專利名稱：受調(diào)控的核酸表達(dá)系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種調(diào)節(jié)基因表達(dá)的系統(tǒng)。本發(fā)明提供改進的能緊密調(diào)節(jié)感興趣的編碼序列表達(dá)的核酸構(gòu)建物。當(dāng)要被表達(dá)的核酸或表達(dá)水平對發(fā)生表達(dá)的細(xì)胞或宿主環(huán)境有毒時就需要這種緊密調(diào)控。本發(fā)明還涉及這種表達(dá)系統(tǒng)在用于包裝病毒載體的細(xì)胞中的應(yīng)用，并提供了制備該必須的核酸構(gòu)建物的方法及它們在調(diào)控重組病毒表達(dá)中的應(yīng)用。一方面，本發(fā)明涉及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中基因表達(dá)的調(diào)控。
背景技術(shù)：
已證明重組核酸技術(shù)是表達(dá)感興趣的核酸所編碼產(chǎn)物的一種強有力的工具。這導(dǎo)致能夠生產(chǎn)用于研究和商品化應(yīng)用的多肽和核酸。
然而某些編碼產(chǎn)物對表達(dá)它們的細(xì)胞或宿主環(huán)境有毒，系由于此產(chǎn)物先天有毒性或由于其表達(dá)水平高而導(dǎo)致毒性。處置此難題的一種方法是采用短時表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)可表達(dá)此編碼產(chǎn)物并在其毒性導(dǎo)致產(chǎn)物水平降低前復(fù)原?；蛘呖蓪⒋司幋a產(chǎn)物置于一緊密調(diào)控系統(tǒng)之下，可使該產(chǎn)物表達(dá)并在毒性升高到致死水平之前仃止其表達(dá)。緊密調(diào)控系統(tǒng)的一個例子見于與tet阻抑子組合中的四環(huán)素調(diào)控的操縱子/啟動子(例如參見美國專利5,750,396)。
在毒產(chǎn)物必須連續(xù)表達(dá)的情況下其表達(dá)特別重要，因為它是細(xì)胞所產(chǎn)生的或者進行代謝活動的較大產(chǎn)物的一個成分。這種情況的一個例子是病毒包裝細(xì)胞系中所表達(dá)的裝配和包裝病毒所必須的產(chǎn)物。如果任何一種必須的病毒基因產(chǎn)物對該細(xì)胞有毒，采用穩(wěn)定(與短暫相反)包裝細(xì)胞系時，關(guān)鍵是需要控制其表達(dá)。必須的毒性病毒基因的一個例子是水泡性口炎病毒(VSV)的G蛋白，它是產(chǎn)生假型病毒顆粒所必須的。
采用tet操縱子和阻抑子來調(diào)控VSV-G表達(dá)的一個例子見Henriette等(J.Virol.73(1)576-584，1999)所述，其中tet阻抑子(作為含VP-16功能域的嵌合融合蛋白，稱為tTA)在巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子的控制下，VSV-G在tet操縱子的控制下。在缺少四環(huán)素時，該嵌合阻抑物的表達(dá)導(dǎo)致不表達(dá)VSV-G。存在四環(huán)素時防止了該操縱子中tTA和tet應(yīng)答元件之間(TRE)的結(jié)合，使VSV-G得以表達(dá)。此系統(tǒng)稱為″tet-on″，當(dāng)存在四環(huán)素時導(dǎo)致該感興趣的基因(即VSV-G)的表達(dá)。
還有另一種″tet-on″系統(tǒng)，其中tTA是一種反式激活蛋白，它在存在四環(huán)素時不能結(jié)合tet操縱子的TSE，但在缺乏四環(huán)素時tTA能結(jié)合該操縱子并強烈激活此啟動子，表達(dá)感興趣的編碼序列。
Klages等(Molec.Therap.2(2)170，2000)描述了采用類似的兩種核酸系統(tǒng)來控制VSV-G的表達(dá)。第一種核酸表達(dá)tTA，其能控制含tet操縱子的TRE，從而控制VSV-G的表達(dá)。同一tTA蛋白也調(diào)控rev蛋白的表達(dá)，rev蛋白進而通過rev應(yīng)答元件(RRE)調(diào)控gag/pol信使RNA的剪接，來調(diào)節(jié)gag和pol區(qū)(病毒包裝所必須)的表達(dá)。
利用rev蛋白來控制基因表達(dá)的另一個例子見Yu等(J.Virol.70(7)4530-37，1996)所述。他們利用tTA表達(dá)來調(diào)節(jié)同處于一個含tet操縱子的TRE調(diào)節(jié)下，HIV-1rev和包膜蛋白的表達(dá)。此rev蛋白進而通過RRE調(diào)節(jié)病毒包膜蛋白的表達(dá)，以及通過另一RRE調(diào)節(jié)gag/pol信使RNA的表達(dá)。雖然另一啟動子調(diào)控gag/pol編碼序列的轉(zhuǎn)錄，但其表達(dá)直接受rev蛋白的調(diào)控因而間接受tTA的調(diào)控。
發(fā)明概述本發(fā)明提供調(diào)控一種或多種感興趣的編碼序列表達(dá)的核酸(表達(dá))構(gòu)建物和方法。該核酸構(gòu)建物性質(zhì)上優(yōu)選重組物并至少包含三種構(gòu)建物，其中至少一個含有感興趣的編碼序列?？蓪⒋藰?gòu)建物視為和用作一種表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)感興趣的編碼序列，其中各種構(gòu)建物表達(dá)一種能調(diào)節(jié)下一種構(gòu)建物表達(dá)的產(chǎn)物，從而通過最后的構(gòu)建物控制感興趣的編碼序列的表達(dá)。各個構(gòu)建物優(yōu)選分別含有一調(diào)控區(qū)如啟動子(任選與操縱子一起)。
本發(fā)明一方面，利用此表達(dá)系統(tǒng)作為用于包裝病毒載體的細(xì)胞或細(xì)胞系的一部分，來調(diào)控包裝此載體所需成分的表達(dá)。此表達(dá)系統(tǒng)可用于調(diào)節(jié)包裝感興趣的病毒載體所必需的病毒結(jié)構(gòu)性和調(diào)節(jié)性基因產(chǎn)物的表達(dá)。要表達(dá)一種以上感興趣的病毒基因產(chǎn)物時，可將這些基因安置在分開的核酸分子上并且仍保留本發(fā)明表達(dá)系統(tǒng)部分。
本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)可具有共同的結(jié)構(gòu)，從而可組合二個或多個系統(tǒng)以表達(dá)所述系統(tǒng)調(diào)節(jié)的一個或多個感興趣的編碼序列。具有共同結(jié)構(gòu)的這些系統(tǒng)的例子包括采用相同的第一和第二種核酸構(gòu)建物，與兩個第三種構(gòu)建物(其含有兩個感興趣的編碼序列，二者均通過第一和第二種核酸構(gòu)建物，受相同的機制調(diào)控。
本發(fā)明的另一方面，第一種核酸構(gòu)建物的表達(dá)優(yōu)選受到緊密調(diào)控或甚至自身調(diào)控。一非限制性例子是通過正反饋機制，其中此第一種核酸構(gòu)建物可抑制其身表達(dá)。在未激活時第一核酸構(gòu)建物的自身調(diào)控產(chǎn)生了非常低的基礎(chǔ)活性，以致幾孚不能表達(dá)該感興趣的(在另一核酸構(gòu)建物中)編碼序列。一但激活了第一核酸構(gòu)建的表達(dá)，此系統(tǒng)中其它所有的構(gòu)建物隨之表達(dá)。在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，采用第一構(gòu)建物的自身調(diào)控來最大程度控制此系統(tǒng)中其它構(gòu)建物的表達(dá)。
可將本發(fā)明的構(gòu)建物和系統(tǒng)加入載體中或?qū)爰?xì)胞中。細(xì)胞中，此構(gòu)建物可整合入細(xì)胞基因組中或保持為游離型構(gòu)建物。細(xì)胞的選擇不是關(guān)鍵，只要該細(xì)胞允許本發(fā)明的構(gòu)建物和系統(tǒng)表達(dá)。本發(fā)明的實施例中，用細(xì)胞來包裝病毒載體，所得病毒載體優(yōu)選具有互補抗性。
本發(fā)明的各構(gòu)建物可在不同的核酸分子上提供，或作為一個或多個其它構(gòu)建物(例如但不限于同一質(zhì)粒、載體或染色體)在同一核酸分子上提供。本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，用此表達(dá)系統(tǒng)在細(xì)胞中包裝病毒載體，各構(gòu)建物優(yōu)選分散在核酸分子中。在一種或多種核酸分子上提供這些構(gòu)建物對實施本發(fā)明通常不是關(guān)鍵性的，只要這些構(gòu)建物的分布不干擾各構(gòu)建物調(diào)節(jié)任一亞序列構(gòu)建物表達(dá)的能力。
或者，在本發(fā)明的另一方面，安置諸構(gòu)建物以從排列中獲得調(diào)控作用。一非限制性實施例是將兩個構(gòu)建物安置在一分子上，使它們的啟動子取向可趨異性表達(dá)諸序列(各啟動子的5’部分比3’部分更靠近在一起)，這樣一啟動子的激活提高了激活其它啟動子的容易程度。已發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒上的這種排列當(dāng)用于細(xì)胞中包裝病毒載體時，提高了載體產(chǎn)生的效價。通過在一個分子上制備趨異性取向的兩種構(gòu)建物然后將該分子整合入細(xì)胞基因組中，可在細(xì)胞中映襯出含有核酸構(gòu)建物穩(wěn)定整合的此種排列。因此應(yīng)沿著兩構(gòu)建物的相對位置保持此趨異性取向。
本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的一種或多種構(gòu)建物表達(dá)的一種或多種產(chǎn)物優(yōu)選來源于病毒，并能嚴(yán)密調(diào)控其它構(gòu)建物的表達(dá)。本發(fā)明的一優(yōu)選表達(dá)系統(tǒng)因而可表達(dá)能調(diào)控該系統(tǒng)其它構(gòu)建物表達(dá)的一種或多種病毒調(diào)節(jié)性蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的構(gòu)建物和系統(tǒng)優(yōu)選用于調(diào)控對細(xì)胞或宿主有毒性的產(chǎn)物(例如但不限于病毒蛋白質(zhì))編碼序列的表達(dá)。當(dāng)然此構(gòu)建物和系統(tǒng)也可用于調(diào)控?zé)o毒產(chǎn)物的表達(dá)。
本發(fā)明的一優(yōu)選實施例中，將本發(fā)明構(gòu)建物摻入細(xì)胞中用于將病毒載體包裝入病毒粒子中。這種細(xì)胞可稱為″包裝細(xì)胞″，因為它們可產(chǎn)生將病毒載體核酸包裝入病毒粒子中所必須的所有成分。這種細(xì)胞可包裝任選含有感興趣的其它異源或內(nèi)源序列的重組病毒核酸。本發(fā)明的諸方面中，此核酸構(gòu)建物導(dǎo)致一可誘導(dǎo)系統(tǒng)，此系統(tǒng)可調(diào)節(jié)必須的病毒組分的表達(dá)，可將這種細(xì)胞視為和用作包裝病毒粒子的一種可誘導(dǎo)系統(tǒng)。
可將本發(fā)明的構(gòu)建物導(dǎo)入細(xì)胞，以將這些構(gòu)建物維持為染色體外物質(zhì)和/或整合性拷貝。本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，這些構(gòu)建物的整合用于產(chǎn)生穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，再用轉(zhuǎn)染細(xì)胞長期限或無限包裝病毒粒子。
本發(fā)明還提供產(chǎn)生上述構(gòu)建物和系統(tǒng)的方法，以及采用此系統(tǒng)調(diào)控編碼序列表達(dá)的方法。這些方法包括利用本發(fā)明產(chǎn)生包裝病毒載體所必須的一種或多種成分。還提供含有本發(fā)明構(gòu)建物或用于所公開方法的試劑盒。
附圖的簡要說明

圖1是本發(fā)明調(diào)控細(xì)胞內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄病毒gag/pol編碼區(qū)和VSV-G蛋白表達(dá)的表達(dá)系統(tǒng)的示意圖。該系統(tǒng)采用四種構(gòu)建物，其中第一構(gòu)建物是tTA在TRE調(diào)控啟動子控制下可自身調(diào)控的表達(dá)構(gòu)建物。第二構(gòu)建物可在TRE調(diào)控啟動子控制下表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒rev蛋白。第三構(gòu)建物可在嵌合性逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動子調(diào)控下表達(dá)含有g(shù)ag/pol編碼區(qū)的逆轉(zhuǎn)錄病毒RRE。第四構(gòu)建物可在異源性啟動子如猿巨細(xì)胞病毒啟動子的調(diào)控下，表達(dá)RRE調(diào)控的VSV-G轉(zhuǎn)錄物。
圖2顯示本發(fā)明的一些不同的核酸構(gòu)建物。顯示諸構(gòu)建物中rev編碼序列置于巨細(xì)胞病毒(CMV)或四環(huán)素(TRE)啟動子控制下。這里的實施例1描述了pTRE-tTASvPuroTKT的組成。pCGCRSRRE-1M在圖5中部分詳述。質(zhì)粒pVP1.2RznoG和pVPznoG-U31TAR2(IRES是內(nèi)部核糖體進入位點)在本文實施例7中詳述。質(zhì)粒pN2CGFP和pN1(cpt)CGFP在本文實施例5和7中敘述。
圖3顯示在有或沒有四環(huán)素調(diào)節(jié)rev表達(dá)時，用抗Rev和抗Tat抗體免疫染色的轉(zhuǎn)染的HT1080-TR克隆。見本文實施例2。
圖4顯示本文實施例7中所述嵌合性U3/TAR2啟動子的示意圖。
圖5顯示含剪接供體和受體位點不同排列的構(gòu)建物賦于基因表達(dá)Rev應(yīng)答(依賴性)或非應(yīng)答(非依賴性)的示意圖。
圖6顯示了western印跡，它證實了通過采用不同剪接供體位點的rev-依賴性VSV-G蛋白的表達(dá)。
優(yōu)選實施例的描述定義″核酸″或″核酸構(gòu)建物″或″核酸分子″是多核苷酸或任何長度的核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸的聚合形式。此術(shù)語僅指該分子的一級結(jié)構(gòu)。因此，該術(shù)語包括雙鏈和單鏈DNA和RNA。此術(shù)語還包括線性或環(huán)形聚合物。
本文所用″感興趣的編碼序列″是需要表達(dá)的感興趣的多核苷酸序列。就其確切序列而言，此編碼序列可知或不知，但可編碼感興趣的RNA或多肽。
本文所用″細(xì)胞″或″宿主″指其中可導(dǎo)入和表達(dá)本發(fā)明核酸構(gòu)建物或表達(dá)系統(tǒng)的相應(yīng)的活生物?！寮?xì)胞″可以是任何細(xì)胞，優(yōu)選真核細(xì)胞。此細(xì)胞可以是一種細(xì)胞系或新分離和轉(zhuǎn)化的原代細(xì)胞，或結(jié)合導(dǎo)入了本發(fā)明核酸構(gòu)建物的細(xì)胞。細(xì)胞系或培養(yǎng)物指通過體外培養(yǎng)而維持的細(xì)胞，可以與衍生此細(xì)胞系或培養(yǎng)物的親代細(xì)胞不同。細(xì)胞的非限制性例子包括真核細(xì)胞如Hela、293、HT-1080、CV-1、TE671或其它人類細(xì)胞、Vero細(xì)胞或D17細(xì)胞。其它細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞(如T或B細(xì)胞)或巨噬細(xì)胞(如單核巨噬細(xì)胞)，或是這些細(xì)胞的前體細(xì)胞如造血干細(xì)胞。實施本發(fā)明的其它細(xì)胞包括星形細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、大腸表皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、朗格漢姆細(xì)胞、單核細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、神經(jīng)原細(xì)胞(例如但不限于腦和眼)、肝細(xì)胞、造血干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、產(chǎn)生精子的細(xì)胞或卵母細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、粘膜細(xì)胞等。優(yōu)選宿主細(xì)胞是真核多細(xì)胞性細(xì)胞(與單細(xì)胞性酵母細(xì)胞相反)，更優(yōu)選哺乳動物如人的細(xì)胞。
細(xì)胞可以單個實體存在，或是較大細(xì)胞集合體的一部分。例如，這種″較大細(xì)胞集合體″可包括細(xì)胞培養(yǎng)物(混合性或純的)，組織(如內(nèi)皮、表皮、粘膜或其它組織，包括含上述CD4缺乏細(xì)胞的組織)，器官(如心、肺、肝、肌肉、膽囊、膀胱、性腺、眼和其它器官)，器官系統(tǒng)(如循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、胃腸道系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、皮膚系統(tǒng)和其它器官系統(tǒng))或生物(如禽類、哺乳類等)。優(yōu)選的器官/組織/細(xì)胞是循環(huán)系統(tǒng)(例如包括但不限于心、血管和血液，包括血液白細(xì)胞和紅細(xì)胞)，呼吸系統(tǒng)(如鼻、咽、喉、氣管、支氣管、肺泡支氣管、肺等)胃腸道系統(tǒng)(如口、咽、食道、胃、小腸、唾液腺、胰腺、肝、膽囊和其它)，泌尿系統(tǒng)(如腎、尿道、膀胱、輸尿管等)，神經(jīng)系統(tǒng)(包括但不限于腦和脊髓，以及特殊感覺器官如眼)和皮膚系統(tǒng)(如表皮、皮下和真皮組織細(xì)胞)。甚對更優(yōu)選細(xì)胞選自心、血管、肺、膽囊、膀胱和眼細(xì)胞。這些細(xì)胞不需要是正常細(xì)胞，可以是患病細(xì)胞。這些患病細(xì)胞可以是但不限于腫瘤細(xì)胞、受感染細(xì)胞、遺傳異常細(xì)胞或靠近或密切接觸異常組織如腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞。
本文中可互換使用的多核苷酸或寡核苷酸的″部分″或″區(qū)域″中2個或多個堿基的連續(xù)序列。其它實施例中一區(qū)域或一部分是至少約3、5、10、15、20、25個連續(xù)核苷酸之一。
″病毒″是由蛋白和核酸組成的傳染性因子，其能利用宿主的遺傳機制產(chǎn)生由病毒核酸所確定的病毒產(chǎn)物。本發(fā)明包括許多方面，例如表達(dá)病毒所編碼的序列可應(yīng)用于RNA和DNA病毒。RNA病毒是能感染原核細(xì)胞(如噬菌體)以及許多真核細(xì)胞，包括哺乳動物特別是人細(xì)胞的多樣性群體。大多數(shù)RNA病毒具有單鏈RNA作為其遺傳物質(zhì)，雖然至少有一個家族具有雙鏈RNA作為其遺傳物質(zhì)?？蓪NA病毒主要分成三組正鏈病毒、負(fù)鏈病毒和雙鏈RNA病毒。與本發(fā)明相關(guān)的RNA病毒包括新培斯樣病毒(如披膜病毒、雀麥草花葉病毒組、南瓜花葉病毒組、煙草花葉病毒組、煙草脆裂病毒組和馬鈴薯X病毒組)，小RNA樣病毒(如小RNA病毒科、杯狀病毒科、豇豆花葉病毒、線蟲傳多面體病毒和馬鈴薯X樣病毒組)；負(fù)鏈病毒(如副粘病科、彈狀病毒科、正粘病毒科和沙粒病毒科)；雙鏈病毒(如呼腸孤病毒科和雙RNA病毒科)；黃病毒樣病毒(如黃病毒科和瘟病毒屬)；逆轉(zhuǎn)錄病毒樣病毒(如逆轉(zhuǎn)錄病毒科)；冠狀病毒科和其它病毒族，其中包括但不限于野田村病毒科。優(yōu)選將本發(fā)明應(yīng)用于黃病毒科的RNA病毒，更優(yōu)選黃病毒屬的病毒，特別是馬堡病毒和埃博拉病毒。黃病毒科的病毒是黃病毒屬的病毒，如黃熱病毒、登革熱病毒、西尼洛河病毒、圣露易斯腦炎病毒、、日本腦炎病毒、Murray谷(Murray Valley)腦炎病毒、Rocio病毒、蜱傳腦炎病毒等。本發(fā)明優(yōu)選應(yīng)用于小RNA病毒科的病毒，優(yōu)選甲肝病毒(HAV)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)或非甲非乙肝炎病毒。
可應(yīng)用于本發(fā)明的另一優(yōu)選RNA病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒科的病毒(即逆轉(zhuǎn)錄病毒)，特別是致癌病毒科、泡沫病毒科、泡沫病毒、慢病毒科、慢病毒屬或亞科的病毒。理想的致癌病毒亞科的RNA病毒是1型或2型嗜人T淋巴細(xì)胞病毒(即HTLV-1或HTLV-2)，牛白血病病毒(BLV)、禽造白細(xì)胞組織增生-肉瘤病毒(如羅斯肉瘤病毒(RSV)、禽髓母細(xì)胞增生病毒(AMV)、禽成紅細(xì)胞增多癥病毒(AEV)和羅斯相關(guān)病毒(RAV；RAV-0至RAV-50)、哺乳動物C-型病毒(如莫洛尼鼠白血病病毒(MuLV)、Harvey鼠肉瘤病毒HaMSV)、Abelson鼠白血病病毒(A-MuLV)、AKR-MuLV、豬白血病病毒(FeLV)、猿肉瘤病毒、網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒(REV)、脾臟壞死病毒(SNV))；B-型病毒(如小鼠乳腺瘤病毒(MMTV))；和D-型病毒(如Mason-Pfizer猴病毒(MPMV)和″SAIDS″病毒)。理想的慢病毒來家族的RNA病毒是1型或2型人免疫缺陷病毒(即HIV-1或HIV-2；其中HIV-1先前稱為淋巴腺病相關(guān)病毒3(HTLV-III)和獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)相關(guān)病毒(ARV))；或其它已得到鑒定并與AIDS或AIDS樣疾病相關(guān)連的HIV-1或HIV-2相關(guān)病毒。縮寫″HIV″或″人免疫缺陷病毒″在這里一般是指這些HIV病毒和HIV相關(guān)病毒。而且，慢病毒亞家族的RNA病毒優(yōu)選羊髓鞘脫落/呼吸急促病毒(如感染羊)、豬免疫缺陷病毒(FIV)和山羊關(guān)節(jié)炎腦水病毒(CAEV)。本發(fā)明也可用于DNA病毒。優(yōu)選的DNA病毒是皰疹病毒(如EB-病毒、單純皰疹病、巨細(xì)胞病毒)；腺病毒、AAV、乳頭瘤病毒、痘苗病毒等。
必須注意，此說明書和附屬權(quán)利要求書中所用的單數(shù)形式的單詞包括相應(yīng)的復(fù)數(shù)，除非文中另有清楚說明。
″表達(dá)″包括脫氧核糖核酸的轉(zhuǎn)錄和/或核糖核酸的翻譯。
如本文所用術(shù)語″包括″和其同源詞，以其廣義應(yīng)用，等于術(shù)語″包含″及其相應(yīng)的同源詞。
″使得″事件發(fā)生的條件，或″適合″于事件發(fā)生的條件，如啟動轉(zhuǎn)錄或翻譯、鏈擴展或延伸等的條件，是不防止或抑制此活動發(fā)生的條件。因此，這些條件允許、提高、促進和/或有助于此活動。本領(lǐng)域已知的和本文所述的這種條件取決于，例如，核苷酸序列的性質(zhì)、溫度和緩沖液條件。這些條件也取決于所需的活動，如核酸/蛋白質(zhì)相互反應(yīng)、蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)相互反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄或翻譯。
術(shù)語″3’″(3引物)一般指多核苷酸或寡核苷酸3’(下游)中距離同一多核苷酸或寡核苷酸中另一區(qū)域或部位的一區(qū)域或部位。
術(shù)語″5’″(5引物)一般指多核苷酸或寡核苷酸5’(上游)中距離同一多核苷酸或寡核苷酸中另一區(qū)域或部位的一區(qū)域或部位。
術(shù)語″3’-DNA部分″、″3’-DNA區(qū)域″、″3’-RNA部分″和″3’-RNA區(qū)域″指位于朝向某多核苷酸或寡核苷酸的3’端的該多核苷酸或寡核苷酸的部分或區(qū)域，并可包括或不包括結(jié)合于同一多核苷酸或寡核苷酸3’大多數(shù)核苷酸的3’大多數(shù)核苷酸或部分。
術(shù)語″5’-DNA部分″、″5’-DNA區(qū)域″、″5’-RNA部分″和″5’-RNA區(qū)域″指位于朝向某多核苷酸或寡核苷酸的5’端的該多核苷酸或寡核苷酸的部分或區(qū)域，并可包括或不包括結(jié)合于同一多核苷酸或寡核苷酸5’大多數(shù)核苷酸的5’大多數(shù)核苷酸或部分。
術(shù)語″異源性″指天然或其天然狀態(tài)時通常發(fā)現(xiàn)不在一起的兩種物質(zhì)之間的關(guān)系。術(shù)語″內(nèi)源性″指天然或其天然狀態(tài)時發(fā)現(xiàn)通常在一起的兩種物質(zhì)之間的關(guān)系。例如，一編碼序列可操作性連接于天然時通常不與該序列相連的一異源性啟動子，或連接于其天然時通常與該序列相連的內(nèi)源性啟動子?；蛘撸缓怂峥晒矁r連接于一異源性啟動子，所述核酸通?？梢娕c其在一起，除非該異源性序列是反義取向。一編碼序列″可操作性連接于″一啟動子時(如當(dāng)該編碼序列和該啟動子一起構(gòu)成能被表達(dá)的天然或重組的構(gòu)建物時)，此啟動子能直接指導(dǎo)該編碼序列的轉(zhuǎn)錄。
除非另有說明，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員共同所理解的含義相同。
本發(fā)明提供的核酸(表達(dá))構(gòu)建物當(dāng)組合應(yīng)用時，能調(diào)節(jié)一種或多種感興趣的編碼序列的表達(dá)。此感興趣的編碼序列可編碼感興趣的或需要表達(dá)的RNA或多肽。此核酸構(gòu)建物優(yōu)選性質(zhì)是重組的，隨后的作用是調(diào)節(jié)位于″最后″構(gòu)建物上的感興趣的編碼序列的表達(dá)。每種構(gòu)建物導(dǎo)致表達(dá)一產(chǎn)物，該產(chǎn)物能調(diào)節(jié)下一種構(gòu)建物的表達(dá)，直至通過調(diào)控最后的構(gòu)建物而表達(dá)該感興趣的編碼序列。各構(gòu)建物優(yōu)選含有一調(diào)節(jié)區(qū)，該區(qū)是可誘導(dǎo)性的和/或受另一構(gòu)建物表達(dá)的調(diào)控。這些構(gòu)建物也任選地含有可選擇性或可檢測性標(biāo)記以有利于鑒定和應(yīng)用?？勺鳛榭蓹z測標(biāo)記的是某構(gòu)建物所導(dǎo)入的細(xì)胞中該構(gòu)建物上的非內(nèi)源性調(diào)節(jié)或編碼序列。
本發(fā)明的構(gòu)建物優(yōu)選存在于用來包裝病毒載體的細(xì)胞或細(xì)胞系中。此構(gòu)建物從而可調(diào)節(jié)包裝所述載體必須的一種或多種病毒組分的表達(dá)。這些病毒組分可以是適當(dāng)包裝所必須的任何病毒基因產(chǎn)物，包括但不限于病毒包膜蛋白、衣殼蛋白、逆轉(zhuǎn)錄病毒的gag或pol蛋白和/或病毒調(diào)節(jié)蛋白?？蓪⒕幋a這些病毒組分的核酸置于一個或多個核酸分子上，只要它們可被表達(dá)產(chǎn)生病毒載體的適當(dāng)包裝。為了減少病毒載體和這些構(gòu)建物之間重組導(dǎo)致產(chǎn)生含所有病毒組分的載體的可能性，優(yōu)選將編碼病毒組分的核酸分散在不同的核酸分子中。優(yōu)選的待表達(dá)病毒組分是HIV-1或HIV-2的gag/pol序列所編碼的那些蛋白、逆轉(zhuǎn)錄病毒(優(yōu)選HIV-1或-2的)rev蛋白和病毒包膜蛋白。
例如但不限制本發(fā)明，本發(fā)明可包括表達(dá)感興趣的編碼序列的三種構(gòu)建物。第一種核酸構(gòu)建物能表達(dá)第一產(chǎn)物，所述第一產(chǎn)物能調(diào)節(jié)第二種核酸構(gòu)建物所編碼的第二產(chǎn)物的表達(dá)；所述第二產(chǎn)物能調(diào)節(jié)所述感興趣的編碼序列(存在于第三種核酸構(gòu)建物上)編碼產(chǎn)物的表達(dá)。優(yōu)選所述三種核酸構(gòu)建物中至少一種含有異源性核酸。其它優(yōu)選實施例中，第一和第二構(gòu)建物的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的直接調(diào)控，而第三構(gòu)建物中的感興趣的編碼序列的表達(dá)受剪接和/或核輸出的調(diào)節(jié)。
本發(fā)明一實施例中，第一構(gòu)建物含有可誘導(dǎo)性或受調(diào)節(jié)的啟動子，如四環(huán)素啟動子/操縱子，或類固醇或蛻皮激素區(qū)。另一調(diào)控系統(tǒng)是ARIAD制藥公司開發(fā)的。此啟動子操作性連接于第一編碼序，該第一編碼序列編碼的產(chǎn)物能調(diào)節(jié)第二構(gòu)建物的表達(dá)。本發(fā)明一優(yōu)選實施例中，此第一構(gòu)建物含有四環(huán)素啟動子和編碼此四環(huán)素啟動子激活劑(或含此激活劑的融合蛋白，例如但不限于tTA)的第一編碼序列，這樣該第一構(gòu)建物在存在四環(huán)素時能自身調(diào)控而不表達(dá)?；蛘撸说谝痪幋a序列編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒，優(yōu)選HIV-1或HIV-2的tat蛋白。
通過去除此實施例中的四環(huán)素來誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致tet激活劑或者tat蛋的表達(dá)。因此第二核酸構(gòu)建物可含有tet啟動子/操縱子，或tat調(diào)節(jié)的啟動子區(qū)，如受表達(dá)的tat蛋白調(diào)節(jié)的5’LTR啟動子。所述第二核酸序列的編碼序列可編碼能調(diào)節(jié)第三構(gòu)建物表達(dá)的任何產(chǎn)物。本發(fā)明一非限制性實施例中，該第二核酸序列可編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒的rev蛋白，來調(diào)節(jié)存在于第三構(gòu)建物上的感興趣的編碼序列的mRNA的剪接和/或核輸出。本發(fā)明含有rev蛋白表達(dá)的實施例中，存在于第三構(gòu)建物上的啟動子可以是任何能表達(dá)感興趣的編碼序列的適當(dāng)啟動子，其表達(dá)的mRNA水平足以在rev蛋白存在時產(chǎn)生所需水平的蛋白質(zhì)，而作用于剪接和/或核輸出。優(yōu)選此啟動子是逆轉(zhuǎn)錄病毒HIV的5’LTR，或巨細(xì)胞病毒(CMV)，宜為人或猿CMV的5’LTR。
應(yīng)用于本發(fā)明包裝細(xì)胞時，第三構(gòu)建物上的感興趣的編碼序列可編碼病毒包膜蛋白(如逆轉(zhuǎn)錄病毒的)，更優(yōu)選HIV-1、HIV-2或MMLV的包膜蛋白；水泡性口炎病毒(VSV)、Mokola病毒或狂犬病毒的G蛋白；GaLV、甲病毒屬E1/2糖蛋白或RD114、豬內(nèi)源性病毒的env蛋白?；蛘?，也可采用編碼嵌合性包膜蛋白的序列。還可采用以下病毒科小RNA病毒科、披膜病毒科、冠狀病毒科、彈狀病毒科、副粘病毒科、正粘病毒科、布尼亞病毒科、沙粒病毒科、Paro病毒科(Paroviridae)、痘病毒科、嗜肝DNA病毒科和皰疹病毒的包膜蛋白編碼序列。
本發(fā)明另一實施例中，第一構(gòu)建物含有操作性連接于類因醇激素受體編碼序列的四環(huán)素啟動子/操縱子，誘導(dǎo)其表達(dá)會導(dǎo)致所述受體的表達(dá)。第二構(gòu)建物含有的啟動子受所述類因醇受體的調(diào)節(jié)(含此受體和活化配體的復(fù)合物可激活所述啟動子的啟動)。在缺乏所述復(fù)合物時此啟動子無活性。第二構(gòu)建物的編碼區(qū)還可編碼能調(diào)控第三構(gòu)建物表達(dá)的產(chǎn)物。例如，第二構(gòu)建物的編碼序列可編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒的tat或rev蛋白。就編碼的tat蛋白而言，第三構(gòu)建物含有其表達(dá)受tat蛋白調(diào)節(jié)的一個區(qū)域，例如但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒的5’LTR啟動子和編碼順式作用RNA元件的稱為TAR的序列。就編碼的rev蛋白而言，只需要使第三構(gòu)建物的表達(dá)如上所述處于rev蛋白的調(diào)控下(通過mRNA剪接和/或核輸出控制)。
應(yīng)用于細(xì)胞包裝病毒載體時，可從與該病毒載體相關(guān)的異源病毒得到逆轉(zhuǎn)錄病毒的tat蛋白。此病毒載體可以是HIV-1衍生的，但不限制本發(fā)明，可在本發(fā)明的一個或多個核酸構(gòu)建物中采用嵌合性逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動子。嵌合性逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動子的一非限制性例子是含異源性TAR序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒5’LTR啟動子，這樣要表達(dá)連接于該啟動子的編碼序列，就必須表達(dá)相關(guān)的異源性tat蛋白。優(yōu)選的嵌合啟動子包括含HIV-2TAR序列的HIV-1 5’LTR啟動子。當(dāng)與能表達(dá)HIV-2tat蛋白的構(gòu)建物聯(lián)用時，可表達(dá)操作性連接于嵌合啟動子的該編碼序列。
本發(fā)明另一實施例中，在本發(fā)明的一個或多個構(gòu)建物中采用了TAR元件，上述表達(dá)系統(tǒng)的任何構(gòu)建物中不需要存在tat蛋白編碼序列。而是，相關(guān)tat蛋白所需的TAR可通過提供另外來源的tat蛋白來滿足。例如，將本發(fā)明構(gòu)建物導(dǎo)入細(xì)胞時，該細(xì)胞可含任選整合入細(xì)胞基因組的其它核酸構(gòu)建物，來表達(dá)所需的tat蛋白。這種單一表達(dá)構(gòu)建物是本領(lǐng)域熟知的。
上述一個例子是tat蛋白與本發(fā)明表達(dá)系統(tǒng)的組合。當(dāng)要表達(dá)二個感興趣的核酸序列時，可將第一個置于本發(fā)明表達(dá)系統(tǒng)控制下，而將第二個置于所述系統(tǒng)和上述其它來源表達(dá)的tat蛋白二者的控制下。例如，可采用三種構(gòu)建物通過rev蛋白(來自第二構(gòu)建物)來調(diào)節(jié)感興趣的第一序列(來自第三構(gòu)建物)的表達(dá)。第四構(gòu)建物表達(dá)的感興趣的第二序列受rev蛋白(來自第二構(gòu)建物)和tat蛋白的調(diào)控。這樣，感興趣的第一序列只處于該系統(tǒng)的控制下，而感興趣的第二序列處于該系統(tǒng)和tat蛋白的共同控制下。當(dāng)然異源性tat蛋白和TAR元件也可用于本發(fā)明其它實施例中?；蛘?，也可使感興趣的第一序列受tat調(diào)節(jié)。
如要取代采用上述tat編碼序列，可采用編碼嵌合tat蛋白的序列。需將Tat摻入一融合蛋白(如Tat-Ga14)中，并保留其HIV-LTR啟動子的反式激活活性。也可采用其它嵌合Tat蛋白，只要其保留了充分的反式激活活性。
采用rev蛋白來調(diào)控后續(xù)構(gòu)建物的表達(dá)時，所述后續(xù)構(gòu)建物的編碼序列應(yīng)含有，或經(jīng)修飾后含有受rev蛋白調(diào)節(jié)的rev應(yīng)答元件(RRE)和相應(yīng)的剪接供體和受體位點。例如，但不限制本發(fā)明，當(dāng)?shù)谌龢?gòu)建物含有的編碼序列編碼病毒包膜或G蛋白時，該編碼序列應(yīng)含有相關(guān)rev蛋白適當(dāng)剪切和/或核輸出所需的剪接供體和受體位點，從而可表達(dá)包膜或G蛋白。可任選地選出這些位點以提供與rev蛋白相關(guān)的弱化剪切功能。這種弱化提供了使表達(dá)更依賴rev蛋白和RRE的一種方法。例如，如果這些剪接位點內(nèi)在功能太快，可在rev蛋白和RRE有機會輸出mRNA和允許該序列表達(dá)前，切下感興趣的編碼序列。因此選擇能在缺乏rev蛋白時足以行施剪切和抑制表達(dá)，同時在存在rev蛋白時能抑制剪切和允許表達(dá)的剪切位點。
可考慮和組合應(yīng)用本發(fā)明的構(gòu)建物，用作感興趣的編碼序列的表達(dá)系統(tǒng)。而且，可組合含有相同構(gòu)建物的二個或多個表達(dá)系統(tǒng)來同時調(diào)節(jié)二個或多個感興趣的編碼序列。例如但不限制本發(fā)明，前二個構(gòu)建物可相同，其中第二構(gòu)建物調(diào)節(jié)二個或多個第三構(gòu)建物上感興趣的編碼序列的表達(dá)，各能表達(dá)一感興趣的編碼序列。此例的一實施例中，第一構(gòu)建物含有四環(huán)素可誘導(dǎo)啟動子，其操作性連接于編碼能調(diào)節(jié)第二構(gòu)建物中rev蛋白編碼序列表達(dá)產(chǎn)物的編碼序列。二個或多個第三構(gòu)建物每一個中的感興趣的編碼序列，可經(jīng)修飾而含有剪切供體和受體位點，這樣在存在第二構(gòu)建物表達(dá)的rev蛋白時可表達(dá)該編碼蛋白質(zhì)。一具體實施例中，在二個第三構(gòu)建物中可存在二個感興趣的編碼序列第一編碼序列是操作性連接于RRE的逆轉(zhuǎn)錄病毒的(優(yōu)選HIV的)gag/pol序列；第二編碼序列是操作性連接于RRE的VSV-G或Mokola病毒的G蛋白。如上述，這兩個第三構(gòu)建物的啟動子可以是任何在rev蛋白存在時能充分表達(dá)的啟動子。
如本文所述，第一核酸構(gòu)建物的表達(dá)優(yōu)選受緊密調(diào)控或甚至自身調(diào)控。作為非限制性實施例，緊密調(diào)控采取正反饋機制，其中第一核酸構(gòu)建物可抑制(直接或間接)其自身表達(dá)。缺乏激活劑時第一核酸構(gòu)建物的這種自身調(diào)控導(dǎo)致極低的基礎(chǔ)活性，低至不能表達(dá)本發(fā)明表達(dá)系統(tǒng)的其它構(gòu)建物。而是，第一核酸構(gòu)物表達(dá)激活時，隨之表達(dá)該系統(tǒng)中所有其它構(gòu)建物。
可將本發(fā)明的構(gòu)建物和系統(tǒng)摻入載體或?qū)爰?xì)胞，例如但不限于哺乳動物、嚙齒動物、靈長動物或人的細(xì)胞?？蓪⒈景l(fā)明的構(gòu)建物整合入細(xì)胞基因組中或維持為游離型構(gòu)建物。本發(fā)明優(yōu)選的細(xì)胞是能表達(dá)單獨的或與其它核酸組合的感興趣的編碼序列的細(xì)胞。可以任何順序?qū)⒈景l(fā)明的構(gòu)建物導(dǎo)入細(xì)胞。導(dǎo)入后通過所述構(gòu)建物上的選擇性或可檢測性標(biāo)志來檢測所述構(gòu)建物，證實所述細(xì)胞中存在這些構(gòu)建物。
雖然本發(fā)明的各構(gòu)建物可存在于各核酸分子中，但本發(fā)明的一些優(yōu)選應(yīng)用包括含多個本發(fā)明構(gòu)建物的一個核酸分子。例如作為非限制性例子，涉及到制備穩(wěn)定的細(xì)胞系，可將本發(fā)明的構(gòu)建物穩(wěn)定整合入細(xì)胞的一個或多個染色體中，以產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系?；蛘?，在導(dǎo)入所述細(xì)胞之前，可將這些構(gòu)建物置于一個或多個游離型載體或質(zhì)粒上。為了應(yīng)用于細(xì)胞來包裝病毒載體，優(yōu)選將各構(gòu)建物分置入不同的核酸分子中，以增加與病毒載體重組的數(shù)量，從而賦予其復(fù)制能力。優(yōu)選本發(fā)明的構(gòu)建物，具體說是其調(diào)節(jié)和編碼序列部分包含病毒來源的序列。實施本發(fā)明優(yōu)選這種病毒性調(diào)節(jié)部分(順式作用)和編碼部分(反式作用)。順式作用區(qū)的例子是TAR和RRE、逆轉(zhuǎn)錄病毒的INS(抑制序列或不穩(wěn)定序列，也稱為CRS)元件，而反式作用編碼區(qū)的例子是tat和rev編碼序列。含病毒構(gòu)建物的細(xì)胞優(yōu)選沒有導(dǎo)入本發(fā)明構(gòu)建物以外的病毒序列。
優(yōu)選在本發(fā)明的構(gòu)建物中采用感興趣的病毒核酸的異源RRE。例子包括但不限于HIV-1衍生核酸的HIV-2RRE，一種CTE(組成性轉(zhuǎn)運元件，如來自Mason-Pfizer猴病毒或其它逆轉(zhuǎn)錄病毒)或PRE(轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件，如美洲旱獺肝炎病毒的這種元件)。除了減少、盡可能減少或消除以具有不同序列的不同RRE為基礎(chǔ)同源重組的可能性外，已觀察到產(chǎn)生的包裝核酸令人驚奇和出孚意料地增加了約5倍。
本發(fā)明的各種表達(dá)感興趣的編碼序列的實施例中，表達(dá)的編碼產(chǎn)物可能對細(xì)胞或宿主有毒。其例子包括病毒的gag-pol蛋白和包膜蛋白，如VSVG蛋白。然而本發(fā)明的整個范圍包括用于表達(dá)對細(xì)胞或宿主無毒，或只在特定情況時(如高水平表達(dá)時或存在其它因素時產(chǎn)生毒性)有毒的序列。
本發(fā)明一優(yōu)選方面涉及制備含有本發(fā)明構(gòu)建物的細(xì)胞和細(xì)胞系。將核酸構(gòu)建物導(dǎo)入細(xì)胞的方法，包括本領(lǐng)域所知的利用條件整合入細(xì)胞基因組的方法(如電穿孔、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀)。優(yōu)選實施例中，設(shè)計構(gòu)建物與細(xì)胞以提供產(chǎn)生含感興趣的具體核酸的病毒顆粒。優(yōu)選復(fù)制缺陷型病毒核酸和衍生自天然病毒但沒有去除或丟失掉內(nèi)源″包裝信號″。本發(fā)明特別優(yōu)選和實施例中，此病毒核酸衍生自HIV-1?？赏ㄟ^國立衛(wèi)生研究院的《AIDS研究和參考試劑計劃目錄》(AIDS Research andReference Reagent Program Catalog)(見Adachi等，J.Virol；59，284-91，1986)獲得野生型菌株的pNL4-3 HIV-1產(chǎn)生HIV-1衍生的病毒核酸?？煽紤]和利用這些細(xì)胞作為病毒核酸的″包裝細(xì)胞″，將其分別導(dǎo)入細(xì)胞中，因為它們可產(chǎn)生將病毒核酸包裝入感染性病毒顆粒中所必須的所有成分。
優(yōu)選的包裝細(xì)胞當(dāng)病毒核酸提供了所有其它成分時，可表達(dá)感興趣的編碼序列的至少一種病毒包膜蛋白，或等價物(如突變體、融合體或其截短形式)。優(yōu)選的包膜蛋白是病毒核酸天然形式內(nèi)源序列(即正常用于包裝該病毒核酸所衍生的病毒)或該病毒核酸的異源序列所編碼的包膜蛋白。為實施本發(fā)明可表達(dá)的各種包膜蛋白包括能改變包裝病毒顆粒靶細(xì)胞特異性的蛋白，或其它可導(dǎo)致假型病毒顆粒的包膜蛋白。采用HIV-1衍生病毒核酸的優(yōu)選異源性包膜蛋白包括VSVG蛋白、Mokola病毒的G蛋白和HIV-2包膜蛋白。
或者，這些細(xì)胞可提供至少一種病毒包膜蛋白，和表達(dá)待包裝病毒核酸包裝成分所必須的一種或多種蛋白。一個非限制性例子是能提供包膜蛋白及相關(guān)tat蛋白，或反式激活所需的一個或多個其它蛋白的細(xì)胞，來包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒核酸(如能提供VSV G蛋白和HIV-1tat蛋白來包裝HIV-1衍生載體的細(xì)胞)。反式激活所需其它蛋白的例子包括gag，pol和rev序列編碼的細(xì)胞。
優(yōu)選待包裝的感興趣的病毒核酸缺乏表達(dá)或編碼一個或多個能使該核酸成為致病性或可能致病性的病毒附屬蛋白序列(例如但不限于Vif，Vpu，Vpr或Nef或其組合或片段)。這可通過去除相應(yīng)的編碼序列或使其突變而防止它們在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平上的表達(dá)來實現(xiàn)。到需要這些蛋白包裝時，可通過本發(fā)明的構(gòu)建物或其它核酸構(gòu)建物包裝細(xì)胞來提供這些蛋白。
本發(fā)明的包裝細(xì)胞表達(dá)的一種或多種病毒蛋白可通過本領(lǐng)域已知的多種方法來證實，包括ELISA法，如利用一種以上識別病毒蛋白抗體的夾心ELISA法。其它非限制性方法的例子包括免疫染色和Western印跡。
這類細(xì)胞包裝的病毒核酸可任選項地含有被上述包裝細(xì)胞包裝的一種或多種感興趣的異源性蛋白。這類異源性蛋白的例子包括美國專利6,168,953中所述的通用抗病毒制劑。例子有核酶、反義序列和/或核酸誘餌。
本發(fā)明一優(yōu)選實施例中，此病毒核酸是美國專利5,885,806和2000年5月1日提交的待批美國專利申請09/562,894所述的一種條件性復(fù)制載體。另一優(yōu)選實施例中，此病毒核酸是還包含編碼gag和pol蛋白的內(nèi)源序列的條件性復(fù)制載體。可考慮和利用這些細(xì)胞作為將所述異源序列包裝入病毒粒子中的一種系統(tǒng)。然后考慮和利用病毒草粒子作為運輸工具使包裝序列感染進入細(xì)胞。
另一優(yōu)選實施例中，設(shè)計本發(fā)明的病毒核酸和構(gòu)建物使它們序列之間的相同性最少，以減少它們之間重組的可能性，從而減少產(chǎn)生復(fù)制能力強的病毒核酸的可能性。優(yōu)選本發(fā)明的病毒核酸和構(gòu)建物之間相同的核酸殘基少于約8個雖然更優(yōu)選少于約6個，少于約4個相同殘基。導(dǎo)入不相同性的方法包括從病毒核酸和/或構(gòu)建物中去除不表達(dá)的或非關(guān)鍵性的序列，或二者中所見的簡并性序列，以減少序列相同性殘基的頻率。
采用本發(fā)明構(gòu)建物的方法包括將其導(dǎo)入能表達(dá)它們的細(xì)胞，以產(chǎn)生一個或多個感興趣的編碼序列的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。可將這種細(xì)胞系統(tǒng)導(dǎo)入多細(xì)胞宿主或已存在于這種宿主中，來體內(nèi)表達(dá)感興趣的編碼序列?？衫么思?xì)胞系統(tǒng)來表達(dá)所述感興趣的序列，然后分離或純化，或用于其它細(xì)胞代謝活動中如包裝病毒粒子。
可在圍繞包裝細(xì)胞的上清液中找到包裝的病毒粒子并任選項地分離它們。粒子優(yōu)選具有高效價和高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，以將包裝的感興趣的病毒核酸導(dǎo)入靶細(xì)胞。
本發(fā)明另一方面，提供用本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生所述構(gòu)建物和系統(tǒng)的方法。各種核酸構(gòu)建物的重組應(yīng)用包括本領(lǐng)域已很好建立的核酸剪接和細(xì)胞轉(zhuǎn)化技術(shù)，可采用而無須不需要的實驗。關(guān)于包裝病毒載體的細(xì)胞，本發(fā)明通過本領(lǐng)域已很好建立的方法，提供在有助于細(xì)胞生長和載體產(chǎn)生的條件下，導(dǎo)入所述病毒載體后培養(yǎng)細(xì)胞的方法。
本發(fā)明另一方面，可制備試劑盒形式的構(gòu)建物和系統(tǒng)，用于表達(dá)一個或多個感興趣的序列。此試劑盒任選地包含實施本發(fā)明所需的其它成分，包括但不限于適當(dāng)?shù)募?xì)胞系、緩沖液、鹽、凍乾穩(wěn)定劑或穩(wěn)定助劑。本發(fā)明的試劑盒包含本文所述的構(gòu)建物，也可包括有利于實施本發(fā)明的其它材料，例如但不限于本發(fā)明所用的，和/或構(gòu)建物、系統(tǒng)和含有它們的細(xì)胞所用的裝置。如熟練醫(yī)師所希望的那樣，可以單個包裝和/或包裝在一起的形式提供含有此試劑盒的商品。
一實施例中，此試劑盒在適當(dāng)容器中包含至少一種表達(dá)系統(tǒng)。優(yōu)選此試劑盒含有至少一指示物，例如但不限于可確定此試劑盒的包裝盒或標(biāo)簽、適用于本發(fā)明所述應(yīng)用的條款和/或至少一份關(guān)于此試劑盒使用的說明書，或本發(fā)明所述應(yīng)用的條款。任選項地，至少一份說明書可以是一套關(guān)于此試劑盒使用的或本發(fā)明所述應(yīng)用條款的說明，或關(guān)于此試劑盒使用或關(guān)于實施本發(fā)明的化合物的更大說明書的一部分。更優(yōu)選地通過包裝標(biāo)簽或說明書，此試劑盒標(biāo)明適合用于表達(dá)感興趣的序列。
實施例在以下實施例中將進一步描述本發(fā)明的化合物和方法。這些實施例作用是進一步闡明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明的范圍。
實施例1四環(huán)素基因調(diào)控系統(tǒng)的調(diào)節(jié)圖1顯示本發(fā)明的示范性受調(diào)控的基因表達(dá)系統(tǒng)，其中二個感興趣的編碼序列逆轉(zhuǎn)錄病毒的gag/pol序列和VSV-G包膜蛋白同時受二個其它核酸構(gòu)建物表達(dá)的調(diào)控。可將該系統(tǒng)視為三個核酸構(gòu)建功立業(yè)物的二個系統(tǒng)的組合，兩系統(tǒng)之間共同采用了第一和第二構(gòu)建物。
本發(fā)明的優(yōu)選表達(dá)系統(tǒng)中，缺乏誘導(dǎo)時TRE啟動子(tet操縱子)表達(dá)的tTA允許高的可誘導(dǎo)表達(dá)水平和低基礎(chǔ)性表達(dá)。這是由于TRE啟動子很弱，該啟動子的任何tTA表達(dá)因四環(huán)素與此系統(tǒng)的接觸而完全失活。去除四環(huán)素后正反饋機制強烈誘導(dǎo)了tTA表達(dá)，產(chǎn)生高水平的Tta，其誘導(dǎo)了第二核酸構(gòu)建物的表達(dá)。
圖2顯示前二個構(gòu)建物pTRE-tTASvPuroTKTat和pTRE-Rev(圖1)的結(jié)構(gòu)示意圖。pTRE-tTASvPuroTKTat中，TRE啟動子表達(dá)tTA，HSV TK啟動子表達(dá)Tat，SV40早期啟動子表達(dá)選擇性標(biāo)志嘌呤酶素抗性基因。發(fā)生兩個構(gòu)建物整合入細(xì)胞時，如上所述，細(xì)胞中的Rev表達(dá)處在四環(huán)素控制下。
實施例2構(gòu)建基于HT1080的包裝細(xì)胞系用摩爾比為10∶1的pTRE-tTASvPuroTKTat和pTRE-Rev質(zhì)粒DNA共轉(zhuǎn)染HT1080細(xì)胞。選出培養(yǎng)中嘌呤酶素抗性的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。2-3周后選出單細(xì)胞集落并擴增，用抗Rev抗體作免疫染色篩選。
用四環(huán)素調(diào)控Rev的表達(dá)在存在或缺少四環(huán)素時將陽性克隆之一2A3(1)-2-F7的細(xì)胞培養(yǎng)在4孔小室玻片中48小時。然后因定細(xì)胞并用Rev抗體或抗Tat抗體染色。圖3顯示TRE啟動子的Rev表達(dá)受到四環(huán)素的緊密調(diào)控。存在四環(huán)素時無陽性細(xì)胞，然而在缺少四環(huán)素時用抗Rev抗體幾孚每一個細(xì)胞都染成陽性。因為HSVTK啟動子組成性表達(dá)Tat基因，在存在或缺少四環(huán)素時，幾孚所有的細(xì)胞都被抗Tat抗體染成陽性。這些結(jié)果表明，Rev表達(dá)受四環(huán)素和TRE啟動子表達(dá)的tTA緊密調(diào)控。
實施例3Gag/Pol整合用比例為1∶10的p(SCMV.Neo)和p(U3-1TAR2.GagPolRRE)共轉(zhuǎn)染二個RT1080-TR克隆(被上述pTRE.Rev和pTRE.tTASvPuroTKTat穩(wěn)定轉(zhuǎn)染)，并在開始GagPol整合轉(zhuǎn)染后48小時用新霉素選擇。p(SCNV.Neo)具有在猿CMV啟動子控制下的可選擇性新霉素抗性基因。p(U3-1TAR2.GagPolRRE)具有在HIV-1的修飾U3啟動子(含HIV-2的TAR2序列)控制下的含GagPol編碼序列的RRE。
用p24試驗篩選抗性克隆，選出共40個具有不同p24值的陽性克隆，稱為HT1080-TRGP或預(yù)包裝細(xì)胞系。最好的克隆能產(chǎn)生5000ng/ml以上的p24并且經(jīng)誘導(dǎo)高1000倍以上(見表1)。大部分克隆誘導(dǎo)后產(chǎn)生100-200倍，存在四環(huán)素時p24本底水平低(3-9ng/ml)(表1)。這表明GagPol表達(dá)通過Rev受到四環(huán)素控制。兩個陽性克隆，11-6和12-5的p24值為1072和1854ng/ml，選出用于VSV-G整合。
表1預(yù)包裝細(xì)胞系的p24 ELISA試驗

實施例4VSV-G整合用20μg p(SCMV.VSVGRRE，TK.Hyg)轉(zhuǎn)染二個HT1080-TRGP克隆(上述11-6和12-5)，并在轉(zhuǎn)染開始后48小時用潮霉素選擇。用抗VSVG篩選抗性克隆。原位免疫染色?？偣灿?個克隆為抗VSVG強染色，純度50-90％，命名為HT1080-TRGPG或包裝細(xì)胞系。存在Tc時和親代HT1080細(xì)胞中未見VSVG染色，而陽性克隆的VSVG染色位于胞漿中，無Tc和存在丁酸鈉時也濃集在細(xì)胞表面。此結(jié)果表明VSVG表達(dá)也通過Rev受四環(huán)素控制。
實施例5病毒載體包裝在96孔板中作有限稀釋進一步純化實施例2選出的HT1080-TR克隆。根據(jù)免疫染色選出最終5個克隆，進一步分析共轉(zhuǎn)染的載體產(chǎn)量。將純度90％以上的HT1080-TR克隆接種在6孔板中，細(xì)胞密度為每平皿1×106細(xì)胞，去除四環(huán)素(Tc)和加入2.5mM丁酸鈉24小時后，用pN2CGFP和pCGCRSRRE各5mg轉(zhuǎn)染。pN2CGFP是HIV-1的復(fù)制缺陷型病毒載體，含有5’-LTR表達(dá)的gag-pol基因，RRE后接gag-pol基因和內(nèi)部CMV啟動子表達(dá)的綠色熒光蛋白(GFP)基因。pCGCRSRRE的總體結(jié)構(gòu)見圖2所示，其中″G″指VSV-G蛋白。
轉(zhuǎn)染后，將培養(yǎng)液換成3ml無Tc的無丁酸鈉的培養(yǎng)液48小時后收集上清液用于轉(zhuǎn)導(dǎo)HT11080細(xì)胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)后48小時，用FACS分析轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的GFP表達(dá)。通過GFP表達(dá)細(xì)胞的％確定載體效價。結(jié)果見表2，其中5個最終克隆中克隆2A(1)-2-E5和2A3(2)產(chǎn)生了較高的效價。
表2

所有樣品進行一式二份測定。用所有四種質(zhì)粒同時共轉(zhuǎn)染HT1080對照在細(xì)胞中產(chǎn)生短暫質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。四個HT1080-TR克隆的終點效價順序如下2A3(2)＞2A2(1)-2-E5＞7A2(2))＞2A3(1)-2-F7。如表所示，用HT1080-TR克隆的載體產(chǎn)量比象HT1080對照短暫轉(zhuǎn)染系統(tǒng)為高。在無四環(huán)素的培養(yǎng)液中克隆2A(1)-2-E5和2A3(2)具有10倍誘導(dǎo)能力。
實施例6采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的包裝細(xì)胞的病毒載體產(chǎn)量篩選實施例4包裝細(xì)胞陽性克隆的pNl(cpt)GFP載體moi 70轉(zhuǎn)導(dǎo)的終點效價。存在四環(huán)素時轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。洗去殘留的載體，轉(zhuǎn)導(dǎo)后用無四環(huán)素但含7mM丁酸鈉的新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)。丁酸鈉處理后24、48和72小時收集上清液在HeLa-Tat細(xì)胞中滴定。合并的混合物細(xì)胞平均每個細(xì)胞含10拷貝載體，在12孔板中或T75瓶中48小時收集時產(chǎn)生的終點效價分別為1.4×106TU/ml或4.0×106TU/ml。TU為轉(zhuǎn)化單位。
3天誘導(dǎo)后裂解所有細(xì)胞。存在四環(huán)素時見到低水平(＜1×102TU/ml的載體產(chǎn)量(表3)。至少7周傳代非生產(chǎn)者細(xì)胞維持相同水平的載體產(chǎn)量(表3)。這表明載體產(chǎn)生/載體包裝受到四環(huán)素控制，四環(huán)素先控制tTA表達(dá)，tTA進而控制Rev表達(dá)，Rev進而(并通過RRE序列)控制GagPol和VSV-G蛋白的表達(dá)，后二者是載體包裝所必須的成分。
表3.通過穩(wěn)定包裝細(xì)胞系制造載體

實施例7通過Tat和Rev表達(dá)調(diào)控感興趣的基因我們已證明HIV-1Rev可調(diào)控下游HIV-2RRE(RRE2)之后的HIV-1 gag-pol基因(由CMV啟動子表達(dá))。Chang等(Nucl.Acids Res.20(20)5465-5472，1992)發(fā)現(xiàn)HIV-2TAR(TAR2)置換的含真正TAR(TAR1)元件的嵌合HIV-1LTR可被HIV-1Tat激活。因為只有TAR元件被置換，HIV-1LTR中余下的R和U5仍存在于此嵌合LTR中。本發(fā)明包括只含HIV-1U3和TAR2的嵌合啟動子U3/TAR2(圖4)，它被用來置換在構(gòu)建物pVP1.2RznoG(見圖2)中表達(dá)gag-pol的CMV啟動子，以產(chǎn)生pVP1.2RznoG-U31TAR2(見圖2)。用pN1CGFP和pCGCRSRRE將質(zhì)粒pVP1.2RznoG或pVP1.2RznoG-U31TAR2共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48小時收集上清液在HT1080上滴定。發(fā)現(xiàn)二構(gòu)建物產(chǎn)生等量的包裝載體(pN1CGFP)。pVP1.2RznoG或pVP1.2RznoG-U31TAR2的效價分別是9.0×106和9.2×106TU/ml(其中TU代表轉(zhuǎn)化單位)。此結(jié)果表明該嵌合啟動子可被Tat反式激活而表達(dá)，其水平比得上CMV啟動子。
實施例8Rev表達(dá)調(diào)控了感興趣的基因Hammarskjold等發(fā)現(xiàn)(J，Vir.68(2)951-958，1994)，只有當(dāng)HIV-1env基因(含RRE元件)在一內(nèi)含子中時，其表達(dá)受Rev調(diào)節(jié)。如果env基因表達(dá)為非內(nèi)含子cDNA，env基因表達(dá)不再受Rev調(diào)節(jié)。Chang和Sharp(Cell 59789-95，1989)發(fā)現(xiàn)受Rev調(diào)控的基因表達(dá)依賴于剪接供體信號的強度。如果剪接供體的信號非常強并且RNA非常有效地被剪切，基因表達(dá)可能不受Rev調(diào)控。
制備了一系列VSV-G表達(dá)構(gòu)建物，其中VSV-G cDNA(″基因″)被插入一內(nèi)含子。VSV-G編碼區(qū)(″基因″)的下游是CRE元件和RRE。RRE的3’端含一剪接受體位點(見″Rev-應(yīng)答″，圖5)。將5個不同的剪接供體(SD)信號克隆到VSV-G cDNA之前(見下表4)表4

這樣整個VSV-G，CRS，和RRE區(qū)被表達(dá)為一內(nèi)含子(見圖5，″Rev-應(yīng)答″)。在293T細(xì)胞中測試這5個VSV-G表達(dá)構(gòu)建物以觀察VSV-G表達(dá)是否受Rev調(diào)控。結(jié)果見圖6。用pCMVRev(rev表達(dá)構(gòu)建物)或pCI(不含Rev基因的pCMVRev親代構(gòu)建物，用作陰性對照)將這5個構(gòu)建物共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞中。Western印跡(Fog/6)顯示5個構(gòu)建物的3個轉(zhuǎn)染的那些細(xì)胞中VSV-G表達(dá)受Rev調(diào)節(jié)。
在用pCMVRev和pCGCRSRRE-1M或pCGCRSRRE-H或pCGCRSRRE-1E之一共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中檢測到VSV-G蛋白。然而，在用pCI和pCGCRSRRE-1M或pCGCRSRRE-H或pCGCRSRRE-1E之一共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中未檢測到VSV-G。資料顯示這三個構(gòu)建物的VSV-G表達(dá)受Rev調(diào)控。
用其它兩種構(gòu)建物(pCGCRSRRE-G和pCGCRSRRE-2E)轉(zhuǎn)染的那些細(xì)胞中未檢出VSV-G。pCGCRSRRE-G中的β-球蛋白剪接供體信號與共有序列剪接供體信號相同，pCGCRSRRE-2E中HIV-2env剪接供體信號與共有序列(見上)有一個核苷酸的差異。有可能這些剪接供體信號太強(剪切太有效)而不受Rev調(diào)控。
應(yīng)注意，用pCMVG轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中表勃VSV-G，這種表達(dá)不依賴于rev表達(dá)。在CMV啟動子控制下直接表達(dá)VSV-G蛋白的此構(gòu)建物中無CRE，RRE和剪接信號。
以上證明了三種VSV-G表達(dá)構(gòu)建物的相同性，即它們的VSV-G表達(dá)可能受Rev調(diào)控。
本文所引用的所有參考文獻包括專利、專利申請和出版物其內(nèi)容納入本文參考文獻中，不論先前是否已納入。
現(xiàn)已充分描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會明白，在寬廣范圍的等價參數(shù)、濃度和條件下無須過多實驗即可進行同樣的工作。本申請包括按照本發(fā)明的基本原理的任何變化、用途或改變，包括不背離本文公開內(nèi)容的那些變化，伴隨本發(fā)明屬領(lǐng)域中的已知或慣用性實例，以及可應(yīng)用于本文以上陳述的基本持征。
權(quán)利要求書(按照條約第19條的修改)以下根據(jù)PCT條約第19條的修改是根據(jù)2003年10月27日寄出的上述申請的國際檢索報告(Form PCT/ISA220)做出的。有兩個月的答復(fù)時間，因此，該修改被及時提交且應(yīng)被認(rèn)為此項修改不會產(chǎn)生費用。
權(quán)利要求1-15是待定的。
權(quán)利要求16-21是新增的。
權(quán)利要求1將權(quán)利要求2的內(nèi)容并入以使其更好地包括本發(fā)明實施方案的內(nèi)容。還修改了權(quán)利要求1中的一個錯誤，即原權(quán)利要求第4行遺漏了“酸”一字。從權(quán)利要求2增加的內(nèi)容至少有該申請的圖1支持。
權(quán)利要求7以獨立的形式重新書寫以強調(diào)被要求的主題。新增的權(quán)利要求16-21分別相應(yīng)于權(quán)利要求7、8、5、10、12和15的主題。它們將權(quán)利要求7、8、5、10、12和15的主題與修改后的權(quán)利要求1的范圍相結(jié)合。
因為刪除了權(quán)利要求2故對從屬權(quán)利要求4-6、9、11和12做了修改。
1.一種包裝細(xì)胞，其特征在于，該包裝細(xì)胞含有能調(diào)節(jié)病毒載體包裝所必須的一種或多種病毒基因產(chǎn)物表達(dá)的第一、第二和第三核酸構(gòu)建物，其中，所述第一核酸構(gòu)建物包含調(diào)節(jié)所編碼的第一產(chǎn)物表達(dá)的四環(huán)素調(diào)節(jié)的啟動子/操縱子；所述第一產(chǎn)物能調(diào)控所述第二核酸構(gòu)建物上編碼的第二產(chǎn)物的表達(dá)；和所述第二產(chǎn)物能調(diào)控所述病毒基因產(chǎn)物的表達(dá)，所述病毒基因產(chǎn)物由存在于所述第三核酸構(gòu)建物上的序列編碼。
3.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其中，所述第一產(chǎn)物是四環(huán)素調(diào)節(jié)的啟動子/操縱子的反式激活蛋白，或含有所述反式激活蛋白的融合蛋白。
4.如權(quán)利要求1或3所述的細(xì)胞，其中，所述第二核酸構(gòu)建物含有四環(huán)素調(diào)節(jié)的啟動子/操縱子。
5.如權(quán)利要求1或3所述的細(xì)胞，其中，所述第二產(chǎn)物是rev蛋白。
6.如權(quán)利要求1或3所述的細(xì)胞，其中，所述第三構(gòu)建物含有逆轉(zhuǎn)錄病毒5’LTR衍生的啟動子。
7.一種包裝細(xì)胞，其特征在于，該包裝細(xì)胞含有能調(diào)節(jié)一種或多種病毒包膜蛋白或G蛋白表達(dá)的第一、第二和第三核酸構(gòu)建物，其中，所述第一核酸構(gòu)建物能夠表達(dá)所編碼的第一產(chǎn)物；所述第一產(chǎn)物能調(diào)控所述第二核酸構(gòu)建物上編碼的第二產(chǎn)物的表達(dá)；和所述第二產(chǎn)物能調(diào)控所述病毒包膜蛋白或G蛋白的表達(dá)，所述蛋白由存在于所述第三核酸構(gòu)建物上的序列編碼。
8.如權(quán)利要求7所述的細(xì)胞還包含編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒gag和pol蛋白的另一核酸構(gòu)建物。
9.如權(quán)利要求1或3所述的細(xì)胞，其中，所述第一產(chǎn)物是tat蛋白或含tat蛋白的嵌合蛋白。
10.如權(quán)利要求7所述的細(xì)胞，其中，所述病毒基因產(chǎn)物是G蛋白。
11.如權(quán)利要求1或3所述的細(xì)胞被所述核酸構(gòu)建物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。
12.如權(quán)利要求1或3所述的細(xì)胞，還包含條件復(fù)制型病毒載體，且其中所述細(xì)胞包裝了所述載體。
13.如權(quán)利要求12所述的細(xì)胞，其中，所述載體衍生自HIV-1。
14.如權(quán)利要求13所述的細(xì)胞，其中，所述G蛋白是VSV或Mokola病毒的G蛋白。
15.一種包裝病毒載體的方法，其特征在于，所述方法包括在第一核酸構(gòu)建物能表達(dá)所述第一產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求13所述的細(xì)胞。
16.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其中，所述病毒基因產(chǎn)物是病毒包膜蛋白或G蛋白。
17.如權(quán)利要求16所述的細(xì)胞，還含有編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒gag和pol蛋白的其它核酸構(gòu)建物。
18.如權(quán)利要求16所述的細(xì)胞，其中，所述第二產(chǎn)物是rev蛋白。
19.如權(quán)利要求16所述的細(xì)胞，其中，所述病毒基因產(chǎn)物是G蛋白。
20.如權(quán)利要求16所述的細(xì)胞，還包含條件復(fù)制型病毒載體，且其中所述細(xì)胞包裝了所述載體。
21.一種包裝病毒載體的方法，其特征在于，所述方法包括在第一核酸構(gòu)建物能表達(dá)所述第一產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求20所述的細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.一種包裝細(xì)胞，其特征在于，該包裝細(xì)胞含有能調(diào)節(jié)病毒載體包裝所必須的一種或多種病毒基因產(chǎn)物表達(dá)的第一、第二和第三核酸構(gòu)建物，其中，所述第一核構(gòu)建物能表達(dá)所編碼的第一產(chǎn)物；所述第一產(chǎn)物能調(diào)控所述第二核酸構(gòu)建物上編碼的第二產(chǎn)物的表達(dá)；和所述第二產(chǎn)物能調(diào)控所述病毒基因產(chǎn)物的表達(dá)，所述病毒基因產(chǎn)物由存在于所述第三核酸構(gòu)建物上的序列編碼。
2.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其中，所述第一核酸構(gòu)建物含有四環(huán)素調(diào)節(jié)的啟動子/操縱子。
3.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其中，所述第一產(chǎn)物是四環(huán)素調(diào)節(jié)的啟動子/操縱子的反式激活蛋白，或含有所述反式激活蛋白的融合蛋白。
4.如權(quán)利要求1-3中任何一項所述的細(xì)胞，其中，所述第二核酸構(gòu)建物含有四環(huán)素調(diào)節(jié)的啟動子/操縱子。
5.如權(quán)利要求1-3中任何一項所述的細(xì)胞，其中，所述第二產(chǎn)物是rev蛋白。
6.如權(quán)利要求1-3中任何一項所述的細(xì)胞，其中，所述第三構(gòu)建物含有逆轉(zhuǎn)錄病毒5’LTR衍生的啟動子。
7.如權(quán)利要求1-3中任何一項所述的細(xì)胞，其中，所述病毒基因產(chǎn)物是病毒包膜蛋白或G蛋白。
8.如權(quán)利要求7所述的細(xì)胞還包含編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒gag和pol蛋白的另一核酸構(gòu)建物。
9.如權(quán)利要求1-3中任何一項所述的細(xì)胞，其中，所述第一產(chǎn)物是tat蛋白或含tat蛋白的嵌合蛋白。
10.如權(quán)利要求9所述的細(xì)胞，其中，所述病毒基因產(chǎn)物是G蛋白。
11.如權(quán)利要求1-3中任何一項所述的細(xì)胞被所述核酸構(gòu)建物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。
12.如權(quán)利要求1-3中任何一項所述的細(xì)胞，還包含條件復(fù)制型病毒載體，且其中所述細(xì)胞包裝了所述載體。
13.如權(quán)利要求12所述的細(xì)胞，其中，所述載體衍生自HIV-1。
14.如權(quán)利要求13所述的細(xì)胞，其中，所述G蛋白是VSV或Mokola病毒的G蛋白。
15.一種包裝病毒載體的方法，其特征在于，所述方法包括在第一核酸構(gòu)建物能表達(dá)所述第一產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求13所述的細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供關(guān)于調(diào)控基因表達(dá)的核酸構(gòu)建物、表達(dá)系統(tǒng)和方法。本發(fā)明可用于調(diào)控任何感興趣的編碼序列，包括包裝病毒粒子所必須的病毒組分的編碼序列的表達(dá)。
文檔編號C12N1/21GK1578837SQ02821442
公開日2005年2月9日 申請日期2002年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月30日
發(fā)明者Y·-N·常, Y·倪, B·德羅普里克 申請人:VIRxSYS股份有限公司