專利名稱：不含酯酶的酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抑制酶制劑中的酯酶活性的方法，例如用于酶催化生產(chǎn)7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)的酶制劑；還涉及酶制劑的生產(chǎn)方法，例如用于生產(chǎn)7-ACA和/或7-氨基-3-羥甲基-3-頭孢烯-4-羧酸的酶制劑。
7-ACA是生產(chǎn)(例如制藥)活性頭孢菌素類抗生素的關(guān)鍵中間體，例如將7-ACA環(huán)系的7位氨基?；缬靡阎陬^孢菌素類抗生素的生產(chǎn)中有價值的或在生產(chǎn)這些抗生素的中間體中有價值的基團酰化；例如獲得在環(huán)系3位有乙酰氧甲基的7-?；被^孢菌素，如頭孢噻肟、頭孢泊肟(頭孢泊肟酯)、頭孢來星；及用于生產(chǎn)可衍生自7-ACA的其它頭孢菌素類抗生素或其中間體；例如進一步將環(huán)系3位的乙酰氧甲基反應獲得3位以不同于乙酰氧甲基的基團取代的頭孢菌素；例如用已知在生產(chǎn)頭孢菌素類抗生素中有價值或已知作為其中間體有價值的基團取代；例如通過乙酰氧基團的親核取代，或通過將乙酰氧甲基脫乙酰化獲得羥甲基(如HACA)，及例如將所得環(huán)系3位羥甲基進一步反應，如通過羥基的親核取代；或去除羥甲基的羥基功能團或去除環(huán)系3位的羥甲基；及需要時，將環(huán)系4位的羧基酯化，例如用已知在頭孢菌素類抗生素的生產(chǎn)中有價值或已知在其中間體中有價值的基團酯化；及需要時通過反應(如按常規(guī)方法)獲得頭孢菌素化合物的鹽和/或溶劑化形式。7-ACA和HACA例如可通過環(huán)系7位氨基的脫?；铜h(huán)系3位乙酰氧甲基的脫乙酰化(例如酶催化)分別從頭孢菌素C獲得。頭孢菌素C酶法脫?；杏杏玫拿甘抢鏒-氨基酸氧化酶(DAO)，它催化頭孢菌素C的氧化脫胺化，經(jīng)中間體α-酮己二酰-7-氨基頭孢烷酸(KA-7-ACA)形成戊二?；?7-氨基頭孢烷酸(Gl-7-ACA)?？蓪l-7-ACA水解，獲得戊二酸和7-ACA，例如通過戊二酰?；?GAC)水解。已知含DAO和GAC的酶制劑如微生物細胞可能含有其他酯酶活性?？赡馨l(fā)生頭孢菌素環(huán)結(jié)構(gòu)3位側(cè)鏈的不希望的脫乙?；?，這例如是由于在酶催化的頭孢菌素C脫?；写嬖邗ッ富钚裕尚纬扇珙^孢菌素C的3-羥甲基衍生物和Gl-7-ACA。這可能造成7-ACA質(zhì)量和產(chǎn)率的顯著下降。通過丙酮或CuSO4處理在DAO存在下降低酯酶活性的常規(guī)方法可不完全地降低酯酶活性。
現(xiàn)出人意外地發(fā)現(xiàn)，用苯甲基磺酰氟(PMSF)處理存在DAO活性的有酯酶活性的混合物或存在GAC活性的有酯酶活性的混合物可顯著地(如基本上完全)降低酯酶活性，而可分別保留高DAO或GAC活性，如基本上沒有變化。這一發(fā)現(xiàn)是令人驚異的，因為按照本發(fā)明，PMSF(已知通過絲氨酸磺?；鳛楹z氨酸蛋白的不可逆抑制劑)可在DAO活性存在下或在GAC活性存在下選擇性地降低存在的酯酶活性，而不顯著影響DAO或GAC活性；更令人驚異的是，在GAC活性存在下PMSF對存在的酯酶活性具有選擇性和有效的抑制作用，因為?；负王ッ赣邢嗨频墓δ芎徒Y(jié)構(gòu)。
一方面，本發(fā)明提供一種在具有酯酶活性和D-氨基酸氧化酶活性和/或戊二酰?；富钚缘幕旌衔镏校缫晕⑸锛毎男问交蛞云錈o細胞提取物形式存在，在保存D-氨基酸氧化酶活性或戊二酰?；富钚缘那闆r下降低(如基本上去除)存在的酯酶活性的方法，包括用苯甲基磺?；幚砭哂絮ッ富钚院虳-氨基酸氧化酶活性和/或戊二酰?；富钚缘幕旌衔铮渲蠨-氨基酸氧化酶活性或戊二酰?；富钚员Ａ?，如用苯甲基磺酰氟處理后與所述處理前的活性基本相同。典型地，D-氨基酸氧化酶活性保留原始值的91％以上，戊二酰?；傅幕钚陨踔帘Ａ粼贾档?7％以上。
本發(fā)明的方法例如可按如下進行已知的和有商品供應的產(chǎn)DAO活性的微生物包括如三角酵母屬(Trigonopsis)、曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)，優(yōu)選三角酵母(Trigonopsis variabilis)微生物。已知的和有商品供應的產(chǎn)GAC活性的微生物包括如假單胞菌屬(Pseudomonas)、無色桿菌屬(Achromobacter)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)或轉(zhuǎn)化子，如大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，如按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子。具有DAO活性或GAC活性和酯酶活性的混合物可通過商業(yè)途徑獲得或按常規(guī)方法獲得，并可呈無細胞提取物形式，如固定化形式，或呈微生物細胞形式，如部分純化或未純化細胞，和/或通透化或未通透化細胞，和/或部分破碎或完整的細胞，和/或固定化或未固定化細胞；如按常規(guī)方法可從發(fā)酵液中獲得的，優(yōu)選呈無細胞提取物形式，如固定化形式。可從發(fā)酵液收獲分離微生物細胞并原樣使用，如離心發(fā)酵液后的濕料形式，或在從發(fā)酵液分離之前或之后將細胞按常規(guī)方法進一步處理，如將細胞勻漿以獲得(如部分)破壞的細胞，和/或?qū)⒓毎蚱渌槠ㄍ富垣@得通透化細胞或細胞碎片，和/或?qū)⒓毎蚱渌槠兓垣@得(如部分)純化的細胞和/或細胞碎片和/或無細胞(通過絮凝作用)提取物，和/或?qū)⒓毎驘o細胞提取物固定化以獲得固定化細胞和/或固定化細胞碎片和/或固定化無細胞提取物。固定化可按常規(guī)方法進行；如在丙烯酸(固定化)珠如EupergitR存在下或在離子交換樹脂如Relite DianionR存在下按本文實施例中描述的方法進行；或按以下描述的本發(fā)明另一方面的方法進行。
微生物細胞可以以如經(jīng)過緩沖的細胞水懸液的形式使用，將從發(fā)酵液中分離的細胞重新懸浮于水或緩沖液中即可得到該懸液，或如果是無細胞提取物，可使用無細胞提取物水溶液。懸液或溶液的pH值應大約為中性，例如pH值6.5-8.5，如7.0或7.0左右比較合適。
本發(fā)明優(yōu)選的具有酯酶活性和DAO活性的混合物應例如基本上沒有例如天然過氧化氫酶活性，例如可將具有DAO、酯酶和過氧化氫酶活性的細胞水性混合物在堿性介質(zhì)(例如pH值9-11.5，如10-11)中處理，例如加入苛性鈉溶液，即可得到基本沒有天然過氧化氫酶活性的混合物。
對具有酯酶活性和DAO活性的混合物或具有酯酶活性和GAC活性的混合物用PMSF進行處理，例如在加入適當濃度范圍(例如0.5％-2.5％，如1％-10％)的PMSF溶液后在適當?shù)臏囟认?如室溫)保溫適當?shù)臅r間(例如幾小時，如1-5小時，如2.5-4小時或更長時間)，用適當溶劑(例如醇，如(C1-C4)的鏈烷醇如乙醇制成PMSF溶液。每100升細胞懸液中加入總量例如1000毫升的PMSF溶液(例如以上所述之濃度范圍的PMSF溶液)，實際上可能足以完全且不可逆地去除不需要的酯酶活性，并例如基本上不降低起始混合物中存在的DAO或GAC活性。在相似的反應條件下，比較在從頭孢菌素C制備Gl-7-ACA或7-ACA的反應中使用經(jīng)PMSF處理的具有DAO或GAC活性的混合物和使用未經(jīng)PMSF處理的具有DAO或GAC活性的混合物所得到的脫乙?；a(chǎn)物的量，即可測定酯酶活性的去除。
可得到DAO或GAC活性很高的混合物，例如基本上與用PMSF處理前相同，而同時酯酶活性例如基本上完全去除?？筛鶕?jù)本發(fā)明得到的混合物可用于如從頭孢菌素C生產(chǎn)7-ACA。在相同反應條件下，使用經(jīng)PMSF處理的DAO和/或GAC活性與使用未經(jīng)PMSF處理的DAO和/或GAC活性相比較，得到的7-ACA的產(chǎn)率和純度得到提高。因此，例如根據(jù)本發(fā)明的酯酶活性去除作用可導致減少，例如基本上不產(chǎn)生，在DAO和/或GAC反應中由于酯酶活性而產(chǎn)生的3位脫乙?；碑a(chǎn)品。根據(jù)本發(fā)明的方法得到的Gl-7-ACA或7-ACA中，不需要的3位脫酰基副產(chǎn)品的量可例如基本上與用作起始材料的頭孢菌素C中相同(典型情況是起始活性為3％時，不超過1％，而不使用PMSF時，可升高至6％)。
另一方面本發(fā)明提供了生產(chǎn)戊二?；?7-氨基頭孢烷酸的方法，包括以下步驟1)用苯甲基磺酰氟處理具有酯酶活性和D-氨基酸氧化酶活性的混合物，以得到例如基本上沒有酯酶活性的混合物，且例如基本上具有與用PMSF處理前相同的D-氨基酸氧化酶活性，2)用通過步驟1)得到的混合物與頭孢菌素C反應得到戊二?；?7-氨基頭孢烷酸，且如果需要，分離戊二?；?7-氨基頭孢烷酸。
另一方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)7-氨基頭孢烷酸的方法，包括以下步驟1)用苯甲基磺酰氟處理具有酯酶活性和D-氨基酸氧化酶活性的混合物，以得到例如基本上沒有酯酶活性的混合物，且例如基本上具有與用苯甲基磺酰氟處理前相同的D-氨基酸氧化酶活性，2)用通過步驟1)得到的混合物與頭孢菌素C反應獲得戊二?；?7-氨基頭孢烷酸，3)將戊二?；?7-氨基頭孢烷酸轉(zhuǎn)化成7-氨基頭孢烷酸，且如果需要，分離7-氨基頭孢烷酸。
可用常規(guī)方法如化學或酶催化方法或根據(jù)本發(fā)明的另一方面(如在本文描述的方法)將戊二?；?7-氨基頭孢烷酸轉(zhuǎn)化成7-氨基頭孢烷酸。
另一方面本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)7-氨基頭孢烷酸的方法，包括以下步驟1)用苯甲基磺酰氟處理具有酯酶活性和D-氨基酸氧化酶活性的混合物，獲得例如基本上沒有酯酶活性的混合物，且例如基本上具有與用PMSF處理前相同的D-氨基酸氧化酶活性，2)用通過步驟1)得到的混合物與頭孢菌素C反應以獲得戊二酰基-7-氨基頭孢烷酸，3)用苯甲基磺酰氟處理具有酯酶活性和戊二酰?；富钚缘幕旌衔铮垣@得例如基本沒有酯酶活性的混合物，且例如基本上具有與用PMSF處理前相同的戊二酰?；富钚?，4)將通過步驟2)得到的戊二?；?7-氨基頭孢烷酸與通過步驟3)得到的混合物反應，獲得7-氨基頭孢烷酸，且如果需要，分離7-氨基頭孢烷酸。
本發(fā)明從頭孢菌素C得到7-ACA的方法可按例如如下實施頭孢菌素C起始物可以是例如游離或鹽形式頭孢菌素C的水懸液或溶液形式；例如頭孢菌素C可以是含有頭孢菌素C的發(fā)酵液形式，例如其中的細胞和固體已被去除(例如用常規(guī)方法去除)，或是鹽式頭孢菌素C如鈉鹽形式?？捎酶鶕?jù)本發(fā)明經(jīng)PMSF預處理的具有DAO活性的混合物(例如以上所述形式)處理頭孢菌素C懸液或溶液，例如在頭孢菌素C水懸液或溶液中加入微生物細胞水懸液或無細胞提取物(或反之)，向懸液或溶液中導入氧，例如以氧氣的形式或空氣的形式，或它們的混合物的形式導入，需要時在壓力下進行。
反應應在適當?shù)膒H值下進行，例如大約為中性，如pH6.5-8.0，如7.0-7.5，并在適當?shù)臏囟认逻M行(如10℃-30℃)，例如在室溫下進行。DAO活性的量，例如相對于頭孢菌素C量的具有DAO活性的細胞懸液的量或具有DAO活性的無細胞提取物的量取決于使用的細胞懸液中存在的DAO活性和需要反應的頭孢菌素C的量，且要求并不嚴格；可以很容易地測定例如短時間反應所需的量，例如可用常規(guī)方法(例如用HPLC)測定例如規(guī)定時間段內(nèi)在混合物內(nèi)形成的Gl-7-ACA的量來測定。
可用常規(guī)方法將得到的Gl-7-ACA分離并提純或可原樣用于下一步驟，例如用于生產(chǎn)7-ACA。
氧化酶活性可用如下方法測定在pH值為8.0，溫度為25℃并向混合物內(nèi)通入氧氣流達到氧飽和時，攪拌下，將0.2-5克通透化細胞形式的具有DAO活性的混合物懸浮在20mM頭孢菌素C水溶液內(nèi)?？捎肏PLC測定Gl-7-ACA和KA-7-ACA的增加?！?U氧化酶”的活性相當于在以上條件下形成1μmol/min Gl-7-ACA和KA-7-ACA。
Gl-7-ACA的水溶液或懸液，例如根據(jù)本發(fā)明可得到的或得到的Gl-7-ACA的水溶液或懸液，可與根據(jù)本發(fā)明用PMSF處理過的具有GAC活性的混合物接觸，例如在Gl-7-ACA的水懸液或溶液內(nèi)加入經(jīng)過緩沖的細胞懸液或無細胞提取物(或反之)。反應可在適當?shù)膒H值下進行，例如略微偏堿性，例如pH值范圍7.5-8.5，如8.2左右，適宜的溫度范圍為10℃-30℃，例如室溫。相對于Gl-7-ACA量的GAC活性的量取決于使用的細胞懸液或無細胞提取物中存在的GAC活性和需要反應的Gl-7-ACA的量且并不嚴格；可以容易地測定例如短時間反應所需的量，例如可通過用常規(guī)方法(例如HPLC)測定例如規(guī)定時間段內(nèi)在混合物中形成的7-ACA的量來測定GAC的量。
可用如下方法測定GAC活性在pH值為8.0，溫度為37℃情況下，通過攪拌將0.5-2g具有GAC活性的混合物懸浮在含有5mM磷酸鹽的2％Gl-7-ACA水溶液中。通過加入100mM氫氧化鈉水溶液使pH值保持在8.0，所使用的氫氧化鈉的量決定于并相當于分別從Gl-7-ACA形成的戊二酸或7-ACA的量?！?U酰化酶”活性相當于在上述條件下分別形成1μmol/min戊二酸或7-ACA。
可將得到的7-ACA按常規(guī)方法分離并提純，或如需要原樣用于進一步加工，例如根據(jù)常規(guī)方法進行的7-ACA反應。
根據(jù)本發(fā)明得到的7-ACA具有高純度，例如得到的7-ACA中3位脫乙?；a(chǎn)物的含量較低，而7-ACA的產(chǎn)率可以很高，例如與在相同反應條件下使用未經(jīng)預處理的DAO活性和/或GAC活性的方法相比具有更高產(chǎn)率。
已知含酶的微生物細胞可以被固定化，固定化的含酶的微生物細胞是有用的，例如由于其具有易回收和重復使用的可能。已知的生產(chǎn)固定化微生物細胞的方法有缺陷，例如可能得到酶穩(wěn)定性差和/或酶比活性低的固定化細胞，和/或固定方法復雜。令人吃驚的是，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)了簡單的具酶活性微生物細胞(例如具有DAO或GAC活性的微生物細胞)的固定化方法，其中固定化細胞可以以含有穩(wěn)定的和高比酶活性的固態(tài)球形粒子形式得到。
另一方面，本發(fā)明提供了從具有酶活性的微生物細胞生產(chǎn)(如)固態(tài)球形粒子的方法，包括以下步驟1)用含伯胺或仲胺的聚合物處理微生物細胞，2)用可與水形成兩相系統(tǒng)的有機溶劑與微生物細胞混合物接觸，例如在可與水形成兩相系統(tǒng)的溶劑中加入微生物細胞混合物，3)用雙功能劑處理從步驟2)得到的混合物，并分離得到的球形粒子；例如更進一步包括在實施步驟1)或2)前用雙功能試劑對微生物細胞進行預處理和/或在分離球形粒子之前向步驟3)得到的混合物中加入與水溶混的溶劑，和/或向步驟1)中得到的混合物中或向?qū)嵤┎襟E1)前的微生物細胞中加入一種固體。
本發(fā)明的方法可用于固定具有通常被稱為生物催化劑的酶活性的微生物細胞。本發(fā)明可用的微生物包括所有種類的微生物，如細菌、酵母、真菌和放線菌，例如三角酵母屬，如三角酵母，土壤桿菌屬(Agrobacterium)，如放射形土壤桿菌(Agrobacterium radiobacter)，紅酵母屬(Rhodotorula)如紅酵母(Rhodotorula glutinis)，側(cè)耳屬(Pleurotus)，如糙皮側(cè)耳(Pleurotus ostreatus)，曲霉屬，青霉屬，假單胞菌屬，無色桿菌屬，芽孢桿菌屬(Bacillus)，如蠟狀芽孢桿菌，裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；或例如轉(zhuǎn)化子如具有酶活性的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子。酶活性包括各種酶活性，如水解酶、異構(gòu)酶、裂解酶、脫羧酶、氧化還原酶活性。具有酶活性的微生物細胞的例子包括例如側(cè)耳屬(例如具有青霉素-V?；富钚缘牟谄?cè)耳細胞)，土壤桿菌屬(例如具有乙內(nèi)酰脲酶和/或N-脫氨甲酰酶活性的放射形土壤桿菌細胞)，紅酵母屬(例如具有酯酶和/或氧化酶活性的紅酵母細胞)，三角酵母屬，(例如具有DAO活性的三角酵母細胞)，裂殖酵母屬(如具有GAC活性的粟酒裂殖酵母細胞)，及轉(zhuǎn)化子細胞(如具有GAC和/或酯酶活性的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子)。
本發(fā)明的方法對生產(chǎn)可用于從頭孢菌素C開始生產(chǎn)7-ACA或HACA的固定化微生物細胞尤其有益。如生產(chǎn)存在酯酶(和/或脫乙?；?活性并具有DAO活性的微生物細胞和/或存在酯酯(和/或脫乙酰化酶)活性并具有GAC活性的微生物細胞。
本發(fā)明的方法可按如下步驟實施可以用例如常規(guī)方法從發(fā)酵液中獲得具有酶活性的微生物細胞。微生物細胞包括任何形式的細胞，例如部分純化或未純化細胞，和/或通透化或未通透化細胞，和/或例如部分破壞的或完整的細胞?？蓮陌l(fā)酵液中分離微生物細胞，并原樣使用，例如在對發(fā)酵液進行離心以后，以濕料的形式使用，或者例如按常規(guī)方法，在從發(fā)酵液中分離細胞之前或之后對細胞進行進一步處理，如將細胞勻漿以獲得部分破碎的細胞和/或?qū)⒓毎蛩槠ㄍ富垣@得通透化細胞或碎片和/或?qū)⒓毎兓垣@得(如)部分純化的細胞和/或碎片。
在固定微生物細胞之前，可按常規(guī)方法將其中不需要的酶活性去除。舉例而言，三角酵母屬的過氧化氫酶活性，如三角酵母細胞內(nèi)的過氧化氫酶活性可通在如pH值9-12的堿性pH下處理一段時間(例如大約15分鐘或更長)而去除，如任選在例如β-疏基乙醇、乙二胺四乙酸(EDTA)等添加劑存在下，向單獨微生物細胞混合物中或存在含伯胺或仲胺的聚合物的微生物細胞混合物中加入苛性鈉溶液。
按照本發(fā)明，微生物細胞可用雙功能劑進行預處理。這里使用的雙功能劑應理解為具有至少兩個可以與伯胺或仲胺基團進行反應的基團的化合物，包括例如戊二醛、庚二亞胺酸二甲酯、表氯醇、N，N′-羰基二咪唑、1，4-丁二醇二環(huán)氧甘油醚、馬來酸酐、二環(huán)己基碳二亞胺、1，6-己二異氰酸酯，優(yōu)選戊二醛。對細胞的預處理可在發(fā)酵液中進行，也可在分離出微生物細胞之后進行，優(yōu)選在發(fā)酵液內(nèi)進行。舉例而言，可以以例如溶解的形式在微生物細胞懸液內(nèi)加入雙功能劑，例如可以以水溶液使用戊二醛，例如10％-30％的水溶液，并將加入戊二醛后得到的混合物攪拌一段時間，例如30分鐘到數(shù)小時，如30分鐘到5個小時。相對于細胞量的雙功能劑的量要求并不嚴格；例如每100克干細胞重，可方便地使用0.1克-100克(例如使用5克到50克)雙功能劑；例如如果使用戊二醛作為雙功能劑，則可使用0.5克-200克，如使用1克-100克25％的水溶液。可用例如常規(guī)方法分離經(jīng)過雙功能劑預處理的細胞，如通過微濾和/或離心方法進行濃縮并低溫貯存，例如以冰凍狀態(tài)保存。將來使用時，冰凍細胞可用泉水沖使其解凍，且如果需要，可按例如常規(guī)方法如微過濾進行濃縮。
微生物細胞(例如按以上描述進行了預處理的微生物細胞)，可以以以例如緩沖的細胞水懸液的形式使用，例如可在pH值6.0-10.0，如8.0或8.0左右，將從發(fā)酵液中分離并經(jīng)過任意進一步處理的細胞重新懸浮于水中，且如果需要，可按常規(guī)，向懸液中加入例如常規(guī)量的添加劑，例如加入β-疏基乙醇、乙二胺四乙酸(EDTA)。向獲得的懸液中加入含伯胺或仲胺的聚合物，包括例如聚乙烯亞胺和聚乙酰胺，優(yōu)選水溶性的，例如分子量60萬-100萬的聚乙烯亞胺的如10％-50％水溶液。含伯胺和/或仲胺的聚合物有商品供應或可按常規(guī)方法生產(chǎn)。相對于干細胞量的含伯胺和/或仲胺的聚合物的量并無嚴格要求，包括每100克干重微生物細胞使用例如1克到100克，如5克到70克，如10克到50克。
將細胞/聚合物混合物與可與水形成兩相系統(tǒng)的有機溶劑接觸，例如向可與水形成兩相系統(tǒng)的有機溶劑中導入細胞/聚合物混合物。適宜的有機溶劑包括例如磷酸三烷基酯，如磷酸三丁酯如磷酸三正丁酯，鏈烷烴如正己烷、正庚烷，芳烴如甲苯，天然或合成油如大豆油、硅氧烷油、柴油，芳族或脂族(例如(C3-C8)烷基如(C4-C6)烷基)單或雙羧酸烷基酯，例如(C1-C8)烷基，如(C1-C4)烷基酯，包括戊二酸、琥珀酸、己二酸的二甲基酯或二乙基酯、苯甲酸或苯二甲酸的乙酯、丁酯、二丁酯、二異丁酯，和茴香醇，優(yōu)選磷酸三烷基酯。有機溶劑的量應使微生物細胞懸液可分散于其中，例如用薄板將微生物細胞攪拌到溶劑中，每克細胞干重可使用例如1ml到100ml，如3ml到50ml溶劑。
將含有細胞、聚合物和有機溶劑的混合液攪拌一段時間，例如直到得到均質(zhì)懸液，并用雙功能劑包括例如戊二醛、表氯醇、N，N′-羰基二咪唑、1，4-丁二醇-二環(huán)氧甘油醚、馬來酸酐、二環(huán)己基碳二亞胺，1，6-己二異氰酸酯進行處理，優(yōu)選戊二醛。如果用雙功能劑對微生物細胞進行過預處理，則適于使用與預處理時所用的雙功能劑相同的雙功能劑。對雙功能劑的量沒有嚴格要求，每100克干重細胞可使用例如0.5克到100克雙功能劑，例如使用戊二醛作為雙功能劑，則適于使用例如1克到200克25％的戊二醛水溶液。在含有細胞、聚合物和有機溶劑的混合液中加入雙功能劑后，交聯(lián)可在例如幾分鐘內(nèi)開始并結(jié)束，可在使用的溶劑混合液中得到微生物細胞(例如)固態(tài)球形顆粒懸液。如需要，可將得到的懸液可與水溶混的且對酶活性無害的有機溶劑接觸，例如對酶活性無損傷的有機溶劑，包括例如醇、酮、聚乙二醇、甘油，優(yōu)選甘油，例如可向有機溶劑中加入得到的細胞懸液或向得到的細胞懸液中加入溶劑。對水溶性有機溶劑的量無嚴格要求且包括足以在反應混合液中形成液-液兩相的量，例如每100克干重細胞適于使用例如100克到5000克及更多溶劑，例如可使用500克到5000克水溶性有機溶劑。相分離可以在將溶劑與細胞懸液接觸后立即發(fā)生。形成的(例如)固態(tài)球形細胞顆?？纱嬖谂c所得的下層水相中。上層，例如主要含有可與水形成兩相系統(tǒng)的有機溶劑，可以很容易地分離且例如基本上完全與下層分離并可再次使用，例如用于進一步的細胞固定化。得到的球形細胞顆?？蔀楣虘B(tài)的，并可按例如常規(guī)方法與有機溶混性溶劑相分離，例如將懸液倒入底部有孔的容器中、離心、過濾?？捎美缛疀_洗將分離出的球形顆粒中的溶劑殘余去除。
在交聯(lián)之前，也就是說在加入雙功能劑之前，例如在加入可與水形成兩相的溶劑之前，可向細胞混合液中加入某種固體，包括例如氧化鋁、活性碳、皂粘土。對固體的量無嚴格要求，適宜的量為每100克干重細胞使用5克到200克，如50克到150克固體。在懸浮于可與水形成兩相的溶劑并在該混合物中加入雙功能劑發(fā)生交聯(lián)后，可以得到特別易于分離的具有有利的狹窄大小分布范圍及優(yōu)異的機械穩(wěn)定性的球形細胞顆粒。
根據(jù)本發(fā)明得到的生物催化劑，例如固態(tài)球形微生物細胞顆粒，可以保存以備以后使用，例如冷藏，例如在適當?shù)木彌_液中保存或例如以冰凍形式或以凍干的形式保存。
可根據(jù)本發(fā)明可得到的、例如這樣得到的含有酶活性的微生物細胞球形顆粒是新穎的。
另一方面，本方面提供了可按下述方法得到的、例如如此得到的(例如)固態(tài)的具有酶活性的含微生物細胞的球形顆粒，所述方法包括以下步驟1)用含伯胺或仲胺的聚合物處理具有酶活性的微生物細胞，2)用可與水形成兩相系統(tǒng)的有機溶劑與微生物細胞混合物接觸，例如在步驟1)之后，向可與水形成兩相系統(tǒng)的有機溶劑中加入微生物細胞混混合物，3)用雙功能劑處理步驟2)中得到的混合物，并分離得到的球形顆粒；例如，進一步包括在實施步驟1)或2)前用雙功能劑對微生物細胞進行預處理；和/或在分離球形顆粒之前，向步驟3)得到的混合物中加入水溶混性溶劑；和/或向步驟1)得到的混合物或?qū)嵤┎襟E1)之前的微生物中加入固體。
根據(jù)本發(fā)明的方法得到的具有酶活性的球形顆粒(例如固態(tài)球形顆粒)可用于酶促反應，例如具有DAO活性的(如)固態(tài)的(如)用PMSF進行過(預)處理的球形顆粒和具有GAC活性的(如)固態(tài)的(如)用PMSF進行過(預)處理的球形顆粒，可用于生產(chǎn)7-ACA和/或Gl-7-ACA和/或HACA。
另一方面，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)戊二?；?7-氨基頭孢烷酸的方法，包括以下步驟
1)用含伯胺或仲胺的聚合物處理具有D-氨基酸氧化酶活性的微生物細胞，2)用可與水形成兩相系統(tǒng)的有機溶劑與微生物細胞混合物接觸，例如在實施步驟1)后，向可與水形成兩相系統(tǒng)的溶劑中加入微生物細胞混混合物，3)用雙功能劑處理步驟2)得到的混合物，并分離得到的球形顆粒，且如果需要，用苯甲基磺酰氟處理存在DAO活性的具有酯酶活性的混合物，例如在步驟3)之前，例如在步驟1)之前；或用苯甲基磺酰氟處理步驟3)得到的存在D-氨基酸氧化酶活性具有酯酶活性的球形顆粒，4)用頭孢菌素C與步驟3)得到的球形顆粒反應，得到戊二?；?7-氨基頭孢烷酸，且如果需要，分離戊二?；?7-氨基頭孢烷酸；例如，可進一步將步驟4)得到的戊二酰-7-氨基頭孢烷酸轉(zhuǎn)化為7-氨基頭孢烷酸。
另一方面，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)戊二?；?7-氨基頭孢烷酸的方法，包括用頭孢菌素C與步驟3)得到的球形顆粒反應，得到戊二?；?7-氨基頭孢烷酸，且如果需要，分離戊二酰基-7-氨基頭孢烷酸。
可用例如常規(guī)方法將步驟4)得到的戊二酰基-7-氨基頭孢烷酸轉(zhuǎn)化為7-氨基頭孢烷酸，例如用化學或酶促方法轉(zhuǎn)化，或按本發(fā)明的另一方面的方法，例如使用根據(jù)本發(fā)明以上敘述可得到的或得到的具有GAC活性的球形顆粒進行轉(zhuǎn)化。如果按照本發(fā)明的存在脫乙酰化酶活性并具有DAO酶活性和/或存在脫乙?；富钚圆⒕哂蠫AC活性的球形顆粒用于與頭孢菌素C或Gl-7-ACA的反應，可得到HACA。
另一方面，本發(fā)明提供了按照本發(fā)明生產(chǎn)球形顆粒的方法或按照本發(fā)明生產(chǎn)的球形顆粒在從頭孢菌素C或從戊二酰基-7-氨基頭孢烷酸生產(chǎn)7-氨基-3-羥甲基-3-頭孢烯-4-羧酸中的應用。
根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的7-ACA或HACA可作為生產(chǎn)頭孢菌素的中間體，例如作為生產(chǎn)一種頭孢菌素類抗生素或其中間體的中間體，通過例如以下方法-將環(huán)系7位的氨基?；?br> -將環(huán)系3位的乙酰氧甲基進一步反應-將環(huán)系4位的羧基酯化-成鹽和/或溶劑化，例如按以上所述進行反應。
另一方面，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)7-氨基頭孢烷酸的方法，包括以下步驟1)用含有伯胺或仲胺的聚合物處理具有戊二酰?；富钚缘奈⑸锛毎?，2)用可與水形成兩相系統(tǒng)的有機溶劑與微生物細胞混合物接觸，3)用雙功能劑處理步驟2)得到的混合物，并分離得到的球形顆粒，4)如果需要，用苯甲基磺酰氟處理存在戊二酰?；富钚杂志哂絮ッ富钚缘幕旌衔铮缭诓襟E3)之前，例如在步驟1)之前進行處理；或如果需要，用苯甲基磺酰氟處理步驟3)得到的存在戊二酰酰化酶活性又有酯酶活性的球形顆粒，5)將戊二酰基-7-氨基頭孢烷酸與步驟3)或步驟4)得到的球形顆粒反應，獲得7-氨基頭孢烷酸，且如果需要，分離得到的7-氨基頭孢烷酸。
另一方面，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)頭孢菌素的方法，例如生產(chǎn)一種頭孢菌素類抗生素或其中間體，其中7-氨基頭孢烷酸或7-氨基-3-羥甲基-3-頭孢烯-4-羧酸(例如根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的7-氨基頭孢烷酸)被用作中間體。
本文中“基本”的意思是例如根據(jù)情況高于初始值的95％，例如96％，97％，或初始值的低于5％，例如4％，3％。
以下實施例中溫度均為攝氏度，以下為所使用的縮略語7-ACA7-氨基頭孢烷酸Ceph C頭孢菌素CDAOD-氨基酸氧化酶GAC戊二酰?；窯DA戊二醛Gl-7-ACA戊二酰基-7-氨基頭孢烷酸KA-7-ACAα-酮己二酰氨基頭孢烷酸PEI聚乙烯亞胺PMSF苯甲基磺酰氟TBP磷酸三正丁酯“1U氧化酶”活性相當于在25℃，pH值為8的情況下，在氧飽和的20mM頭孢菌素C水溶液中形成1μmol/min Gl-7-ACA和KA-7-ACA。
“1U?；浮被钚韵喈斢谠?7℃，pH值為8的情況下，在2％的Gl-7-ACA水溶液中形成1μmol/min戊二酸或7-ACA。
實施例1獲得基本去除酯酶活性的具有DAO活性的混合物的通用程序從具有酯酶活性和DAO活性的水性發(fā)酵液中，可按常規(guī)方法(參見例如Kublicek-Pranz，E.M.等，Can.J.Microbiol.，1985，31，pp624-628)收獲細胞沉淀，將得到的10克細胞沉淀重新懸浮于50ml水中，并在室溫下，在pH值為11的情況下用苛性鈉溶液處理大約90分鐘以去除過氧化氫酶活性。加入磷酸將混合物的pH值調(diào)節(jié)至大約為7。
向得到的混合物中加入每毫升乙醇中含10毫克PMSF的乙醇溶液500μl，在室溫下保溫得到的混合物約3小時。得到的細胞懸液可原樣用于需要DAO活性的反應。細胞沉淀的DAO活性530U氧化酶用苛性鈉處理后的DAO活性490U氧化酶用PMSF處理后的DAO活性450U氧化酶(等于用PMSF處理前活性的92％)。
實施例2將按實施例1所述得到的經(jīng)PMSF處理的具有DAO活性的細胞懸液加入1000ml水中含10克頭孢菌素C的溶液中，將獲得的溶液的pH值調(diào)節(jié)至7.5。在室溫并向混合液中導入氧氣的情況下，將獲得的混合物攪拌大約180分鐘。Gl-7-ACA產(chǎn)率91％起始頭孢菌素C溶液中3位脫乙?；a(chǎn)物的總量相當于頭孢菌素C的3％得到的反應液中3位脫乙酰化產(chǎn)物的總量相當于起始頭孢菌素C的3％。
重復實施例2，但使用未經(jīng)PMSF處理的DAO活性Gl-7-ACA產(chǎn)率88％起始頭孢菌素C溶液中3位脫乙?；a(chǎn)物的總量相當于頭孢菌素C的3％得到的反應溶液中3位脫乙?；a(chǎn)物的總量相當于起始頭孢菌素C的6％。
實施例3在用PMSF處理前，將按實施例1所述獲得的細胞懸液勻漿(勻漿化細胞中DAO活性385U氧化酶)并按實施例1所述用PMSF處理得到的勻漿細胞(勻漿并用PMSF處理的細胞內(nèi)DAO活性372U氧化酶，相當于用PMSF處理前活性的96％)。按實施例2所述將得到的細胞懸液與頭孢菌素C反應。Gl-7-ACA產(chǎn)率93％起始頭孢菌素C溶液中3位脫乙?；a(chǎn)物的量相當于頭孢菌素C的3％獲得的反應液中3位脫乙?；a(chǎn)物的量相當于起始頭孢菌素C的3％。
重復實施例3，但使用未經(jīng)PMSF處理的DAO活性Gl-7-ACA產(chǎn)率89％起始頭孢菌素C溶液中3位脫乙?；a(chǎn)物的量相當于頭孢菌素C的3％獲得的反應液中3位脫乙酰化產(chǎn)物的量相當于起始頭孢菌素的7％。
實施例4
在用苛性鈉處理之前，將按實施例1所述得到的10克細胞沉淀懸浮于50ml水中，向獲得的懸液內(nèi)加入2克聚乙烯亞胺(分子量600000-1000000)，在室溫及pH值為11(通過加入苛性鈉溶液進行調(diào)節(jié))的情況下，將獲得的混合液保溫90分鐘。向獲得的混合液中加入磷酸，將pH值調(diào)節(jié)到8.5，將得到的懸液與50ml甲苯攪拌。得到了溶劑中有細微的滴狀細胞顆粒的乳狀液，向其中加入8ml 25％的GDA溶液。細微的滴狀細胞顆粒固化形成固態(tài)球形顆粒。分離固態(tài)球形顆粒并用泉水沖洗。
球形顆粒中DAO活性290U氧化酶將獲得的固態(tài)球形顆粒懸浮于pH7.0的50ml 20mM磷酸緩沖液中，并與500μl類似于實施例1中所述之PMSF溶液混合，將獲得的混合液保溫180分鐘。經(jīng)PMSF處理的固態(tài)球形顆粒的DAO活性305U氧化酶。
將獲得的經(jīng)PMSF處理的固態(tài)球形顆粒用于與實施例2所述類似的頭孢菌素C的反應。Gl-7-ACA產(chǎn)率92％起始頭孢菌素C溶液中3位脫乙?；a(chǎn)物的量相當于頭孢菌素C的3％獲得的反應液中3位脫乙酰化產(chǎn)物的量相當于起始頭孢菌素C的3％。
重復實施例4，但使用未經(jīng)PMSF處理的固態(tài)球形顆粒。Gl-7-ACA產(chǎn)率89％起始頭孢菌素C溶液中3位脫乙?；a(chǎn)物的量相當于頭孢菌素C的3％獲得的反應液中3位脫乙?；a(chǎn)物的量相當于起始頭孢菌素C的7％。
實施例5從發(fā)酵液中分離出10克重組大腸桿菌株(例如CCM4229，GAC活性720U酰化酶)濕細胞沉淀并沖洗，在50ml pH7.0的50mM的磷酸緩沖液中將濕細胞沉淀重新懸浮。向獲得的懸液中加入含10毫克PMSF/毫升的乙醇溶液0.5ml，在室溫下攪拌所獲得的混合物約3小時。
GAC活性708U?；?相當于用PMSF處理前的98％)。
將10克Gl-7-ACA溶于1000ml水中并將pH值調(diào)節(jié)為8.2。向其中加入按以上所述得到的經(jīng)PMSF處理的大腸桿菌懸液，在保持pH值大約為8.0-8.2的情況下，在12℃下將獲得的混合液攪拌約180分鐘。7-ACA產(chǎn)率93％起始Gl-7-ACA溶液中3位脫乙酰化產(chǎn)物的量相當于Gl-7-ACA的3％獲得的反應液中3位脫乙?；a(chǎn)物的量相當于起始Gl-7-ACA的3％。
重復實施例5，但使用未經(jīng)PMSF處理的GAC活性。7-ACA產(chǎn)率90％起始Gl-7-ACA溶液中3位脫乙?；a(chǎn)物的量相當于Gl-7-ACA的3％獲得的反應液中3位脫乙酰化產(chǎn)物的量相當于起始Gl-7-ACA的7％。
實施例6將10克洗過的重組大腸桿菌細胞株如CCM4229濕細胞沉淀(GAC活性720U?；?，懸浮于50ml pH7.0的50mM磷酸緩沖液，并在700巴壓力下勻漿。將勻漿細胞(GAC活性752U酰化酶)與實施例5中所述之PMSF乙醇溶液混合。PMSF處理過的細胞中GAC活性768U?；浮?br> 將獲得的懸液加入Gl-7-ACA溶液中，并按實施例5所述進行反應。7-ACA產(chǎn)率89％起始Gl-7-ACA溶液中3位脫乙?；a(chǎn)物的量相當于Gl-7-ACA的3％獲得的反應液中3位脫乙?；a(chǎn)物的量相當于起始Gl-7-ACA的3％。
重復實施例6，但使用未經(jīng)PMSF處理的GAC活性。Gl-7-ACA產(chǎn)率83％起始Gl-7-ACA溶液中3位脫乙酰化產(chǎn)物的量相當于Gl-7-ACA的3％獲得的反應液中3位脫乙?；a(chǎn)物的量相當于起始Gl-7-ACA的6％。
實施例7將從10克洗過的重組大腸桿菌細胞株如CCM 4229濕細胞沉淀(GAC活性7350U酰化酶)得到的勻漿細胞懸浮于50ml pH7.0的50mM磷酸緩沖液中，并與絮凝劑(1ml SediflocRCL 900-18/40)混合。向獲得的混合液中加入乙酸將pH值調(diào)節(jié)為5.2，在約40℃并攪拌的情況下將得到的混合物保溫約1小時，在10℃下再攪拌1小時。通過離心凈化獲得的混合液，將含有GAC活性的無細胞上層(GAC活性6150U?；?的pH值調(diào)節(jié)到7.5，將其與PMSF溶液混合并進行與實施例5類似的保溫。經(jīng)過PMSF處理的無細胞提取物的GAC活性6220U酰化酶。將得到的混合液與10克丙烯酸(固定劑)珠(EupergitRC)混合，用50ml 1mol硫酸鈉水溶液處理，在室溫及震蕩的情況下保溫64小時，將獲得的荷酶載體材料與固定溶液分離，并作為催化劑用于與實施例5所述類似的Gl-7-ACA溶液的反應。7-ACA產(chǎn)率90％起始Gl-7-ACA溶液中3位脫乙?；a(chǎn)物的量相當于Gl-7-ACA的3％獲得的反應溶液中3位脫乙?；a(chǎn)物的量相當于起始Gl-7-ACA的3％。
重復實施例7但使用未經(jīng)PMSF處理的固定化的GAC活性。7-ACA產(chǎn)率83％起始Gl-7-ACA溶液中3位脫乙?；a(chǎn)物的量相當于Gl-7-ACA的3％獲得的反應液中3位脫乙?；a(chǎn)物的量相當于起始Gl-7-ACA的6％。
實施例8按與實施例7所述類似的方法固定GAC活性，但不在固定化之后用PMSF處理，而在固定化過程中向含有具有GAC活性的無細胞上清、Eupergit和硫酸鈉的混合液中加入1ml與實施例5所述類似的PMSF溶液。
從固定化溶液中分離獲得的經(jīng)PMSF處理的荷酶載體材料，并將其作為催化劑用于與實施例5所述類似的Gl-7-ACA溶液的反應。7-ACA及脫乙?；a(chǎn)物的產(chǎn)率與實施例7基本相同。
實施例9按與實施例7所述類似的方法生產(chǎn)含GAC的上清，但不用PMSF處理(GAC活性5830U?；?。將得到的溶液與40克離子交換樹脂混合，將獲得的混合物的pH值調(diào)節(jié)為7.5并在室溫及震蕩的情況下保溫大約300分鐘。分離并沖洗獲得的離子交換樹脂(GAC活性1865U?；?。
將獲得的離子交換樹脂懸浮于200ml 50mM的磷酸緩沖液中，加入2ml實施例5中使用的PMSF溶液，將得到的混合液在攪拌的情況下保溫約180分鐘。經(jīng)PMSF處理的離子交換樹脂的GAC活性1810U?；?，相當于用PMSF處理前的催化劑中GAC活性的97％。
將獲得的經(jīng)PMSF處理的荷酶離子交換樹脂作為催化劑用于與實施例5類似的Gl-7-ACA溶液的反應。起始Gl-7-ACA溶液中3位脫乙?；a(chǎn)物的量相當于Gl-7-ACA的3％獲得的反應溶液中3位脫乙?；a(chǎn)物的量相當于起始Gl-7-ACA的3％。
通過微過濾用泉水將冰凍細胞解凍并沖洗，并將體積濃縮到大約735ml，濃縮細胞塊中的DAO活性26350U。
b、聚合物處理將按步驟a得到的735ml細胞(100克細胞干重)與β-疏基乙醇(5mM)、EDTA(2mM)和40克50％的PEI水溶液(分子量60萬-100萬)懸浮于水中(總體積大約為800ml)，并在室溫下緩慢攪拌約90分鐘，在此期間通過加入苛性鈉溶液使pH值保持為11。向獲得的混合物中加入磷酸將pH值調(diào)節(jié)到9。DAO活性24360U(相當于按實施例10a所述獲得的經(jīng)預處理的DAO活性的94％)。
c、交聯(lián)在室溫下，邊攪拌邊將步驟b中獲得的細胞/聚合物混合物加入到位于攪拌容器內(nèi)的3000ml TBP中。大約30分鐘內(nèi)，可得到均勻地分散于TBP中的細胞/聚合物小滴，向其中加入40克25％GDA水溶液。交聯(lián)立即開始，并于數(shù)分鐘后結(jié)束。可得到固態(tài)球形顆粒形態(tài)的細胞。在15℃到20℃下向獲得的混合物中加入2000g甘油，完成TBP相和水相的分離。將主要含有甘油和固態(tài)球形細胞顆粒的下層與主要含有TBP的上層分離。獲得的上層(2900ml)可在例如另一次交聯(lián)中再次使用。大約90分鐘后，將下層內(nèi)的固態(tài)球形顆粒分離并用泉水沖洗以去除殘余TBP和甘油。得到580克濕重具有氧化酶活性的固態(tài)球形顆粒，相當于121克干重。固態(tài)球形顆粒中DAO比活性為32U/克濕重(153U/克干重)，也就是說，總的DAO活性為18560U(相當于按實施例10a所述獲得的經(jīng)預處理的DAO活性的71％)。
實施例11將實施例10c中得到的580克固態(tài)球形顆粒(濕重)懸浮于2000ml泉水中，并在室溫下攪拌。將20mg PMSF溶于20ml無水乙醇中，并將獲得的溶液于大約2分鐘內(nèi)加入氧化酶懸液中。將混合液保溫約3小時，分離形成的固態(tài)球形顆粒，并用乙醇水溶液(1000ml，10％)和泉水沖洗。
得到563g固態(tài)球形顆粒(濕重，相當于118克干重)。經(jīng)PMSF處理的固態(tài)球形顆粒的DAO比活性為31U/克濕重(148U/克干重)，也就是說，總的DAO活性為17450U(相當于按實施例10a獲得的經(jīng)過預處理的DAO活性的67％，及用PMSF處理前活性的94％)。獲得的固態(tài)球形顆粒中的酯酶活性已基本去除。
實施例12加入磷酸將按實施例10a和b制得的細胞/聚合物混合物的pH調(diào)到9.0，并加入80克氧化鋁。按實施例10c所述進行與該混合物的交聯(lián)。得到630克固態(tài)球形顆粒(濕重，相當于193克干重)。該固態(tài)球形顆粒中的DAO比活性為26U/克濕重(85U/克干重)，即DAO總活性為16440U(相當于如實施例10a中所得經(jīng)預處理的DAO活性的63％)。獲得了240-500微米的狹窄大小分布范圍。
實施例13按與實施例10所述類似的方法進行，但不加甘油。在交聯(lián)后，將懸液攪拌約60分鐘。讓獲得的懸液穿過底部有孔的容器，從而將獲得的固態(tài)球形顆粒從TBP懸液中分離，孔的大小小于獲得的固態(tài)球形顆粒的大小。獲得2680ml TBP，用泉水沖洗去除獲得的固態(tài)球形顆粒中的殘余TBP。
得到610克固態(tài)球形顆粒(濕重，相當于126克干重)，固態(tài)球形顆粒的DAO比活性為36U/克濕重(174U/克干重)，也就是說，總的DAO活性為21960U(相當于按實施例10a所述獲得的經(jīng)過預處理的DAO活性的85％)。
實施例14將按實施例10和11所述類似方法獲得的經(jīng)PMSF處理的固態(tài)球形顆粒(81克濕重，DAO活性2500U)與1升pH值為7.2的75mM的Ceph C溶液混合，在5巴壓力下向獲得的混合液內(nèi)導入空氣約80分鐘。將溶液與固態(tài)球形顆粒分離，用HPLC進行分析。在分離出的溶液中可測出0.6mMCeph C，70.7mM Gl-7-ACA和3mM KA-7-ACA。
將實施例14重復142次，每次使用新鮮的Ceph C溶液和實施例14中所述的經(jīng)PMSF處理的同一固態(tài)球形顆粒。
第142次反應中，在與Ceph C接觸約160分鐘后，將溶液與固態(tài)球形顆粒分離并用HPLC分析。在分離的溶液中可測得0.5mM Ceph C，69.8mM Gl-ACA和0.4mM KA-7-ACA。
反應142次后，固態(tài)球形顆粒已使用了308小時，分離出93克固態(tài)球形顆粒(濕重，相當于24克干重)。
獲得的固態(tài)球形顆粒的DAO比活性為12U/克濕重，相當于47U/克干重，也就是說，總的DAO活性為1120U(初始活性的45％)。
實施例15分別用3.3克25％的GDA水溶液按與實施例10a所述類似的方法對具有DAO活性的粟酒裂殖酵母細胞，例如ATCC 38399和ATCC 38436(濕重分別為82克和90克)進行預處理。收獲細胞并保存于冰凍狀態(tài)。解凍后，將混合物用泉水沖洗并濃縮，從例如ATCC 38399獲得164ml中的20.4克干物質(zhì)，從例如ATCC 38436獲得180ml中的24.1克干物質(zhì)。
按實施例10b所述方法分別用2.8克50％PEI水溶液處理7克細胞干重的例如ATCC 38399和ATCC 38436。
在230ml TBP中加入3.5克25％GDA水溶液和400克甘油，按與實施例10c所述類似的方法，分別在得到的懸液中進行交聯(lián)。通過濾網(wǎng)用泉水沖洗獲得的固態(tài)球形顆粒以去除甘油和TBP殘余物。
從例如ATCC 38436得到59.5克濕重的具有DAO活性的固態(tài)球形顆粒(14.0克干重)，從例如ATCC 38399得到55.6克濕重的具有DAO活性的固態(tài)球形顆粒(16.1克干重)。獲得的固態(tài)球形顆粒與按實施例10c得到的固態(tài)球形顆粒表現(xiàn)出相似的DAO反應特性和相似的穩(wěn)定性特征。
粟酒裂殖酵母適于克隆和表達不同的酶，可以按與本實施例所述類似的簡單方法獲得其他生物催化劑，如具有其他酶活性的固態(tài)球形顆粒。
實施例16按與實施例10a中所述類似的方法，用3.3克25％的GDA溶液對糙皮側(cè)耳細胞(90克濕重，18970U青霉素V?；?進行預處理。從生成的細胞懸液中收獲細胞并冷凍保存。在解凍后，用泉中沖洗并通過微過濾濃縮。
用7.4克50％PEI水溶液處理得到的18.6克細胞(干重)。在560mlTBP中加入7.4克25％GDA溶液和370克甘油，按與實施例10c類似的方法進行細胞交聯(lián)。通過濾網(wǎng)用泉水沖洗獲得的固態(tài)球形顆粒以去除甘油和TBP殘余物。
得到223克含青霉素V酰化酶的固態(tài)球形顆粒(濕重，相當于29.4克干重)。
青霉素V?；傅谋然钚詾?0.4U/克濕重，也就是說，總的青霉素V?；甘?1240U(相當于初始活性的39％)。
1U青霉素V?；赶喈斢谠趐H7.5及28℃下，在K-青霉素-V磷酸緩沖的溶液液中每分鐘形成1μmol 6-氨基青霉烷酸。
實施例17按與實施例10a和10b所述類似的方法制備三角酵母細胞，例如ATCC58536(54克濕重，DAO活性2600U氧化酶)。
按與實施例10c所述類似的方法進行交聯(lián)，但是在攪拌的情況下向300ml戊二酰二甲酯或己二酸二甲酯(而不是100克干重細胞用3000mlTBP)內(nèi)加入含有三角酵母細胞的細胞/聚合物混合物。在15℃-20℃下，向每種混合液中分別加入5克25％GDA溶液及400克甘油，按與實施例10c所述類似方法進行交聯(lián)。
分別得到93.4克和86.9克具有DAO活性的固態(tài)球形顆粒(濕重，分別相當于20.6克和20.2克干重)。
DAO比活性分別為14.8U/克濕重或12.5U/克濕重，也就是說，總的活性分別為1382U(初始活性的53％)或1086U(初始活性的42％)。
權(quán)利要求
1.一種在具有酯酶活性和D-氨基酸氧化酶和/或戊二酰?；富钚缘幕旌衔镏?，在保存D-氨基酸氧化酶活性或戊二酰?；富钚缘那闆r下，降低酯酶活性的方法，包括用苯甲基磺酰氟處理具有酯酶活性和D-氨基酸氧化酶活性和/或戊二酰?；富钚缘幕旌衔铩?br> 2.一種生產(chǎn)戊二?；?7-氨基頭孢烷酸的方法，包括以下步驟1)用苯甲基磺酰氟處理具有酯酶活性和D-氨基酸氧化酶活性的混合物，2)用頭孢菌素C與步驟1)得到的混合物反應以得到戊二?；?7-氨基頭孢烷酸。
3.權(quán)利要求2的方法，其中還包括分離步驟(2)獲得的戊二酰基-7-氨基頭孢烷酸的步驟。
4.一種生產(chǎn)7-氨基頭孢烷酸的方法，包括以下步驟1)用苯甲基磺酰氟處理具有酯酶活性和戊二酰?；富钚缘幕旌衔铮?)用戊二?；?7-氨基頭孢烷酸與步驟1)得到的混合物反應，以獲得7-氨基頭孢烷酸。
5.權(quán)利要求4的方法，其中還包括分離步驟2)得到的7-氨基頭孢烷酸的步驟。
6.一種生產(chǎn)戊二?；?7-氨基頭孢烷酸的方法，包括以下步驟1)用含伯胺或仲胺的聚合物處理具有D-氨基酸氧化酶活性的微生物細胞，2)用可與水形成兩相系統(tǒng)的有機溶劑與微生物細胞混合物接觸，3)用雙功能劑處理步驟2)得到的混合物，并分離獲得的球形顆粒，用苯甲基磺酰氟處理存在D-氨基酸氧化酶活性并具有酯酶活性的混合物，或用苯甲基磺酰氟處理存在D-氨基酸氧化酶并具有酯酶活性的從步驟3)獲得的球形顆粒，4)用頭孢菌素C與從步驟3)獲得的球形顆粒反應，以獲得戊二?；?7-氨基頭孢烷酸。
7.權(quán)利要求6的方法，其中還包括分離步驟(4)獲得的戊二酰基-7-氨基頭孢烷酸的步驟。
8.一種生產(chǎn)戊二?；?7-氨基頭孢烷酸的方法，包括用頭孢菌素C與可根據(jù)權(quán)利要求6定義的步驟3)獲得的球形顆粒反應，獲得戊二?；?7-氨基頭孢烷酸。
9.權(quán)利要求8的方法，其中還包括分離戊二酰基-7-氨基頭孢烷酸的步驟。
10.一種生產(chǎn)7-氨基頭孢烷酸的方法，其中根據(jù)權(quán)利要求2的步驟2)或權(quán)利要求6的步驟4)得到的戊二?；?7-氨基頭孢烷酸被轉(zhuǎn)化成7-氨基頭孢烷酸。
11.一種生產(chǎn)7-氨基頭孢烷酸的方法，包括以下步驟1)用含伯胺或仲胺的聚合物處理具有戊二酰?；富钚缘奈⑸锛毎?，2)用可與水形成兩相系統(tǒng)的有機溶劑與微生物細胞混合物接觸，3)用雙功能劑處理從步驟2)得到的混合物；并分離獲得的球形顆粒，4)用苯甲基磺酰氟處理存在戊二酰?；富钚圆⒕哂絮ッ富钚缘幕旌衔铮蛴帽郊谆酋７幚韽牟襟E3)獲得的存在戊二酰?；富钚圆⒕哂絮ッ富钚缘那蛐晤w粒，5)用戊二?；?7-氨基頭孢烷酸與從步驟3)或步驟4)獲得的球形顆粒反應，以獲得7-氨基頭孢烷酸。
12.權(quán)利要求11的方法，其中還包括分離步驟(5)獲得的7-氨基頭孢烷酸的步驟。
13.一種生產(chǎn)頭孢菌素的方法，其中根據(jù)權(quán)利要求4-10中任一項的方法生產(chǎn)的7-氨基頭孢烷酸或7-氨基-3-羥甲基-3-頭孢烯-4羧酸被用作中間體。
全文摘要
一種在具有酯酶活性和D－氨基酸氧化酶活性和/或具有酯酶活性和戊二酰?；富钚缘幕旌衔镏?，通過用苯甲基磺酰氟處理，在保存D－氨基酸氧化酶活性或戊二酰?；富钚缘耐瑫r降低酯酶活性的方法；用含伯胺或仲胺的聚合物、可與水形成兩相系統(tǒng)的有機溶劑和雙功能劑處理具有酶活性的微生物細胞可獲得球形顆粒形態(tài)的固定化生物催化劑；所述方法和生物催化劑在7－氨基頭孢烷酸、7－氨基－3－羥甲基－3－頭孢烯－4－羧酸及頭孢菌素類抗生素的生產(chǎn)中的應用。
文檔編號C12N11/04GK1515679SQ0313818
公開日2004年7月28日 申請日期1998年9月8日 優(yōu)先權(quán)日1997年9月9日
發(fā)明者A·雷克特, W·里索斯特, F·克諾斯德, N·帕爾馬, A 雷克特, 鄧溝, 魎固 申請人:生物化學有限公司