專利名稱：Adamts1基因第一號外顯子多態(tài)性的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及ADAMTS1基因第一號外顯子的單核苷酸多態(tài)性。本發(fā)明還涉及分析ADAMTS1基因第一號外顯子的等位基因突變的方法。
背景技術：
ADAMTS1是一種分泌蛋白，N端有信號肽，鋅結合位點，以及富含半胱氨酸的區(qū)域。ADAMTS蛋白家族都在蛋白質水解過程中起作用。更有研究者發(fā)現(xiàn)，不論體內、體外試驗的結果都表明，ADAMTS1極為有效地破壞了血管形成過程，效果比Thrombospondin-1、endostatin和ADAMTS8都要突出。(J.Biol.Chem.27423349-23357，1999.)。
在本申請之前，還沒有ADAMTS1基因第一號外顯子多態(tài)性的相關報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的就是提供ADAMTS1基因第一號外顯子的多態(tài)性及其檢測方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種檢測人ADAMTS1基因第一號外顯子的單核苷酸多態(tài)性的方法，它包括步驟(a)確定在人ADAMTS1基因第一號外顯子的SEQ ID NO1所示序列的第255位的核苷酸；(b)檢測在所述位置是否存在單核苷酸多態(tài)性。
在一優(yōu)選例中，所述的單核苷酸多態(tài)性是在第255位存在T。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離核酸，它具有SEQ ID NO1所示的序列，且第255位為T。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種等位基因特異性的核酸引物，其長度為15-50bp，且特異性地雜交并擴增出含人ADAMTS1基因第一號外顯子的SEQ IDNO1所示序列中第255位單核苷酸多態(tài)性的擴增產物。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種等位基因特異性的寡核苷酸探針，其長度為15-50bp，且特異性地雜交并檢測含人ADAMTS1基因第一號外顯子的SEQ IDNO1所示序列中第255位單核苷酸多態(tài)性。
一種試劑盒包括(1)特異性擴增人ADAMTS1基因第一號外顯子的引物對，(2)檢測擴增產物與正常的ADAMTS1基因第一號外顯子相比是否存在變化所需的試劑，所述的SEQ ID NO1所示序列中第255位單核苷酸多態(tài)性。
另一種診斷試劑盒包括本發(fā)明上述的引物和/或本發(fā)明上述的寡核苷酸探針。
具體實施例方式
本發(fā)明人通過廣泛而深入的研究，已經發(fā)現(xiàn)了ADAMTS1基因第一號外顯子所編碼的蛋白序列中第85位Ala(A)->Val(V)多態(tài)(即mRNA上255位C->T多態(tài)性)，在此基礎上完成了本發(fā)明。
根據(jù)對正常人ADAMTS1基因測序結果，發(fā)現(xiàn)了該SNP。經分析發(fā)現(xiàn)，該SNP導致第85位氨基酸由Ala(A)->Val(V)。由于這是不同性質氨基酸的置換，因此，會導致ADAMTS1基因第一號外顯子所編碼的蛋白活性發(fā)生改變。
ADAMTS1基因第一號外顯子的cDNA序列列于SEQ ID NO1，其中開放閱讀框為第2-496位，其所編碼的氨基酸序列列于SEQ ID NO2。ADAMTS1基因第一號外顯子的基因組序列可以從GenBank中獲得。
本領域的技術人員知道，有大量的分析技術可用于檢測ADAMTS1基因第一號外顯子中所述位點是否存在單核苷酸多態(tài)性。這些技術包括(但并不限于)DNA測序、雜交測序；酶促錯配切割、異源雙鏈分析、點雜交、寡核苷酸陣列(DNA芯片)、Mini-sequencing、Taqman技術、分子信標等，變性高效液相色譜法(DHPLC)。
另一方面，本發(fā)明的檢測方法被用于評估個體患ADAMTS1基因第一號外顯子相關疾病的易感性。
用于本發(fā)明的測試樣品沒有特別限制，對于檢測SNP而言，可以是從血液、組織等樣品中抽提出的DNA或mRNA。對于檢測ADAMTS1基因第一號外顯子活性而言，可以任何含有ADAMTS1基因第一號外顯子的樣品，如血液等。
用于本發(fā)明方法或檢測試劑盒的引物和探針，根據(jù)ADAMTS1基因第一號外顯子的cDNA序列(SEQ ID NO1的序列)或基因組序列進行設計，并可用常規(guī)的合成技術進行合成即可。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1基因的抽提和測序用常規(guī)酚氯仿法從人的血液中提取DNA，濃度校正至20ng/ul后，用于常規(guī)PCR擴增。引物是有義引物5’-gtctcctggg gctccaat-3’(SEQ ID NO3)反義引物5’-agcggctgga tgaaatacg-3’(SEQ ID NO4)擴增出的498bp的產物，純化后進行DNA測序。
實施例2SNP的獲得對ADAMTS1基因進行直接測序。將測定的各樣本序列進行比較，從而得出序列的差異，獲得SNP。
實施例3檢測試劑盒制備一檢測ADAMTS1基因相關疾病易感性的檢測試劑盒，其中，含有下列可擴增出255位SNP的引物對
有義引物5’-gtctcctggg gctccaat-3’(SEQ ID NO3)反義引物5’-agcggctgga tgaaatacg-3’(SEQ ID NO4)對擴增產物與正常對照用變性高效液相色譜儀(DHPLC)進行色譜分析，可輕易地檢測出255位的C->T型SNP。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
SEQUENCE LISTING<110>上海人類基因組研究中心<120>ADAMTS1基因第一號外顯子多態(tài)性<130>030115<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>498<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(2)..(496)<223>
<400>1g tct cct ggg gct cca atg cag cga gct gtg ccc gag ggg ttc gga agg 49Ser Pro Gly Ala Pro Met Gln Arg Ala Val Pro Glu Gly Phe Gly Arg1 5 10 15cgc aag ctg ggc agc gac atg ggg aac gcg gag cgg gct ccg ggg tct 97Arg Lys Leu Gly Ser Asp Met Gly Asn Ala Glu Arg Ala Pro Gly Ser20 25 30cgg agc ttt ggg ccc gta ccc acg ctg ctg ctg ctc gcc gcg gcg cta 145Arg Ser Phe Gly Pro Val Pro Thr Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Leu35 40 45ctg gcc gtg tcg gac gca ctc ggg cgc ccc tcc gag gag gac gag gag 193Leu Ala Val Ser Asp Ala Leu Gly Arg Pro Ser Glu Glu Asp Glu Glu50 55 60cta gtg gtg ccg gag ctg gag cgc gcc ccg gga cac ggg acc acg cgc 241Leu Val Val Pro Glu Leu Glu Arg Ala Pro Gly His Gly Thr Thr Arg65 70 75 80ctc cgc ctg cac gcc ttt gac cag cag ctg gat ctg gag ctg cgg ccc 289Leu Arg Leu His Ala Phe Asp Gln Gln Leu Asp Leu Glu Leu Arg Pro85 90 95gac agc agc ttt ttg gcg ccc ggc ttc acg ctc cag aac gtg ggg cgc 337Asp Ser Ser Phe Leu Ala Pro Gly Phe Thr Leu Gln Asn Val Gly Arg100 105 110
aaa tcc ggg tcc gag acg ccg ctt ccg gaa acc gac ctg gcg cac tgc 385Lys Ser Gly Ser Glu Thr Pro Leu Pro Glu Thr Asp Leu Ala His Cys115 120 125ttc tac tcc ggc acc gtg aat ggc gat ccc agc tcg gct gcc gcc ctc 433Phe Tyr Ser Gly Thr Val Asn Gly Asp Pro Ser Ser Ala Ala Ala Leu130 135 140agc ctc tgc gag ggc gtg cgc ggc gcc ttc tac ctg ctg ggg gag gcg 481Ser Leu Cys Glu Gly Val Arg Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Gly Glu Ala145 150 155 160tat ttc atc cag ccg ct 498Tyr Phe Ile Gln Pro165<210>2<211>165<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Ser Pro Gly Ala Pro Met Gln Arg Ala Val Pro Glu Gly Phe Gly Arg1 5 10 15Arg Lys Leu Gly Ser Asp Met Gly Asn Ala Glu Arg Ala Pro Gly Ser20 25 30Arg Ser Phe Gly Pro Val Pro Thr Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Leu35 40 45Leu Ala Val Ser Asp Ala Leu Gly Arg Pro Ser Glu Glu Asp Glu Glu50 55 60Leu Val Val Pro Glu Leu Glu Arg Ala Pro Gly His Gly Thr Thr Arg65 70 75 80Leu Arg Leu His Ala Phe Asp Gln Gln Leu Asp Leu Glu Leu Arg Pro85 90 95Asp Ser Ser Phe Leu Ala Pro Gly Phe Thr Leu Gln Ash Val Gly Arg
100 105 110Lys Ser Gly Ser Glu Thr Pro Leu Pro Glu Thr Asp Leu Ala His Cys115 120 125Phe Tyr Ser Gly Thr Val Asn Gly Asp Pro Ser Ser Ala Ala Ala Leu130 135 140Ser Leu Cys Glu Gly Val Arg Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Gly Glu Ala145 150 155 160Tyr Phe Ile Gln Pro165<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3gtctcctggg gctccaat 18<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4agcggctgga tgaaatacg 19
權利要求
1.一種檢測人ADAMTS1基因第一號外顯子的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，它包括步驟(a)確定在人ADAMTS1基因第一號外顯子的SEQ ID NO1所示序列的第255位的核苷酸；(b)檢測在所述位置是否存在單核苷酸多態(tài)性。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的單核苷酸多態(tài)性是在第255位存在T。
3.一種分離核酸，其特征在于，它具有SEQ ID NO1所示的序列，且第255位為T。
4.一種等位基因特異性的核酸引物，其特征在于，其長度為15-50bp，且特異性地雜交并擴增出含人ADAMTS1基因第一號外顯子的SEQ ID NO1所示序列中第255位單核苷酸多態(tài)性的擴增產物。
5.一種等位基因特異性的寡核苷酸探針，其特征在于，其長度為15-50bp，且特異性地雜交并檢測含人ADAMTS1基因第一號外顯子的SEQ ID NO1所示序列中第255位單核苷酸多態(tài)性。
6.一種診斷試劑盒，其特征在于，它包括(1)特異性擴增人ADAMTS1基因第一號外顯子的引物對，(2)檢測擴增產物與正常的ADAMTS1基因第一號外顯子相比是否存在變化所需的試劑，所述的SEQ ID NO1所示序列中第255位單核苷酸多態(tài)性。
7.一種診斷試劑盒，其特征在于，它包括權利要求4所述的引物和/或權利要求5所述的寡核苷酸探針。
全文摘要
本發(fā)明涉及ADAMTS1基因第一號外顯子的單核苷酸多態(tài)性(SNP)。本發(fā)明提供了分析ADAMTS1基因第一號外顯子的SNP或其活性的方法。本發(fā)明的SNP是SEQ ID NO1所示序列的人ADAMTS1基因第一號外顯子的第255位的C－＞T多態(tài)性。該SNP導致編碼蛋白第85位發(fā)生Ala(A)－＞Val(V)改變，從而改變了蛋白活性。
文檔編號C12N15/11GK1519350SQ0311504
公開日2004年8月11日 申請日期2003年1月22日 優(yōu)先權日2003年1月22日
發(fā)明者黃薇, 施錦繡, 奚慧峰, 金力, 薇 黃 申請人:上海人類基因組研究中心