專利名稱：叔丁基紫杉烷衍生物的酶促拆分的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于紫杉烷(taxane)衍生物的酶促拆分和從所述紫杉烷衍生物制備口服有效的抗腫瘤化合物的方法。
背景技術(shù)：
紫杉醇(Paclitaxel)是從太平洋紫杉樹(Pacific yew trees)，即短葉紅豆杉(Taxus brevifolia)的樹皮中提取的一種天然產(chǎn)物，是抗癌藥劑紫杉醇(TAXOL)的活性成分。在活體動物模型內(nèi)，它顯示出良好的抗腫瘤活性，并且近期的研究闡明了其獨有的作用模式，其中涉及微管蛋白的異常多聚化作用和有絲分裂的阻斷。它在臨床上被用于對抗多種人類癌癥。從療效和商業(yè)角度看，它都是一種重要的癌藥劑(canceragent)。大量臨床試驗正在進行，以擴展和提高這種藥劑在治療人類增殖疾病中的效用。很多作者都綜述了TAXOL臨床研究結(jié)果。在《腫瘤學(xué)(Oncology)》的1999年第26期(1，增刊2)上，在所載一份腫瘤研討會的完整出版物中，包括了由大量不同作者所著論文的一部非常新近的匯編。其他的例子是在如下所述的文章中，例如由Rowinsky等所著TAXOL一種新研究的抗微管劑，《國家癌癥研究所雜志(J.Natl.Cancer Instl)》，82第1247-1259頁，1990；由Rowinsky和Donehower所著“抗微管劑在癌癥化療中的臨床藥理學(xué)和應(yīng)用”，《藥物學(xué)治療(Pharmac.Ther.)》，5235-84，1991；由Spencer和Faulds所著“紫杉醇，其藥效學(xué)和藥物動力學(xué)性質(zhì)和在癌癥治療中的潛在療效的回顧”，《藥物(drugs)》，48(5)794-847，1994；由K.C.Nicolaou等所著“TAXOL化學(xué)和生物學(xué)”，Angew.Chem.，Int.Ed.Engl.，3315-44，1994；由F.A.Holmes，A.P.Kudelka，J.J.Kavanaugh，M.H.Huber，J.A.Ajani，V.Valero所著、由Gunda I.Georg，Thomas T.Chen，Iwao Ojima，和Dolotrai M.Vyas編輯的書“紫杉烷抗癌藥劑基礎(chǔ)科學(xué)和目前狀況”，1995，美國化學(xué)協(xié)會(American Chemical Society)，華盛頓特區(qū)，31-57；由Susan G Arbuck和Barbara Blaylock所著、由Mathew Suffness編輯的書“TAXOL科學(xué)和應(yīng)用”，1995，CRC出版公司(CRC Press Inc.)，Boca Raton，F(xiàn)lorida，379-416；也包括在本文引用的參考文件中的研究結(jié)果。
也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一種命名為泰索帝(docetaxel)的紫杉醇半合成同型物(analog)具有良好的抗腫瘤活性，是一種可以通過商業(yè)途徑獲得的癌藥劑TAXOTERE的活性成分。參見，刪除了A環(huán)側(cè)鏈取代基和具有可變化C-2構(gòu)型的生物活性紫杉醇類似物(Taxol Analogues)，《醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志(J.Med.Chem.)》，34，第1176-1184頁(1991)；紫杉醇類似物的結(jié)構(gòu)和它們抗有絲分裂活性之間的關(guān)系，《醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志(J.Med.Chem.)》，34，第992-998頁(1991)，引入此處供參考。由Jorge E.Cortes和Richard Pazdur所著的一篇關(guān)于TAXOTERE的臨床活性的綜述已經(jīng)發(fā)表在《臨床腫瘤學(xué)雜志(Joumal of Clinical Oncology)》，1995，13(10)，第2643-2655頁。Paclitaxel和docetaxel的結(jié)構(gòu)如下所示，同時示出屬于此類分子的慣例編號系統(tǒng)；這種編號系統(tǒng)也應(yīng)用在本申請中。
Paclitaxel(TAXOL)R＝苯基；R1＝乙酰基Docetaxel(TAXOTERE)R＝叔丁氧基；R1＝氫在發(fā)明者Samuel Broder，Kenneth L.Duchin和Sami Selim的PCT專利申請WO 98/53811的下列引用語中，以及在該引用語中所引用的參考文獻中，能夠找到大量證據(jù)證明Paclitaxel沒有口服活性。該引用語寫道“口服給藥時，Paclitaxel非常不易吸收(小于1％)；參見Eiseman等，有關(guān)Taxol和Taxus的第二屆NCl研討會(1992年9月)；Suffness等，TAXOL科學(xué)和應(yīng)用(CRC出版社1995)。Eisemann等指出，在口服時，Paclitaxel的生物利用率僅為0％；Suffness等報告Paclitaxel的口服定量給藥(oral dosing)似乎是不可能的，由于口服給藥達到160毫克/公斤/天時沒有證實發(fā)現(xiàn)抗腫瘤活性。而且，沒有開發(fā)出有效的方法，使口服Paclitaxel或者其他口服紫杉烷或表明有抗腫瘤活性的Paclitaxel同型物如docetaxel能夠有效施用(即，增加Paclitaxel口服生物利用率的方法)。由于這個原因，到目前為止，Paclitaxel還沒有能夠?qū)Σ∪丝诜褂?，?dāng)然沒有用于Paclitaxel敏感疾病的病程或治療中?！痹谟蒍.Terwogt等所著的另一篇報告中，發(fā)表在《柳葉刀(theLancet)》，1998年7月25日，第352卷，第285頁，也描述了在鼠類(小鼠)腫瘤模型(sc M109)中，對應(yīng)于高達160毫克/公斤/注射的劑量而沒有任何療效跡象的低生物活性，和Suffness一樣，得出的結(jié)論是進一步增加定量給藥不會產(chǎn)生療效，盡管沒有達到毒性劑量。而且，我們自己在無胸腺小鼠或無胸腺大鼠中異體移植人腫瘤，用口服施用Paclitaxel進行對抗，企圖證實活性的努力到目前沒有成功。
本發(fā)明提供了對同處于審理中的美國專利申請序號09/712,352中所公開的特別有效的水溶性C-4紫杉烷同型物的酶促拆分外消旋混合物，此處將該專利申請引入以供參考，該酶促拆分外消旋混合物具有其有口服活性，因此，在口服之后具有對抗增殖性疾病的功效。與本發(fā)明有關(guān)的一些背景技術(shù)如下所示。
某些在C-4羥基團處有修飾的紫杉烷衍生物在本技術(shù)領(lǐng)域已有描述。
授予Poss等的美國專利號5,808,102，和PCT公開的專利申請?zhí)朩O94/14787中包含了對在C-4位置具有修飾的紫杉烷同型物的描述。
Gunda l.Georg等，在《四面體通訊(Tetrahedron Letters)》，1994，35(48)第8931-8934頁中描述了C-4酯同型物的合成。
S.Chen等，在《有機化學(xué)雜志(Joumal of Organic Chemistry)》1994，59(21)，6156-8中描述了C-4環(huán)丙基酯同型物的合成。
在1998年11月24日頒發(fā)給Chen，Shu-Hui的美國專利號5,840,929中論及C-4甲氧基醚衍生物。
Chen，Shu-Hui。C-4甲基醚Paclitaxel同型物的首次合成和4-脫乙酰-4-甲基醚漿果赤霉素III的非預(yù)期反應(yīng)活性?！端拿骟w通訊(Tetrahedron Letters)》，1996，37(23)，第3935-3938頁。
下面的參考文獻中討論了許多C-4酯或碳酸酯同型物Chen，Shu-Hui；Wei，Jian-Mei；Long，Byron H.；Fairchild，Craig A.；Carboni，Joan；Mamber，Steven W.；Rose，William C.；Johnston，Kathy；Casazza，Anna M.；等。新C-4 paclitaxel(Taxol)同型物有效的抗腫瘤藥劑。Boorg.Med.Chem.Lett.，1995，5(22)，2741-6。
C-4吖丙啶基氨基甲酸酯同型物的制備已經(jīng)被描述在Chen，Shu-Hui，F(xiàn)airchild，Craig；Long，Byron H.新的C-4含氮丙啶(Aziridine-Bearing)的Paclitaxel(Taxol)同型物的合成和生物學(xué)評估?！夺t(yī)學(xué)化學(xué)雜志(J.Med.Chem.)》。1995，38(12)，263-7。
下面論文以C-4同型物的制備說明來描述反應(yīng)或變化一種修飾10-脫乙酰基漿果赤霉素III的C-4位的新方法(A newmethod to modify the C-4 position of 10-deacetylbaccatin III)。Uoto，Kouichi；Takenoshita，Haruhiro；lshyama，Takashi；Terasawa，Hirofumi；Soga，Tsunehiko，《化學(xué)藥理學(xué)報(Chem.Phar.Bull.)》。1997，45(12)，2093-2095。
Samaranayaka，Gamini；Neidigh，Kurt A.；Kiingston，David G.I.；修飾的紫杉醇(Taxols)，8。赤霉素III的脫酰化和再?；??！短烊划a(chǎn)物雜志(J.Nat.Prod.)》，1193，56(6)884-98。
Datta，Apurba；Jayasinghe，Lalith R.；Georg，Gunda I.。4-脫乙?；仙即己?0-乙酰基-4-脫乙?；┧鞯?4-Deacetyltaxol and10-Acetyl-4-deacetyltaxotere)合成和生物學(xué)評估?！夺t(yī)學(xué)化學(xué)雜志(J.Med.Chem.)》。1994，37(24)，4258-60。
盡管存在上述提到的C-4同型物例子或制備它們的方法，但是沒有提供證實有口服效果的C-4同型物的證據(jù)。本發(fā)明提供了一種用于拆分有口服效果的C-4同型物的外消旋混合物的方法。
下面的參考資料描述了用于活性口服紫杉烷的方法或可能的方法。
已經(jīng)報道了在調(diào)節(jié)劑存在時施用紫杉烷的方法，該方法能在口服后增加血漿中紫杉烷的含量Terwogt，Jetske M.Meerum；Beijnen，JosH.；Ten Bokkel Huinink，Wim W.；Rosing，Hilde；Schellens，Jan H.M.。環(huán)孢霉素與Paclitaxel聯(lián)合施用使口服治療成為可能?！读~刀(Lancet)》(1998)，352(9124)，285。
Terwogt，Jetski M.Meerum；Malingre，Mirte M.；Beijnen，Jos H.；Huinink，Wim W.；Ten Bokkel；Rosing，Hilde；Koopman，F(xiàn)ranciska J.；Van Tellingen，Olaf；Swart，Martha；Schellens，Jan H.M.。口服環(huán)孢霉素A與Paclitaxel聯(lián)合施用使口服治療成為可能?！杜R床癌癥研究(Clin.Cancer Res.)》(1990)，5(11)，3379-3384。
Hansel，Steven B.通過與金雞納寧聯(lián)合施用，使紫杉烷能夠口服生物利用的方法。根據(jù)國際申請專利合作條約提出的國際申請WO97/27855，于1997年8月7日公開出版。
Broder，Samuel；Duchin，Kenneth L.；Selim，Sami。用環(huán)孢霉素增強生物有效性、對病人口服紫杉烷的方法和組合物。根據(jù)國際申請專利合作條約提出的國際申請WO 98/53811，于1998年12月3日公開出版。這些報告沒有包括有效抗腫瘤的數(shù)據(jù)，而是根據(jù)血漿中存在紫杉烷推斷它們具有有效抗癌的潛力。
在本技術(shù)領(lǐng)域的先有技術(shù)中，已經(jīng)出現(xiàn)了至少一份有關(guān)藥物前體在臨床前動物模型中的口服活性報告Scola，Pual M；Kadow，John F；Vyas，Dolatrai M.。Paclitaxel藥物前體衍生物的制備。歐洲專利申請EP747385，于1996年12月11日公開出版。有口服療效的藥物前體的口服生物有效性沒有被公開，并且沒有這些化合物作用于人的進一步報告發(fā)表。
最近，一份描述具有抗小鼠腫瘤口服活性的紫杉烷同型物(IDN-5109)的摘要，于1999年，公開在位于Philadelphia的美國癌癥研究者協(xié)會。這份摘要的參考資料是Pratesi G.；Polizzi D.；TotoretoM.；Riva A.；Bombardelli E.；Zunino F；IND5109一種新的口服使用后有效的紫杉烷。美國癌癥研究者協(xié)會會議錄(Proc Am Assoc CancerRes)1999 40摘要1905，國家腫瘤研究所(Istituto Nazionale Tumori)，20133米蘭和Indena SpA，20139，米蘭，意大利。這種化合物的結(jié)構(gòu)與本發(fā)明描述的化合物完全不同。不像本發(fā)明所包含的化合物，IND5109是從14-β羥基漿果赤霉素III衍生而來，并且在C-4位的羥基基團上有一個乙酸根。
為了完整性，列出關(guān)于這種化合物的活性的兩篇參考文獻。
Nicoletti ML，Rossi C，Monardo C，Stura S，Morazzoni P，Bombardelli E，Valoti G，Giavazzi R.Paclitaxel類似物IND5109對具有Paclitaxel不同敏感性的人類卵巢癌異種移植的抗腫瘤效果。美國癌癥研究者協(xié)會會議錄1999 40摘要1910評估+引證(Evals+citations)。
Polizzi，Donatella；Pratesi，Graziella；Tortoreto，Monica；Supino，Rosanna；Riva，Antonella；Bombardelli，Ezio；Zunino，F(xiàn)ranco。一種在一組人類腫瘤異種移植者中具有改善的耐受性和治療活性的新紫杉烷?！栋┌Y研究(Cancer Res.)》。1999，59(5)，1036-1040。
紫杉醇(Paclitaxel)是一種高度依賴于療程的藥物，慣例地延長腫瘤暴露時間有益。這一點與Paclitaxel的作用機制有關(guān)，由于紫杉烷(taxanes)僅僅識別和結(jié)合處于多聚化狀態(tài)的微管蛋白，而微管蛋白多聚化只是在癌細胞周期的一個短暫時間內(nèi)發(fā)生。流行使用的靜脈輸液(1-3小時)是目前易于接受的和有效的，并且避免了需要長期的(＞24小時)連續(xù)療程的常規(guī)使用方法。然而，口服紫杉烷可以提供易于變化的和成本效率性的方式來完成這種長期暴露。最近，臨床效果已經(jīng)證明，采用每星期重復(fù)使用一次的中等劑量(即，除了能耐受的最大劑量)的TAXOL，口服紫杉烷對于這種長期方案是理想的。其他報道的使用紫杉烷的臨床適應(yīng)癥(例如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，多發(fā)性硬化癥)也將得益于口服紫杉烷的有效性。一種能口服施用的、有效的紫杉烷，能提供一種與注射方式不同的誘人的替代方案，與當(dāng)前臨床紫杉烷使用形式不同，并且由于仍然需要研究治療方案的許多途徑，它也提供了一個有潛力的治療優(yōu)勢。
這樣就很清楚，非常需要提供純的、高度拆分形式的紫杉烷，并且與腸胃外施用紫杉醇相比，它具有很好的口服生物利用度和很好的口服功效。
發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供有效方法，用于拆分對映異構(gòu)體混合物，優(yōu)選是外消旋混合物，這些混合物由鑒定出、在制備口服用紫杉烷(taxanes)，例如Taxol中用作中間體的特別有用的化合物組成，也就是用于這些化合物的立體特異性制備。本發(fā)明的另一方面，拆分后的對映異構(gòu)體被用于制備紫杉烷，用于在恒溫動物包括人類中口服使用。
特別地，本發(fā)明提供一種用于拆分包括分子式Ia和Ib的對映異構(gòu)體的混合物的方法，其中，在如下所示的兩個分子式Ia和Ib中，R1都是在相對于叔丁基(t-butyl)基團的順式位置
或者，其中，在兩個分子式IIa和IIb中，R1都是在相對于叔丁基(t-butyl)基團的反式位置 其中R1是-O-C(O)烷基，-O-C(O)芳基，或者-O-C(O)環(huán)烷基；包括如下步驟(a)將羧酸酯水解酶或提供羧酸酯水解酶的微生物與所述混合物接觸，其中所述酶催化所述混合物的立體選擇性水解，從而提供兩種化合物的混合物，其中，在一種化合物中，R1是-O-C(O)烷基，-O-C(O)芳基，或者-O-C(O)環(huán)烷基；和在另一種化合物中，R1是羥基；和(b)回收所述化合物中的一種或者兩種。
發(fā)明詳述本發(fā)明的方法進一步描述如下。
順式對映異構(gòu)體下面一對順式對映異構(gòu)體可以用本發(fā)明的酶催化方法分離
和 即，分子式Ia和Ib的對映異構(gòu)體，其中，在Ia和Ib兩者之中，R1是在相對于叔丁基基團的順式位置。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明的方法，優(yōu)選是拆分順式對映異構(gòu)體混合物。
反式對映異構(gòu)體下面一對反式對映異構(gòu)體可以用本發(fā)明的酶催化方法分離 和 即，分子式IIa和IIb的對映異構(gòu)體，其中，在兩者之中，R1是在相對于叔丁基基團的反式位置。
拆分對映異構(gòu)體混合物的優(yōu)選方法一種混合物，包括分子式Ia和Ib或IIa和IIb的化合物的對映異構(gòu)體混合物，優(yōu)選地通過立體選擇性水解被拆分，在羧酸酯水解酶存在下，優(yōu)選地在來自微生物的羧酸酯水解酶存在下。
如此制備的一對化合物是非對映異構(gòu)體，可以最終被分離而得到光學(xué)活性的，優(yōu)選是光學(xué)純的化合物。優(yōu)選地，光學(xué)純度大于99％，特別是99.5％。
本發(fā)明也提供該混合物的一種化合物，基本上不含有其他異構(gòu)體，這種化合物可以用本發(fā)明的方法制備。
另外，本發(fā)明關(guān)于使用通過上述方法所獲得的中間產(chǎn)物制備精選的紫杉烷化合物的工藝過程。
定義術(shù)語“立體選擇性轉(zhuǎn)化”，用在這里，是指一種對映(異構(gòu))體相對于另外一種對映(異構(gòu))體的優(yōu)先反應(yīng)，即，不對稱的、對映選擇性反應(yīng)。同樣地，術(shù)語“立體選擇性水解”，是指一種對映體相對于另外一種對映體的優(yōu)先水解。
術(shù)語“混合物”，當(dāng)所述術(shù)語在這里是被用于對映異構(gòu)體化合物時，代表含有同等的(消旋的)或不同等量的對映異構(gòu)體的混合物。
術(shù)語“拆分”，用在這里，代表部分拆分，也優(yōu)選地，代表完全拆分。
術(shù)語“非對映異構(gòu)體形式”，用在這里，代表一種化合物的結(jié)構(gòu)，最初它是一對對映異構(gòu)體中的一個，由于其中至少有一個基團被修飾，以致所述化合物不再是原本的那對對映異構(gòu)體中的另一個化合物的鏡像。
術(shù)語“酶催化過程”或“酶促法”，用在這里，代表本發(fā)明運用酶或者微生物的工藝過程或方法。
術(shù)語“烷基(alkyl)”，“烷(alkan)”或“烷(alk)”，單獨地或作為其他基團的部分用在這里，優(yōu)選代表直鏈和支鏈，任意被取代的碳氫化合物，在正鏈(normal chain)中含有1到15個碳原子，優(yōu)選是1到6個碳原子，例如甲基，乙基，丙基，異丙基，丁基，叔丁基，異丁基，戊基，己基，異己基，庚基，4，4-二甲基戊基，辛基，2，2，4-三甲基戊基，壬基，癸基，十一烷基，十二烷基，它們的各種支鏈異構(gòu)體，和類似物。典型的取代基可以包含選自下面所列基團的一個或多個基團鹵(特別是氯)，三鹵甲基，烷氧基(例如，兩個烷氧基取代基形成一個乙縮醛)，芳基例如沒有取代的芳基、烷基-芳基、或鹵芳基，環(huán)烷基例如沒有取代的環(huán)烷基或烷基-環(huán)烷基，羥基或被保護的羥基基團，羧基，烷氧基羰基，烷基酰胺，烷基羰基酰胺，氨基，芳基羰基酰胺，硝基，氰基，硫羥或烷基硫代。特別優(yōu)選的烷基取代基是羥基基團。
術(shù)語“環(huán)烷基”，單獨地或作為其他基團的部分用在這里，優(yōu)選地，代表任意被取代的飽和環(huán)烴基團，含有1到3個環(huán)和3到12個環(huán)上碳原子，優(yōu)選是3到8個環(huán)上碳原子，其包括環(huán)丙基，環(huán)丁基，環(huán)戊基，環(huán)己基，環(huán)庚基，環(huán)辛基，環(huán)癸基，環(huán)十二烷基，和金剛烷基。典型的取代基包括一或多個如上所述的烷基基團，或如上所述的一或多個基團作為烷基取代基。
術(shù)語“芳基”，用在這里，優(yōu)選代表單環(huán)或雙環(huán)的，取代的芳族基，在環(huán)部分中含有6到12個碳原子，例如，沒有被取代的苯基、二苯基、萘基，或用取代基取代了的基團，例如，取代基是烷基，鹵烷基，環(huán)烷烷基，鹵素，烷氧基，鹵烷氧基，羥基，芳基和類似物。
術(shù)語“羥基保護基團”，用在這里，代表有能力保護游離羥基基團的基團，在需要應(yīng)用保護作用的反應(yīng)之后，其可以被移去，而不會干擾分子的其余部分。可以找到用于羥基保護的各種基團和它們的合成方法，例如，在“有機合成中的保護基(Protective Groups in OrganicSynthesis)”中，由T.W.Greene，John Wiley，Sons，1981，或Fiser和Fiser所著，引入此處作為參考。典型的羥基保護基團，包括甲氧基甲基，1-乙氧基乙基，芐氧基甲基，(β-三甲基甲硅烷基乙氧基)甲基，四氫吡喃基，2，2，2-三氯乙氧基-羰基，叔丁基(二苯基)甲硅烷基，三烷基甲硅烷基，三氯甲氧基羰基，和2，2，2-三氯乙氧基甲基。
原材料包括分子式Ia和Ib的化合物的原材料混合物可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備，例如，描述在下述文獻中的方法，歐洲專利申請?zhí)?00,971，引入此處供參考。例如，分子式Ia和Ib的順式-β-內(nèi)酰胺化合物的消旋混合物可以通過形成下式所示亞胺來制備t-butyl-CH＝N-可以通過下式所示醛的反應(yīng)形成t-butyl-CHO然后，這樣制備的亞胺可以與下式所示的酰氯反應(yīng) 其中R1如前面所定義，例如，乙酸基乙酰氯，從而產(chǎn)生分子式Ia和Ib所示的順式-β-內(nèi)酰胺化合物組成的消旋混合物。后面的反應(yīng)可以在溶劑例如亞甲基氯中，在堿例如三乙胺的存在下，在一定溫度例如-20℃進行，隨后加熱到25℃。
如果期望一種不同的內(nèi)酰胺原材料，上述過程可以，依次地，跟隨對所形成的內(nèi)酰胺進行修飾的過程。
除了消旋混合物外，起始混合物可以如此得到，例如，通過將分子式為Ia或Ib的化合物中的一種添加到這些化合物的消旋混合物中。
例如，起始混合物可以含有，分子式為Ia和Ib的化合物的非對映體，盡管在進行本發(fā)明的酶催化拆分法之前分離這種化合物是優(yōu)選的。
酶和微生物在本發(fā)明的方法中應(yīng)用的酶和微生物可以是任何酶和微生物，只要具備催化如本文所述的立體選擇性轉(zhuǎn)化的能力。各種酶，例如，酯酶，脂酶，酰胺酶和?；D(zhuǎn)移酶，不管來源和純度，可以是動物酶或植物酶或它們的混合物的形式，例如，微生物的細胞，破碎的細胞，細胞的提取物，或來源于合成物。
至于微生物的運用，本發(fā)明的方法可以用任何微生物的細胞材料進行，只要該材料具備如本文描述的立體選擇性轉(zhuǎn)化的催化能力。在細胞使用中，可以是完好的濕細胞形式或干細胞，如凍干，噴霧干燥，或加熱干燥的細胞。使用細胞時，也可以是處理過的細胞材料形式，例如，破裂的細胞或細胞提取物。細胞或細胞材料可以是細胞或細胞提取物。細胞或細胞材料可以在游離狀態(tài)下使用，或固定化在支持物上，例如通過物理吸附或包埋。
適合作為催化酶來源的典型微生物屬包括毛霉菌屬(Mucor)，大腸桿菌屬(Escherichia)，葡萄球菌屬(Staphylococcus)，土壤桿菌屬(Agrobacterium)，不動桿菌屬(Actinetobacter)，根霉菌屬(Rhizopus)，曲霉屬(Aspergillus)，諾卡菌屬(Nocardia)，鏈霉菌屬(Streptomyces)，木霉屬(Trichoderma)，念珠菌屬(Candida)，紅酵母屬(Rhodotorula)，球擬酵母菌屬(Torulopsis)，變性桿菌屬(Proteus)，芽孢桿菌屬(Bacillus)，產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)，假單孢菌屬(Psuedomonas)，紅球菌屬(Rhododoccus)，短桿菌屬(Brevibacterium)，地絲菌屬(Geotrichum)，腸桿菌屬(Enterobacter)，色桿菌屬(Chromobacterium)，節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)，細桿菌屬(Microbacterium)，分支桿菌(Mycobacerium)，酵母菌屬(Saccharomyces)，青霉素屬(Penicillium)，甲烷桿菌(Methanobacterium)，葡萄孢屬(Botrytis)，毛殼菌屬(Chaetomium)，蛇孢菌屬(Ophiobolus)，分支孢子菌屬(Cladosporium)，和類似物。遺傳工程宿主細胞的應(yīng)用也在本發(fā)明之中。
適合在本方法中運用的特定微生物包括粘稠色桿菌(Chromobacterium viscosum)，銅綠假單孢菌(Pseudomonasaeuriginosa)例如ATCC 25619，熒光假單孢菌(Pseudomonasfluorescens)，惡臭假單孢菌(Pseudomonas putida)例如ATCC 31303，卵圓形假單孢菌(Pseudomonas ovalis)，大腸桿菌(Escherichia coli)，金色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)，糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenesfaecalis)，灰霉鏈霉菌(Streptomyces griseus)，洋蔥假單孢菌(Pseudomonas cepacia)，皺褶念珠菌(Candida rugosa)例如ATCC14830，念珠菌地絲菌(Geotrichum candidum)例如ATCC 32345，棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus)，紅球菌諾卡菌(Nocardiaerythropolis)，厭氧諾卡菌(Nocardia asteraides)，草分支桿菌(Mycobacterium phlei)，根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium radiobacter)，黑曲菌(Aspergillus niger)，米根霉菌(Rhizopos oryzae)，和類似物。和單個物種使用一樣，兩個或多個微生物物種可以在實施本工藝過程中予以使用。術(shù)語“ATCC”，用在這里，是指美國模式菌種收集中心(American Type Culture Collection)，12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852，的目錄編號。美國模式菌種收集中心為所指微生物的保藏處。
本發(fā)明的拆分方法可以在微生物(后者多種微生物)生長之后進行，也可以在微生物生長的同時進行，對于后者，就是通過原位發(fā)酵和拆分過程進行。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以完成微生物的生長，例如，通過使用含有營養(yǎng)素例如碳源和氮源以及微量元素的適當(dāng)培養(yǎng)基。
用于本發(fā)明的典型的、可通過商業(yè)途徑獲得的酶包括脂酶例如Amano PS-30[洋蔥假單孢菌(Pseudomonas cepacia)]，Amano GC-20[念珠菌地絲菌(Geotrichum candium)]，Amano APF[黑曲霉(Aspergillusniger)]，Amano AK[假單孢菌屬(Pseudomonas sp.)]，熒光假單孢菌(Pseudomonas fluorescens)脂酶[生物催化劑有限責(zé)任公司(Biocatalyst Ltd.)]，Amano脂酶P-30[假單孢菌屬(Pseudomonassp.)]，Amano P[熒光假單孢菌(Pseudomonas fluorescens)]，AmanoAY-30[圓柱狀念珠菌(Candida cylindracea)]，Amano N[雪白根霉菌(Rhizopus niveus)]，Amano R[青霉菌屬(Penicillium sp.)]，Amano FAP[稻屬根霉菌(Rhizopus oryzae)]，Amano AP-12[黑曲霉(Aspergillusniger)]，Amano MAP[曼赫毛霉菌(Mucor meihei)]，Amano GC-4[念珠菌地絲菌(Geotrichum candium)]，Sigma L-0382和L-3126[豬胰脂酸(porcine pancrease)]，Sigma L-3001(麥胚)，Sigma L-1754[圓柱狀念珠菌(Candida cylindracea)]，Sigma L-0763[粘稠色桿菌(Chromobacterium viscosum)]和Sigma K-30[黑曲霉(Aspergillusniger)]。另外，從動物組織得來的典型酶包括，來自豬肝臟的酯酶，來自胰腺的∝-糜蛋白酶和胰酶制劑，例如豬胰脂肪酶(Sigma)。在實施本工藝過程中，和使用一種酶一樣，可以使用兩種或多種酶。
在下面的反應(yīng)方案中，進一步描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。然而，為了清楚，這里的這些反應(yīng)方案描述的是某些順式對映異構(gòu)體混合物的拆分，應(yīng)該理解到的是這些描述出的實施方案一樣適用于本發(fā)明的其他對映異構(gòu)體混合物的拆分。
實施例1來自洋蔥假單孢菌的固定化脂酶PS-30拆分外消旋順式-3-4-叔丁基-3-乙?；灌?2-酮制備一種反應(yīng)混合物，含有10mM磷酸鉀緩沖液3升，90克的外消旋順式-3-4-叔丁基-3-乙?；灌?2-酮，和45克的固定化的洋蔥假單孢菌(Pseudomonas cepacia)脂酶PS-30。在40℃下，以每分鐘攪拌150次，進行反應(yīng)。將反應(yīng)混合物的pH值用25％的氫氧化鈉溶液維持在7.0。4小時后，反應(yīng)產(chǎn)生49％的預(yù)期的手性乙酸酯(理論上，最大產(chǎn)率為50％)且大于99％的超純對映異構(gòu)體。
實施例2來自鐮刀霉菌屬的固定化Pen V酰胺酶拆分外消旋順式-3-4-叔丁基-3-乙?；灌?2-酮制備一種反應(yīng)混合物，含有10mM磷酸鉀緩沖液20毫升，100毫克的外消旋順式-3-4-叔丁基-3-乙?；灌?2-酮，和25毫克的鐮刀霉菌屬(Fusarium Sp.)的固定化的Pen V酰胺酶。在40C下，每分鐘攪拌150次，進行反應(yīng)。將反應(yīng)混合物的pH值用0.1N的氫氧化鈉溶液維持在7.0。在3小時之后，反應(yīng)產(chǎn)生36％的預(yù)期手性乙酸酯(理論上，最大產(chǎn)率為50％)且一種對映異構(gòu)體的超出量大于90％。
實施例3固定化的來自洋蔥假單孢菌的脂酶PS-30和來自鐮刀霉菌屬的Pen V酰胺酶拆分外消旋順式-3-4-叔丁基-3-丙酸基吖啶-2-酮制備一種反應(yīng)混合物，含有10mM的磷酸鉀緩沖液20毫升，100毫克的外消旋順式-3-4-叔丁基-3-丙酸基吖啶-2-酮，和50毫克的洋蔥假單孢菌(Pseudomonas cepacia)的固定化脂酶PS-30。在40℃下，每分鐘攪動150次，進行反應(yīng)。將反應(yīng)混合物的pH值用0.1N的氫氧化鈉維持在7.0。18小時后，反應(yīng)產(chǎn)生48％的預(yù)期的手性丙酸酯(理論上，最大值為50％)和一種超出量大于99％的對映異構(gòu)體。
制備一種反應(yīng)混合物，含有10mM的磷酸鉀緩沖液20毫升，100毫克的外消旋順式-3-4-叔丁基-3-丙酸基吖啶-2-酮，和25毫克的來自鐮刀霉菌屬(Fusarium Sp.)的固定化Pen V酰胺酶。在40℃下，每分鐘攪動150次，進行反應(yīng)。將反應(yīng)混合物的pH值用0.1N的氫氧化鈉維持在7.0。20分鐘后，反應(yīng)產(chǎn)生25％的預(yù)期的手性丙酸酯(理論最大值為50％)和一種超出量大于98％的對映異構(gòu)體。
實施例4洋蔥假單孢菌的固定化脂酶PS-30拆分外消旋順式-3-4-叔丁基-3-己?；灌?2-酮制備一種反應(yīng)混合物，含有10mM的磷酸鉀緩沖液20毫升，100毫克的外消旋順式-3-4-叔丁基-3-己?；灌?2-酮，和50毫克的洋蔥假單孢菌(Pseudomonas cepacia)的固定化脂酶PS-30。在40℃下，每分鐘攪動150次，進行反應(yīng)。將反應(yīng)混合物的pH值用0.1N的氫氧化鈉維持在7.0。30分鐘后，反應(yīng)產(chǎn)生48％的預(yù)期的手性己酰(理論最大值50％)和大于99％的一種對映異構(gòu)體的超出量。
實施例5固定化的來自鐮刀霉菌屬的Pen V酰胺酶拆分外消旋順式-3-4-叔丁基-3-苯乙?；灌?2-酮制備一種反應(yīng)混合物，含有10mM的磷酸鉀緩沖液20毫升，100毫克的外消旋順式-3-4-叔丁基-3-苯乙?；灌?2-酮，和25毫克的固定化的來自鐮刀霉菌屬(Fusarium Sp.)的Pen V酰胺酶。在40℃下，每分鐘攪動150次，進行反應(yīng)。反應(yīng)混合物的pH值用0.1N的氫氧化鈉維持在7.0。18小時后，反應(yīng)產(chǎn)生25％的預(yù)期的手性苯乙酰(理論最大值50％)和對映異構(gòu)體超出量大于99％。
此處公開的旋光活性對映體可以用于生產(chǎn)分子式III所表示的抗腫瘤化合物，或者它們的藥物上可接受的鹽。
其中R1如上所定義；和R2是CHC(O)O-。
特別優(yōu)選的化合物是其中的R1為O-C(O)-叔丁基的化合物。
通式III的化合物對于不正常的細胞增殖發(fā)揮顯著的抑制作用，并有治療特性，這使它可能治療具有與不正常細胞增殖相關(guān)的病理狀況的病人。另外，這類化合物具有顯著的口服生物利用率，因而，在口服用藥后，可以引發(fā)它們積極的治療效應(yīng)。
通過描繪在下面的流程

圖1中的過程，可以生產(chǎn)分子式III所示的化合物。這個方法可以很容易變化，以便用于生產(chǎn)分子式III范圍內(nèi)的化合物，但是這些變化沒有明確地公開。
方法之一，需要的化合物可以通過流程1中圖解所示的一般方法制備。在該流程的步驟(a)中，如前所述，分子式Ia，Ib，IIa或IIb所示的對映異構(gòu)體與分子式IV所示的化合物(漿果赤霉素III衍生物)反應(yīng)。
在該流程1的步驟(a)中，在偶合前，將(C)13-碳上的羥基基團轉(zhuǎn)化為金屬醇鹽是有利的。預(yù)期的金屬醇鹽的組成，通過分子式IV的化合物與強金屬堿反應(yīng)完成，例如，二異丙酰胺鋰，C1-6烷基鋰，雙-(三甲基甲硅烷基)酰胺鋰或鈉或鉀，苯基鋰，氫化鈉，氫化鉀，氫化鋰，或類似的堿。例如，當(dāng)需要醇鋰時，分子式IV的化合物可以，在惰性溶劑如四氫呋喃中，與丁基鋰反應(yīng)。通過Holton的方法，分子式Ia，Ib，IIa或IIb所示的適合化合物與被取代的漿果赤霉素結(jié)合的例子，見U.S.5，175,315；U.S.5,466,834；U.S.5,229,526；U.S.5,274,124；U.S.5,243,045；U.S.5,227,400；U.S.5,336,785；和U.S.5,254,580；U.S.5,294,637；或EP 0 590 267 A2，將其每一個引入此處供參考。
流程1 在此所用，R3和R4是慣用的羥基保護基團，如分子式V中所示和如以前所討論的。慣用的羥基保護基團是可以用于封閉或者保護羥基功能的部分，本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對此很了解。優(yōu)選地，所述基團是可以通過對分子保留部分不會導(dǎo)致能察覺的破壞的方法而被除去的基團。例如，這樣的能容易除去的羥基保護基團包括氯乙?；籽跫谆?，1-甲基-1-甲氧乙基，四氫吡喃基，四氫噻喃基，二烷基甲硅烷基醚例如二甲基甲硅烷基醚，和三烷基甲硅烷基醚例如三甲基甲硅烷基醚、三乙基甲硅烷基醚，和叔丁基二甲基甲硅烷基醚，二烷基烷氧基甲硅烷基醚，如二異丙基甲氧基甲硅烷基醚；2，2，2-三氯乙氧基甲基，2，2，2-三氯乙氧基羰基(或簡化為三氯乙氧基羰基)，苯氧基羰基和類似物。其他可以用的適合的羥基保護基團可以在以前討論過的T.W.Greene中找到，也在Theodora W.Greene和Peter G.M.Wuts所著“有機合成中的保護基團(Protecting Groups in Organic Synthesis)”第三版的第二章中找到(1999，John Wiley & Sons，紐約)，引入此處供參考。分子式IV所示的化合物的常在文獻中采用的保護基團是三烷基甲硅烷基。對R3而言，最優(yōu)選的基團包括1-甲基-1-甲氧乙基(MOP)，三烷基甲硅烷基醚，或二烷基甲硅烷基醚例如二異丙甲氧基甲硅烷基醚。
對R4而言，最優(yōu)選的基團是二烷基烷氧基甲硅烷基醚，例如二異丙甲氧基甲硅烷基醚，但是三烷基甲硅烷基醚，或碳酸鹽，例如苯碳酸鹽也可以是優(yōu)選的。在步驟(b)中，保護基團R3或R4或可能兩者是從分子式V所示的化合物中除去的。如果R3或R4是基于甲硅烷基的保護基團，在四氫呋喃(THF)溶劑中可以有效地被三乙胺、三氫氟化物除去。其他來源的氟化物也可以被利用。例如，四丁氟化銨，氫氟化吡啶鎓，氟化鉀，或氟化銫可以利用。可以利用氟化鉀與絡(luò)合劑如18-冠-6或類似物的結(jié)合，來輔助脫甲硅基作用。在這種條件下，典型使用的是如乙腈這樣的溶劑。其他條件，例如溫和的含水鹽酸或三氟乙酸，和諸如乙腈或四氫呋喃(THF)的共溶劑，可以用于甲硅烷基的脫保護。相同的酸性條件對1-甲基-1-甲氧乙酯(MOP)保護基團的除去也能很好的起作用。
真正使用的條件要根據(jù)對R3或R4所使用的保護基團而確定。例如一個優(yōu)選的路線是對R3采用MOP基團，和對R4采用二異丙甲氧基甲硅烷基醚。在這種情況下，步驟(b)將使用含水鹽酸和一種有機溶劑獲得溫和的酸性環(huán)境(workup)。在步驟(c)中，得到的2’脫保護的化合物將暴露于含氟的物質(zhì)中，例如在四氫呋喃(THF)溶劑中的三乙胺三氫氟化物中，并在色譜法或結(jié)晶學(xué)純化后，產(chǎn)生化合物III。
權(quán)利要求
1.一種方法，用于拆分包含分子式Ia和Ib的對映異構(gòu)體混合物，其中，在兩個分子式Ia和Ib中，R1相對于叔丁基基團是在順式位置 或，其中，在兩個分子式IIa或IIb中，R1是在相對于叔丁基基團的反式位置 其中，R1是-O-C(O)烷基，-O-C(O)芳基，或者-O-C(O)環(huán)烷基；包括的步驟為(a)用羧酸酯水解酶與所述混合物接觸，其中所述酶催化所述混合物的立體選擇性水解，提供兩種化合物的混合物，其中，在一種化合物中，R1是-O-C(O)烷基，-O-C(O)芳基，或者-O-C(O)環(huán)烷基；和在另一個化合物中，R1是羥基；和(b)回收所述化合物中的一種或者兩種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述混合物是在水和/或一種有機醇存在時被拆分的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中R1是-O-C(O)烷基。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中在步驟(a)中所形成的化合物具有下面的結(jié)構(gòu)
5.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中在步驟(a)中形成的化合物具有下面的結(jié)構(gòu)
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述羧酸酯水解酶是從微生物獲得。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述酶是選自酯酶，脂酶，酰胺酶和酰基轉(zhuǎn)移酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述酶是脂酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述酶是選自來自假單孢菌屬(Pseudomonas sp.)的脂酶PS-30，來自洋蔥假單孢菌(Pseudomonascepacia)的脂酶PS-30，來自念珠菌地絲菌(Geotrichum candidum)的脂酶GC-20，來自雪白根霉菌(Rhizopus niveus)的脂酶N，來自黑曲霉(Aspergillus niger)的脂酶APF，來自念珠菌屬(Candida sp.)的脂酶AY-30，假單孢菌屬(Pseudomonas sp.)的脂酶AK，熒光假單孢菌(Pseudomonas fluorescens)和豬胰脂肪酶的脂酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述酶是固定化在支持物上。
11.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述酶是酰胺酶。
12.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述酶是從鐮刀菌屬(Fusariumsp.)獲得的PenV酰胺酶。
13.一種制備分子式III所示化合物的方法， 其中R1是-O-C(O)烷基，-O-C(O)芳基或-O-C(O)環(huán)烷基；和R2是CHC(O)O-，該方法包括將選自分子式Ia，Ib，IIa和IIb所示的一種化合物與分子式IV所示的化合物化合物反應(yīng)， 其中R1是-O-C(O)烷基，-O-C(O)芳基或者-O-C(O)環(huán)烷基； 其中R2是CH3C(O)O-和R4是一個保護基團，和去除R4基團以便形成分子式III所示的化合物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，進一步包括將分子式IV的化合物與用一種強金屬堿反應(yīng)，從而轉(zhuǎn)化C-13羥基基團成為金屬醇鹽。
全文摘要
一種用于拆分由下式[插入化學(xué)結(jié)構(gòu)式]化合物的順或反對映異構(gòu)體組成的混合物的方法，其中R
文檔編號C12P17/02GK1545555SQ02816293
公開日2004年11月10日 申請日期2002年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月21日
發(fā)明者R·N·帕特爾, R N 帕特爾 申請人:百時美施貴寶公司