專利名稱：家畜口蹄疫病毒a、o型基因工程雙價多肽疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種家畜口蹄疫病毒(FMDV)和雙價多肽疫苗以及遺傳工程領(lǐng)域，尤其是一種A、O型基因工程雙價多肽疫苗及其制備方法。
(2)背景技術(shù)口蹄疫是致偶蹄動物的一種急性、高度接觸性、發(fā)熱性傳染病，以傳播迅速、感染性高而著稱，國際獸疫局將其列為A類傳染病之首。傳統(tǒng)的疫苗主要是滅活的和減毒的致病物質(zhì)，即病原體在培養(yǎng)、純化后，或者被滅活，或者被降低其毒性。這兩種疫苗雖然具有較好的免疫原性，但是生產(chǎn)的安全性較差，需要對實驗室以及參加實驗的工作人員采取保護措施，保證不被致病物質(zhì)污染保證病毒不泄漏。在疫苗生產(chǎn)過程中，病毒有可能沒有完全殺死或充分減毒，會導(dǎo)致疫苗中含有高毒性致病物質(zhì)，進而導(dǎo)致被免疫動物發(fā)病而使疾病大規(guī)模流行。絕大多數(shù)的現(xiàn)行疫苗的有效期都很短，而且常常需要冷凍保存，這增大了疫苗在農(nóng)村推廣使用的難度。DNA重組技術(shù)的發(fā)展為制造新一代的重組疫苗提供了新思路。雖然目前已克隆了口蹄疫病毒VP1蛋白并制成口蹄疫疫苗，但是其免疫原性弱，對動物的保護效果尚不理想?？谔阋邔儆谛NA病毒科口蹄疫病毒屬，共包括A、O、C等7種血清型。我國主要以O(shè)型為主，A型口蹄疫也時有發(fā)生。目前口蹄疫的基因工程疫苗均為單價。1986年美國伊萊公司(CN86103718A)提出一種口蹄疫疫苗的制備方法，它是有治療或預(yù)防口蹄疫活性的化合物。這種化合物含有結(jié)構(gòu)式X-A-Y-B-Z序列，其中A和B是組成口蹄疫病毒VP外殼蛋白血清型序列的氨基酸殘基序列，其中一個含有18到24氨基酸殘基，并包括O血清型141-158位上氨基酸殘基序列或其它血清型的相同序列，而另一個含有14到20氨基酸殘基，并包括O血清型200到213位上的氨基酸殘基序列或其它血清型的相同序列。1999年香港科技大學(xué)(CN1270839A)提出一種口蹄疫的抗原化抗體疫苗，它屬于一種治療豬口蹄疫的疫苗，此疫苗是將得自FMDV的肽表位移植到豬抗體CDR環(huán)而產(chǎn)生的抗原化抗體疫苗。可通過PCR由FMDV的VP1基因克隆FMDV肽表位。使用重疊的PCR法將FMDV肽表位插入到豬免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因的CDR區(qū)域內(nèi)，將所得的抗原化抗體基因克隆至哺乳動物表達(dá)載體。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至CHO或骨髓瘤細(xì)胞，選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子細(xì)胞系以大量產(chǎn)生所需的蛋白質(zhì)疫苗。2000年中國科學(xué)院上海植物生理研究所提出一種新型口蹄疫苗及其制備方法，它是一種新的含口蹄疫病毒抗原小肽的融合蛋白及其編碼序列，以及這些融合蛋白在口蹄疫的診斷和預(yù)防上的用途。還提供了含有這些新型融合蛋白的口蹄疫疫苗及其制備方法。所說的融合蛋白，是在煙草花葉病毒外殼蛋白的第155-156位氨基酸之間插入有長度為10-20個氨基酸的口蹄疫病毒特異性表位。該口蹄疫病毒特異性表位的長度為11-14個氨基酸。該口蹄疫病毒特異性表位選自下組SEQ ID NO2、3和4。2001年深圳市三方圓信息技術(shù)有限公司提出一種家畜口蹄疫基因工程苗及其制造方法，工程苗是由病毒RNA反轉(zhuǎn)錄獲得并可編碼VP1蛋白的全DNA序列，是在包括植物的根莖葉和種子在內(nèi)的植物反應(yīng)器中形成的立體結(jié)構(gòu)的總和，分子量為30-150KDa，通過將VP1全基因插入質(zhì)粒載體、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入植物中表達(dá)和轉(zhuǎn)基因種子種入土壤獲得可作為疫苗的植物等過程。
(3)發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種能同時有效地預(yù)防A、O型口蹄疫病毒的、安全可靠的疫苗及其制備方法。
本發(fā)明克隆了A、O型口蹄疫病毒VP1的抗原決定簇，將其串聯(lián)與能顯著提高其免疫原性的大片段相連后，插入原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白經(jīng)純化后制成具有口蹄疫A、O型免疫原性的雙價多肽疫苗。
本發(fā)明是一種能預(yù)防A、O型口蹄疫病毒的雙價多肽疫苗。是將編碼A、O型口蹄疫病毒毒株的VP1蛋白中的抗原決定簇部分連接。為增強其免疫原性，在該基因的末端連接上一段中間包含O、A型口蹄疫病毒抗原簇的大片段。其核苷酸序列為1GGATCCATGGCTGTGCCAAACTTGCGTGGCGATTTGCAGGTGTTGGCTCAGAAAGTGGCT61 CGTACTTTGCCAGAGCTCCGATCG CGTCATAAACAGAAAATTGTGGCTCCAGTGAAACAG121 ACTTTGGAATTCGGCTCTGGCCGTCGTGGCGACGATATGGGCTCTTTGGCTGCTCGTGTGGTG181 AAACAGTTGCCAGGTACCGTCGACATGGACATTGACCCGTATAAAGAATTTGGAGCTTCT241 GTGGAGTTACTCTCTTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCTATTCGAGATCTCCTCGAC301 ACCGCCTCTGCTCTGTATCGGGAGGCCTTAGAGTCTCCGGAACATTGTTCACCTCACCAT361 ACAGCACTCAGGCAAGCTATTCTGTGTTGGGGTGAGTTGATGAATCTGGCCACCTGGGTG421 GGAAGTAATTTGGAAGACCCAGCAGTCGACGCAGTTCCAAACTTGCGTGGTGATTTGCAG481GTTTTGGCACAGAAAGTTGCTCGTACCTTGCCAGGCTCTGGCCGTCGTGGCGATATGGGC541TCTTTGGCTGCTCGTGTGGTGAAACAGTTGCCACTCGAGTCCAGGGAATTAGTAGTCAGC601 TATGTCAATGTTATGGGCCTAAAAATCAGACAACTACTGTGGTTTCACATTTCCTGTCTT661 ACTTTTGGAAGAGAAACTGTTCTTGAGTATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACT721 CCTCCTGCTTACAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTT
781 GTTAGACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCT841 CAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTCAATGTTAGAAGCTT其中7～72，85～126，451～513為VP1蛋白的O型抗原決定簇；133～192，514～573為VP1蛋白的A型抗原決定簇；205～450，574～894為有利于FMDV多肽疫苗形成一定空間結(jié)構(gòu)的載體蛋白；其他序列為連接片段。
本發(fā)明的疫苗，其包涵體變性蛋白經(jīng)Ni+-NTA-Sepharose 6B親和層析柱在非變性的條件下直接分離純化，具體步驟如下1)在濕菌加緩沖液(buffer)A(6M鹽酸胍，0.1M磷酸鈉，0.01M Tris/HCl，pH8.0)，離心，收集上清；2)將用buffer A平衡的Ni+-NTA-Sepharose 6B加至上清中，將凝膠裝到層析柱上；3)用buffer A和buffer B(8M尿素，0.1M磷酸鈉，0.01M Tris/HCl，pH8.0)洗脫；4)用buffer C(8M尿素，0.1M磷酸鈉，0.01M Tris/HCl，pH6.3)洗脫；5)用buffer D(8M尿素，0.1M磷酸鈉，0.01M Tris/HCl，pH5.9)洗脫，再用buffer E(8M尿素，0.1M磷酸鈉，0.01M Tris/HCl，pH4.5)洗脫，收集，用SDS-PAGE分析；6)用buffer F(6M鹽酸胍，0.2M乙酸)洗滌，收集，作SDS-PAGE分析。
表達(dá)產(chǎn)物分別用以下四種溶液依次透析復(fù)性12～24h1)8M尿素，5mM EDTA，1×PBS；2)2M尿素，5mM EDTA，1×PBS；3)0.2M尿素，5mM EDTA，1×PBS；4)5mM EDTA，1×PBS。
(4)


圖1為誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖。
圖2為蛋白質(zhì)過柱純化圖。
圖3為純化的重組蛋白和包涵體的Dot-Elisa分析。
(5)具體實施方式
以下將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的說明。
原核表達(dá)載體pET-28a經(jīng)BamH I和Hind III雙酶切后的產(chǎn)物，純化后與以上片段通過T4DNA連接酶于16℃連接過夜。次日轉(zhuǎn)化感受態(tài)pET28a表達(dá)菌BL21(DE3)細(xì)胞。經(jīng)酶切及PCR鑒定得陽性克隆pET28a-T8-3S。
將此陽性克隆置于具有Kanr的LB培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)過夜，次日取300～700uL過夜培養(yǎng)液接種于10mL LB培養(yǎng)基中，30～37℃培養(yǎng)3h，使菌種OD600達(dá)0.6～0.9，吸1mL作為對照，然后加IPTG使其終濃度為1mmol/L，37℃誘導(dǎo)3～6h，每隔一小時從培養(yǎng)液中取1mL轉(zhuǎn)移至離心管中，12,000g離心1～5min，收集菌體，沉淀重懸于100μL的1×SDS加樣緩沖液中，100℃加熱3～10min，進行SDS-PAGE(濃縮膠8％，分離膠12％)電泳后進行考馬斯亮藍(lán)染色4～10h，用甲醇∶冰醋酸∶水(45∶45∶10，V/V/V)溶液中45℃脫色1～4h。與pET-28a空載體誘導(dǎo)表達(dá)樣品的SDS-PAGE電泳相比，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后第二個小時開始便出現(xiàn)了明顯的重組融合蛋白條帶，分子量與計算的相吻合，為34KD左右，參見圖1，其中第一道為pET-28a未誘導(dǎo)表達(dá)；第二道為pET-28a誘導(dǎo)表達(dá)4h；第三道為pET28a-T8-3S未誘導(dǎo)表達(dá)；第四道為pET28a-T8-3S誘導(dǎo)表達(dá)2h；第五道為pET28a-T8-3S誘導(dǎo)表達(dá)3h；第六道為蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品。
本發(fā)明的疫苗，其包涵體變性蛋白經(jīng)Ni+-NTA-Sepharose 6B親和層析柱在非變性的條件下直接分離純化(參見圖2，其中橫坐標(biāo)為時間T/Min，縱坐標(biāo)為紫外吸收值a/(280nm))，具體步驟如下1)每克濕菌加4～5mL buffer A(6M鹽酸胍，0.1M磷酸鈉，0.01M Tris/HCl，pH8.0)，室溫攪拌；10,000g離心10～20min收集上清；2)將4～5mL用buffer A平衡的Ni+-NTA-Sepharose 6B加至上清中，室溫攪拌40～60min，將凝膠裝到直徑為1.6cm的層析柱上；3)用10個床體積的buffer A和5個床體積的buffer B(8M尿素，0.1M磷酸鈉，0.01MTris/HCl，pH8.0)洗脫，如必要，洗至A 280＜0.01；4)用buffer C(8M尿素，0.1M磷酸鈉，0.01M Tris/HCl，pH6.3)洗脫，洗至A280＜0.01；5)用10-20mL buffer D(8M尿素，0.1M磷酸鈉，0.01M Tris/HCl，pH5.9)先洗，再用10-20mLbuffer E(8M尿素，0.1M磷酸鈉，0.01M Tris/HCl，pH4.5)洗，每3mL收集一管，用SDS-PAGE分析；6)用20 mLbuffer F(6M鹽酸胍，0.2M乙酸)洗滌，每3mL收集一管，作SDS-PAGE分析。
表達(dá)產(chǎn)物分別用以下四種溶液依次透析復(fù)性12～24h1)8M尿素，5mM EDTA，1×PBS；2)2M尿素，5mM EDTA，1×PBS；3)0.2M尿素，5mM EDTA，1×PBS；4)5mM EDTA，1×PBS。
為進一步確證該融合蛋白是以何形式在大腸桿菌中表達(dá)，我們將收集的表達(dá)后菌體經(jīng)10mM Tris-Cl(pH7.6)的緩沖液重懸，冰浴中進行超聲波破碎菌體(破碎8～40次，每次30～60s，間隔30～60s)，細(xì)胞裂解液于4℃，12,000g離心15min，吸上清，與上樣緩沖液以1∶1混合，沉淀重懸于1×SDS上樣緩沖液中，100℃加熱3min，于8％濃縮膠，12％分離膠中進行SDS-PAGE電泳，經(jīng)染色脫色后分析該融合表達(dá)蛋白是以包涵體的形式存在的。
為了檢測融合重組蛋白是否具有FMDV抗A和抗O的抗原性，以小鼠FMDV標(biāo)準(zhǔn)抗A和抗O抗體作為第一抗體，以辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，對純化的重組蛋白和包涵體進行Dot-Elisa檢測，結(jié)果表明純化的重組蛋白和包涵體均能與抗A和抗O抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，表明包涵體和純化的蛋白均具有抗A和抗O雙重抗原性(參見圖3)，其中第一道為純化的重組蛋白，第二道為包涵體；1一抗為小鼠標(biāo)準(zhǔn)FMDV抗A型免疫血清；2一抗為小鼠標(biāo)準(zhǔn)FMDV抗O型免疫血清；3一抗為小鼠陰性血清。將純化后的融合重組蛋白、包涵體經(jīng)12％SDS-PAGE電泳分離后，電轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用封閉液封閉后，以FMDV標(biāo)準(zhǔn)抗A和抗O抗體作為第一抗體，以辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG為二抗，進行WesternBlotting分析，在包涵體和純化后的融合重組蛋白樣品中可以檢測到一個特異性條帶，分子量大小約33KD，與計算值相吻合，而pET-28a誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物樣品中無相應(yīng)條帶。這進一步說明了包涵體和純化的蛋白均具有抗A和抗O雙重抗原性。
將純化的重組蛋白50～100μg與完全佐劑等體積混合注射小鼠，半月后相同劑量加強免疫一次，一周后以相同劑量再免疫一次，一周后眼眶采血，制備血清供Elisa檢測用。ELISA板每孔包被5～10μg純化的重組蛋白質(zhì)，4℃過夜，洗滌液洗滌5～10min，用封閉液封閉1～2h，按系列梯度稀釋免疫后的待測血清，加陰性、陽性血清作為對照，37℃溫育1h，洗滌后加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗，加200μL/孔TMB顯色底物，室溫避光30min，加終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀波長450nm處測OD值，用空白孔調(diào)零點，如OD值大于陰性對照OD值的2.1倍，認(rèn)為是陽性。測純化蛋白免疫后血清的效價為1280。
實施例用化學(xué)方法合成編碼O和A型口蹄疫病毒VP1蛋白中抗原決定簇的DNA片段，將此三片段串聯(lián)后與一段中間包含O、A型口蹄疫病毒抗原簇的大片段連接，與pET-28a原核表達(dá)載體質(zhì)粒，分別懸浮于TE緩沖液中，經(jīng)BamHI和HindIII雙酶切后，跑1％的瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)EB染色后回收亮帶，用少量膠回收試劑盒回收DNA。兩者混合后，加入1單位的T4DNA連接酶，在16℃連接過夜，加入到40μL現(xiàn)制的大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，4℃保持30min，經(jīng)37℃熱激，冰浴2min后，加入360μL未加抗性的LB液體培養(yǎng)基，37℃搖菌45min，倒入帶有Kanr的LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)一夜后挑取單克隆提取質(zhì)粒后酶切鑒定，選出陽性克隆子。通過DNA測序，該克隆子與設(shè)計相符。
將陽性克隆子接種于少量Kanr培養(yǎng)基中，37℃過夜振蕩，次日取1000μL過夜培養(yǎng)液接種于含Kanr的100mL LB培養(yǎng)基中，37℃搖菌3h，使菌液OD600達(dá)到0.8左右，加IPTG使其終濃度為1mmol/L，37℃誘導(dǎo)表達(dá)4h，12,000g離心1min，收集菌體，用兩倍體積的10mmol/LTris-Cl(pH7.6)的緩沖液重懸，冰浴中用超聲波破碎菌體，破碎60次，每次40s，間隔1min，菌體于10,000g離心30min，即得到重組的融合蛋白，其融合蛋白含量約占40％。每克菌體加4～5mL buffer A(6M鹽酸胍，0.1M磷酸鈉，0.01M Tris/HCl，pH8.0)，室溫攪拌；10,000g離心10～20min收集上清將4～5mL用buffer A平衡的Ni+-NTA-Sepharose 6B加至上清中，室溫攪拌40～60min，將凝膠裝到直徑為1.6cm的層析柱上；用10個床體積的buffer A和5個床體積的buffer B(8M尿素，0.1M磷酸鈉，0.01M Tris/HCl，pH8.0)洗脫，如必要，洗至A280＜0.01；用buffer C(8M尿素，0.1M磷酸鈉，0.01M Tris/HCl，pH6.3)，洗至A280＜0.01用10個床體積buffer D(8M尿素，0.1M磷酸鈉，0.01M Tris/HCl，pH5.9)先洗，再用10個床體積buffer E(8M尿素，0.1M磷酸鈉，0.01M Tris/HCl，pH4.5)洗，每3mL收集一管，用SDS-PAGE分析。用20mL buffer F(6M鹽酸胍，0.2M乙酸)洗滌，每3mL收集一管，作SDS-PAGE分析。表達(dá)產(chǎn)物分別用以下四種溶液依次透析復(fù)性12～24h1)、8M尿素，5mM EDTA，1×PBS；2)、2M尿素，5mM EDTA，1×PBS；3)、0.2M尿素，5mM EDTA，1×PBS；4)、5mM EDTA，1×PBS。
權(quán)利要求
1.家畜口蹄疫病毒A、O型基因工程雙價多肽疫苗，其特征在于其核苷酸序列為1GGATCCATGGCTGTGCCAAACTTGCGTGGCGATTTGCAGGTGTTGGCTCAGAAAGTGGCT61 CGTACTTTGCCAGAGCTCCGATCGCGTCATAAACAGAAAATTGTGGCTCCAGTGAAACAG121 ACTTTGGAATTCGGCTCTGGCCGTCGTGGCGATATGGGCTCTTTGGCTGCTCGTGTGGTG181 AAACAGTTGCCAGGTACCGTCGACATGGACATTGACCCGTATAAAGAATTTGGAGCTTCT241 GTGGAGTTACTCTCTTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCTATTCGAGATCTCCTCGAC301 ACCGCCTCTGCTCTGTATCGGGAGGCCTTAGAGTCTCCGGAACATTGTTCACCTCACCAT361 ACAGCACTCAGGCAAGCTATTCTGTGTTGGGGTGAGTTGATGAATCTGGCCACCTGGGTG421 GGAAGTAATTTGGAAGACCCAGCAGTCGACGCAGTTCCAAACTTGCGTGGTGATTTGCAG482GTTTTGGCACAGAAAGTTGCTCGTACCTTGCCAGGCTCTGGCCGTCGTGGCGATATGGGC542TCTTTGGCTGCTCGTGTGGTGAAACAGTTGCCACTCGAGTCCAGGGAATTAGTAGTCAGC601 TATGTCAATGTTATGGGCCTAAAAATCAGACAACTACTGTGGTTTCACATTTCCTGTCTT661 ACTTTTGGAAGAGAAACTGTTCTTGAGTATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACT721 CCTCCTGCTTACAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTT781 GTTAGACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCT841 CAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTCAATGTTAGAAGCTT其中7～72，85～126，451～513為VP1蛋白的O型抗原決定簇；133～192，514～573為VP1蛋白的A型抗原決定簇；205～450，574～894為有利于FMDV多肽疫苗形成一定空間結(jié)構(gòu)的載體蛋白；其他序列為連接片段。
2.家畜口蹄疫病毒A、O型基因工程雙價多肽疫苗的制備方法，其特征在于其包涵體變性蛋白經(jīng)Ni+-NTA-Sepharose 6B親和層析柱在非變性的條件下直接分離純化，具體步驟如下1)在濕菌加buffer A，離心，收集上清，所說的buffer A為6M鹽酸胍，0.1M磷酸鈉，0.01MTris/HCl，pH8.0；2)將用buffer A平衡的Ni+-NTA-Sepharose 6B加至上清中，將凝膠裝到層析柱上；3)用buffer A和buffer B洗脫，所說的buffer B為8M尿素，0.1M磷酸鈉，0.01MTris/HCl，pH8.0；4)用buffer C洗脫，所說的buffer C為8M尿素，0.1M磷酸鈉，0.01M Tris/HCl，pH6.3；5)用buffer D洗脫，再用buffer E洗脫，收集，用SDS-PAGE分析，所說的buffer D為8M尿素，0.1M磷酸鈉，0.01M Tris/HCl，pH5.9，所說的buffer E為8M尿素，0.1M磷酸鈉，0.01MTris/HCl，pH4.5；6)用buffer F洗滌，收集，作SDS-PAGE分析，所說的buffer F為6M鹽酸胍，0.2M乙酸；表達(dá)產(chǎn)物分別用以下四種溶液依次透析復(fù)性12～24h1)8M尿素，5mM EDTA，1×PBS；2)2M尿素，5mM EDTA，1×PBS；3)0.2M尿素，5mM EDTA，1×PBS；4)5mM EDTA，1×PBS。
全文摘要
涉及一種家畜口蹄疫病毒和雙價多肽疫苗以及遺傳工程領(lǐng)域，尤其是一種A、O型基因工程雙價多肽疫苗及其制備方法?？寺×薃、O型口蹄疫病毒VP1的抗原決定簇，將其串聯(lián)與能顯著提高其免疫原性的大片段相連后，插入原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白經(jīng)純化后制成具有口蹄疫A、O型免疫原性的雙價多肽疫苗。其制備方法為在濕菌加緩沖液，離心，收集上清；將平衡的Ni
文檔編號C12N15/33GK1602958SQ0313503
公開日2005年4月6日 申請日期2003年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月29日
發(fā)明者陳亮, 邵寒娟, 沈明山, 蘇勇波, 林濤, 郭小玲 申請人:廈門廈大建南應(yīng)用技術(shù)有限公司