專利名稱：Pcnt基因第三十九號(hào)外顯子多態(tài)性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及PCNT基因第三十九號(hào)外顯子的單核苷酸多態(tài)性。本發(fā)明還涉及分析PCNT基因第三十九號(hào)外顯子的等位基因突變的方法。
背景技術(shù)：
中周蛋白(pericentrin，PCNT)是一種高度保守的生物細(xì)胞中心體相關(guān)蛋白。研究者認(rèn)為，它和真核細(xì)胞內(nèi)的中心體微管組織的形成過(guò)程密切相關(guān)。(Cell 1994Feb 25；76(4)639-50)。
在本申請(qǐng)之前，還沒(méi)有PCNT基因第三十九號(hào)外顯子多態(tài)性的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供PCNT基因第三十九號(hào)外顯子的多態(tài)性及其檢測(cè)方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種檢測(cè)人PCNT基因第三十九號(hào)外顯子的單核苷酸多態(tài)性的方法，它包括步驟(a)確定在人PCNT基因第三十九號(hào)外顯子的SEQ ID NO1所示序列的第346位的核苷酸；(b)檢測(cè)在所述位置是否存在單核苷酸多態(tài)性。
在一優(yōu)選例中，所述的單核苷酸多態(tài)性是在第346位存在C。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離核酸，它具有SEQ ID NO1所示的序列，且第346位為C。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種等位基因特異性的核酸引物，其長(zhǎng)度為15-50bp，且特異性地雜交并擴(kuò)增出含人PCNT基因第三十九號(hào)外顯子的SEQ IDNO1所示序列中第346位單核苷酸多態(tài)性的擴(kuò)增產(chǎn)物。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種等位基因特異性的寡核苷酸探針，其長(zhǎng)度為15-50bp，且特異性地雜交并檢測(cè)含人PCNT基因第三十九號(hào)外顯子的SEQ IDNO1所示序列中第346位單核苷酸多態(tài)性。
一種試劑盒包括(1)特異性擴(kuò)增人PCNT基因第三十九號(hào)外顯子的引物對(duì)，(2)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物與正常的PCNT基因第三十九號(hào)外顯子相比是否存在變化所需的試劑，所述的SEQ ID NO1所示序列中第346位單核苷酸多態(tài)性。
另一種診斷試劑盒包括本發(fā)明上述的引物和/或本發(fā)明上述的寡核苷酸探針。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人通過(guò)廣泛而深入的研究，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了PCNT基因第三十九號(hào)外顯子所編碼的蛋白序列中第116位Cys(C)->Arg(R)多態(tài)(即mRNA上346位T->C多態(tài)性)，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
根據(jù)對(duì)正常人PCNT基因測(cè)序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了該SNP。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，該SNP導(dǎo)致第116位氨基酸由Cys(C)->Arg(R)。由于這是不同性質(zhì)氨基酸的置換，因此，會(huì)導(dǎo)致PCNT基因第三十九號(hào)外顯子所編碼的蛋白活性發(fā)生改變。
PCNT基因第三十九號(hào)外顯子的cDNA序列列于SEQ ID NO1，其中開(kāi)放閱讀框?yàn)榈?-435位，其所編碼的氨基酸序列列于SEQ ID NO2。PCNT基因第三十九號(hào)外顯子的基因組序列可以從GenBank中獲得。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道，有大量的分析技術(shù)可用于檢測(cè)PCNT基因第三十九號(hào)外顯子中所述位點(diǎn)是否存在單核苷酸多態(tài)性。這些技術(shù)包括(但并不限于)DNA測(cè)序、雜交測(cè)序；酶促錯(cuò)配切割、異源雙鏈分析、點(diǎn)雜交、寡核苷酸陣列(DNA芯片)、Mini-sequencing、Taqman技術(shù)、分子信標(biāo)等，變性高效液相色譜法(DHPLC)。
另一方面，本發(fā)明的檢測(cè)方法被用于評(píng)估個(gè)體患PCNT基因第三十九號(hào)外顯子相關(guān)疾病的易感性。
用于本發(fā)明的測(cè)試樣品沒(méi)有特別限制，對(duì)于檢測(cè)SNP而言，可以是從血液、組織等樣品中抽提出的DNA或mRNA。對(duì)于檢測(cè)PCNT基因第三十九號(hào)外顯子活性而言，可以任何含有PCNT基因第三十九號(hào)外顯子的樣品，如血液等。
用于本發(fā)明方法或檢測(cè)試劑盒的引物和探針，根據(jù)PCNT基因第三十九號(hào)外顯子的cDNA序列(SEQ ID NO1的序列)或基因組序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，并可用常規(guī)的合成技術(shù)進(jìn)行合成即可。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1基因的抽提和測(cè)序用常規(guī)酚氯仿法從人的血液中提取DNA，濃度校正至20ng/ul后，用于常規(guī)PCR擴(kuò)增。引物是有義引物5’-cagaggacac aggaggcttg-3’(SEQ ID NO3)反義引物5’-ccacgtgaac catcctaact c-3’(SEQ ID NO4)擴(kuò)增出的507bp的產(chǎn)物，純化后進(jìn)行DNA測(cè)序。
實(shí)施例2SNP的獲得對(duì)PCNT基因進(jìn)行直接測(cè)序。將測(cè)定的各樣本序列進(jìn)行比較，從而得出序列的差異，獲得SNP。
實(shí)施例3檢測(cè)試劑盒制備一檢測(cè)PCNT基因相關(guān)疾病易感性的檢測(cè)試劑盒，其中，含有下列可擴(kuò)增出346位SNP的引物對(duì)有義引物5’-cagaggacac aggaggcttg-3’(SEQ ID NO3)反義引物5’-ccacgtgaac catcctaact c-3’(SEQ ID NO4)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物與正常對(duì)照用變性高效液相色譜儀(DHPLC)進(jìn)行色譜分析，可輕易地檢測(cè)出346位的T->C型SNP。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
SEQUENCE LISTING<110>上海人類基因組研究中心<120>PCNT第三十九號(hào)外顯子多態(tài)性<130>030115<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>507<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(1)..(435)<223>
<400>1cag agg aca cag gag gct tgc gtg cac cag gac aca cag gcc cat cac 48Gln Arg Thr Gln Glu Ala Cys Val His Gln Asp Thr Gln Ala His His1 5 10 15gct ctg ctg cag aag ctg aag gag gag aag tcc cgg gtg gtg gac ttg 96Ala Leu Leu Gln Lys Leu Lys Glu Glu Lys Ser Arg Val Val Asp Leu20 25 30caa gca atg ctt gaa aag gtg cag cag caa gcc ctg cat tct cag cag144Gln Ala Met Leu Glu Lys Val Gln Gln Gln Ala Leu His Ser Gln Gln35 40 45cag ctt gag gct gag gct cag aag cac tgt gag gcg ctc agg aga gag192Gln Leu Glu Ala Glu Ala Gln Lys His Cys Glu Ala Leu Arg Arg Glu50 55 60aag gag gta agt gcc aca ctg aag tcg acg gtg gaa gcc ctg cac acc240Lys Glu Val Ser Ala Thr Leu Lys Ser Thr Val Glu Ala Leu His Thr65 70 75 80caa aaa cga gag ctg aga tgc tct ctg gag aga gag agg gag aaa cca288Gln Lys Arg Glu Leu Arg Cys Ser Leu Glu Arg Glu Arg Glu Lys Pro85 90 95gcg tgg ttg cag gca gaa tta gag cag tea cac cca cgg ttg aaa gag336Ala Trp Leu Gln Ala Glu Leu Glu Gln Ser His Pro Arg Leu Lys Glu100 105 110
caa gaa gga tgc aag gct gcg agg agg agc gcg gag gcc agg cag agc384Gln Glu Gly Cys Lys Ala Ala Arg Arg Ser Ala Glu Ala Arg Gln Ser115 120 125cca gcg gct gcg gag cag tgg agg aag tgg cag aga gac aag gag aag432Pro Ala Ala Ala Glu Gln Trp Arg Lys Trp Gln Arg Asp Lys Glu Lys130 135 140ctg gtgagagccg cctgccggcg gacgtccaca cctaaaaacg ataagcaatt 485Leu145ggagttagga tggttcacgt gg 507<210>2<211>145<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Gln Arg Thr Gln Glu Ala Cys Val His Gln Asp Thr Gln Ala His His1 5 10 15Ala Leu Leu Gln Lys Leu Lys Glu Glu Lys Ser Arg Val Val Asp Leu20 25 30Gln Ala Met Leu Glu Lys Val Gln Gln Gln Ala Leu His Ser Gln Gln35 40 45Gln Leu Glu Ala Glu Ala Gln Lys His Cys Glu Ala Leu Arg Arg Glu50 55 60Lys Glu Val Ser Ala Thr Leu Lys Ser Thr Val Glu Ala Leu His Thr65 70 75 80Gln Lys Arg Glu Leu Arg Cys Ser Leu Glu Arg Glu Arg Glu Lys Pro85 90 95Ala Trp Leu Gln Ala Glu Leu Glu Gln Ser His Pro Arg Leu Lys Glu100 105 110
Gln Glu Gly Cys Lys Ala Ala Arg Arg Ser Ala Glu Ala Arg Gln Ser115 120 125Pro Ala Ala Ala Glu Gln Trp Arg Lys Trp Gln Arg Asp Lys Glu Lys130 135 140Leu145<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3cagaggacac aggaggcttg20<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4ccacgtgaac catcctaact c 2權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)人PCNT基因第三十九號(hào)外顯子的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，它包括步驟(a)確定在人PCNT基因第三十九號(hào)外顯子的SEQ ID NO1所示序列的第346位的核苷酸；(b)檢測(cè)在所述位置是否存在單核苷酸多態(tài)性。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的單核苷酸多態(tài)性是在第346位存在C。
3.一種分離核酸，其特征在于，它具有SEQ ID NO1所示的序列，且第346位為C。
4.一種等位基因特異性的核酸引物，其特征在于，其長(zhǎng)度為15-50bp，且特異性地雜交并擴(kuò)增出含人PCNT基因第三十九號(hào)外顯子的SEQ ID NO1所示序列中第346位單核苷酸多態(tài)性的擴(kuò)增產(chǎn)物。
5.一種等位基因特異性的寡核苷酸探針，其特征在于，其長(zhǎng)度為15-50bp，且特異性地雜交并檢測(cè)含人PCNT基因第三十九號(hào)外顯子的SEQ ID NO1所示序列中第346位單核苷酸多態(tài)性。
6.一種診斷試劑盒，其特征在于，它包括(1)特異性擴(kuò)增人PCNT基因第三十九號(hào)外顯子的引物對(duì)，(2)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物與正常的PCNT基因第三十九號(hào)外顯子相比是否存在變化所需的試劑，所述的SEQ ID NO1所示序列中第346位單核苷酸多態(tài)性。
7.一種診斷試劑盒，其特征在于，它包括權(quán)利要求4所述的引物和/或權(quán)利要求5所述的寡核苷酸探針。
全文摘要
本發(fā)明涉及PCNT基因第三十九號(hào)外顯子的單核苷酸多態(tài)性(SNP)。本發(fā)明提供了分析PCNT基因第三十九號(hào)外顯子的SNP或其活性的方法。本發(fā)明的SNP是SEQ ID NO1所示序列的人PCNT基因第三十九號(hào)外顯子的第346位的T－＞C多態(tài)性。該SNP導(dǎo)致編碼蛋白第116位發(fā)生Cys(C)－＞Arg(R)改變，從而改變了蛋白活性。
文檔編號(hào)C12P19/34GK1519339SQ0311503
公開(kāi)日2004年8月11日 申請(qǐng)日期2003年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月22日
發(fā)明者黃薇, 施錦繡, 奚慧峰, 金力, 黃 薇 申請(qǐng)人:上海人類基因組研究中心