專利名稱：Prkcbp2基因第一號外顯子多態(tài)性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及PRKCBP2基因第一號外顯子的單核苷酸多態(tài)性。本發(fā)明還涉及分析PRKCBP2基因第一號外顯子的等位基因突變的方法。
背景技術(shù)：
PRKCBP2，即蛋白激酶C結(jié)合蛋白2(Protein Kinase C Binding Protein 2)，又名少突細(xì)胞系轉(zhuǎn)錄因子2(Oligodendrocyte lineage transcription factor 2，Olig2 or Oligo2)，是一種基本的“螺旋-環(huán)形-螺旋”(Helix-Loop-Helix，HLH)轉(zhuǎn)錄因子。已經(jīng)有研究者指出，該轉(zhuǎn)錄因子在神經(jīng)上皮中少突細(xì)胞前體形成的區(qū)域特異性表達(dá)，以及在少突細(xì)胞前體內(nèi)也有特異性表達(dá)。從而，解決了先前神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤無法用細(xì)胞形態(tài)學(xué)或者其它傳統(tǒng)標(biāo)記方法標(biāo)記的問題，這種轉(zhuǎn)錄因子可能被用作少突細(xì)胞腫瘤的理想標(biāo)記，用于檢測或者診斷腦部腫瘤。(Proc.Nat.Acad.Sci.9810851-10856，2001)。
在本申請之前，還沒有PRKCBP2基因第一號外顯子多態(tài)性的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供PRKCBP2基因第一號外顯子的多態(tài)性及其檢測方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種檢測人PRKCBP2基因第一號外顯子的單核苷酸多態(tài)性的方法，它包括步驟(a)確定在人PRKCBP2基因第一號外顯子的SEQ ID NO1所示序列的第109位的核苷酸；(b)檢測在所述位置是否存在單核苷酸多態(tài)性。
在一優(yōu)選例中，所述的單核苷酸多態(tài)性是在第109位存在G。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離核酸，它具有SEQ ID NO1所示的序列，且第109位為G。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種等位基因特異性的核酸引物，其長度為15-50bp，且特異性地雜交并擴(kuò)增出含人PRKCBP2基因第一號外顯子的SEQ ID NO1所示序列中第109位單核苷酸多態(tài)性的擴(kuò)增產(chǎn)物。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種等位基因特異性的寡核苷酸探針，其長度為15-50bp，且特異性地雜交并檢測含人PRKCBP2基因第一號外顯子的SEQ IDNO1所示序列中第109位單核苷酸多態(tài)性。
一種試劑盒包括(1)特異性擴(kuò)增人PRKCBP2基因第一號外顯子的引物對，(2)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物與正常的PRKCBP2基因第一號外顯子相比是否存在變化所需的試劑，所述的SEQ ID NO1所示序列中第109位單核苷酸多態(tài)性。
另一種診斷試劑盒包括本發(fā)明上述的引物和/或本發(fā)明上述的寡核苷酸探針。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人通過廣泛而深入的研究，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了PRKCBP2基因第一號外顯子所編碼的蛋白序列中第11位His(H)->Arg(R)多態(tài)(即mRNA上109位A->G多態(tài)性)，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
根據(jù)對正常人PRKCBP2基因測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了該SNP。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，該SNP導(dǎo)致第11位氨基酸由His(H)->Arg(R)。由于這是不同性質(zhì)氨基酸的置換，因此，會(huì)導(dǎo)致PRKCBP2基因第一號外顯子所編碼的蛋白活性發(fā)生改變。
PRKCBP2基因第一號外顯子的cDNA序列列于SEQ ID NO1，其中開放閱讀框?yàn)榈?8-464位，其所編碼的氨基酸序列列于SEQ ID NO2。PRKCBP2基因第一號外顯子的基因組序列可以從GenBank中獲得。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道，有大量的分析技術(shù)可用于檢測PRKCBP2基因第一號外顯子中所述位點(diǎn)是否存在單核苷酸多態(tài)性。這些技術(shù)包括(但并不限于)DNA測序、雜交測序；酶促錯(cuò)配切割、異源雙鏈分析、點(diǎn)雜交、寡核苷酸陣列(DNA芯片)、Mini-sequencing、Taqman技術(shù)、分子信標(biāo)等，變性高效液相色譜法(DHPLC)。
另一方面，本發(fā)明的檢測方法被用于評估個(gè)體患PRKCBP2基因第一號外顯子相關(guān)疾病的易感性。
用于本發(fā)明的測試樣品沒有特別限制，對于檢測SNP而言，可以是從血液、組織等樣品中抽提出的DNA或mRNA。對于檢測PRKCBP2基因第一號外顯子活性而言，可以任何含有PRKCBP2基因第一號外顯子的樣品，如血液等。
用于本發(fā)明方法或檢測試劑盒的引物和探針，根據(jù)PRKCBP2基因第一號外顯子的cDNA序列(SEQ ID NO1的序列)或基因組序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，并可用常規(guī)的合成技術(shù)進(jìn)行合成即可。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1基因的抽提和測序用常規(guī)酚氯仿法從人的血液中提取DNA，濃度校正至20ng/ul后，用于常規(guī)PCR擴(kuò)增。引物是有義引物5’-ctcctctcct ggaagttttc g-3’(SEQ ID NO3)反義引物5’-catccatggc gatgttga-3’(SEQ ID NO4)擴(kuò)增出的465bp的產(chǎn)物，純化后進(jìn)行DNA測序。
實(shí)施例2SNP的獲得對PRKCBP2基因進(jìn)行直接測序。將測定的各樣本序列進(jìn)行比較，從而得出序列的差異，獲得SNP。
實(shí)施例3檢測試劑盒制備一檢測PRKCBP2基因相關(guān)疾病易感性的檢測試劑盒，其中，含有下列可擴(kuò)增出109位SNP的引物對有義引物5’-ctcctctcct ggaagttttc g-3’(SEQ ID NO3)反義引物5’-catccatggc gatgttga-3’(SEQ ID NO4)對擴(kuò)增產(chǎn)物與正常對照用變性高效液相色譜儀(DHPLC)進(jìn)行色譜分析，可輕易地檢測出109位的A->G型SNP。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
SEQUENCE LISTING<110>上海人類基因組研究中心<120>PRKCBP2基因第一號外顯子多態(tài)性<130>030115<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>465<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(78)..(464)<223>
<400>1ctcctctcct ggaagttttc gggtccgagg gaaggaggac cctgcgaaag ctgcgacgac60tatcttcccc tggggcc atg gac tcg gac gcc agc ctg gtg tcc agc cac 110Met Asp Ser Asp Ala Ser Leu Val Ser Ser His1 5 10ccg tcg tcg cca gag ccc gat gac ctt ttt ctg acg gcc cgg agt aag 158Pro Ser Ser Pro Glu Pro Asp Asp Leu Phe Leu Thr Ala Arg Ser Lys15 20 25ggc agc agc ggc agc gcc ttc act ggg ggc acc gtg tcc tcg tcc acc 206Gly Ser Ser Gly Ser Ala Phe Thr Gly Gly Thr Val Ser Ser Ser Thr30 35 40tcg agt gac tgc ccg ccg gag ctg agc gcc gag ctg tac ggc gct atg 254Ser Ser Asp Cys Pro Pro Glu Leu Ser Ala Glu Leu Tyr Gly Ala Met45 50 55ggc tct gcg ggc gcg tat cct ggg gac aag cta gga ggc agt ggc ttc 302Gly Ser Ala Gly Ala Tyr Pro Gly Asp Lys Leu Gly Gly Ser Gly Phe60 65 70 75aag tca tcc tcg tcc agc acc tcg tcg tct acg tcg tcg gcg gct gcg 350Lys Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ser Ser Ser Thr Ser Ser Ala Ala Ala80 85 90tcg tcc acc aag aag gac aag aag caa atg aca gag ccg gag ctg cag 398
Ser Ser Thr Lys Lys Asp Lys Lys Gln Met Thr Glu Pro Glu Leu Gln95 100 105cag ctg cgt ctc aag atc aac agc cgc gag cgc aag cgc atg cac gac446Gln Leu Arg Leu Lys Ile Asn Ser Arg Glu Arg Lys Arg Met His Asp110 115 120ctc aac atc gcc atg gat g 465Leu Asn Ile Ala Met Asp125<210>2<211>129<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met Asp Ser Asp Ala Ser Leu Val Ser Ser His Pro Ser Ser Pro Glu1 5 10 15Pro Asp Asp Leu Phe Leu Thr Ala Arg Ser Lys Gly Ser Ser Gly Ser20 25 30Ala Phe Thr Gly Gly Thr Val Ser Ser Ser Thr Ser Ser Asp Cys Pro35 40 45Pro Glu Leu Ser Ala Glu Leu Tyr Gly Ala Met Gly Ser Ala Gly Ala50 55 60Tyr Pro Gly Asp Lys Leu Gly Gly Ser Gly Phe Lys Ser Ser Ser Ser65 70 75 80Ser Thr Ser Ser Ser Thr Ser Ser Ala Ala Ala Ser Ser Thr Lys Lys85 90 95Asp Lys Lys Gln Met Thr Glu Pro Glu Leu Gln Gln Leu Arg Leu Lys100 105 110Ile Asn Ser Arg Glu Arg Lys Arg Met His Asp Leu Asn Ile Ala Met115 120 125
Asp<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3ctcctctcct ggaagttttc g 21<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4catccatggc gatgttga 18
權(quán)利要求
1.一種檢測人PRKCBP2基因第一號外顯子的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，它包括步驟(a)確定在人PRKCBP2基因第一號外顯子的SEQ ID NO1所示序列的第109位的核苷酸；(b)檢測在所述位置是否存在單核苷酸多態(tài)性。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的單核苷酸多態(tài)性是在第109位存在G。
3.一種分離核酸，其特征在于，它具有SEQ ID NO1所示的序列，且第109位為G。
4.一種等位基因特異性的核酸引物，其特征在于，其長度為15-50bp，且特異性地雜交并擴(kuò)增出含人PRKCBP2基因第一號外顯子的SEQ ID NO1所示序列中第109位單核苷酸多態(tài)性的擴(kuò)增產(chǎn)物。
5.一種等位基因特異性的寡核苷酸探針，其特征在于，其長度為15-50bp，且特異性地雜交并檢測含人PRKCBP2基因第一號外顯子的SEQ ID NO1所示序列中第109位單核苷酸多態(tài)性。
6.一種診斷試劑盒，其特征在于，它包括(1)特異性擴(kuò)增人PRKCBP2基因第一號外顯子的引物對，(2)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物與正常的PRKCBP2基因第一號外顯子相比是否存在變化所需的試劑，所述的SEQ ID NO1所示序列中第109位單核苷酸多態(tài)性。
7.一種診斷試劑盒，其特征在于，它包括權(quán)利要求4所述的引物和/或權(quán)利要求5所述的寡核苷酸探針。
全文摘要
本發(fā)明涉及PRKCBP2基因第一號外顯子的單核苷酸多態(tài)性(SNP)。本發(fā)明提供了分析PRKCBP2基因第一號外顯子的SNP或其活性的方法。本發(fā)明的SNP是SEQ ID NO1所示序列的人PRKCBP2基因第一號外顯子的第109位的A－＞G多態(tài)性。該SNP導(dǎo)致編碼蛋白第11位發(fā)生His(H)－＞Arg(R)改變，從而改變了蛋白活性。
文檔編號C12N15/11GK1519335SQ03115029
公開日2004年8月11日 申請日期2003年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月22日
發(fā)明者黃薇, 施錦繡, 奚慧峰, 金力, 黃 薇 申請人:上海人類基因組研究中心