asn Pro Gly Ala Pro Ala Val Val Thr Asp Gly Ala Asn1 5 10 15Gly Ala Arg Lys Trp Ser Gly Lys Val His Ala Leu Leu Pro Asn Ser20 25 30Lys Pro Glu Gln Ala Trp Arg Leu Leu Lys Asp Phe Ile Asn Leu His35 40 45Lys Ile Met Pro Ser Leu Ser Val Cys Glu Leu Val Glu Gly Lys Ala50 55 60Asn Val Val Gly Cys Val Arg His Val Lys Gly Ile Met His Pro Ile65 70 75 80Glu Glu Glu Phe Trp Ala Lys Glu Lys Leu Val Ala Leu Asp Asn Lys85 90 95Asn Met Ser Tyr Ser Tyr Ile Phe Thr Glu Cys Phe Thr Gly Phe Glu100 105 110Asp Tyr Thr Ala Thr Met Gln Ile Val Glu Gly Pro Glu His Lys Gly115 120 125
Cys Arg Phe Asp Trp Ser Phe Gln Cys Lys Tyr Ile Glu Gly Met Thr130 135 140Glu Ser Ala Phe Ala Glu Ile Leu Gln His Trp Ala Thr Glu Ile Gly145 150 155 160Gln Lys Ile Glu Glu Ile Cys Asn Ala165<210>3<211>682<212>DNA<213>Allium fistulosum L.
<220>
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aag atc atg cct tcg ttg tca gtc tgt gaa ctg gta gaa ggt gag gcc192Lys Ile Met Pro Ser Leu Ser Val Cys Glu Leu Val Glu Gly Glu Ala50 55 60aat gtt gtt ggt tgt gtt cgc cac gtt aaa ggt ata atg cac cca ata240Asn Val Val Gly Cys Val Arg His Val Lys Gly Ile Met His Pro Ile65 70 75 80gaa gag gaa ttt tgg gcc aag gag aag ctg gtg gca ctg gat aat aag288Glu Glu Glu Phe Trp Ala Lys Glu Lys Leu Val Ala Leu Asp Asn Lys85 90 95aac atg agc tac agt tat att ttt act gag tgt ttt aca ggg ttc gag336Asn Met Ser Tyr Ser Tyr Ile Phe Thr Glu Cys Phe Thr Gly Phe Glu100 105 110gat tac acg gct acc atg caa ata gtg gag gga cct gag cac aag gga384Asp Tyr Thr Ala Thr Met Gln Ile Val Glu Gly Pro Glu His Lys Gly115 120 125tgt aga ttt gac tgg tct ttt cag tgc aag tat atc gag ggt atg act432Cys Arg Phe Asp Trp Ser Phe Gln Cys Lys Tyr Ile Glu Gly Met Thr130 135 140gaa tct gca ttc gcc gag att ctg cag cat tgg gct act gaa att ggt480Glu Ser Ala Phe Ala Glu Ile Leu Gln His Trp Ala Thr Glu Ile Gly145 150 155 160cag aaa atc gaa gag att tgc aat gct tgattatgaa tatcggttat 527Gln Lys Ile Glu Glu Ile Cys Asn Ala165ggtttggtgc attgtgtgtg ttttaaaccg tatcttgtga tgtaataaag taacgtaata 587tgtgcacgta ataagtaagc ctgagtgttg tgtgttcaat aaaaaagaac ttgctttttg 647catgttctaa tgcttttcaa aaaaaaaaaa aaaaa 682<210>4<211>169<212>PRT<213>Allium fistulosum L.
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<210>5<211>730<212>DNA<213>Allium chinense L.
<220>
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gag gaa ttt tgg gcc aag gag aag ctg gtt gca ctg gat gat aag aac344Glu Glu Phe Trp Ala Lys Glu Lys Leu Val Ala Leu Asp Asp Lys Asn85 90 95atg agc tgt agt tat att ttt gtt gag tgt ttt aca ggg tac gag gat392Met Ser Cys Ser Tyr Ile Phe Val Glu Cys Phe Thr Gly Tyr Glu Asp100 105 110tac aca gct acc atg caa ata gtg gag gga tct gag cac aag gga tgt440Tyr Thr Ala Thr Met Gln Ile Val Glu Gly Ser Glu His Lys Gly Cys115 120 125aga ttt gac tgg tct ttt cag tgt aag tat atc gag ggt atg act gaa488Arg Phe Asp Trp Ser Phe Gln Cys Lys Tyr Ile Glu Gly Met Thr Glu130 135 140 145tct gca ttc acc gat gtt ctg cag cat tgg gct act gag att ggt cag536Ser Ala Phe Thr Asp Val Leu Gln His Trp Ala Thr Glu Ile Gly Gln150 155 160aaa att gaa gag att tgc aat gct tgatcatgaa taccggttat gttgtgatgc 590Lys Ile Glu Glu Ile Cys Asn Ala165attgtgtctg ttttaatccc tatcttgtga tttaataatg taacgtaata tgcatgtaat 650aagtaagccg agtgttgtgt tttcaataaa atagaatttg cttttgcaag ttctaatgct 710tttcaaaaaa aaaaaaaaaa 730<210>6<211>169<212>PRT<213>Allium chinense L.
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<220>
<221>CDS<222>(55)..(561)<223>P<220>
<221>polyA位點(diǎn)<222>(724)..(739)<223>P<400>7acacaattca gactcacatt acgttatatc aagaagattg tccaatcaga aaaa atg57Met1gag cta aat cct ggt gca cct gct gta gtc gct gat agt gct aac gga105Glu Leu Asn Pro Gly Ala Pro Ala Val Val Ala Asp Ser Ala Asn Gly5 10 15gct cga aaa tgg agc ggc aaa gtc cat gct ttg ctt cca aat aca aag153Ala Arg Lys Trp Ser Gly Lys Val His Ala Leu Leu Pro Asn Thr Lys20 25 30cca gag caa gca tgg aca cta cta aaa gac ttt att aac ctt cac aag201Pro Glu Gln Ala Trp Thr Leu Leu Lys Asp Phe Ile Asn Leu His Lys35 40 45gtc atg cct tcg ttg tca gtc tgt gaa ctg gta gaa ggt gag gcc aat249Val Met Pro Ser Leu Ser Val Cys Glu Leu Val Glu Gly Glu Ala Asn50 55 60 65gtt gtt ggt tgt gtt cgc tac gtt aaa ggt ata atg cac cca ata gaa297Val Val Gly Cys Val Arg Tyr Val Lys Gly Ile Met His Pro Ile Glu70 75 80gag gaa ttt tgg gcc aag gag aag ctg gtg gcg ctg gat aat aag aac345Glu Glu Phe Trp Ala Lys Glu Lys Leu Val Ala Leu Asp Asn Lys Asn85 90 95atg agc tac agt tat att ttt act gag tgt ttt aca ggg tac gag gat393Met Ser Tyr Ser Tyr Ile Phe Thr Glu Cys Phe Thr Gly Tyr Glu Asp100 105 110
tac acg gct acc atg caa ata gtg gag ggt cct gag cac aag gga agt441Tyr Thr Ala Thr Met Gln Ile Val Glu Gly Pro Glu His Lys Gly Ser115 120 125aga ttt gac tgg tct ttt cag tgc aag tat atc gag ggt atg act gaa489Arg Phe Asp Trp Ser Phe Gln Cys Lys Tyr Ile Glu Gly Met Thr Glu130 135 140 145tct gca ttc acc gag att ctg cag cat tgg gct act gag ata ggt cag537Ser Ala Phe Thr Glu Ile Leu Gln His Trp Ala Thr Glu Ile Gly Gln150 155 160aaa atc gaa gag gtt tgc agt gct tgatcatgaa tatcggtttt cagtgctgtg 591Lys Ile Glu Glu Val Cys Ser Ala165atgcattatg tgtcttttaa accttgtctt gtgatataat aaagtaacgt aatatgtgca651tgtaataagt aagactgagt gttgtgtgtt caataaaaaa gaatttgctt tttgcaagtt711ctagtgcttt tcaaaaaaaa aaaaaaaa 739<210>8<211>169<212>PRT<213>Allium cepa L.
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Asn Val Val Gly Cys Val Arg Tyr Val Lys Gly Ile Met His Pro Ile65 70 75 80Glu Glu Glu Phe Trp Ala Lys Glu Lys Leu Val Ala Leu Asp Asn Lys85 90 95Asn Met Ser Tyr Ser Tyr Ile Phe Thr Glu Cys Phe Thr Gly Tyr Glu100 105 110Asp Tyr Thr Ala Thr Met Gln Ile Val Glu Gly Pro Glu His Lys Gly115 120 125Ser Arg Phe Asp Trp Ser Phe Gln Cys Lys Tyr Ile Glu Gly Met Thr130 135 140Glu Ser Ala Phe Thr Glu Ile Leu Gln His Trp Ala Thr Glu Ile Gly145 150 155 160Gln Lys Ile Glu Glu Val Cys Ser Ala165<210>9<211>648<212>DNA<213>Allium ampeloprasum L.
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att tgc aaa gca tgatcatgaa tatgggtcaa tttgtgatgc tgtgtgcatg532Ile Cys Lys Alatgtgttttcc ttctgtcttg tgatgtaatg aaagtaacgt aattccagat gcatgtaatc 592tgtagtgctt gtgttttcaa taaataagaa tttgctttca aaaaaaaaaa aaaaaa 648<210>10<211>164<212>PRT<213>Allium ampeloprasum L.
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Met Gln Leu Val Glu Glu Ser Asp Gln Lys Gly Thr Arg Phe Asp Trp115 120 125Ser Phe Gln Cys Lys Tyr Ile Glu Gly Val Thr Ala Thr Ser Phe Ala130 135 140Ala Val Leu Gln Ile Trp Ala Asp Glu Ile Ala Gln Lys Ile Glu Glu145 150 155 160Ile Cys Lys Ala<210>11<211>737<212>DNA<213>Allium cepa L.
<220>
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<221>polyA位點(diǎn)<222>(722)..(737)<223>P<400>11acaattcaga ctcacattac gttatatcaa gaagattgtc caatcagaaa aa atg gag 58Met Glu1cta aat cct ggt gca cct gct gta gtc gct gat agt gct aac gga gct106Leu Asn Pro Gly Ala Pro Ala Val Val Ala Asp Ser Ala Asn Gly Ala5 10 15cga aaa tgg agc ggc aaa gtc cat gct ttg ctt cca aat aca aag cca154Arg Lys Trp Ser Gly Lys Val His Ala Leu Leu Pro Asn Thr Lys Pro
20 25 30gag caa gca tgg aca cta cta aaa gac ttt att aac ctt cac aag gtc202Glu Gln Ala Trp Thr Leu Leu Lys Asp Phe Ile Asn Leu His Lys Val35 40 45 50atg cct tcg ttg tca gtc tgt gaa ctg gta gaa ggt gag gcc aat gtt250Met Pro Ser Leu Ser Val Cys Glu Leu Val Glu Gly Glu Ala Asn Val55 60 65gtt ggt tgt gtt cgc tac gtt aaa ggt ata atg cac cca ata gaa gag298Val Gly Cys Val Arg Tyr Val Lys Gly Ile Met His Pro Ile Glu Glu70 75 80gaa ttt tgg gcc aag gag aag ctg gtg gcg ctg gat aat aag aac atg346Glu Phe Trp Ala Lys Glu Lys Leu Val Ala Leu Asp Asn Lys Asn Met85 90 95agc tac agt tat att ttt act gag tgt ttt aca ggg tac gag gat tac394Ser Tyr Ser Tyr Ile Phe Thr Glu Cys Phe Thr Gly Tyr Glu Asp Tyr100 105 110acg gct acc atg caa ata gtg gag ggt cct gag cac aag gga agt aga442Thr Ala Thr Met Gln Ile Val Glu Gly Pro Glu His Lys Gly Ser Arg115 120 125 130ttt gac tgg tct ttt cag tgc aag tat atc gag ggt atg act gaa tct490Phe Asp Trp Ser Phe Gln Cys Lys Tyr Ile Glu Gly Met Thr Glu Ser135 140 145gca ttc acc gag att ctg cag cat tgg gct act gag ata ggt cag aaa538Ala Phe Thr Glu Ile Leu Gln His Trp Ala Thr Glu Ile Gly Gln Lys150 155 160atc gaa gag gtt tgc agt gct tgatcatgaa tatcggtttt cagtgctgtg 589Ile Glu Glu Val Cys Ser Ala165atgcattatg tgtcttttaa accttgtctt gtgatataat aaagtaacgt aatatgtgca 649tgtaataagt aagactgagt gttgtgtgtt caataaaaaa gaatttgctt tttgcaagtt 709ctagtgcttt tcaaaaaaaa aaaaaaaa 737
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<220>
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100 105 110tac acg gcc acc atg caa att atg gat gga tgc gag cat aag gga agc443Tyr Thr Ala Thr Met Gln Ile Met Asp Gly Cys Glu His Lys Gly Ser115 120 125aga ttt gag tgg tcc ttc cag tgt aac tac atc gag ggt atg act gaa491Arg Phe Glu Trp Ser Phe Gln Cys Asn Tyr Ile Glu Gly Met Thr Glu130 135 140 145tct gcc ttc act gac att ctg cag cat tgg acc act gag att ggt cag539Ser Ala Phe Thr Asp Ile Leu Gln His Trp Thr Thr Glu Ile Gly Gln150 155 160aaa att gaa gag att tgc agt gct tgattatgaa tatcggttta tgctgtgatg 593Lys Ile Glu Glu Ile Cys Ser Ala165caatgtgtgt gtattaatcc ctgccttgtg atgtgataaa ataacttaat atgtcatatg 653catgtaatag gcaagccagg gtggtgttgt gttctcaata aaaagcattt gctttttgca 713taaaaaaaaa aaa 726<210>16<211>169<212>PRT<213>Allium ampeloprasum L.
<400>16Met Met Thr Tyr Pro Gly Asn Arg Ala Val Ala Thr Asp Gly Ala Lys1 5 10 15Glu Ala Pro Lys Trp Lys Gly Lys Ala Tyr Ala Leu Leu Pro Asn Thr20 25 30Lys Pro Glu His Ala Trp Lys Leu Leu Lys Asp Phe Ile Asn Leu His35 40 45
Lys Thr Met Pro Ser Leu Ser Val Cys Glu Leu Val Glu Gly Glu Val50 55 60Asn Ala Val Gly Cys Val Arg His Val Lys Gly Ile Met His Pro Met65 70 75 80Glu Gln Glu Phe Trp Ala Lys Glu Lys Leu Val Ala Val Asp Asp Lys85 90 95Ala Met Ser Tyr Ser Tyr Ile Phe Thr Glu Cys Phe Thr Gly Tyr Glu100 105 110Asp Tyr Thr Ala Thr Met Gln Ile Met Asp Gly Cys Glu His Lys Gly115 120 125Ser Arg Phe Glu Trp Ser Phe Gln Cys Asn Tyr Ile Glu Gly Met Thr130 135 140Glu Ser Ala Phe Thr Asp Ile Leu Gln His Trp Thr Thr Glu Ile Gly145 150 155 160Gln Lys Ile Glu Glu Ile Cys Ser Ala165<210>17<211>20<212>DNA<213>人工合成序列<220>
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<223>PCR引物<220>
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<220>
<221>修飾堿基<222>(34)..(34)<223>i<220>
<221>修飾堿基<222>(35)..(35)<223>i<400>19ggccacgcgt cgactagtac gggnngggnn gggnng36<210>20<211>30<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>PCR引物<400>20ctcttcgatt ttctgaccta tctcagtagc 30<210>21<211>22<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>PCR引物<400>21atggagctaa atcctggtgc gc 22<210>22<211>22<212>DNA<213>人工合成序列
<220>
<223>PCR引物<400>22atggagcaaa attctggtac gc 22<210>23<211>15<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>PCR引物<220>
<221>修飾堿基<222>(3)..(3)<223>i<220>
<221>修飾堿基<222>(6)..(6)<223>i<220>
<221>修飾堿基<222>(9)..(9)<223>i<400>23ggngcnmgna artgg 15<210>24<211>22<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>PCR引物<400>24atggagctaa atcctggtgc ac 22<210>25<211>25<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>PCR引物<400>25gaattttggg ccaaggagaa gctgg25<210>26<211>25<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>PCR引物<400>26tcctcgtacc ctgtaaaaca ctcag25<210>27<211>23<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>PCR引物<400>27atgatgacat atcctggaaa tcg 23<210>28<211>21
<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>PCR引物<400>28cacacagcat cacaaattga c21<210>29<211>22<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>PCR引物<400>29atggcgcaaa atcctggtgt gc 22<210>30<211>45<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>PCR引物<400>30aactggaaga attcgcggcc gcaggaattt tttttttttt ttttt 4權(quán)利要求
1.DNA，編碼表現(xiàn)出將1-丙烯次磺酸轉(zhuǎn)變?yōu)榇邷I成分的作用的蛋白質(zhì)或多肽。
2.權(quán)利要求1所述的DNA，其中上述DNA是由序列1、5、7、9、13或15所示的堿基序列構(gòu)成的，或由以下(a)～(c)中的任一個(gè)構(gòu)成的(a)由在序列1、5、7、9、13或15所示堿基序列中付加、缺失、或置換1或多個(gè)堿基后的堿基序列構(gòu)成的DNA；(b)在嚴(yán)格條件下與由序列1、5、7、9、13或15所示堿基序列構(gòu)成的DNA可進(jìn)行雜交的DNA；(c)由與序列1、5、7、9、13或15所示堿基序列的同源性在60％以上的堿基序列構(gòu)成的DNA。
3.引物，由序列25所示，用于屬于蔥屬植物的催淚成分合成酶基因的分離。
4.利用序列25所示引物，對屬于蔥屬植物的催淚成分合成酶基因進(jìn)行分離的方法。
5.含有權(quán)利要求1或2所述DNA的重組載體。
6.含有權(quán)利要求1或2所述的DNA重組載體的轉(zhuǎn)化體。
7.具有催淚成分合成酶活性的蛋白質(zhì)或多肽的制造方法，其特征是對用含有權(quán)利要求1或2所述的DNA重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，然后對產(chǎn)生在培養(yǎng)基中或細(xì)胞中的具有催淚成分合成酶活性的蛋白質(zhì)或多肽進(jìn)行分離。
8.具有催淚成分合成酶活性的蛋白質(zhì)或多肽，含有以下任一個(gè)序列(a)序列2、6、8、10、14或16所示的氨基酸序列、(b)在序列2、6、8、10、14或16所示的氨基酸序列中付加、缺失或置換1或多個(gè)氨基酸后的氨基酸序列、或(c)與序列2、6、8、10、14或16所示氨基酸序列的同源性在65％以上的氨基酸序列。
9.具有抑制權(quán)利要求8所述蛋白質(zhì)或多肽的mRNA翻譯的功能的核酸分子。
全文摘要
本發(fā)明涉及與粉碎或切斷洋蔥等植物時(shí)發(fā)生催淚成分的生成有關(guān)的表現(xiàn)出將1－丙烯次磺酸轉(zhuǎn)變?yōu)榇邷I成分的作用的蛋白質(zhì)或多肽、編碼該蛋白質(zhì)或多肽的DNA(催淚成分合成酶基因)、使用用于屬于蔥屬植物的催淚成分合成酶基因分離的引物以及使用該引物分離該基因的方法、含有上述DNA的重組載體、包含含有上述DNA的重組載體的轉(zhuǎn)化體、對用含有上述DNA的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)制造具有催淚成分合成酶活性的蛋白質(zhì)或多肽的方法、具有催淚成分合成酶活性的蛋白質(zhì)或多肽、以及具有抑制具有催淚成分合成酶活性的蛋白質(zhì)或多肽的mRNA翻譯的功能的核酸分子。
文檔編號C12N15/82GK1639337SQ0380504
公開日2005年7月13日 申請日期2003年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月1日
發(fā)明者今井真介, 柘植信昭, 鐮田庸宏, 正村典也, 正野仁慈 申請人:好侍食品株式會(huì)社