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一種從復雜組分物質如中藥和化學混合物中高通量篩選、捕獲和分離目標分子的方法

文檔序號:422526閱讀:386來源:國知局
專利名稱:一種從復雜組分物質如中藥和化學混合物中高通量篩選、捕獲和分離目標分子的方法
技術領域
本發(fā)明是在基礎分子生物學及生物醫(yī)學領域中,提出了一種新的從復雜組分物質如中藥和組合化學混合物中高通量篩選、捕獲和分離目標分子的方法,即運用檢測特定DNA/RNA結合蛋白的雙鏈核酸或肽核酸微陣列芯片與DNA/RNA結合蛋白反應,建立DNA/RNA結合蛋白與芯片上雙鏈核酸或肽核酸靶點結合的親合性,作為標準參照體系;再將復雜組分物質與微陣列芯片反應,反應后微陣列芯片繼續(xù)與DNA/RNA結合蛋白反應,通過對照標準參照體系,篩選出復雜組分物質與微陣列芯片反應后,那些與DNA/RNA結合蛋白反應親合性發(fā)生變化的微陣列芯片探針,用這些探針制備親合層析介質,使親合層析介質與復雜組分物質發(fā)生親合結合反應,捕獲復雜組分物質中與親合層析探針特異結合的組分,通過洗脫,分離該組分;本發(fā)明提出的方法為建立了一種創(chuàng)新性的高通量藥物篩選模型,即高通量篩選DNA/RNA結合蛋白的DNA/RNA靶點結合藥物性小分子,因此本發(fā)明在在生物醫(yī)學領域,特別是創(chuàng)新藥物與中藥現(xiàn)代化研究中具有重要的應用價值。
背景技術
藥物研究是十分復雜的工程,最突出的特點是周期長,投入高,風險大,影響因素多,因此提高藥物研發(fā)的效率在醫(yī)藥研究中具有重要意義。在藥物研究的藥物發(fā)現(xiàn)、臨床前研究和臨床研究三個階段中,藥物發(fā)現(xiàn)是制約藥物研究的關鍵環(huán)節(jié)。藥物發(fā)現(xiàn)不僅決定著藥物的有無,同時也決定著藥物研究的成敗與藥物的質量,因此國際藥物研究機構都對藥物發(fā)現(xiàn)過程給予了極大的關注。藥物發(fā)現(xiàn)需要篩選對可能作為藥物使用的物質進行藥物價值的評價,即藥物篩選。篩選的樣品越多,發(fā)現(xiàn)新藥的可能性越大,因此高通量藥物篩選技術成為目前藥物篩選的重要平臺。高通量藥物篩選就是應用先進的技術手段,同時對大量的被篩選樣品(samples)就生物學活性或藥理活性進行分析評價的過程。高通量藥物篩選采用的篩選模型是體外微量實驗方法,主要是分子和細胞水平的評價方法,而不是傳統(tǒng)的動物實驗或組織器官實驗方法,這種微量實驗方法減少了樣品試劑材料的消耗,減低了篩選成本,但需要檢測方法具有較高的特異性和靈敏性。高通量藥物篩選所采用的藥物篩選模型(或藥物篩選方法)要求藥物篩選模型能夠高通量靈敏地反映樣品所具有的內在活性,因此是實現(xiàn)高通量藥物篩選的技術關鍵。常用的高通量藥物篩選模型可以根據(jù)其生物學特點分為以下幾類①受體結合分析法;②酶活性測定法;③細胞因子測定法;④細胞活性測定法;⑤代謝物質測定法;⑥基因產物測定法。因此,建立更多的創(chuàng)新性的高通量藥物篩選模型對于高通量藥物篩選非常重要。
中藥的藥效物質基礎(有效成分或部位)和作用機制非常復雜,現(xiàn)有的傳統(tǒng)藥理學與化學相結合的研究方法周期長、耗時多、所需財力大,且由于藥理模型等因素限制,難以闡明中藥多成分、多靶點的作用機制;免疫組織化學法、流式細胞儀檢測法雖然研究周期大大縮短,但難以大量獲取中藥治病的復雜機理蘊涵的大量生物信息。生物芯片具有自動化高通量獲取生物信息的功能,因而在中藥作用機制的研究中已經發(fā)揮了重要作用。運用基因表達芯片檢測疾病和正常組織或中藥處理前后組織細胞基因表達譜的變化,能夠發(fā)現(xiàn)病癥相關基因和藥物效應基因,進行中藥作用機理和中藥靶標篩選的研究;因此這種利用基因芯片發(fā)現(xiàn)藥物效應基因,篩選中藥作用靶點和探討中藥作用機理的研究目前已經成為中藥研究的重要技術。但這種研究的局限性在于不能揭示藥物究竟是如何引起效應基因表達改變的,因而對藥物作用的具體靶點、途徑、方式以及藥物發(fā)揮作用的具體成分不得而知,對于藥物發(fā)揮作用的有效成分的鑒定、分離仍然無能為力。到目前為止,這方面研究的進展并沒有達到人們在藥物研究中的預期結果。中藥研究迫切需要研究技術的創(chuàng)新。
本發(fā)明所提出的雙鏈DNA微陣列芯片研究中藥作用機理和篩選中藥有效成分的技術體系,充分利用雙鏈DNA微陣列芯片能夠檢測生物分子相互作用的特點,特別是DNA與蛋白質的相互作用,從具體的調控蛋白分子與其不同基因的啟動子序列的DNA結合特性,受到中藥等小分子的調控為切入點,在基因表達調控有關的生物分子相互作用層次上,進行中藥作用機理的研究。這種研究方法將“疾病—藥物—作用靶點—有效成分—機理”緊密地聯(lián)系在一起,既是對中藥作用機理的研究,同時是對中藥有效成分的篩選;能夠回答中藥中什么成分、通過怎樣的途徑、作用在什么靶點,產生了療效;同時將那些真正發(fā)揮療效的成分從中藥復雜組成的海洋中分離出來,進行其化學性質的鑒定和藥理學研究,進而開發(fā)新的候選藥物和指導組合化學分子設計。因此本發(fā)明從基因表達調控中DNA/蛋白質分子相互作用的分子生物學層次,在國內外首先建立運用雙鏈DNA微陣列芯片研究中藥作用機理、篩選中藥序列特異性DNA結合或DNA/蛋白質相互作用干預性成分的技術及思想體系。這一技術及思想體系完全不同于目前普遍運用單鏈DNA基因表達芯片研究中藥作用下基因表達譜變化的方法,因此建立了一種創(chuàng)新的藥物篩選模型,這一模型尤其適合中藥等組成成分非常復雜的研究體系。
大量的研究發(fā)現(xiàn),許多疾病與基因異常表達調控有關,而中藥治療這些疾病能取得顯著療效且毒副作用小,因此從基因表達調控的水平研究中藥作用的機制、篩選和分離中藥活性成分具有重要意義。眾多研究也表明,很多藥物分子依賴與基因組DNA或蛋白質分子的直接相互作用,直接或間接地影響DNA復制、基因轉錄、翻譯和修飾等發(fā)揮其藥物效應,因此直接從生物分子相互作用,特別是DNA/蛋白質相互作用的水平研究中藥作用的機制和篩選中藥活性成分是非常有價值的。我們的大量前期研究表明,雙鏈DNA芯片能夠非常有效地檢測基因表達調控中序列特異性DNA/蛋白質的相互作用,因此本發(fā)明提出制備雙鏈DNA微陣列芯片,從生物分子相互作用的深度研究中藥作用機理、鑒定中藥作用靶點、在線捕獲和分離中藥活性成分的研究。本發(fā)明確立的實驗體系能說明中藥中哪些成分,在基因表達調節(jié)的哪個靶點,通過怎樣的分子相互作用,導致了中藥的醫(yī)療效果。

發(fā)明內容
(1)發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供一種從復雜組分本發(fā)明提出一種從復雜組分物質如中藥(herbs)和組合化學(combinatorial chemistry)混合物中高通量篩選(screening)、捕獲(capturing)和分離(isolating)目標分子的新方法,為高通量藥物篩選(highthroughput screening,HTS)建立新的藥物篩選模型,即通過復雜組分物質與雙鏈DNA(或RNA/PNA)微陣列芯片的體外微量雜交實驗,從分子相互作用水平判斷藥物樣品的DNA結合活性,并通過親合層析捕獲和分離藥物樣品中的DNA結合活性組分;再通過對所分離組分的化學性質及藥理學研究,將所分離組分開發(fā)成為先導藥物(leading drugs)。
該方法首先針對特定目標的序列特異性DNA結合蛋白,特別是轉錄因子如NF-κB、核受體,p53等,在固相支持物表面制備一種雙鏈脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)或具有相似功能的肽核酸(PNA)微陣列芯片,使其dsDNA探針上嵌合序列特異性DNA結合蛋白的DNA結合位點,用以高通量定量檢測細胞內或人工反應體系內序列特異性DNA結合蛋白的含量,并通過序列特異性DNA結合蛋白與微陣列芯片的結合分析,建立序列特異性DNA結合蛋白與其芯片上各DNA靶點的結合親合性標準參數(shù)體系;再運用該微陣列芯片與復雜組分物質如中藥和化學混合物反應,反應后通過檢測序列特異性DNA結合蛋白與其芯片上各DNA靶點的結合親合性變化,篩選與標準參數(shù)體系比較,那些結合親合性改變了的DNA靶點;將其作為DNA親合介質連接到層析柱表面,制備特異性DNA探針層析柱;再將復雜組分物質如中藥和化學混合物灌柱,用DNA探針捕獲復雜組分物質中與DNA探針特異結合的有效分子;最后經洗脫收獲與DNA探針分離的有效分子,進行其化學性質、分子生物學基礎及藥理學研究,開發(fā)成為序列特異性DNA結合蛋白DNA靶點特異性候選藥物。該發(fā)明的技術及思想體系,在基礎分子生物學研究,特別是序列特異性DNA結合蛋白(轉錄因子)基因表達調控,以及生物醫(yī)學研究,如序列特異性DNA結合蛋白(轉錄因子)相關疾病藥物作用機理研究和藥物性分子篩選中有廣泛而重要的應用價值。
(2)技術方案本發(fā)明采用多種技術方法在固相支持物表面制備的雙鏈DNA微陣列芯片,用于復雜組分物質中活性靶分子的篩選、捕獲和分離。下面以制備和利用雙鏈DNA微陣列芯片為例,說明本發(fā)明的技術操作流程。
(2.1)制備雙鏈DNA微陣列芯片
①.雙分子雙鏈DNA微陣列芯片的制備方法依靠原位合成法制備雙分子雙鏈DNA微陣列芯片可按照Church等的方法進行(USPatent 6326489);點樣法制備雙鏈DNA微陣列芯片可按其他方法進行,如兩互補寡核苷酸復性。
②.單分子雙鏈DNA微陣列芯片的制備方法單分子雙鏈DNA微陣列芯片的制備可按照Lockhart等(US Patent 5556752)、王進科等(China Patent 02112780.8;02137945.9)的方法進行;單分子雙鏈DNA微陣列芯片也可以用其他方法進行制備。
不管運用上述何種方法制備雙鏈DNA微陣列芯片,該雙鏈DNA微陣列芯片的雙鏈DNA探針分子上必須嵌合針對特定DNA結合蛋白,特別是序列特異性DNA結合蛋白如轉錄因子的結合位點,如針對NF-κB蛋白的DNA結合位點Ig-κB(GGGACTTTCC)。并且,雙鏈DNA探針分子上特定DNA結合蛋白的DNA結合位點,與固相介質間具有充分的空間距離,便于分子反應;在DNA結合位點兩側應含有適當長度的核苷酸序列,創(chuàng)造有利于DNA結合蛋白或藥物或組合化學分子與DNA結合位點發(fā)生結合反應的有利環(huán)境。
(2.2)建立DNA/蛋白質相互作用親合性標準體系①.培養(yǎng)特定細胞(如HeLa細胞),培養(yǎng)基中加不同種類的DNA結合蛋白(如NF-κB)表達誘導劑(如TNF-α)誘導適當時間,收集培養(yǎng)細胞,抽提制備DNA結合蛋白純蛋白;或構建DNA結合蛋白原核或真核表達載體,將載體引物原核或真核表達系統(tǒng)(細胞或無細胞表達系統(tǒng)),制備不同種類DNA結合蛋白純蛋白;②.DNA結合蛋白檢測雙鏈DNA微陣列芯片雜交用適當封閉劑(blocking reagents)(如牛血清白蛋白BSA;鮭魚精DNA,脫脂奶粉;Denharts溶液等)封閉;③.不同種類DNA結合蛋白純蛋白與DNA結合蛋白檢測雙鏈DNA微陣列芯片在適宜溫度雜交適當時間;雜交液中應含有適量兩性電解質(如HEPES,Tris-HCl)、擔體(如dI-dC)、陽離子(如Na+,K+)、去污劑(如NP-40)、抗氧化劑(如DTT)等,提供DNA結合蛋白與DNA結合的環(huán)境條件;④.除去雜交液,芯片用洗滌緩沖液洗滌(如含有適量Tween-20或Triton-100的PBS溶液);⑤.芯片與熒光標記DNA結合蛋白抗體雜交(或先與DNA結合蛋白抗體雜交,再與熒光標記二抗雜交);步驟③-⑤也可以直接用熒光標記的DNA結合蛋白純蛋白與芯片的雜交代替;⑥.芯片在微陣列芯片掃描儀(或熒光顯微鏡、化學發(fā)光、磷光成像儀等)上觀察,記錄熒光等信號;⑦.依據(jù)芯片上各DNA探針的熒光等信號,分析DNA結合蛋白與不同DNA靶點結合的親合性,建立標準參數(shù)體系。
(2.3)篩選DNA結合蛋白的DNA靶點特異性結合小分子
①.DNA結合蛋白檢測雙鏈DNA微陣列芯片用適當封閉劑(blocking reagents)(如牛血清白蛋BSA;脫脂奶粉;Denharts溶液等)封閉;②.DNA結合蛋白檢測雙鏈DNA微陣列芯片與含有組合化學分子或天然生物分子(如中藥)的雜交液雜交;雜交液中應含有適量兩性電解質(如HEPES,Tris-HCl)、擔體(如dI-dC)、陽離子(如Na+,K+)、去污劑(如NP-40)、抗氧化劑(如DTT)等,提供NF-κB與DNA結合的環(huán)境條件;③.除去雜交液,芯片用洗滌緩沖液洗滌(如含有適量Tween-20或Triton-100的PBS溶液);④.DNA結合蛋白純蛋白再與DNA結合蛋白檢測雙鏈DNA微陣列芯片在適宜溫度雜交;雜交液中應含有適量兩性電解質(如HEPES,Tris-HCl)、擔體(如dI-dC)、陽離子(如Na+,K+)、去污劑(如NP-40)、抗氧化劑(如DTT)等,提供DNA結合蛋白與DNA結合的環(huán)境條件;⑤.除去雜交液,芯片用洗滌緩沖液洗滌(如含有適量Tween-20或Triton-100的PBS溶液);⑥.芯片與熒光標記DNA結合蛋白抗體雜交(或先與DNA結合蛋白抗體雜交,再與熒光標記二抗雜交);步驟④-⑥也可以直接用熒光標記的DNA結合蛋白純蛋白與芯片的雜交代替;⑦.芯片在微陣列芯片掃描儀(或熒光顯微鏡、化學發(fā)光、磷光成像儀等)上觀察,記錄熒光等信號;⑧.將芯片上DNA探針系統(tǒng)呈現(xiàn)的熒光等信號和芯片直接與DNA結合蛋白雜交呈現(xiàn)的熒光等信號(對照)進行比較,尋找那些熒光等信號出現(xiàn)變化的DNA探針;⑨.用熒光等信號出現(xiàn)變化的DNA探針制備親合層析介質;⑩.用制備的親合層析介質對組合化學分子或天然生物分子(如中藥)混合物進行親合層析,分離與DNA結合蛋白的DNA結合位點所結合的靶分子,并對分離純化的靶分子進行化學性質鑒定及生理、藥理作用分析研究,進而開發(fā)成為新的候選藥物。
(2.4)篩選DNA/蛋白質相互作用干擾性小分子①.DNA結合蛋白檢測DNA微陣列芯片雜交用適當封閉劑(blocking reagents)(如牛血清白蛋BSA;脫脂奶粉;Denharts溶液等)封閉;②.DNA結合蛋白檢測雙鏈DNA微陣列芯片再與含有組合化學分子或天然生物分子(如中藥)及DNA結合蛋白的雜交液雜交;雜交液中應含有適量兩性電解質(如HEPES,Tris-HCl)、擔體(如dI-dC)、陽離子(如Na+,K+)、去污劑(如NP-40)、抗氧化劑(如DTT)等,提供NA結合蛋白與DNA結合的環(huán)境條件;③.除去雜交液,芯片用洗滌緩沖液洗滌(如含有適量Tween-20或Triton-100的PBS溶液);④.芯片與熒光標記DNA結合蛋白抗體雜交(或先與DNA結合蛋白抗體雜交,再與熒光標記二抗雜交);步驟②-④也可以直接用熒光標記的DNA結合蛋白純蛋白與芯片的雜交代替;⑤.芯片在微陣列芯片掃描儀(或熒光顯微鏡、化學發(fā)光、磷光成像儀等)上觀察,記錄熒光等信號;⑥.將芯片上DNA探針系統(tǒng)呈現(xiàn)的熒光等信號和芯片直接與DNA結合蛋白雜交呈現(xiàn)的熒光等信號(對照)進行比較,尋找那些熒光等信號出現(xiàn)變化的DNA探針,⑦.用那些熒光等信號出現(xiàn)變化的DNA探針制備親合介質;⑧.用DNA探針制備親合介質對組合化學分子或天然生物分子(如中藥)混合物在DNA結合蛋白存在的情況下進行親合層析,分離與DNA結合蛋白/DNA結合位點共同作用的靶分子,并對分離純化的靶分子進行化學性質鑒定及生理、藥理作用分析研究,進而開發(fā)成為新的候選藥物。
上述方法(2.2)-(2.4)中,為了實現(xiàn)DNA結合蛋白與芯片雜交結果的檢測,所進行的DNA結合蛋白、DNA結合蛋白抗體、DNA結合蛋白二抗的熒光標記,可以用放射性同位素(如32P等)、酶(如HRP)、金屬(如Ag)等標記代替,而采用放射性同位素檢測(如X光膜感光、磷成像phosphoimaging等)、化學發(fā)光(如CSPD等)、化學生色(如NTP)及金標等檢測方法代替;甚至DNA結合蛋白、DNA結合蛋白抗體、DNA結合蛋白二抗等不進行任何標記,而采用物理學方法如原子力顯微鏡(AFM)等手段進行檢測;其他非標記的DNA/蛋白質相互作用檢測方法同樣可以用于DNA結合蛋白檢測雙鏈DNA微陣列芯片的檢測。
上述技術方案中(2.3)-(2.4)僅僅是運用本發(fā)明所提出的技術體系篩選兩類生物活性分子的示例,并不是本發(fā)明所提出的技術體系在藥物研究或基礎研究中應用的全部內容,只要是運用本發(fā)明所提出的雙鏈DNA微陣列芯片研究藥物作用機理和篩選藥物或用于其他目的分子,都是本專利所包括的。
(3)技術效果本發(fā)明提出的DNA結合蛋白檢測雙鏈核酸微陣列芯片為一種高通量檢測各種與雙鏈核酸能夠在自然生物環(huán)境中發(fā)生相互作用的蛋白質的技術平臺,這一技術將在兩個領域發(fā)揮重要作用,一是為DNA結合蛋白相關基礎分子生物學中基因表達調控和信號傳導提供新的高通量研究手段,二是為生物醫(yī)學中DNA結合蛋白相關多種疾病候選藥物分子的高通量篩選及病理、藥理學研究提供新的技術手段。
本發(fā)明提出的DNA結合蛋白檢測雙鏈核酸微陣列芯片為高檢測核酸結合蛋白與其雙鏈核酸靶點相互作用(結合作用)提供了很好的技術手段。為了確證這一功能,我們運用專利技術(02137945.9;02112780.8)制備了含有30個野生型NF-κB蛋白靶DNA序列(表1)的雙鏈DNA微陣列芯片,檢測了NF-κB家族蛋白p50同二聚體與30個野生型NF-κB靶DNA序列的結合親合性,我們發(fā)現(xiàn)待檢溶液中的p50同二聚體蛋白能夠以非常不同的親合性與各DNA位點結合(如附圖7),證明含有30個野生型NF-κB靶DNA序列的dsDNA微陣列芯片完全能夠通過一次實驗,高通量測定NF-κB家族蛋白p50同二聚體與眾多野生型DNA靶點結合的親合性;這一結果有力地說明雙鏈核酸微陣列芯片在檢測序列特異性轉錄因子與其靶DNA序列的結合特異性和親合性時非常高效可靠,是一種基于生物芯片技術思想的高通量檢測序列特異性DNA結合蛋白與其基因組中靶dsDNA位點相互作用規(guī)律的新技術。
表1 NF-κB檢測雙鏈DNA微陣列芯片上30個野生型NF-κB結合DNA位點

我們運用DNA結合蛋白NF-κB為研究對象證實了本發(fā)明的技術效果。NF-κB是一類序列特異性轉錄因子,參與眾多基因的表達調控;如當細胞受到炎癥介質、病毒感染、氧化應激等多種物質刺激后,NF-κB在胞質內被激活,進入細胞核與病毒(HIV, Adenovirus,HSV,SIV,SV-40,EBV)、細胞因子(IFN,TNF,IL-1,IL-2,IL-6,IL-8,IL-10,IL-11,IL-12,IL-13)、生長因子(G-CSF,GM-CSF,EPO,M-CSF,VEGF C)、細胞粘附分子(ELAM-1,ICAM-1,VCAM-1,MadCAM-1,Endoglin)、急性相反應蛋白(Angiotensinogen,beta-defensin-2,Tissue factor-1,Pentraxin PTX3,Complement factor C4)、酶(ADH,Lysozyme,PIM-1,Serpin 2A,GelatinaseB,GD3-synthase)、免疫球蛋白(Ig κlight chain)等基因增強子序列結合,增強這些基因的轉錄;因而在一系列由細胞因子、炎癥介質及蛋白酶類參與的疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。大量的研究表明NF-κB過度活化與炎癥、血管疾病、腫瘤、病毒感染、腦血管疾病、阿爾茨海默病、帕金森氏病、過敏性腦炎、感染性休克、風濕性關節(jié)炎、支氣管哮喘、動脈粥樣硬化、潰瘍性結腸炎等病理過程存在非常密切的關系。因此目前NF-κB已成為新藥開發(fā)的重要靶點,許多生物和生化抑制劑能夠阻斷NF-κB信號通路或抑制NF-κB/DNA結合,從而有助于NF-κB相關疾病的治療。因此,篩選抑制NF-κB作用的最佳部位是NF-κB與DNA的相互結合作用,只要能夠封閉或干擾NF-κB與DNA的相互結合作用,就能夠有效地抑制NF-κB作用。大量的實驗已經證明許多小分子能夠與NF-κB的DNA靶點直接結合,封閉或干擾NF-κB與DNA的相互結合,有效地抑制NF-κB對DNA靶點調控的下游基因的表達增強作用,如己酮可可堿[Pentoxifylline(1-(5′-oxohexyl)3,7-dimetylxanthine,PTX)]、1,25-二羥膽骨化醇[Calcitriol(1,25-dihydroxyvitamine D3)]、羥基吡啶硫酮(Pyrithione)、甲基紅霉素(Clarithromycin)、Quinadril(ACE inhibitor)、阱(Diamide)、三(氮)唑核苷,病毒唑(抗病毒藥)(ribavirin)、醌衍生物[E3330(quinone derivative)]、血液復合胺衍生物[Serotonin derivative(N-(p-coumaroyl)serotonin,SC)]、除銹霉素A(Herbimycin A)、水楊酸偶氮磺胺吡啶(Sulfasalazine)、對苯二酚(Hydroquinone(HQ))、洛凡司丁(Mevinolin),5′-甲硫腺苷[5′-methylthioadenosine(MTA)]、嗎啡合成衍生[KT-90(morphine synthetic derivative)]、N-乙基-順丁烯二酰亞胺[N-ethyl-maleimide(NEM)]、煙堿(Nicotine)等。特別是研究表明,中藥中存在一些小分子,能夠直接與NF-κB的DNA靶點直接結合,封閉或干擾NF-κB與DNA的相互結合,有效地抑制NF-κB對DNA靶點調控的下游基因的表達增強作用,如甘草酸(Glycyrrhizin)(抗病毒)、金絲桃素(Hypericin)(抗病毒、腫瘤)、水飛薊(黃酮)(Silymarin)(保肝)。我們運用甘草酸(甘草皂苷、甘草甜素)研究了運用NF-κB檢測dsDNA微陣列芯片高通量篩選NF-κB相關多種疾病候選藥物分子的可行性,我們觀察到隨著NF-κB蛋白體系中存在的甘草酸分子濃度的逐步提高,NF-κB蛋白與DNA靶點結合的親合性越低,即證明甘草酸分子競爭性占據(jù)了芯片DNA探針上的NF-κB蛋白結合位點,導致芯片上可供NF-κB蛋白結合的DNA位點減少。這些研究表明運用雙鏈核酸微陣列芯片可以高通量篩選中藥或組合化學藥物中潛在的“核酸結合蛋白/核酸”相互作用干擾性分子,開發(fā)新的核酸結合蛋白相關疾病候選藥物、研究藥物作用機理在技術上是完全可性的。


圖1是固相支持物表面制備的雙鏈核酸微陣列芯片示意2是雙鏈核酸微陣列芯片上雙鏈核酸探針及蛋白質結合位點示意3是雙鏈核酸微陣列芯片與蛋白質結合建立親合性標準參數(shù)體系分子示意4是雙鏈核酸微陣列芯片與復雜組分物質反應及蛋白結合檢測示意5是鑒定雙鏈核酸微陣列芯片與復雜組分物質反應探針及親合介質制備示意6是親合介質捕獲并分離復雜組分物質中效應分子示意7是示例蛋白與雙鏈核酸微陣列芯片雜交建立親合性參數(shù)體系實驗圖五具體實施方式
1、雙鏈核酸微陣列芯片的準備下面僅以示例蛋白NF-κB與制備在玻片上的雙鏈DNA微陣列芯片反應為例,說明本發(fā)明技術實施。
單鏈寡核苷酸的設計及化學合成運用中國專利(02112780.8)技術設計并用固相化學合成技術合成探針單鏈寡核苷酸,制備檢測NF-κB的雙鏈DNA微陣列芯片。合成的探針單鏈寡核苷酸構件如下5′NH2-TTTTAGTTGAG CGTACGC-GCGTACG-OH 3′;其中方框內DNA序列為一個示例NF-κB結合位點,其他位點序列如表1所示。下劃線序列為兩方向互補序列。用合成的寡核苷酸,按下面技術方案進行NF-κB檢測雙鏈DNA微陣列芯片的制備①.固相化學合成一條較短的寡核苷酸(如表2⑦1),使寡核苷酸含有NF-κB結合位點(紅色堿基GGGACTTTCC),并且在其3′端(羥基)含有兩段鏈內反向互補序列(黃色堿基);②.將氨基寡核苷酸⑦1以40μM溶解在碳酸緩沖液(0.1M carbonate buffer,pH9.0)中,用PixSys5500(Cartesian Technology Inc.)點樣(濕度80%)到醛基修飾玻片表面,點樣后置于濕盒內0.1M碳酸緩沖液(pH9.0)浸濕的濾紙上,密封濕盒,在37℃溫育1小時,再用0.1%SDS溶液洗滌2分鐘;玻片用滅菌雙蒸水簡單淋洗后,轉入硼氫化鈉溶液
中,浸泡3分鐘,再用滅菌雙蒸水淋洗兩次,氮氣吹干,4℃保存?zhèn)溆?;?將10μL雜交液加到步驟2制備的寡核苷酸⑥1的微陣列上,用憎水硅烷[PlusoneRepel-Silane ES(Dimethyldichlorosilance solution 2% w/v in octamethylcyclotetrasixane),Pharmacia Biotech)處理的蓋玻片覆蓋溶液及微陣列,放置于密封濕盒內60℃復性1小時;復性后玻片用2×SSC/0.1%SDS溶液洗滌2分鐘,用滅菌雙蒸水簡單淋洗,氮氣吹干,4℃保存?zhèn)溆?;?將10μL DNA聚合酶反應緩沖液[Polymerase Reaction50mM Tris-HCl(pH7.2),10mM MgSO4,0.1mM DTT,40μM dNTP,20μg/ml acetylated BSA,2U/μl DNApolymerase Ilarge(Klenow)fragment(3′to 5′exo-;Promega,Madison,WI)]加到步驟3制備的寡核苷酸微陣列上,用憎水硅烷[PlusoneRepel-Silane ES(Dimethyldichlorosilance solution 2% w/v in octamethylcyclotetra-sixane),PharmaciaBiotech)處理的蓋玻片覆蓋溶液及微陣列,放置于密封濕盒內37℃延伸反應1小時;反應后玻片用2×SSC/0.1% SDS和0.2×SSC/0.1%SDS溶液各洗滌5分鐘,用滅菌雙蒸水簡單淋洗,氮氣吹干,4℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.NF-κB檢測DNA微陣列芯片檢測待檢測物中NF-κB蛋白的技術操作①.轉錄因子NF-κB p50蛋白用人p50全長cDNA(編碼453氨基酸)表達載體在細菌中表達提取(Promega,Madison,WI);②.NF-κB檢測DNA微陣列芯片用5%BSA/PBS溶液封閉室溫封閉1小時③.適量NF-κB蛋白溶解于DNA結合緩沖液中(DNA-binding buffer10mM HEPES pH7.9,50mM KCl,2.5mM DTT,0.1mM EDTA,0.05%NP-40,10%Glycerol,5%BSA),室溫保育30分鐘;取10μL DNA結合緩沖液滴加到NF-κB檢測DNA微陣列上,用憎水硅烷[PlusoneRepel-Silane ES(Dimethyldichlorosilance solution 2% w/v inoctamethylcyclotetrasixane),Pharmacia Biotech)處理的蓋玻片覆蓋溶液及微陣列,放置于密封濕盒內37℃或室溫保育1小時;④.反應后玻片在室溫下分別用PBS/0.05% Tween 20,PBS/0.01% Triton 100及PBS(141mM NaCl,7.2mM Na2HPO4,2.8mM NaH2PO4,pH7.4)洗滌15min;⑤.氮氣吹干玻片,取10μL,含有適量熒光素Cy3(FluoroLinkTMCy3 monofunctional dye,Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ)標記的NF-κB蛋白抗體[NF-κB p50(E-10)sc-8414,Santa Cruz Biotechnology,Inc.]的PBS(141mM NaCl,7.2mMNa2HPO4,2.8mM NaH2PO4,pH7.4)溶液,滴加到NF-κB檢測DNA微陣列上,用憎水硅烷[PlusoneRepel-Silane ES(Dimethyldichlorosilance solution 2% w/v inoctamethylcyclotetrasixane),Pharmacia Biotech)處理的蓋玻片覆蓋溶液及微陣列,放置于密封濕盒內37℃或室溫保育1小時;⑥.抗體反應后,玻片用PBS(141mM NaCl,7.2mM Na2HPO4,2.8mM NaH2PO4,pH7.4)溶液室溫洗滌30分鐘,再用用滅菌雙蒸水簡單淋洗,氮氣吹干。
⑦.芯片在微陣列芯片掃描儀(如ScanArrayLite,Packard Biochip Technologies)上掃描(適當參數(shù)channel、laser power,PMT gain,resolution.),記錄熒光信號;⑧.用芯片芯片熒光信號分析軟件(如QuantArraymicroarray analysis software,PackardBiochip Technologies)進行數(shù)據(jù)分析。檢測結果如圖7所示。
3.NF-κB檢測DNA微陣列芯片檢測中藥中NF-κB蛋白DNA靶點結合分子的操作①.轉錄因子NF-κB p50蛋白用人p50全長cDNA(編碼453氨基酸)表達載體在細菌中表達提取(Promega,Madison,WI);②.NF-κB檢測DNA微陣列芯片用5%BSA/PBS溶液封閉室溫封閉1小時③.將適量中藥萃取物溶于DNA結合緩沖液中(DNA-binding buffer10mM HEPESpH7.9,50mM KCl,2.5mM DTT,0.1mM EDTA,0.05%NP-40,10%Glycerol,5%BSA),37℃保育1小時;取10μL DNA結合緩沖液滴加到NF-κB檢測dsDNA微陣列上,用憎水硅烷[PlusoneRepel-Silane ES(Dimethyldichlorosilance solution 2% w/v inoctamethylcyclotetrasixane),Pharmacia Biotech)處理的蓋玻片覆蓋溶液及微陣列,放置于密封濕盒內37℃或室溫保育2小時;④.反應后玻片在室溫下分別用PBS/0.05% Tween 20,PBS/0.01% Triton 100及PBS(141mM NaCl,7.2mM Na2HPO4,2.8mM NaH2PO4,pH7.4)洗滌15min;⑤.適量NF-κB蛋白溶解于DNA結合緩沖液中(DNA-binding buffer10mM HEPESpH7.9,50mM KCl,2.5mM DTT,0.1mM EDTA,0.05%NP-40,10%Glycerol,5%BSA),室溫保育30分鐘;取10μL DNA結合緩沖液滴加到NF-κB檢測DNA微陣列上,用憎水硅烷[PlusoneRepel-Silane ES(Dimethyldichlorosilance solution 2% w/v inoctamethylcyclotetrasixane),Pharmacia Biotech)處理的蓋玻片覆蓋溶液及微陣列,放置于密封濕盒內37℃或室溫保育1小時;⑥.反應后玻片在室溫下分別用PBS/0.05% Tween 20,PBS/0.01%Triton 100及PBS(141mM NaCl,7.2mM Na2HPO4,2.8mM NaH2PO4,pH7.4)洗滌15min;⑦.氮氣吹干玻片,取10μL含有適量熒光素Cy3(FluoroLinkTMCy3 monofunctional dye,Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ)標記的NF-κB蛋白抗體[NF-κB p50(E-10)sc-8414,Santa Cruz Biotechnology,Inc.]的PBS(141mM NaCl,7.2mMNa2HPO4,2.8mM NaH2PO4,pH7.4)溶液,滴加到NF-κB檢測DNA微陣列上,用憎水硅烷[PlusoneRepel-Silane ES(Dimethyldichlorosilance solution 2% w/v inoctamethylcyclotetrasixane),Pharmacia Biotech)處理的蓋玻片覆蓋溶液及微陣列,放置于密封濕盒內37℃或室溫保育1小時;
⑧.抗體反應后,玻片用PBS(141mM NaCl,7.2mM Na2HPO4,2.8mM NaH2PO4,pH7.4)溶液室溫洗滌30分鐘,再用用滅菌雙蒸水簡單淋洗,氮氣吹干。
⑨.芯片在微陣列芯片掃描儀(如ScanArray Lite,Packard Biochip Technologies)上掃描(適當參數(shù)channel、laserpower,PMT gain,resolution.),記錄熒光信號;⑩.用芯片熒光信號分析軟件(如QuantArray microarray analysis software,PackardBiochip Technologies)進行數(shù)據(jù)分析。
.將芯片上DNA探針系統(tǒng)呈現(xiàn)的熒光等信號和芯片直接與DNA結合蛋白雜交呈現(xiàn)的熒光等信號(對照)進行比較,尋找那些熒光等信號出現(xiàn)變化的DNA探針;.用熒光等信號出現(xiàn)變化的DNA探針制備親合介質;.用DNA探針制備親合介質對組合化學分子或天然生物分子(如中藥)混合物在DNA結合蛋白存在的情況下進行親合層析,分離與DNA結合蛋白/DNA結合位點共同作用的靶分子.對分離純化的靶分子進行化學性質鑒定及生理、藥理作用分析研究,進而開發(fā)成為新的候選藥物。
權利要求
1.一種從復雜組分物質高通量篩選、捕獲和分離目標分子的新方法,包括(a)提供雙鏈核酸微陣列芯片,該芯片上排布大量捕獲探針,其中每個探針在芯片上有區(qū)別于其它探針的具體位置,并且每個探針上都有一獨特區(qū)域;(b)將雙鏈核酸微陣列芯片與復雜組分物質接觸;(c)篩選鑒定那些與復雜組分物質發(fā)生相互作用的探針;(d)用所鑒定的發(fā)生相互作用的探針制備親合介質;(e)用鑒定探針制備的親合介質與復雜組分物質接觸;(f)親合介質捕獲和分離復雜組分物質中與鑒定探針發(fā)生相互作用的目標分子。
2.在權利要求1中,復雜組分物質為組成成分復雜,含有大量化學性質及結構已知或未知的天然或人工合成物質。
3.在權利要求1中,復雜組分物質為中藥、中藥復方及組合化學分子及其混合物等。
4.在權利要求1中,雙鏈核酸微陣列芯片為脫氧核糖核酸(DNA)微陣列芯片、核糖核酸(RNA)微陣列芯片,以及它們的組合物。
5.在權利要求1中,雙鏈肽核酸微陣列芯片為以肽鍵代替核酸中磷酸二酯鍵形成外圍雙螺旋骨架的核酸人工類似物(如肽核酸)構成的微陣列芯片。
6.在權利要求1中,雙鏈核酸微陣列芯片的每個獨立的探針上的獨特區(qū)域為特定目標的雙鏈DNA或RNA結合蛋白的作用位點。
7.在權利要求1中,雙鏈核酸微陣列芯片的每個獨立的探針上的獨特區(qū)域為特定目標的序列特異性雙鏈DNA或RNA結合蛋白的作用位點。
8.在權利要求6中,特定目標的雙鏈DNA或RNA結合蛋白為參與DNA復制、修復、重組、限制及基因表達調控的蛋白質。
9.在權利要求6中,特定目標的雙鏈DNA或RNA結合蛋白為參與基因表達調控的蛋白質,即轉錄因子。
10.在權利要求1中,發(fā)生在復雜組分物質與芯片探針間的相互作用為結合作用。
11.在權利要求1中,用鑒定探針制備的親合介質為耦聯(lián)鑒定探針的親合層析基質。
12.在權利要求1中,親合介質與復雜組分物質接觸為親合層析過程。
13.在權利要求1中,親合介質捕獲復雜組分物質中目標分子的過程為親合層析中親合介質與復雜組分物質中靶分子發(fā)生結合作用的過程。
14.在權利要求1中,分離復雜組分物質中目標分子的過程為親合層析中洗脫收集靶分子的過程。
全文摘要
本發(fā)明提出一種從復雜組分物質如中藥和組合化學分子及其混合物中高通量篩選、捕獲和分離目標分子的新方法。該方法首先針對特定目標的雙鏈核酸結合蛋白特別是序列特異性DNA結合蛋白,如轉錄因子如NF-κB、核受體等,在固相支持物表面制備一種雙鏈核酸微陣列芯片,使其雙鏈核酸探針上嵌合雙鏈核酸結合蛋白的結合位點,用以高通量測定量核酸結合蛋白與雙鏈核酸微陣列芯片上各結合位點的親合性,建立序列核酸結合蛋白與其芯片上各核酸靶點的結合親合性標準參數(shù)體系;再用雙鏈核酸微陣列芯片與復雜組分物質如中藥和組合化學分子及其混合物反應,反應后通過檢測核酸結合蛋白與其芯片上各核酸靶點的結合親合性變化,篩選出那些與標準參數(shù)體系比較結合親合性發(fā)生改變的核酸靶點;將其作為核酸親合介質連接到層析柱表面,制備特異性核酸探針層析柱;再將復雜組分物質如中藥和組合化學分子及其混合物灌柱,用核酸探針捕獲復雜組分物質中與核酸探針特異結合的有效分子;最后經洗脫收獲與核酸探針結合的有效分子,進行其化學性質、分子生物學基礎及藥理學研究,開發(fā)成為核酸結合蛋白的核酸靶點特異性候選藥物。該發(fā)明的技術及思想體系,在基礎分子生物學研究,特別是序列特異性DNA結合蛋白(轉錄因子)基因表達調控,以及生物醫(yī)學研究,如序列特異性DNA結合蛋白(轉錄因子)相關疾病藥物作用機理研究和藥物性分子篩選中有廣泛而重要的應用價值。
文檔編號C12Q1/68GK1590560SQ0315288
公開日2005年3月9日 申請日期2003年9月1日 優(yōu)先權日2003年9月1日
發(fā)明者王進科, 陸祖宏, 李同祥 申請人:王進科, 李同祥, 陸祖宏
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