專利名稱：有效檢測雙鏈核酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測核酸的方法，這種方法可通過使用嵌入劑以高靈敏度檢測雙鏈核酸。
背景技術(shù)：
檢測通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等核酸擴增反應(yīng)而獲得的擴增產(chǎn)物，最通用的方法是將擴增后的溶液進行瓊脂糖凝膠電泳并與溴化乙啶等熒光嵌入劑結(jié)合，然后觀察特征熒光。如果沒有可能被其它DNA污染，只是希望了解是否產(chǎn)生了擴增產(chǎn)物時，則可省略電泳步驟，向擴增反應(yīng)后的溶液中加入熒光嵌入劑來觀測熒光。然而熒光嵌入劑也與引物等單鏈DNA結(jié)合而發(fā)出熒光。檢測到的熒光信號中可能包含顯著性水平的背景干擾。
最近，本發(fā)明作者成功開發(fā)了新的核酸擴增方法-環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)方法(Notomi，T.等.，Nucleic Acids Res.28(12)，e63(2000)，WO00/28082)，它無需PCR方法中不可避免的復(fù)雜的溫度控制。在LMAP方法中，模板多核苷酸的3’末端區(qū)自退火，互補鏈的合成于此開始，同時使用退火的引物與上述合成中形成的環(huán)組合。由此能夠在等溫條件下進行擴增反應(yīng)，顯著提高了核酸擴增的簡便性。
使用熒光嵌入劑對核酸擴增產(chǎn)物進行實時監(jiān)測的過程中，PCR方法中，伴隨溫度循環(huán)，核酸擴增產(chǎn)物由于熱變性而反復(fù)解離和再聚合，熒光強度也隨之會有顯著的變化。而在LAMP方法中，由于在等溫條件下進行反應(yīng)，因而熒光強度并不變化。因而LAMP方法更適合核酸擴增產(chǎn)物的實時監(jiān)測。只是在LAMP方法中所需的引物為PCR方法中約10倍的量。當(dāng)用熒光嵌入劑檢測由LAMP方法獲得的核酸擴增產(chǎn)物時，由同樣存在的單鏈引物引起的背景干擾水平增高。因此難以以高靈敏度只檢測擴增的雙鏈核酸。
本發(fā)明的目的在于提供檢測核酸的方法，所述方法通過降低來自單鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的信號，能夠高靈敏度地使用嵌入劑檢測雙鏈核酸。
為了達到上述目的，本發(fā)明人進行了深入的研究。結(jié)果，通過向含有均與嵌入劑結(jié)合的雙鏈核酸和單鏈核酸的混合物中加入與單鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的反應(yīng)優(yōu)先于雙鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的化合物、或者與單鏈核酸的結(jié)合強度高于嵌入劑但與雙鏈核酸的結(jié)合強度低于嵌入劑的化合物，成功地降低了來自單鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的信號。從而完成了本發(fā)明。
更具體地說，本發(fā)明涉及降低來自單鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的信號的方法，該方法通過將與單鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的反應(yīng)優(yōu)先于雙鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的化合物加入到含有均與嵌入劑(例如溴化乙錠、吖啶橙、TO-PRO-1或YO-PRO-1)結(jié)合的雙鏈和單鏈核酸的混合物中，由此降低來自單鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的信號。與單鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的反應(yīng)優(yōu)先于與雙鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的化合物的例子有氧化劑如次氯酸鈉、過氧化氫或高錳酸鉀，還原劑如硼氫化鈉或氰基硼氫鈉。
本發(fā)明還涉及降低來自單鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的信號的方法，該方法通過將與單鏈核酸的結(jié)合強度高于嵌入劑但與雙鏈核酸的結(jié)合強度低于嵌入劑的化合物加入到含有均與嵌入劑(例如溴化乙錠、吖啶橙、TO-PRO-1或YO-PRO-1)結(jié)合的雙鏈和單鏈核酸的混合物中，由此降低來自單鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的信號。與單鏈核酸的結(jié)合強度高于嵌入劑但與雙鏈核酸的結(jié)合強度低于嵌入劑的化合物的例子有與上述嵌入劑不同的第二嵌入劑(例如亞甲基藍、放線菌素D、SYBR Green II或OliGreen)。
本發(fā)明進一步涉及檢測核酸擴增產(chǎn)物的方法，該方法包含下述步驟(a)通過核酸擴增反應(yīng)來擴增核酸；(b)向核酸擴增反應(yīng)后的反應(yīng)溶液中加入嵌入劑；(c)采用上述任一種方法降低來自單鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的信號；(d)測定反應(yīng)溶液的熒光強度。
本發(fā)明還涉及檢測核酸擴增產(chǎn)物的方法，該方法包含下述步驟(a)在嵌入劑存在下，通過核酸擴增反應(yīng)來擴增核酸；(b)采用上述的任一種方法，降低來自單鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的信號；以及(c)測定反應(yīng)溶液的熒光強度。
本發(fā)明進一步涉及檢測核酸擴增產(chǎn)物的方法，該方法包含下述步驟(a)在嵌入劑和與單鏈核酸的結(jié)合強度高于嵌入劑但與雙鏈核酸的結(jié)合強度低于嵌入劑的化合物存在下，通過核酸擴增反應(yīng)擴增核酸；以及(b)測定反應(yīng)溶液的熒光強度。
上述核酸擴增反應(yīng)可以通過以下步驟進行(a)從目標(biāo)區(qū)3’末端向該多核苷酸鏈3’末端依次選取第1任意序列F1c、第2任意序列F2c和第3任意序列F3c；從目標(biāo)區(qū)5’末端向該多核苷酸鏈5’的末端依次選取第4任意序列R1、第5任意序列R2和第6任意序列R3；(b)制備下述引物包含與F2c互補的序列F2和在F2的5’側(cè)與F1c相同的序列的引物；包含與F3c互補的序列F3的引物；包含與R2相同的序列和在該序列的5’側(cè)與R1互補的序列R1c的引物；包含與R3相同的序列的引物；(c)在鏈置換型聚合酶和上述引物存在下，以上述核苷酸鏈為模板合成DNA。
上述核酸擴增反應(yīng)可通過以下步驟實施(a)從目標(biāo)區(qū)3’末端向該多核苷酸鏈3’末端依次選取第1任意序列F1c和第2任意序列F2c；從目標(biāo)區(qū)5’末端向該多核苷酸鏈的5’末端依次選取第3任意序列R1和第4任意序列R2；(b)制備下述引物包含與F2c互補的序列F2和在F2的5’側(cè)與F1c相同的序列的引物；包含與R2相同的序列和在該序列的5’側(cè)與R1互補的序列R1c的引物；(c)在鏈置換型聚合酶、上述引物和解鏈溫度調(diào)節(jié)劑(例如甜菜堿或三甲胺N-氧化物)存在下，以上述核苷酸鏈為擴增模板合成DNA。
本發(fā)明進一步涉及用于檢測雙鏈核酸的試劑盒，作為組成，所述試劑盒包含嵌入劑(例如溴化乙錠、吖啶橙、TO-PRO-1或YO-PRO-1)、與單鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的反應(yīng)優(yōu)先于雙鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的化合物和/或與單鏈核酸的結(jié)合強度高于嵌入劑但與雙鏈核酸的結(jié)合強度低于嵌入劑的化合物。與單鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的反應(yīng)優(yōu)先于雙鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的化合物的例子有氧化劑如次氯酸鈉、過氧化氫或高錳酸鉀；還原劑如硼氫化鈉或氰基硼氫鈉。與單鏈核酸的結(jié)合強度高于嵌入劑但與雙鏈核酸的結(jié)合強度低于嵌入劑的化合物有與上述嵌入劑不同的第二嵌入劑(例如亞甲基藍、放線菌素D、SYBRGreen 2或OliGreen)。
發(fā)明的公開以下詳細說明本發(fā)明。
本發(fā)明涉及檢測雙鏈核酸的方法，本方法通過向含有均與嵌入劑結(jié)合的雙鏈和單鏈核酸的混合物中添加與單鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的反應(yīng)優(yōu)先于雙鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的化合物、或者與單鏈核酸的結(jié)合強度高于嵌入劑但與雙鏈核酸的結(jié)合強度低于嵌入劑的化合物，降低來自單鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的信號，從而可以以高靈敏度檢測與雙鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的信號。
因此，本方法特別適合在利用單鏈核酸引物的核酸擴增反應(yīng)過程中或擴增后，該反應(yīng)系統(tǒng)中除了擴增的雙鏈核酸外還有顯著量引物存在的情況下，選擇性地檢測擴增產(chǎn)物的場合。
在本發(fā)明中，術(shù)語“嵌入劑”是指插層劑，它是可插入(嵌入)到通過DNA核苷酸配對形成的相鄰平面之間的化合物。術(shù)語“信號”是指作為特定物質(zhì)或條件的標(biāo)志功能的物質(zhì)，例如來自核酸上結(jié)合的嵌入劑的熒光。
1.核酸擴增反應(yīng)本發(fā)明特別用于檢測利用單鏈核酸引物進行核酸擴增反應(yīng)時所得的擴增產(chǎn)物(雙鏈核酸)。核酸擴增反應(yīng)的例子除了聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)外，還有上述LAMP法、鏈置換擴增(SDA)法(特公平7-114718號公報)以及基于核酸序列的擴增反應(yīng)(nucleic acid sequence basedamplification，NASBA)方法(特許第2650159號)。更具體地說，由于在LAMP方法中使用比PCR法更大量的引物，因而擴增反應(yīng)后殘余單鏈引物的量也多。因此本發(fā)明的檢測雙鏈核酸的方法非常適合檢測由LAMP法得到的擴增產(chǎn)物。
在LAMP方法中，核苷酸序列末端形成環(huán)結(jié)構(gòu)進行擴增，在聚合酶作用下從環(huán)結(jié)構(gòu)處開始延伸的同時，在環(huán)內(nèi)的區(qū)雜交的引物一邊通過鏈置換來延伸核酸鏈，一邊將延伸產(chǎn)物解離成單鏈。由此生成的單鏈核酸在其末端具有自我互補區(qū)，因此在其末端形成環(huán)，并開始新的延伸。實際上LAMP方法是在等溫條件下進行的，因此上述反應(yīng)同時、平行進行。LAMP方法的特征除了在等溫條件下進行的鏈置換型反應(yīng)之外，還有擴增產(chǎn)物的量非常大。原因之一是LAMP法不包含使聚合酶失活的熱變性過程。以下對LAMP法進行說明。
(1)LAMP法首先表示LAMP法的概要(

圖1和圖2)。在LAMP法中，首先制備作為擴增目標(biāo)的模板多核苷酸。該模板多核苷酸(DNA或RNA)可以用化學(xué)合成的方法，或者依照傳統(tǒng)的方法從生物材料如組織或細胞中制備。制備該模板多核苷酸，使擴增目標(biāo)區(qū)兩側(cè)(5’側(cè)和3’側(cè))存在適宜長度的序列(稱為“兩側(cè)序列”)(圖1A)。術(shù)語“兩側(cè)序列”是指包含從該目標(biāo)區(qū)的5’末端到該多核苷酸鏈的5’末端的區(qū)的序列，以及包含從該目標(biāo)區(qū)3’末端到該多核苷酸鏈的3’末端的區(qū)的序列(圖1A中兩箭頭(←→)所指示的部分)。在目標(biāo)區(qū)的5’側(cè)和3’側(cè)，兩側(cè)序列的長度為10-1,000個核苷酸，優(yōu)選30-500個核苷酸。
從包含目標(biāo)區(qū)和兩側(cè)序列的模板多核苷酸鏈(圖1A)上的兩側(cè)序列中任意選取預(yù)先確定的區(qū)。具體地說，從目標(biāo)區(qū)3’末端向該多核苷酸鏈的3’末端依次選取第1任意序列F1c、第2任意序列F2c以及第3任意序列F3c(圖1B)。同樣地，從目標(biāo)區(qū)5’末端向該多核苷酸鏈的5’末端依次選取第4任意序列R1、第5任意序列R2和第6任意序列R3(圖1B)。當(dāng)選擇上述任意序列F1c和上述任意序列R1時，F(xiàn)1c和R1之間的距離可以是0個核苷酸，即兩者相鄰。另外也可以選擇為F1c和R1部分重疊的形式。上述第1-第6區(qū)是依照制備的多核苷酸鏈的序列分別而且任意地選取的。優(yōu)選選取的各區(qū)分別含有5-100個核苷酸，更優(yōu)選10-50個核苷酸。通過選擇核苷酸長度，便于下述引物的退火。
如圖2L所示，各任意序列的選取優(yōu)選使LAMP獲得的擴增產(chǎn)物在序列F1c和序列F1、序列R1與序列R1c之間優(yōu)先開始分子內(nèi)退火形成末端環(huán)結(jié)構(gòu)，而不是分子間退火。例如，為了優(yōu)先啟動分子內(nèi)退火，在選取任意序列時考慮序列F1c和序列F2c之間的距離、序列R1和序列R1c之間的距離就非常的重要。更具體地說，優(yōu)選兩個序列的位置距離為0-500個核苷酸，優(yōu)選0-100個核苷酸，最優(yōu)選10-70個核苷酸。這些數(shù)值分別表示不包括序列F1c和F2c及序列R1與R2的核苷酸數(shù)。
接著，設(shè)計并合成被稱為“FA引物”的引物，與F2c退火。術(shù)語“FA引物”是指包含與F2c區(qū)互補的序列F2和與F1c相同的另一個序列(為了方便，也稱為“F1c”)。有關(guān)的例子包括具序列F1c的3’末端與F2的5’側(cè)相連結(jié)構(gòu)的引物(圖1C)。術(shù)語“退火”是指通過沃森-克里克模式的核苷酸配對而形成雙鏈結(jié)構(gòu)的核苷酸鏈。使FA引物與模板多核苷酸鏈上的序列F2c退火后，DNA鏈的合成從FA引物上的F2處開始(圖1D)。隨后，包含與F3c互補的序列F3的引物(以下可稱為“F3引物”)與模板多核苷酸鏈上的序列F3c退火(圖1D)。DNA的鏈置換型合成從退火后的F3引物處開始(圖1E)。當(dāng)多核苷酸與用來合成互補鏈的模板雜交產(chǎn)生雙鏈結(jié)構(gòu)時，一邊將該多核苷酸從模板上分離，一邊從引物處開始合成互補鏈的反應(yīng)，這個過程被稱為“鏈置換型DNA合成”。具體例子包括在合成進行時由FA引物合成的鏈被由上述F3引物合成的鏈置換這一反應(yīng)。也可以說是由FA引物合成的模板多核苷酸鏈的互補鏈可被從上述F3引物處開始延伸的鏈以互補鏈分離的方式置換。
下述(i)和(ii)所示的兩種核苷酸鏈可以通過上述合成反應(yīng)獲得。
(i)包含與模板多核苷酸鏈上的序列“(3’)F3c-F2c-F1c-目標(biāo)區(qū)-R1-R2-R3(5’)”互補的序列“(5’)F3-F2-F1-目標(biāo)區(qū)-R1c-R2c-R3c(3’)”的核苷酸鏈(圖1F)。
(ii)通過置換(分離)方式形成的單鏈的核苷酸鏈，即包含“(5’)F1c-F2-F1-目標(biāo)區(qū)-R1c-R2c-R3c(3’)”的核苷酸鏈，在其5’末端側(cè)具有與F1c相同的序列(圖1G)。
上述(ii)的核苷酸鏈中，F(xiàn)1與F1c是互補的，因此通過F1和F1c之間的鏈內(nèi)氫鍵，兩者雜交，形成發(fā)夾環(huán)(圖1G)。F2包含在這個發(fā)夾環(huán)中。
隨后，被稱為“RA引物”的引物與上述(ii)的核苷酸鏈上的序列R2c退火。在上述RA引物中，與序列R1互補的序列R1c的3’側(cè)與序列R2的5’側(cè)連接。DNA鏈的合成從上述RA引物處開始(圖1H)。當(dāng)由RA引物處開始的延伸DNA的合成達到在F1和F1c之間形成的雙鏈處時，F(xiàn)1c序列被該延伸的DNA以與圖1E所示的置換方式相同的方式置換(圖1I)。然后，包含與序列R3c互補的序列R3的引物(以下也可稱為“R3引物”)與模板多核苷酸鏈上的R3c退火(圖1I)。DNA的鏈置換型合成就從該退火的R3引物處開始(圖2J)。根據(jù)上述合成方式，合成下述(iii)和(iv)兩種核苷酸鏈。
(iii)與序列“(5’)F1c-F2-F1-目標(biāo)區(qū)-R1c-R2c-R3c(3’)”互補的核苷酸鏈“(3’)F1-F2c-F1c-目標(biāo)區(qū)-R1-R2-R3(5’)”(圖2K)。
(iv)在其3’末端側(cè)附近有F1，同時在其5’末端側(cè)附近有R1c的核苷酸鏈“(3’)F1-F2c-F1-目標(biāo)區(qū)-R1-R2-R1c(3’)”(圖2L)。
上述(iv)序列通過在3’側(cè)存在的序列F1與F1c之間以及5’側(cè)存在的序列R1和R1c之間的鏈內(nèi)氫鍵形成發(fā)夾環(huán)(圖2L)。
隨后，在上述(iv)核苷酸鏈中，上述FA引物的F2區(qū)與3’側(cè)發(fā)夾環(huán)部分的F2c退火(圖2M)。DNA鏈的合成通過鏈內(nèi)氫鍵，從退火的F1處開始。在圖1M中，從F1處開始合成的延伸鏈通過打開由R1-R2-R1c形成的發(fā)夾環(huán)而達到5’末端。另一方面，從F2開始的反應(yīng)合成與“F1c-目標(biāo)區(qū)-R1-R2-R1c”構(gòu)成的鏈互補的鏈。在這種情況下，F(xiàn)1以及從F1開始合成的鏈“F1-目標(biāo)區(qū)-R1c-R2c-R1”被從F2開始合成的鏈所置換。這樣就得到了以“-目標(biāo)序列-R1c-R2c-R1”所示的具有單鏈伸出結(jié)構(gòu)的單鏈的雙鏈DNA。所述單鏈伸出結(jié)構(gòu)的部分通過單鏈伸出結(jié)構(gòu)部分(“R1c-R2c-R1”)的R1c和R1之間形成鏈內(nèi)氫鍵，從而形成發(fā)夾環(huán)(圖2N)。該結(jié)構(gòu)部分通過鏈內(nèi)氫鍵從退火的R1處開始合成DNA鏈(圖2N)?；谏鲜龊铣?，得到下述(v)和(vi)兩種核苷酸鏈。
(v)序列“(3’)R1-R2-R1c-目標(biāo)區(qū)-F1-F2-F1c-目標(biāo)區(qū)-R1-R2c-R1c-目標(biāo)區(qū)-F1-F2c-F1c-目標(biāo)區(qū)-R1-R2-R1c(5’)”(圖2O)。
(vi)在3’末端側(cè)附近有F1c、在5’末端側(cè)附近有R1的序列“(3’)F1c-F2-F1-目標(biāo)區(qū)-R1c-R2c-R1(3’)”(圖2P)。
上述(v)與(vi)核苷酸鏈分別通過鏈內(nèi)氫鍵形成發(fā)夾環(huán)，其中(v)具有R2c作為環(huán)部分，(vi)具有F2和R2c作為環(huán)部分。在兩個序列中，上述RA引物與形成發(fā)夾環(huán)的R2c部分退火，即，如(v)和(vi)所述，從該引物處開始DNA合成，進而進行含有目標(biāo)序列的核苷酸鏈(與(vi)所示序列互補的鏈)的合成。該互補鏈與圖2L所示序列相同，因此之后重復(fù)圖2L至圖2P的反應(yīng)。另一方面，從圖1A開始的反應(yīng)也能進行，因此，通過重復(fù)這一系列的合成，多核苷酸鏈的擴增就得以進行。
上述的擴增反應(yīng)是用四種引物來進行的，即FA引物、RA引物、F3引物以及R3引物。另外，僅用FA引物和RA引物兩種引物而不用F3引物和R3引物也可在等溫條件下開始擴增反應(yīng)。在這兩種擴張反應(yīng)中，在反應(yīng)系統(tǒng)中需要有甜菜堿或三甲胺N-氧化物(TMANO)等解鏈溫度(Tm)調(diào)節(jié)劑存在。
(2)反應(yīng)條件在根據(jù)LAMP法的反應(yīng)中，將下述成分加入到模板單鏈核酸中(i)四種寡核苷酸(FA、RA、外部引物F3和外部引物R3)；(ii)DNA聚合酶，用于互補鏈的鏈置換型合成；以及(iii)作為DNA聚合酶底物的核苷酸。
反應(yīng)通過溫育進行，溫育溫度可使構(gòu)成FA或RA的核苷酸序列與互補核苷酸序列之間形成穩(wěn)定的核苷酸配對，且可保持酶活性。溫育溫度為50-75℃，優(yōu)選55-70℃。溫育時間為1分鐘-10小時，優(yōu)選5分鐘-4小時。
在上面介紹的兩種LAMP方法中，所述FA引物和所述RA引物都是指“內(nèi)部引物”，而所述引物F3和所述引物R3都稱為“外部引物”。
從外部引物開始的核苷酸鏈的合成要在從內(nèi)部引物開始的核苷酸鏈合成之后開始。為了滿足這個條件，有使內(nèi)部引物的濃度設(shè)定為比外部引物高的方法。更具體地說，可通過設(shè)定內(nèi)部引物的濃度比外部引物的濃度高2-50倍，優(yōu)選4-25倍。
催化互補鏈的鏈置換型合成的聚合酶(也稱為“鏈置換型聚合酶”)包括Bst DNA聚合酶、Bca(exO-)DNA聚合酶，大腸桿菌DNA聚合酶I的克列諾片段、Vent DNA聚合酶、Vent(ExO-)DNA聚合酶(從VentDNA聚合酶中除去外切核酸酶活性)、Deep Vent DNA聚合酶、Deep Vent(ExO-)DNA聚合酶(從DeepVent DNA聚合酶中除去外切核酸酶活性)、φ29噬菌體DNA聚合酶、MS-2噬菌體DNA聚合酶、Z-Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)以及KOD DNA聚合酶(toyobo Co.，Ltd.)。
反應(yīng)是在例如使酶反應(yīng)有適宜的pH的緩沖劑、保持酶的催化活性或退火所需的鹽、酶保護劑以及根據(jù)需要添加的解鏈溫度(Tm)調(diào)節(jié)劑存在下進行的。緩沖劑例如使用從弱堿性到中性范圍內(nèi)具緩沖作用的Tris-HCl。pH根據(jù)使用的聚合酶調(diào)節(jié)。作為鹽，可適當(dāng)添加MgCl2、KCl、NaCl、(NH4)2SO4等，以保持酶的活性和調(diào)節(jié)核酸的解鏈溫度(Tm)?？墒褂门Ｑ灏椎鞍谆蛱穷愖鳛槊傅谋Ｗo劑。進一步使用甜菜堿(N，N，N-三甲基甘氨酸)、三甲胺N-氧化物(TMANO)、二甲基亞砜(DMSO)或甲酰胺作為解鏈溫度(Tm)調(diào)節(jié)劑。通過使用解鏈溫度(Tm)調(diào)節(jié)劑，上述寡核苷酸的退火可以在限定的溫度條件下調(diào)節(jié)。特別是甜菜堿和三甲胺N-氧化物(TMANO)通過其isostabilization作用可有效提高鏈置換的效率。通過向反應(yīng)溶液中加入0.2-3.0M，優(yōu)選0.5-1.5M左右的甜菜堿，可對本發(fā)明的核酸擴增反應(yīng)起促進作用。因為這些解鏈溫度調(diào)節(jié)劑有降低解鏈溫度的作用，所以，必須考慮其它反應(yīng)條件如鹽濃度和反應(yīng)溫度，依據(jù)經(jīng)驗來確定具適當(dāng)嚴(yán)格性和反應(yīng)性的條件。
2.降低來自單鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的信號的方法下面的方法是降低含有均與嵌入劑結(jié)合的雙鏈和單鏈核酸的混合物中單鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的信號的方法的例子。
(1)添加與單鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的反應(yīng)優(yōu)先于與雙鏈核酸結(jié)合的嵌入劑的化合物的方法(1)-1 氧化劑或還原劑的利用向含有均與嵌入劑結(jié)合的雙鏈和單鏈核酸的混合物中加入與單鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的反應(yīng)優(yōu)先于雙鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的化合物。這樣能降低來自單鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的信號。與單鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的反應(yīng)優(yōu)先于雙鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的化合物的例子有氧化劑或還原劑。具體地說，向添加嵌入劑進行染色的雙鏈核酸和單鏈核酸的混合溶液中進一步加入氧化劑或還原劑，在適當(dāng)?shù)臏囟认卤３诌m當(dāng)長的時間。與雙鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑相比，單鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑優(yōu)先被氧化或還原。這就降低了來自單鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的熒光強度。嵌入劑的例子包括溴化乙錠、吖啶橙、TO-PRO-1和YO-PRO-1等。氧化劑的例子包括次氯酸鈉(NaClO)、過氧化氫(H2O2)和高錳酸鉀(KMnO4)，還原劑的例子包括硼氫化鈉(NaBH4)或氰基硼氫鈉(NaBH3CN)。
當(dāng)用這種方法檢測核酸擴增產(chǎn)物時，熒光強度的測定通常是向核酸擴增反應(yīng)后的反應(yīng)溶液中加入嵌入劑，然后再加入氧化劑或還原劑來進行的。另外也可以向核酸擴增反應(yīng)之前的反應(yīng)溶液中加入嵌入劑，在嵌入劑存在下進行擴增反應(yīng)，在反應(yīng)后加入氧化劑或還原劑，測定熒光強度。
(1)-2 絡(luò)合物形成體化合物的利用可以使用與嵌入劑形成絡(luò)合物的化合物作為與單鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的反應(yīng)優(yōu)先于雙鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的化合物。具體地說，向雙鏈和單鏈核酸的混合溶液中加入嵌入劑和上述絡(luò)合物形成體化合物，在適當(dāng)?shù)臏囟认卤３诌m當(dāng)長的時間。與雙鏈核酸和嵌入劑之間的結(jié)合相比，單鏈核酸和嵌入劑之間弱的結(jié)合優(yōu)先被該絡(luò)合物形成反應(yīng)抑制。這就降低了來自單鏈上結(jié)合的嵌入劑的熒光強度。嵌入劑與絡(luò)合物形成體化合物組合的例子有亞甲基藍(嵌入劑)和酸性橙7(絡(luò)合物形成體化合物)的組合。
當(dāng)用這種方法檢測核酸擴增產(chǎn)物時，熒光強度的測定通常是通過同時或相繼向核酸擴增反應(yīng)后的反應(yīng)溶液中加入嵌入劑和絡(luò)合物形成體化合物來進行。另外也可以向核酸擴增之前的反應(yīng)溶液中加入嵌入劑，擴增在該嵌入劑存在下進行，在反應(yīng)后加入絡(luò)合物形成體化合物，測定熒光強度。
利用形成絡(luò)合物導(dǎo)致的吸收光譜的差別，可以測定吸光度來代替熒光強度。也就是說，由于嵌入劑的吸收光譜與它的絡(luò)合物的吸收光譜不同，因此可只定量檢測沒有形成絡(luò)合物的嵌入劑。
(2)添加與單鏈核酸的結(jié)合強度高于嵌入劑但與雙鏈核酸的結(jié)合強度低于嵌入劑的化合物向含有均與嵌入劑結(jié)合的雙鏈和單鏈核酸的混合物中加入與單鏈核酸的結(jié)合強度高于嵌入劑但與雙鏈核酸的結(jié)合強度低于嵌入劑的化合物。這樣能降低來自單鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的信號。與單鏈核酸的結(jié)合強度高于嵌入劑但與雙鏈核酸的結(jié)合強度低于嵌入劑的化合物的例子有與上述嵌入劑(以下稱為“第一嵌入劑”)不同的第二嵌入劑。向因加入第一嵌入劑而染色的單鏈和雙鏈核酸的混合物中加入與單鏈核酸的結(jié)合強度高于第一嵌入劑但與雙鏈核酸的結(jié)合強度低于第一嵌入劑、與第一嵌入劑不同的第二嵌入劑，在適當(dāng)?shù)臏囟认卤３诌m當(dāng)長的時間。因此，與雙鏈核苷酸上結(jié)合的第一嵌入劑相比，單鏈核酸上結(jié)合的第一嵌入劑優(yōu)先被第二嵌入劑置換。這降低了來自單鏈核酸上結(jié)合的第一嵌入劑的熒光強度。先加入到雙鏈和單鏈核酸混合物中的第一嵌入劑的例子包括溴化乙錠、吖啶橙、TO-PRO-1和YO-PRO-1。為了優(yōu)先置換單鏈核酸上結(jié)合的第一嵌入劑而添加的與第一嵌入劑不同的第二嵌入劑的例子有亞甲基藍、放線菌素D、SYBR Green II和OliGreen。
通過這種方法檢測核酸擴增產(chǎn)物時，熒光強度的測定通常通過向核酸擴增后的反應(yīng)溶液中加入嵌入劑，接著再加入與該嵌入劑不同的第二嵌入劑，檢測熒光強度。另外，也可以向核酸擴增反應(yīng)之前的反應(yīng)溶液中加入嵌入劑，在該嵌入劑存在下進行擴增反應(yīng)，反應(yīng)后再加入與上述嵌入劑不同的第二嵌入劑，檢測熒光強度。其他也可以向核酸擴增反應(yīng)之前的反應(yīng)溶液中預(yù)先加入上述兩種嵌入劑，在這兩種嵌入劑存在下進行擴增反應(yīng)，在反應(yīng)后檢測熒光強度。
3.雙鏈核酸的檢測本發(fā)明中，雙鏈核酸的檢測是在實施上述2的處理后，使用熒光光度計測定與核酸結(jié)合的嵌入劑發(fā)出的熒光來進行。例如，當(dāng)檢測上述1的反應(yīng)得到的擴增產(chǎn)物時，以不加入模板DNA的擴增反應(yīng)系統(tǒng)(對照系統(tǒng)1)或不加入DNA聚合酶的反應(yīng)系統(tǒng)(對照系統(tǒng)2)作為對照。對上述對照系統(tǒng)以及加入模板DNA和DNA聚合酶的通常的擴增反應(yīng)系統(tǒng)(測試系統(tǒng))進行上述2的處理，檢查對照系統(tǒng)與測試系統(tǒng)熒光強度的差異。由此通過反應(yīng)可以確定反應(yīng)溶液中是否生成擴增產(chǎn)物。更具體地說，當(dāng)測試系統(tǒng)的熒光強度比對照系統(tǒng)1或2的熒光強度大時，就可以判定在該測試系統(tǒng)中檢測到了擴增產(chǎn)物。
可用來測定熒光強度的熒光光度計的例子有ABI PRISM 7700序列檢測系統(tǒng)(PE Applied BiOsystems)。當(dāng)檢測熒光強度時，激發(fā)波長和測定波長根據(jù)用于核酸染色的嵌入劑的種類適當(dāng)確定。在本發(fā)明中，對擴增反應(yīng)啟動后的反應(yīng)溶液實施上述2的處理后，并測定其熒光強度隨時間的變化。由此可以監(jiān)測反應(yīng)產(chǎn)物隨反應(yīng)時間的變化情況。
4.用于檢測或監(jiān)測雙鏈核酸的試劑盒根據(jù)上述3的檢測或監(jiān)測核酸擴增產(chǎn)物的方法，可以將所需的試劑進行包裝，作為試劑盒提供。具體的例子包括含有以下組成的試劑盒。
(1)嵌入劑(例如溴化乙錠、吖啶橙、TO-PRO-1和YO-PRO-1)；(2)化合物，其與單鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的反應(yīng)優(yōu)先于雙鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑(例如氧化劑如次氯酸鈉(NaClO)、過氧化氫(H2O2)或高錳酸鉀(KMnO4)；還原劑如硼氫化鈉或氰基硼氫鈉)；以及(3)化合物，其與單鏈核酸的結(jié)合強度高于嵌入劑但與雙鏈核酸的結(jié)合強度低于嵌入劑(例如與先加入到雙鏈和單鏈核酸的混合溶液中的嵌入劑不同的第二嵌入劑如亞甲基藍、放線菌素D、SYBR Green2或OliGreen)。
通過加入如下組成，這種試劑盒也可以用于基于LAMP法的目標(biāo)核酸的擴增和檢測。
(a)當(dāng)從構(gòu)成所檢測的核酸的目標(biāo)區(qū)的3’末端向該多核苷酸鏈的3’末端依次選取第1任意序列F1c、第2任意序列F2c和第3任意序列F3c，從目標(biāo)區(qū)的5’末端向該多核苷酸鏈的5’末端依次選取第4任意序列R1、第5任意序列R2和第6任意序列R3時，包含與上述F2c互補的序列F2和在F2的5’側(cè)與F1c相同的序列的引物、包含與F3c互補的序列F3的引物；包含與R2相同的序列和該序列的5’側(cè)與R1互補的序列R1c的引物；以及包含與上述R3相同的序列的引物；(b)催化互補鏈的鏈置換型合成反應(yīng)的聚合酶；(c)作為互補鏈合成反應(yīng)底物的核苷酸。
上述試劑盒中的這些組成可以根據(jù)所使用的LAMP方法的實施形式變化。具體地說，包含與任意序列F3c互補的序列F3的引物、包含與任意序列R3相同的序列的引物都可以選擇性的從上述組成中去除。這種情況下，優(yōu)選加入解鏈溫度調(diào)節(jié)劑(例如甜菜堿或三甲胺N-氧化物)。還可以選擇性加入為酶反應(yīng)提供適宜條件的緩沖液以及檢測合成反應(yīng)產(chǎn)物所需的試劑。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施形式，可以將一次反應(yīng)所需的試劑以分開的狀態(tài)裝入反應(yīng)容器。
附圖簡述圖1表示LAMP方法擴增的概要。
圖2表示LAMP方法擴增的概要。
圖3表示當(dāng)在溴化乙錠存在下進行LAMP反應(yīng)，然后加入還原劑或氧化劑時各反應(yīng)溶液的熒光強度。
圖4表示當(dāng)在吖啶橙存在下進行LAMP反應(yīng)，然后加入還原劑或氧化劑時各反應(yīng)溶液的熒光強度。
圖5表示除加入溴化乙錠外還加入第二嵌入劑進行LAMP反應(yīng)時各反應(yīng)溶液的熒光強度。
圖6表示向吖啶橙外中加入第二嵌入劑進行LAMP反應(yīng)時各反應(yīng)溶液的熒光強度。
圖7表示除加入YO-PRO-1外還加入亞甲基藍作為第二嵌入劑進行LAMP反應(yīng)時各反應(yīng)溶液的熒光強度。
圖8表示加入亞甲基藍和酸性橙-7進行LAMP反應(yīng)時各反應(yīng)溶液的吸光度。
本說明書包含特愿2001-183716說明書所披露的內(nèi)容的部分或全部，它是本申請的優(yōu)先權(quán)文件。
實施發(fā)明的最佳形式參考下述實施例更具體地說明本發(fā)明，當(dāng)然本發(fā)明的技術(shù)范圍并不局限于這些實施例。
氧化劑或還原劑在使用溴化乙錠檢測LAMP反應(yīng)產(chǎn)物中的效果(1)LAMP方法進行核酸擴增反應(yīng)表1反應(yīng)溶液組成反應(yīng)溶液組成(25μL中)20mM Tris-HCl pH8.810mM KCl10mM(NH4)2SO44mM MgSO40.1％吐溫200.4mM dNTP8U Bst DNA聚合酶(NEB)1.6μM FA引物
1.6μM RA引物0.4μM F3引物0.4μM R3引物作為LAMP反應(yīng)模板，將6×10-20mol前列腺特異性抗原(PSA)DNA加入到上述反應(yīng)溶液中，再加入用于檢測擴增產(chǎn)物的溴化乙錠(EtBr，0.5μ/ml)。然后在65℃擴增30分鐘。如上所述，加入模板DNA的反應(yīng)溶液被確定為陽性反應(yīng)溶液，而沒有加入模板DNA的反應(yīng)溶液作為陰性反應(yīng)溶液。在該擴增反應(yīng)中，模板中包含的如下序列(SEQ ID NO.1)是我們感興趣的多核苷酸。
5′-TGCTTGTGGCCTCTCGTGGCAGGGCAGTCTGCGGCGGTGTTCTGGTGCACCCCCAGTGGGTCCTCACAGCTGCCCACTGCATCAGGAACAAAAGCGTGATCTTGCTGGGTCGGCACAGCCTGTTTCATCCTGAAGACACAGGCCAGGTATTTCAGGTCAGCCACAGCTTCACACACCC-3′(SEQ ID NO1)上述反應(yīng)溶液中的內(nèi)部引物(FA引物和RA引物)和外部引物(F3引物和R3引物)依照SEQ ID NO.1所示核苷酸序列設(shè)計如下。
·FA引物5′-TGTTCCTGATGCAGTGGGCAGCTTTAGTCTGCGGCGGTGTTCTG-3′(SEQ IDNO2)·RA引物5′-TGCTGGGTCGGCACAGCCTGAAGCTGACCTGAAATACCTGGCCTG-3′(SEQID NO3)[外部引物]·F3引物5′-TGCTTGTGGCCTCTCGTG-3′(SEQ ID NO4)·R3引物5′-GGGTGTGTGAAGCTGTG-3′(SEQ ID NO5)
(2)氧化反應(yīng)或還原反應(yīng)將擴增反應(yīng)后的上述陽性和陰性反應(yīng)溶液進行氧化反應(yīng)或還原反應(yīng)。具體地說，氧化反應(yīng)是通過向上述兩種反應(yīng)溶液中加入次氯酸鈉(NaClO)，使其濃度為2.8％，在室溫下保持2小時來進行。還原反應(yīng)是通過向兩種反應(yīng)溶液中加入4mM硼氫化鈉(NaBH4)和0.4mM的氫氧化鈉(NaOH)，在冰上保持10分鐘來進行。反應(yīng)后，用ABI PRISM 7700序列檢測系統(tǒng)(PE Applied BiOsystems)，在488nm激發(fā)波長、605nm測定波長測定各反應(yīng)溶液的熒光強度。
測定結(jié)果見圖3。在反應(yīng)溶液沒有進行氧化或還原反應(yīng)(圖3中EtBr)的情況下，陽性反應(yīng)溶液的熒光強度為3,012，而陰性反應(yīng)溶液為2,695。也就是說，由于雙鏈核酸擴增產(chǎn)物的發(fā)生所引起的熒光強度差為317。與之相對，在反應(yīng)溶液用次氯酸鈉進行氧化反應(yīng)的情況下(圖3中EtBr+NaClO)，陽性反應(yīng)溶液的熒光強度為1,784，而陰性反應(yīng)溶液648。這就是說，由雙鏈核酸擴增產(chǎn)物的發(fā)生所引起的熒光強度差高達1,136。在反應(yīng)溶液用硼氫化鈉進行還原反應(yīng)的情況下(圖3中EtBr+NaBH4)，陽性反應(yīng)溶液的熒光強度為1,051，而陰性反應(yīng)溶液為218，也就是說，由雙鏈核酸擴增產(chǎn)物的發(fā)生所引起的熒光強度差高達833。
由上可知使用溴化乙錠檢測雙鏈核酸擴增產(chǎn)物時，通過氧化或還原溴化乙錠染色的擴增產(chǎn)物可提高檢測靈敏度。
氧化劑或還原劑在使用吖啶橙檢測LAMP反應(yīng)產(chǎn)物中的效果在實施例1的核酸擴增反應(yīng)中，除添加吖啶橙代替溴化乙錠、測定波長改為575nm以外，在與實施例1相同的試驗條件下檢查氧化劑或還原劑在LAMP反應(yīng)產(chǎn)物檢測效率中的效果。測定結(jié)果見圖4。在反應(yīng)溶液沒有進行氧化或還原反應(yīng)的情況下(圖4中AO)，陽性反應(yīng)溶液的熒光強度為7,053，而陰性反應(yīng)溶液為6,155。也就是說，由雙鏈核酸擴增產(chǎn)物的發(fā)生所引起的熒光強度差為898。與之相對，在反應(yīng)溶液用次氯酸鈉進行氧化反應(yīng)的情況下(圖4中AO+NaClO)，陽性反應(yīng)溶液的熒光強度為5,521，而陰性反應(yīng)溶液為201。也就是說，由雙鏈核酸擴增產(chǎn)物的發(fā)生所引起的熒光強度差高達5,320。在反應(yīng)溶液用硼氫化鈉進行還原反應(yīng)的情況下(圖4中AO+NaBH4)，陽性反應(yīng)溶液的熒光強度為6,214，而陰性反應(yīng)溶液為596。也就是說，由雙鏈核酸擴增產(chǎn)物的發(fā)生所引起的熒光強度差高達5,618。
以上可知使用吖啶橙檢測雙鏈核酸擴增產(chǎn)物時，可以通過氧化或還原被吖啶橙染色的擴增產(chǎn)物來提高檢測的靈敏度。
其他嵌入劑在使用溴化乙錠檢測LAMP反應(yīng)產(chǎn)物中的效果LAMP反應(yīng)的條件與實例1中的反應(yīng)條件相同，只是除了添加溴化乙錠外，還加入20μM亞甲基藍、1μg/ml放線菌素D或稀釋100,000倍的SYBR Green 2(Molecular Probes)作為第二嵌入劑。檢查上述各種第二嵌入劑在LAMP反應(yīng)產(chǎn)物檢測效率中的效果。測定結(jié)果見圖5。在反應(yīng)溶液中除溴化乙錠外不添加第二嵌入劑的情況下(圖5中EtBr)，陽性反應(yīng)溶液的熒光強度為3,085，而陰性反應(yīng)溶液為2,701。也就是說，由雙鏈核酸擴增產(chǎn)物的發(fā)生所引起的熒光強度差為384。與之相對，在反應(yīng)溶液中加入了亞甲基藍的情況下(圖5中EtBr+MB)，陽性反應(yīng)溶液的熒光強度為860，而陰性反應(yīng)溶液為116，也就是說，由雙鏈核酸擴增產(chǎn)物的發(fā)生所引起的熒光強度差高達744。在反應(yīng)溶液中加入了放線菌素D的情況下(圖5中EtBr+AD)，陽性反應(yīng)溶液的熒光強度為3,158，而陰性反應(yīng)溶液為2,322，也就是說，由雙鏈核酸擴增產(chǎn)物的發(fā)生所引起的熒光強度差高達836。在反應(yīng)溶液中加入了SYBR Green 2的情況下(圖5中EtBr+SYBR-G)，陽性反應(yīng)溶液的熒光強度為2,822，而陰性反應(yīng)溶液為2,268。也就是說，由雙鏈核酸擴增產(chǎn)物的發(fā)生所引起的熒光強度差高達554。
以上可知用溴化乙錠檢測雙鏈核酸擴增產(chǎn)物時，使LAMP反應(yīng)在第二嵌入劑和溴化乙錠共同存在下進行，可以提高檢測靈敏度。
其他嵌入劑在使用吖啶橙檢測LAMP反應(yīng)產(chǎn)物中的效果LAMP反應(yīng)條件與實施例1的反應(yīng)條件相同，除加入吖啶橙代替溴化乙錠，還加入20μM亞甲基藍、1μg/ml放線菌素D或稀釋100,000倍的SYBR Green 2(Molecular Probes)作為第二嵌入劑，測定波長設(shè)為575nm。檢查各嵌入劑在LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的檢測效率中的效果。結(jié)果見圖6。在反應(yīng)溶液中除吖啶橙外沒有加入第二嵌入劑的情況下(圖6中AO)，陽性反應(yīng)溶液的熒光強度為7,121，而陰性反應(yīng)溶液為6,195。也就是說，由雙鏈核酸擴增產(chǎn)物的發(fā)生所引起的熒光強度差為926。與之相對，在反應(yīng)溶液中加入亞甲基藍的情況下(圖6中AO+MB)，陽性反應(yīng)溶液的熒光強度為3,500，而陰性反應(yīng)溶液為350。也就是說，由雙鏈核酸擴增產(chǎn)物的發(fā)生所引起的熒光強度差高達3,150。在反應(yīng)溶液中加入放線菌素D的情況下(圖6中AO+AD)，陽性反應(yīng)溶液的熒光強度為7,368，而陰性反應(yīng)溶液為4,762。也就是說，由雙鏈核酸擴增產(chǎn)物的發(fā)生所引起的熒光強度差高達2,606。在反應(yīng)溶液中加入SYBRGreen 2的情況下(圖6中AO+SYBR-G)，陽性反應(yīng)溶液的熒光強度為9,435，而陰性反應(yīng)溶液為4,721。也就是說，由雙鏈核酸擴增產(chǎn)物的發(fā)生所引起的熒光強度差高達4,714。
以上可知用吖啶橙檢測雙鏈核酸擴增產(chǎn)物時，使LAMP反應(yīng)在第二嵌入劑和吖啶橙共同存在下進行，可以提高檢測靈敏度。
亞甲基藍在用YO-PRO-1檢測LAMP反應(yīng)產(chǎn)物中的效果除加入1μg/ml YO-PRO-1和10μM亞甲基藍作為第二嵌入劑來代替溴化乙錠外，LAMP反應(yīng)條件與實施例3的反應(yīng)條件相同。檢查亞甲基藍在使用YO-PRO-1檢測LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的效率中的效果。使用20μL擴增后的反應(yīng)溶液和讀板儀(Polarion，Tecan)，以485nm激發(fā)波長、535nm測定波長、25℃下檢測其熒光強度。測定結(jié)果見圖7。
在反應(yīng)溶液中沒有加入亞甲基藍的情況下(圖7中YO-PRO-1)，陽性反應(yīng)溶液的熒光強度為39,194，而陰性反應(yīng)溶液為34,047。也就是說，由雙鏈核酸擴增產(chǎn)物的發(fā)生所引起的熒光強度差為5,147。
與之相對，在反應(yīng)溶液中加入了亞甲基藍的情況下(圖7中YO-PRO-1+MB)，陽性反應(yīng)溶液的熒光強度為33,596，而陰性反應(yīng)溶液為13,592。也就是說，由雙鏈核酸擴增產(chǎn)物的發(fā)生所引起的熒光強度差高達20,004。
以上可知在用YO-PRO-1檢測雙鏈核酸擴增產(chǎn)物時，使LAMP反應(yīng)在第二嵌入劑亞甲基藍與YO-PRO-1同時存在下進行，可以提高檢測靈敏度。
絡(luò)合物形成體化合物在使用亞甲基藍檢測LAMP反應(yīng)產(chǎn)物中的效果將亞甲基藍和酸性橙7在水溶液中混合。形成絡(luò)合物。一形成絡(luò)合物，亞甲基藍和酸性橙7(AdO)的吸收光譜均發(fā)生了變化。因此，通過測定吸收光譜可以確定是否形成了絡(luò)合物。
將500μM亞甲基藍或者亞甲基藍和AdO的混合液(各500μM；亞甲基藍與AdO形成絡(luò)合物)分別加入到LAMP反應(yīng)溶液中，然后與實施例1同樣的方式進行核酸擴增反應(yīng)。用島津UV-2200分光光度計(使用10mm比色皿)、680nm測定波長測定擴增后反應(yīng)溶液的吸光度。測定結(jié)果見圖8。在反應(yīng)溶液中沒有加入AdO的情況下(圖8中MB)，陽性反應(yīng)溶液的吸光度為0.75，而陰性反應(yīng)溶液為0.71。也就是說，由雙鏈核酸擴增產(chǎn)物的發(fā)生所引起的吸光度差為0.04。與之相對，在反應(yīng)溶液中加入了AdO的情況下(圖8中MB+AdO)，陽性反應(yīng)溶液的吸光度為0.46，而陰性反應(yīng)溶液為0.38，也就是說，由雙鏈核酸擴增產(chǎn)物的發(fā)生所引起的吸光度差為0.08。
這表明，AdO可以調(diào)節(jié)亞甲基藍向DNA的插入。更具體地說，由于亞甲基藍插入單鏈DNA的牢固程度較弱，因此被AdO抑制。相反的，亞甲基藍插入雙鏈DNA牢固，因此不能被AdO抑制，因此可認為亞甲基藍從絡(luò)合物中游離出來。
由此可知，嵌入劑與單鏈核酸之間的鍵合可以優(yōu)先被絡(luò)合物形成反應(yīng)抑制，就如通過氧化或還原的方法一樣。因此，可以提高雙鏈核酸擴增產(chǎn)物檢測的靈敏度。
本說明說中援引的所有公開出版物、專利和專利申請都直接作為參考，成為本說明書的一部分。
產(chǎn)業(yè)可利用性本發(fā)明提供有效檢測雙鏈核酸擴增產(chǎn)物的方法。尤其是將本發(fā)明應(yīng)用于通過LAMP法檢測核酸擴增產(chǎn)物時，LAMP法與PCR相比，可通過使用大量的引物，有效降低來自單鏈核酸的背景干擾。
序列表獨立文本SEQ ID NO.1；合成DNASEQ ID NO.2；合成DNASEQ ID NO.3；合成DNASEQ ID NO.4；合成DNASEQ ID NO.5；合成DNA
序列表序列表<110>榮研化學(xué)株式會社(EIKEN KAGAKU KABUSHIKI KAISHA)<120>有效檢測雙鏈核酸的方法<130>PH-1583-PCT<150>JP 2001-183716<151>2001-06-18<160>5<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>178<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>1tgcttgtggc ctctcgtggc agggcagtct gcggcggtgt tctggtgcac ccccagtggg 60tcctcacagc tgcccactgc atcaggaaca aaagcgtgat cttgctgggt cggcacagcc 120tgtttcatcc tgaagacaca ggccaggtat ttcaggtcag ccacagcttc acacaccc178<210>2<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>2tgttcctgat gcagtgggca gctttagtct gcggcggtgt tctg 44<210>3<211>45<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>3tgctgggtcg gcacagcctg aagctgacct gaaatacctg gcctg 45<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>4tgcttgtggc ctctcgtg 18<210>5<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>5gggtgtgtga agctgtg 171/權(quán)利要求
1.一種降低來自單鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的信號的方法，其中是將與單鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的反應(yīng)優(yōu)先于雙鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的化合物加入到均與嵌入劑結(jié)合的雙鏈和單鏈核酸的混合物中，從而降低來自單鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的信號。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述嵌入劑是溴化乙錠、吖啶橙、TO-PRO-1、YO-PRO-1或亞甲基藍中的任一種。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中與單鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的反應(yīng)優(yōu)先于與雙鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的化合物是氧化劑或還原劑。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述氧化劑是次氯酸鈉、過氧化氫或高錳酸鉀中的任意一種。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述還原劑是硼氫化鈉或氰基硼氫鈉。
6.一種降低來自單鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的信號的方法，其中是將與單鏈核酸的結(jié)合強度高于嵌入劑但與雙鏈核酸的結(jié)合強度低于嵌入劑的化合物加入到含有雙鏈和單鏈核酸的混合物中。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述嵌入劑為溴化乙錠、吖啶橙、TO-PRO-1、YO-PRO-1或亞甲基藍中的任一種。
8.權(quán)利要求6或7的方法，其中與單鏈核酸的結(jié)合強度高于嵌入劑但與雙鏈核酸的結(jié)合強度低于嵌入劑的化合物是與上述嵌入劑不同的第二嵌入劑。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述第二嵌入劑是亞甲基藍、放線菌素D、SYBR Green II或OliGreen中的任意一種。
10.一種檢測核酸擴增反應(yīng)產(chǎn)物的方法，該方法包含以下步驟(a)通過核酸擴增反應(yīng)擴增核酸；(b)向核酸擴增反應(yīng)后的反應(yīng)溶液中加入嵌入劑；(c)根據(jù)權(quán)利要求1-9的任一種方法降低來自單鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的信號；以及(d)測定反應(yīng)溶液的熒光強度。
11.一種檢測核酸擴增反應(yīng)產(chǎn)物的方法，該方法包含以下步驟(a)在嵌入劑存在下通過核酸擴增反應(yīng)擴增核酸；(b)根據(jù)權(quán)利要求1-9的任一種方法降低來自單鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的信號；以及(c)測定反應(yīng)溶液的熒光強度。
12.一種檢測核酸擴增反應(yīng)產(chǎn)物的方法，該方法包含以下步驟(a)在嵌入劑以及與單鏈核酸的結(jié)合強度高于嵌入劑但與雙鏈核酸的結(jié)合強度低于嵌入劑的化合物存在下，通過核酸擴增反應(yīng)擴增核酸；以及(b)測定反應(yīng)溶液的熒光強度。
13.權(quán)利要求10-12中任一項的檢測方法，其中所述核酸擴增反應(yīng)通過以下步驟進行(a)從目標(biāo)區(qū)3’末端向該多核苷酸鏈3’末端依次選取第1任意序列F1c、第2任意序列F2c和第3任意序列F3c；從目標(biāo)區(qū)的5’末端向該核苷酸鏈的5’末端依次選取第4任意序列R1、第5任意序列R2和第6任意序列R3；(b)制備下述引物包含與F2c互補的序列F2和在F2的5’側(cè)與F1c相同的序列的引物；包含與F3c互補的序列F3的引物；包含與R2相同的序列和在該序列的5’側(cè)與R1互補的序列R1c的引物；包含與R3相同的序列的引物；以及(c)以上述核苷酸鏈作為模板，在鏈置換型聚合酶和上述引物存在下合成DNA。
14.權(quán)利要求10-12中任一項的檢測方法，其中所述核酸擴增反應(yīng)通過以下步驟進行(a)從目標(biāo)區(qū)3’末端向該多核苷酸鏈3’末端依次選取第1任意序列F1c和第2任意序列F2c；從目標(biāo)區(qū)5’末端向該核苷酸鏈的5’末端依次選取第3任意序列R1和第4任意序列R2；(b)制備下述引物包含與F2c互補的序列F2和在F2的5’側(cè)與F1c相同的序列的引物；包含與R2相同的序列和在該序列的5’側(cè)與R1互補的序列R1c的引物；以及(c)以上述核苷酸鏈作為擴增反應(yīng)模板，在鏈置換型聚合酶、上述引物和解鏈溫度調(diào)節(jié)劑存在下合成DNA。
15.權(quán)利要求14的檢測方法，其中所述解鏈溫度調(diào)節(jié)劑為甜菜堿或三甲胺N-氧化物
16.一種用于檢測雙鏈核酸的試劑盒，該試劑盒包含下述化合物作為組成嵌入劑；與單鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的反應(yīng)優(yōu)先于雙鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的化合物和/或與單鏈核酸的結(jié)合強度高于嵌入劑但與雙鏈核酸的結(jié)合強度低于嵌入劑的化合物。
17.權(quán)利要求16的試劑盒，其中所述嵌入劑是溴化乙錠、吖啶橙、TO-PRO-1或YO-PRO-1中的任意一種。
18.權(quán)利要求17的試劑盒，其中與單鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的反應(yīng)優(yōu)先于雙鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的化合物是氧化劑或還原劑。
19.權(quán)利要求18的試劑盒，其中所述氧化劑是次氯酸鈉、過氧化氫或高錳酸鉀中的任意一種。
20.權(quán)利要求18的試劑盒，其中所述還原劑是硼氫化鈉或氰基硼氫鈉。
21.權(quán)利要求16的試劑盒，其中與單鏈核酸的結(jié)合強度高于嵌入劑但與雙鏈核酸的結(jié)合強度低于嵌入劑的化合物是與上述嵌入劑不同的第二嵌入劑。
22.權(quán)利要求21的試劑盒，其中所述第二嵌入劑是亞甲基藍、放線菌素D、SYBR Green II或OliGreen中的任意一種。
全文摘要
一種有效檢測雙鏈核酸的方法。即降低單鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑發(fā)出的信號的方法，其特征在于包括均與嵌入劑結(jié)合的雙鏈核酸與單鏈核酸的混合物中，加入與單鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑的反應(yīng)優(yōu)先于雙鏈核酸上結(jié)合的嵌入劑、或者與單鏈核酸的結(jié)合強度高于嵌入劑但與雙鏈核酸的結(jié)合強度低于嵌入劑，從而降低單鏈核酸上結(jié)合嵌入劑發(fā)出的信號。
文檔編號C12Q1/68GK1543509SQ0281599
公開日2004年11月3日 申請日期2002年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月18日
發(fā)明者富田憲弘, 森安義 申請人:榮研化學(xué)株式會社