專利名稱：有益于肝臟的膳食補充劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對肝臟有益并且可被用作膳食補充劑的組合物。這些組合物含有可以通過在特定頻率和場強的電磁場中生長而得到的酵母細胞。
背景技術(shù)：
肝臟疾病有很多類型，包括急性肝炎、慢性肝炎、毒性肝損傷、肝癌、肝硬化、脂肪肝、門靜脈高壓等等。在一些患者中，肝臟疾病發(fā)展成肝硬化，或者在一段時間后甚至形成肝癌(A report by the research groupon liver diseases，Health and Welfare Ministry，1979)。因此，對肝炎的預(yù)防、觀察和治療對肝硬化和肝癌的預(yù)防是重要的。近年來，已經(jīng)研制出了肝炎和肝硬化動物模型，如今正在將這些模型應(yīng)用于肝臟疾病研究(Mori etal.，Hepatic，Cholecyst，Pancresto 19(5)905-910(1989))。
休息和膳食是用于治療急性肝炎的主要方法，而各種其它方法被用來治療活性型慢性肝炎，特別是乙型肝炎。干擾素、阿糖腺苷和阿昔洛韋已經(jīng)被用于肝炎治療。但是，這些藥物的長期使用會引起嚴(yán)重的副作用。因此，強烈希望研制出治療肝臟疾病的安全有效的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明基于這樣的發(fā)現(xiàn)某些酵母細胞可以被具有特定頻率和場強的電磁場活化，從而產(chǎn)生有益于肝臟的物質(zhì)。因此，可以將含有這些活化酵母細胞的組合物用作改善肝臟健康的膳食補充劑，例如改善肝炎癥狀、肝硬化、脂肪肝和其它肝臟疾病。
本發(fā)明包括一種含有多種酵母細胞的組合物，這些酵母細胞曾被培養(yǎng)在頻率范圍為大約18000-18500MHz(例如18180-18240MHz)、場強范圍為大約50-500mV/cm(例如100-450mV/cm)的交流電場中。將這些酵母細胞在交流電場中的培養(yǎng)一段時間，這段時間足以將所述的多種酵母細胞活化，以產(chǎn)生有益于肝臟的物質(zhì)。例如，當(dāng)攝入培養(yǎng)的酵母細胞的時候，這些酵母細胞可以使哺乳動物體內(nèi)的谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(GPT)，堿性磷酸酶(AP)，和/或乳酸脫氫酶5(LDH-5)的血清水平正?；?br> 在一個實施方案中，在所述的時間段內(nèi)，交流電場的頻率和/或場強可以在上述的范圍內(nèi)變化。換句話說，可以使所述的酵母細胞暴露于一系列電磁場。典型的時間段是40-100小時(例如50-80小時)。
可以被包含在此組合物中的酵母細胞全都可以從中國普通微生物菌種保藏中心(China General Microbiological Culture Collection Center)(“CGMCC”)得到，此保藏中心是布達佩斯條約認可的保藏中心(中國微生物菌種保藏管理委員會，中國科學(xué)院微生物研究所，海淀區(qū)，2714信箱，北京，100080，中國)?？梢允褂玫慕湍阜N類包括但不限于通常在食品和制藥工業(yè)中使用的那些種類，例如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，卡爾酵母(Saccharomyces carlsbergensis)，薛瓦酵母(Saccharomyces chevalieri)，德爾布酵母(Saccharomyces delbrueckii)，少孢酵母(Saccharomyces exiguous)，發(fā)酵性酵母(Saccharomycesfermentati)，洛格酵母(Saccharomyces logos)，蜂蜜酵母(Saccharomycesmellis)，卵形酵母(Saccharomyces oviformis)，羅斯酵母(Saccharomycesrosei)，魯酵母(Saccharomyces rouxii)，清酒酵母(Saccharomyces sake)，葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)，威爾酵母(Saccharomyceswillianus)，黃酒酵母(Saccharomyces sp.)，八孢裂殖酵母(Schizosaccharomyces octosporus)，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)，擲孢酵母(Sporobolomyces roseus)，白球擬酵母(Torulopsiscandida)，famta擬酵母(Torulopsis famta)，圓球擬酵母(Torulopsisglobosa)，平常球擬酵母(Torulopsis inconspicua)，貝雷絲孢酵母(Trichosporon behrendii)，頭狀絲孢酵母(Trichosporon capitatum)，絲孢酵母(Trichosporon cutaneum)，維克酵母(Wickerhamia fluoresens)，木生念珠菌(Candida arborea)，克魯斯念珠菌(Candida krusei)，朗比克念珠菌(Candida lambica)，解脂念珠菌(Candida lipolytica)，近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)，鐵紅念珠菌(Candida pulcherrima)，皺落念珠菌(Candida rugousa)，熱帶念珠菌(Candida tropicalis)，產(chǎn)朊念珠菌(Candida utilis)，Crebrothecium ashbyii，白地霉(Geotrichumcandidum)，異常漢遜酵母(Hansenula anomala)，產(chǎn)阿拉伯糖醇漢遜酵母(Hansenula arabitolgens)，杰丁漢遜酵母(Hansenula jadinii)，土星漢遜酵母(Hansenula saturnus)，schneggii漢遜酵母(Hansenula schneggii)，亞膜漢遜酵母(Hansenula subpelliculosa)，檸檬形克勒克酵母(Kloeckeraapiculata)，油脂酵母(Lipomyces starkeyi)，粉狀畢赤酵母(Pichiafarinosa)，膜醭畢赤酵母(Pichia membranaefaciens)，紅冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)，紅酵母(Rhodotorula glutinis)，小紅酵母(Rhodotorula minuta)，深紅酵母(Rhodotorula rubar)，橙黃紅酵母(Rhodotorula aurantiaca)，路德類酵母(Saccharomycodes ludwigii)，和墨類酵母(Saccharomycodes sinenses)。例如，所述的酵母細胞可以是漢遜釀酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae Hanson)AS2.375，AS2.501，AS2.502，AS2.503，AS2.504，AS2.535，AS2.558，AS2.560，AS2.561，AS2.562，或IFFI1048；或者漢遜卡爾酵母(Saccharomyces carlsbergensisHansen)AS2.420或AS2.444。
除非作出相反的限定，本文使用的所有科技術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的意思。下文描述示例性的方法和材料，在本發(fā)明的測試或者實踐中也可以使用與本文所述的方法和材料類似或等效的方法和材料。本文提及的所有出版物和其它文獻在此全部引入作為參考。在內(nèi)容相互抵觸的情況下，以本發(fā)明的說明書、包括定義為準(zhǔn)。所述的材料、方法和實施例都僅僅是說明性的，不能理解為對本發(fā)明的限制。在本發(fā)明的全部說明書和權(quán)利要求中，措詞“包含(comprise)”或其變體如“含有(comprises)”或“包括(comprising)”，應(yīng)該被理解為表示包含所陳述的整數(shù)或者整數(shù)組，但是并不排除任何其它整數(shù)或者整數(shù)組。
從下面的發(fā)明詳述以及權(quán)利要求中，可以明白本發(fā)明的其它特點和優(yōu)勢。


圖1是一幅示意圖，其顯示了使用電磁場來活化酵母細胞的示例性裝置。1酵母培養(yǎng)物；2容器；3電源。
圖2是一幅示意圖，其顯示了制作本發(fā)明酵母組合物的示例性裝置。此裝置包括信號發(fā)生器和相互連接的容器1、2和3。
發(fā)明詳述本發(fā)明基于這樣的發(fā)現(xiàn)某些酵母細胞株可以被具有特定頻率和場強的電磁場(“EMF”)活化，從而產(chǎn)生在肝臟疾病治療中有用的制劑。含有活化酵母細胞的酵母組合物可以被用作健康飲料或者藥丸形式的膳食補充劑。在某些實施方案中，本發(fā)明的酵母組合物可以改善肝臟功能，從而使谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶，堿性磷酸酶，和/或乳酸脫氫酶5的血清水平正?；?。
由于包含在這些酵母組合物中的活化酵母細胞，曾經(jīng)經(jīng)受過酸性條件(pH2.5-4.2)的培養(yǎng)，所以該組合物在胃中是穩(wěn)定的并且可以被繼續(xù)運行到小腸。一旦進入小腸中，這些酵母細胞就被各種消化酶破裂，這樣，生物活性物質(zhì)就被被釋放出來很容易被吸收。
本發(fā)明的發(fā)明者沒有被任何理論或者機理所束縛，相信EMF激活或者增強酵母細胞中的一個基因或一組基因的表達，或者改變了酵母細胞中某些細胞組分(例如DNA，RNA，酶/蛋白質(zhì))的構(gòu)象和/或活性，這樣引起有益于肝臟的制劑產(chǎn)生。I.用于本發(fā)明的酵母菌株在本發(fā)明中使用的酵母的類型包括，但不限于下列種屬酵母菌屬(Saccharomyces)、念珠菌屬(Candida)、Crebrothecium、地絲菌屬(Geotrichum)、漢遜酵母菌屬(Hansenula)、克勒克酵母屬(Kloeckera)、油脂酵母屬(Lipomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)、紅酵母屬(Rhodotorula)、類酵母屬(Saccharomycocde)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、擲孢酵母屬(Sporobolomyces)，球擬酵母屬(Torulopsis)、絲孢酵母屬(Trichosporon)、威克酵母屬(Wickerhamia)。
上面所列類別中的示例性種類包括但不限于表1中描述的種類。本發(fā)明中使用的酵母菌株可以從實驗室培養(yǎng)中得到，或者從公眾可以獲取的培養(yǎng)物保藏中心那里得到，保藏中心例如CGMCC和美國典型培養(yǎng)物保藏中心，10801 University Boulevard，馬納薩斯，VA 20110-2209。有用菌株(帶有CGMCC的保藏號)的非限制性實例是漢遜釀酒酵母AS2.375，AS2.501，AS2.502，AS2.503，AS2.504，AS2.535，AS2.558，AS2.560，AS2.561，AS2.562，和IFFI1048；和漢遜卡爾酵母AS2.420或AS2.444。其它可以使用的非限定性例子被描述在表1中。通常，本發(fā)明優(yōu)選的酵母菌屬是在葡萄酒工業(yè)和食物發(fā)酵中使用的那些酵母菌株。因此，含有這些酵母細胞的組合物對于人消費是安全的。
本發(fā)明酵母組合物的制備并不限于從純的酵母菌株開始，但是這樣做是優(yōu)選的。可以通過培養(yǎng)不同種類或菌株的酵母細胞的混合物來生產(chǎn)本發(fā)明的酵母組合物。
表1示例性的酵母菌株









II.電磁場的施加可以通過各種本領(lǐng)域已知的方法來產(chǎn)生和施加用于本發(fā)明的電磁場。例如可以通過施加交流電場或者振蕩磁場來產(chǎn)生EMF。
可以通過電極與培養(yǎng)基的直接接觸、或者通過電磁感應(yīng)，將交流電場施加給細胞培養(yǎng)物。見例如圖1。使用電極與培養(yǎng)基相接觸的方法，可以在培養(yǎng)基中產(chǎn)生相對高的電場。必須注意防止在電極處的電解將非目的離子引入培養(yǎng)基，并且主意防止接觸電阻、氣泡或者電解的其它特性使電場水平下降到目的電場水平以下。電極應(yīng)該與其環(huán)境相匹配，例如在氯離子富集的溶液中使用Ag-AgCl電極，而且電極應(yīng)該在盡可能低的電壓下運轉(zhuǎn)。關(guān)于綜述，見Goodman等的Effects of EMF on Molecules andCells，International Review of Cytology，A Survey of Cell Biology，Vol.158，Academic Press，1995。
也可以通過施加振蕩磁場來產(chǎn)生本發(fā)明使用的EMF?？梢杂猛ㄟ^赫姆霍茲線圈的振蕩電流來產(chǎn)生振蕩磁場。此振蕩磁場又會誘導(dǎo)出電場。
本發(fā)明使用的EMF的頻率范圍為大約18000MHz-18500MHz。示例性的頻率包括18205，18211，18217，18223，和18227MHz。本發(fā)明使用的場強范圍為大約100-450mV/cm(例如100-150，210-260，300-340，或者380-420mV/cm)。示例性的場強是240，248，408，415，和315mV/cm。
當(dāng)將一系列EMF施加到酵母培養(yǎng)物的時候，可以將酵母培養(yǎng)物保持在相同的容器中，使用一套相同的EMF發(fā)生器和發(fā)射器來改變頻率和/或場強。系列中的每個EMF都可以具有不同的頻率或者不同的場強；或者不同的頻率和不同的場強。這些頻率和場強優(yōu)選處于上述的范圍內(nèi)。盡管可以在系列中使用任何有效數(shù)目的EMF，但是優(yōu)選將酵母培養(yǎng)物暴露于總數(shù)為2，3，4，5，6，7，8，9或者10個EMF的系列中。
盡管在EMF存在的情況下，酵母細胞甚至可以在培養(yǎng)幾個小時后被激活，但是優(yōu)選的情況是，應(yīng)該允許含有活化酵母細胞的組合物在EMF存在的情況下繁殖和生長總計40-100個小時。
圖1描述了產(chǎn)生交流電場的示例性裝置?？梢酝ㄟ^AC源(3)產(chǎn)生所需頻率和強度的電場，AC源(3)能夠產(chǎn)生優(yōu)選為正弦波形的、頻率范圍為5-20,000MHz的交流電場。也可以使用能夠用較窄的頻率范圍產(chǎn)生信號的信號發(fā)生器。如果需要，可以使用信號放大器來增加輸出。培養(yǎng)容器(2)可以由非導(dǎo)電性材料如玻璃、塑料或者陶瓷制成。連接培養(yǎng)容器(2)和信號發(fā)生器(3)的纜線，優(yōu)選為高頻率同軸電纜，其傳輸頻率為至少30GHz。
可以通過多種方法將交流電場施加于所述的培養(yǎng)基，這些方法包括將酵母培養(yǎng)物(1)放置到與信號發(fā)射器(例如能夠傳送EMF的金屬線或者管)非常接近的地方。所述的金屬線或者管可以由紅銅制造，而且可以被放置到容器(2)內(nèi)直至3-30cm的深度。例如，如果容器(2)中的流體深度為15-20cm，20-30cm，30-50cm，50-70cm，70-100cm，100-150cm或者150-200cm，那么金屬線距容器(2)底部的長度可以分別是3-5cm，5-7cm，7-10cm，10-15cm，15-20cm，20-30cm和25-30cm。所用金屬線/管的數(shù)目可以是1-10個(例如2-3)。盡管并不要求，但是建議對于10L體積的培養(yǎng)物，應(yīng)該使用直徑為0.5-2mm的金屬線/管。對于體積為10-100L的培養(yǎng)物，可以使用直徑為3-5mm的金屬線/管。對于體積為100-1000L的培養(yǎng)物，可以使用直徑為6-15mm的金屬線/管。對于體積大于1000L的培養(yǎng)物，可以使用直徑為20-25mm的金屬線/管。
在一個實施方案中，通過浸入培養(yǎng)物(1)的電極來施加電場。在這個實施方案中，一個電極可以是放置在容器(2)底部的金屬板，另一個電極可以含有均勻分布在培養(yǎng)物(1)中的多個電極線，這樣可以實現(xiàn)電場能量的均勻分布。所用電極線的數(shù)量取決于培養(yǎng)物的體積以及金屬線的直徑。III.培養(yǎng)基本發(fā)明使用的培養(yǎng)基含有能夠被酵母細胞吸收的營養(yǎng)源。可以將復(fù)合含碳物質(zhì)以適當(dāng)?shù)男问?例如蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、和木糖)作為酵母細胞的碳源?？梢愿鶕?jù)培養(yǎng)基的其它組分調(diào)節(jié)碳源的確切量。通常，含碳物質(zhì)的量的范圍為大約培養(yǎng)基重量的0.1％-10％，優(yōu)選為大約0.1％-5％，最優(yōu)選為大約2％。這些碳源可以單獨或者組合使用。同樣可以將含有氨基酸的物質(zhì)以合適的形式(例如牛肉膏和蛋白胨)單獨或者組合加入。通常含氨基酸物質(zhì)的量的變化范圍為大約培養(yǎng)基重量的0.1％-1％，優(yōu)選為大約0.1％-0.5％?？梢约尤氲脚囵B(yǎng)基中的無機鹽是能夠產(chǎn)生鈉、鉀、鈣、硫酸鹽、硫酸鹽、碳酸鹽和類似離子的常規(guī)鹽。營養(yǎng)無機鹽的非限制性實例是(NH4)2HPO4，CaCO3，KH2PO4，K2HPO4，MgSO4，NaCl，和CaSO4。IV.酵母細胞的電磁激活為了活化或者增強酵母細胞產(chǎn)生有益于腸胃系統(tǒng)的制劑的能力，將這些細胞在適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中、在無菌條件下、在20℃-35℃(例如28℃-32℃)、在上述的交流電場或者一系列交流電場中培養(yǎng)足夠長的時間(例如10-150小時)。
在圖1中描述了進行培養(yǎng)的典型裝置(見上)。典型的培養(yǎng)基含有每1000ml無菌水中的下列物質(zhì)20g的蔗糖，40μg的維生素B1，50μg的維生素B6，0.2g的KH2PO4，0.2g的MgSO4·7H2O，0.25g的NaCl，0.1g的CaSO4·2H2O，3.0g的CaCO3·5H2O，和2.5g的蛋白胨。隨后將目的菌株加入到培養(yǎng)基中以形成含有1×108個細胞/1000ml培養(yǎng)基的混合物。酵母細胞可以是表1中列出的任何菌株。隨后將該混合物加入到圖1所示的裝置中。
酵母細胞的活化過程涉及下列步驟(1)將活化裝置的溫度保持在24-33℃(例如28-32℃)，并將酵母細胞培養(yǎng)30-42個小時(例如38小時)；(2)施加頻率為大約18205MHz、場強為大約210-260mV/cm(例如239-241mV/cm)的交流電場13-20小時(例如15小時)；(3)隨后施加頻率為大約18211MHz、場強為大約220-260mV/cm(例如247-249mV/cm)的交流電場15-25小時(例如19小時)；(4)而后施加頻率為大約18217MHz、場強為大約380-420mV/cm(例如大約406-410mV/cm)的交流電場20-30小時(例如25小時)；(5)隨后施加頻率為大約18223MHz、場強為大約380-420mV/cm(例如413-417mV/cm)的交流電場中培養(yǎng)9-12小時(例如10小時)；和(6)而后施加頻率為18277MHz、場強為大約300-330mV/cm(例如313-317mV/cm)的交流電場9-12小時(例如10小時)。通過各種本領(lǐng)域已知的方法，從培養(yǎng)基中回收活化的酵母細胞，干燥(例如通過凍干)并且儲存在4℃。優(yōu)選地，干燥的酵母細胞的濃度不小于1010細胞/g。V.酵母細胞對胃環(huán)境的適應(yīng)由于本發(fā)明的酵母組合物在到達小腸以前必須通過胃，而有效組分是在小腸中從這些酵母細胞中釋放出來，因此優(yōu)選將這些酵母細胞在酸性條件下培養(yǎng)以使這些細胞適應(yīng)胃液。這種適應(yīng)過程能夠使酵母在酸性胃環(huán)境中有更好的生存能力。
為了達到這一目的，可以將含有活化酵母細胞的酵母粉以10g(每克含有超過1010個活化的細胞)/1000ml與高酸性適應(yīng)的培養(yǎng)基混和。而后對酵母混合物進行培養(yǎng)，首先在頻率為大約18223MHz、場強為390-420mV/cm(例如403-407mV/cm)的交流電場存在的情況下、在大約28-32℃培養(yǎng)25-48小時(例如46小時)。將所得到的酵母細胞進一步在頻率為大約18227MHz、場強為300-330mV/cm(例如大約315-319mV/cm)的交流電場存在的情況下、在大約28-32℃培養(yǎng)15-25小時(例如20小時)。隨后將所得到的適應(yīng)化酵母細胞干燥并以粉末形式(≥1010細胞/g)室溫儲存或者在0-4℃真空儲存。
典型的適應(yīng)化培養(yǎng)基是通過將700ml新鮮豬胃液和300ml野生中國山楂提取物混和制成的。用0.1M的鹽酸(HCL)和0.2M的苯二酸氫鉀(C6H4(COOK)COOH)將的pH調(diào)節(jié)到2.5。新鮮豬胃液的制備如下。將大約4月齡的新生荷蘭白豬處死，回收它們胃中的全部內(nèi)含物并將其與2000ml的水在無菌條件下混和。隨后使該混合物在無菌條件下，在4℃靜置6小時以沉淀食物殘渣。收集上清液以用于適應(yīng)化培養(yǎng)基。關(guān)于野生中國山楂提取物的制備，在無菌條件下干燥500g新鮮的野生中國山楂，以減少水份含量(≤8％)。隨后研磨(≥20目)此干果并將其加入1500ml的無菌水。將混合物在無菌條件下、在4℃靜置6小時。收集山楂上清液以在適應(yīng)化培養(yǎng)基中使用。VI.酵母混合物的制備為了制備本發(fā)明的酵母混合物，可以使用圖2中描述的裝置或其等效裝置。此裝置包括第一容器(1)、第二容器(2)、和第三容器(3)，每個容器裝備有一對電極(4)。所述電極中的一個是放置于容器底部上的金屬板，另一個電極包含多個均勻分布在容器空間內(nèi)的電極線，以實現(xiàn)電場能量的均勻分布。所有三對電極都被連接到一個普通的信號發(fā)生器。
用于此目的的培養(yǎng)基是一種混合的水果提取物溶液，每1000L該溶液含有下述組分300L的野生中國山楂提取物、300L棗提取物、300L五味子(Schisandra chinensis(Turez)Bail seeds)提取物、和100L的大豆提取物。關(guān)于山楂、棗、五味子提取物的制備，清洗新鮮的水果并在無菌條件下干燥以將水含量減少到不超過8％。而后研磨(≥20目)100千克的干果并將其加入到400L的無菌水中。將混合物在無菌條件下、在室溫攪動12小時，隨后以1000rpm離心以去除不溶的殘余物。關(guān)于大豆提取物的制備，清洗新鮮的大豆并將其在無菌條件下干燥以將含水量減少到不超過8％。隨后將30千克的大豆研磨成不小于20目的顆粒，加入130L無菌水。將混合物在無菌條件下、在室溫攪動12小時，隨后以1000rpm離心以去除不溶的殘余物。為了制造培養(yǎng)基，將這些提取物根據(jù)上面的配方混和，將溶液在121℃下熱壓消毒30分鐘，并在使用前冷卻到40℃以下。
將如上(上面的V部分)制備的1000g活化的酵母粉加入到1000L混合的水果提取物溶液中，將酵母溶液轉(zhuǎn)移到圖2中所示的第一容器(I)中。隨后，在頻率為大約18223MHz、場強為390-420mV/cm(例如403-407mV/cm)的交流電場存在的情況下、在大約28-32℃的無菌條件下培養(yǎng)16小時。將酵母細胞進一步在頻率為大約18227MHz、場強為320-350mV/cm(例如333-337mV/cm)的交流電場存在的情況下培養(yǎng)。將培養(yǎng)繼續(xù)進行另12個小時。
隨后將酵母培養(yǎng)物從第一容器(1)轉(zhuǎn)移到含有1000L培養(yǎng)基的第二容器(2)(如果需要，可以在現(xiàn)在可以使用的第一容器(1)中開始新的一批酵母培養(yǎng)物培養(yǎng))中，隨后將其處于頻率為大約18223MHz、場強為200-220mV/cm(例如206-210mV/cm)的交流電場中10小時。然后將電場的頻率和場強分別改變?yōu)榇蠹s18227MHz和210-230mV/cm(例如213-217mV/cm)。將培養(yǎng)繼續(xù)進行另10個小時。
而后將酵母培養(yǎng)物從第二容器(2)轉(zhuǎn)移到含有1000L培養(yǎng)基的第三容器(3)中，并將其處于頻率為大約18223MHz、場強為90-110mV/cm(例如104-108mV/cm)的交流電場中12小時。然后將電場的頻率和場強分別改變?yōu)榇蠹s18227MHz和100-120mV/cm(例如103-107mV/cm)。將培養(yǎng)繼續(xù)進行另8個小時。
將來自第三容器(3)的酵母培養(yǎng)物包裝到真空密封的瓶中以用作膳食補充劑如健康飲料。如果需要，還可以將成品酵母培養(yǎng)物在24小時內(nèi)干燥并以粉末形式儲存。該膳食補充劑可以每次30-60ml、每天3-4次地攝取3個月，優(yōu)選在餐前和就寢前10-30分鐘攝取。
在一些實施方案中，還可以以無菌可注射制劑的形式通過靜脈或者腹膜給予本發(fā)明的組合物。這樣的無菌制劑制備如下。將滅菌的健康飲料組合物首先在超聲波(1000Hz)下處理10分鐘，隨后在4355rpm離心另10分鐘。使用1MNaOH將所得到上清液的pH調(diào)節(jié)到7.2-7.4，并隨后在無菌條件下通過膜(對于靜脈注射0.22μm，對于腹膜內(nèi)注射0.45μm)進行過濾。在使用前，將所得到的無菌制劑浸入35-38℃的水浴中30分鐘。
本發(fā)明的酵母組合物衍生于食品和制藥工業(yè)中使用的酵母。因此這些酵母組合物沒有與許多制藥化合物相關(guān)的副作用。
使用漢遜釀酒酵母AS2.560，在交流電場存在的情況下培養(yǎng)，按照如上所述的方法制備以下實驗中所使用的活化酵母組合物，所述的交流電場具有被列在以上IV部分中的建議使用范圍之后的括號中所例舉的電場頻率和場強。除了在沒有EMF的情況下進行培養(yǎng)，以如VI部分中所述的相同方法制備對照酵母組合物。除非作出相反的限定，所有的酵母組合物和相應(yīng)的對照組合物均通過胃內(nèi)給食給予所述的動物。實施例1血清谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶活性谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(GPT)通常在肝細胞中表達。當(dāng)肝臟組織經(jīng)歷壞死或者其它損害時，GPT被釋放到血液中從而升高了血清GPT水平。因此，血清GPT水平是肝臟功能的重要指示器。
在此研究中，將32只Wistar大鼠(170-200g，8-10月齡)分為4組，每組4只雌性鼠和4只雄性鼠。組A中的大鼠每天給予3ml的活化酵母組合物，給予8天。在第一和第五天，還給這些大鼠注射5mg四氯化碳/1000g體重。以相同的方法處理組B和組C中的大鼠，只是分別使用對照酵母組合物和鹽水代替活化酵母組合物給予這些大鼠。以與組C相同的方法處理組D中的大鼠，但是不給予四氯化碳。在第8天，處死大鼠，抽取血樣用于測定血清GPT水平。
為了實現(xiàn)這一目的，將來自每只動物的0.1ml血清與0.5ml谷氨酸丙酮酸底物溶液(1M)混和并在37℃的水浴中溫育30分鐘。而后加入0.5ml的2，4-二硝基苯肼并繼續(xù)溫育20分鐘。最后加入5ml0.4M的NaOH。以相同的方法制備對照反應(yīng)物，但是血清是在溫育步驟之后30分鐘、而不是之前30分鐘被立即加入。將對照反應(yīng)物用于校準(zhǔn)，在520nm處測定樣品的光密度。通過使用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定GPT濃度。數(shù)據(jù)顯示在下表2中。
表2

這些數(shù)據(jù)證實活化的酵母組合物明顯地將四氯化碳處理大鼠的血清GPT恢復(fù)到正常水平。實施例2血清堿性磷酸酶活性血清堿性磷酸酶(AP)主要由肝臟產(chǎn)生。AP的血清水平是肝臟健康的指示器，其水平的升高提示肝臟不健康。
在此研究中，將32只雄性斯普拉格-道立大鼠(Sprague-Dawley rats)(120-150g)分成4組。每天給予組A中的大鼠3ml活化酵母組合物，給予13天。在此時間段內(nèi)，每3天給這些動物注射2mg含有15％四氯化碳的液體石蠟/1000g體重(共計四次)。以相同的方法處理組B和組C中的大鼠，只是分別使用對照酵母組合物和鹽水代替活化酵母組合物給予這些大鼠。以與組C相同的方法處理組D中的大鼠，但是不給予石蠟。
在第13天，在最后的四氯化碳注射之后，使動物禁食16小時。處死這些動物，測定它們的血清GPT和AP水平。GPT水平如上測定。對于AP水平的測定，將0.1ml來自動物的血清與4ml AP底物溶液混和并在37℃的水浴中溫育7分鐘。隨后加入1ml 0.6％的4-AAP(丙氨酸氨肽酶)和1ml 4.8％的K3Fe(CN)6。除了使用PHEN標(biāo)準(zhǔn)溶液代替血清，以相同的方法制備標(biāo)準(zhǔn)。空白對照不加入血清或者PHEN溶液。
使用空白對照來校準(zhǔn)分光光度計，在500nm處測量樣品的光密度。堿性磷酸酶(AP)活性被計算為[(測試樣品的OD)/(標(biāo)準(zhǔn)的OD)]×10。實驗數(shù)據(jù)顯示在下面的表3中。
表3

這些結(jié)果表明與對照組合物不同，本發(fā)明的活化酵母組合物將被注射了肝臟損傷制劑的大鼠的GPT和AP的血清水平正?；嵤├?乳酸脫氫酶5的活性乳酸脫氫酶5(LDH-5)水平的升高往往伴隨著由乙肝病毒引起的肝炎。在此實驗中，評價了所述的活化酵母組合物在小鼠模型中對肝炎治療的效力。
使用制備自雜種小鼠的肝臟提取物來免疫純種小鼠以誘導(dǎo)慢性肝炎。具體地說，將來自雜種小鼠的肝臟切碎并在低溫離心機中以10,000g的轉(zhuǎn)速離心30分鐘。收集上清液并將其與弗氏完全佐劑(Freund′s completeadjuvant)混和，以形成用于注射到新斷奶的雄性C57BL小鼠中的乳劑。
將40只新斷奶的C57BL小鼠分成4個相等的組。每天給予組A中的每只小鼠1ml活化酵母組合物，給予9周。在最開始的5周，每周兩次地給每只這些小鼠注射0.1ml地肝臟提取物乳劑。在剩下的4周里，一周一次地給予注射。以相同的方法處理組B和組C中的大鼠，只是分別使用對照酵母組合物和鹽水代替活化酵母組合物給予這些大鼠。以與組C相同的方法處理組D中的大鼠，但是不給予肝臟乳劑。
在治療最后一天的24小時以后，處死動物并收集動物的血清。使用醋酸纖維素電泳從血清中分離出LDH-5。通過PEG(聚乙二醇)沉淀法測定CICs(循環(huán)中免疫復(fù)合物)。結(jié)果見下表4。
表4

這些數(shù)據(jù)證實與對照相比，活化的酵母組合物顯著地降低了被誘發(fā)肝炎的小鼠的血清LDH-5和CLC水平。
雖然已經(jīng)對本發(fā)明的一些實施方案進行了闡述，但是很明顯，可以對這些基本構(gòu)想進行改變，以提供利用本發(fā)明組合物和方法的其它實施方案。
權(quán)利要求
1.一種含有多種酵母細胞的組合物，其中所述的多種酵母細胞的特征在于與未經(jīng)如下交流電場培養(yǎng)過酵母細胞相比，作為它們曾經(jīng)被在頻率范圍是18180-18240MHz、場強范圍是100-450mV/cm的交流電場存在的情況下培養(yǎng)過的結(jié)果，其能夠使哺乳動物中血清谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(GPT)，堿性磷酸酶(AP)，或者乳酸脫氫酶5(LDH-5)的水平正?；?br> 2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述的頻率范圍是18205-18227MHz。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中所述的場強范圍是210-420mV/cm。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中所述的酵母細胞選自釀酒酵母，卡爾酵母，薛瓦酵母，德爾布酵母，少孢酵母，發(fā)酵性酵母，洛格酵母，蜂蜜酵母，卵形酵母，羅斯酵母，魯酵母，清酒酵母，葡萄汁酵母，威爾酵母，黃酒酵母，八孢裂殖酵母，粟酒裂殖酵母，擲孢酵母，白球擬酵母，famta擬酵母，圓球擬酵母，平常球擬酵母，貝雷絲孢酵母，頭狀絲孢酵母，絲孢酵母，維克酵母，木生念珠菌，克魯斯念珠菌，朗比克念珠菌，解脂念珠菌，近平滑念珠菌，鐵紅念珠菌，皺落念珠菌，熱帶念珠菌，產(chǎn)朊念珠菌，Crebrothecium ashbyii，白地霉，異常漢遜酵母，產(chǎn)阿拉伯糖醇漢遜酵母，杰丁漢遜酵母，土星漢遜酵母，schneggii漢遜酵母，亞膜漢遜酵母，檸檬形克勒克酵母，油脂酵母，粉狀畢赤酵母，膜醭畢赤酵母，紅冬孢酵母，紅酵母，小紅酵母，深紅酵母，橙黃紅酵母，路德類酵母，和墨類酵母。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中所述的酵母細胞是保藏在中國普通微生物菌種保藏中心的菌株，其保藏號選自漢遜釀酒酵母AS2.375，AS2.501，AS2.502，AS2.503，AS2.504，AS2.535，AS2.558，AS2.560，AS2.561，AS2.562和IFFI1048，以及漢遜卡爾酵母AS2.420和AS2.444的細胞。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物的形式是片劑、粉劑或者健康飲料的形式。
7.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物的形式是健康飲料的形式。
8.一種治療受試者肝炎的方法，其包括經(jīng)口服給予所述的受試者權(quán)利要求1的組合物。
9.一種酵母組合物的制備方法，其包括在交流電場存在的情況下將多種酵母細胞培養(yǎng)一段時間，所述交流電場的頻率范圍是18180-18240MHz、場強范圍是100-450mV/cm，其中所述一段時間足以充分地提高所述多種酵母細胞使具有肝臟問題的哺乳動物的血清GPT、AP、或者LDH-5水平正常化的能力。
全文摘要
含有多種酵母細胞的組合物，其中所述的多種酵母細胞的特征在于其能夠使哺乳動物中血清GPT，AP和/或LDH－5的水平正?；@些酵母細胞具有這種能力的原因是因為它們曾經(jīng)被在具有特定頻率和特定場強的交流電場存在的情況下培養(yǎng)過。本發(fā)明還包括制造和使用這些組合物的方法。
文檔編號C12N13/00GK1481823SQ0314780
公開日2004年3月17日 申請日期2003年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月28日
發(fā)明者張令玉 申請人:歐亞生物科技有限公司