專(zhuān)利名稱(chēng)：用于測(cè)量哺乳動(dòng)物組織絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種用于測(cè)量哺乳動(dòng)物細(xì)胞中絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶表達(dá)水平的方法及其應(yīng)用。更具體地講，本發(fā)明提供一種用于比較性測(cè)量正常哺乳動(dòng)物細(xì)胞和過(guò)度增殖性哺乳動(dòng)物細(xì)胞中絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶表達(dá)水平的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
膜脂組成是不同膜高度特異性的并且取決于細(xì)胞的生理狀態(tài)，因此對(duì)了解這些現(xiàn)象的調(diào)節(jié)是重要的(Merrill，A.H.，Jr.，Characterization of serine palmitoyltransferase activity in Chinese hamsterovary cells(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶活性的表征)，Biochimica et Biophysica Acta，1983；754，284-91)。鞘脂是真核細(xì)胞膜而不是原核細(xì)胞膜的遍在組分。除給細(xì)胞和細(xì)胞器膜提供結(jié)構(gòu)完整性之外，越來(lái)越多的證據(jù)證明鞘脂參與調(diào)節(jié)各種細(xì)胞功能。鞘脂代謝中間體例如鞘氨醇、鞘氨醇-1-磷酸(S-1-P)和神經(jīng)酰胺參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化、衰老性細(xì)胞周期和增殖性細(xì)胞凋亡(D.K.Perry，J.Carton，A.K.Shah，F(xiàn).Meredith，D.J.Jhlinger和Y.A.Hanrun，Serinepalmitoyltransferase regulates de novo ceramide generation duringetoposide-induced apoptosis(絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶在依托泊苷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡期間調(diào)節(jié)從頭神經(jīng)酰胺的產(chǎn)生)，J.Biol.Chem.，2000，275，9078-84)。其它信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能包括抑制細(xì)胞內(nèi)的DAG/PKC途徑、Ca2+活動(dòng)化和K+流入。鞘脂的這些功能和其它功能著重指出鞘脂代謝在生理上重要的現(xiàn)象例如腫瘤抑制、組織發(fā)育、損傷和萎縮中的潛在重要性(有關(guān)綜述參見(jiàn)Y.A.Hannun，Sphingolipid second messengersTumor suppressor lipidsEicosanoids and Other Bioactive Lipids(鞘脂第二信使腫瘤抑制脂質(zhì)類(lèi)花生酸和其它生物活性脂質(zhì))，Cancer，Inflammation and Radiation Injury 1997，2；305-312)。
調(diào)節(jié)鞘脂代謝的酶在保持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)方面是關(guān)鍵性的，并且其活性的破壞可以引起疾病。由于污染串珠鐮孢菌素真菌毒素而抑制神經(jīng)酰胺合酶的動(dòng)物飼料，引起馬腦白質(zhì)軟化和豬肺水腫。通過(guò)HDL降低TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞中的S-1-P產(chǎn)生降低粘著蛋白的表達(dá)，因此增加抵抗動(dòng)脈粥樣硬化的保護(hù)作用。因此，調(diào)節(jié)鞘脂代謝的酶是控制細(xì)胞現(xiàn)象的鞘脂介導(dǎo)的調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵因子。
各種鞘脂的骨架從長(zhǎng)鏈堿基二氫鞘氨醇、鞘氨醇產(chǎn)生，而在酵母中從植物二氫鞘氨醇產(chǎn)生。長(zhǎng)鏈堿基合成的第一個(gè)獨(dú)特關(guān)鍵反應(yīng)涉及通過(guò)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(SPT；棕櫚酰輔酶A；L-絲氨酸C-棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(脫羧作用))使L-絲氨酸與脂肪酸?；o酶A的縮合，產(chǎn)生3-酮二氫鞘氨醇(Merrill，1983)。微粒體膜內(nèi)在蛋白SPT由至少兩種亞基SPT1和SPT2組成。SPT的催化亞基被認(rèn)為是SPT2，而調(diào)節(jié)活性被認(rèn)為是SPT1亞基。在酵母中，LCB活性既需要LCB1亞基又需要LCB2亞基，而Tsc3p對(duì)最佳LCB功能是必不可少的。
由于SPT是從頭鞘脂生物合成中的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)酶，因此預(yù)期SPT活性的改變將會(huì)影響細(xì)胞功能的鞘脂介異的調(diào)節(jié)。在酵母中，SPT與熱和高滲應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。培養(yǎng)的人角質(zhì)細(xì)胞，當(dāng)用UV照射時(shí)，正調(diào)節(jié)SPT活性并且顯示SPT2 mRNA和蛋白質(zhì)水平相應(yīng)增加。SPT活性在細(xì)胞凋亡期間增加并且在用化療藥依托泊苷處理的細(xì)胞中控制從頭神經(jīng)酰胺合成(Perry，2000)。用多球殼菌素抑制SPT活性在豬腎細(xì)胞LLCK-1中逆轉(zhuǎn)神經(jīng)酰胺合酶抑制劑串珠鐮孢菌素的細(xì)胞凋亡和抗增殖作用。
最近，SPT表達(dá)與病理生理病癥密切相關(guān)。諸如血管成形術(shù)的手術(shù)導(dǎo)致血管損傷，并且起始對(duì)該損傷的應(yīng)答—統(tǒng)稱(chēng)為再狹窄的事件的級(jí)聯(lián)。據(jù)報(bào)道氣囊損傷性大鼠頸動(dòng)脈增生性血管平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中SPT1和SPT2兩者的表達(dá)均增加(D.J.Uhlinger，J.M.Carton，D.C.Argentieri，B.P.Damiano和M.R.D′Andrea，IncreasedExpression of Serine Palmitoyltransferase(SPT)in Balloon-injured RatCarotid Artery(氣囊損傷性大鼠頸動(dòng)脈中絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(SPT)的表達(dá)增加)，THromb.Haem.，2001，86，1320-6)。
脂質(zhì)代謝途徑的變化屬于正常細(xì)胞去分化重要過(guò)程。所進(jìn)行的研究已經(jīng)表明，與正常肝細(xì)胞相比，在肝細(xì)胞瘤的細(xì)胞膜中存在較高百分比的鞘脂(Williams RD，Nixon DW，Merrill AH，Jr.，Comparisonof serine palmitoyltransferase in Morris hepatoma 7777 and rat liver(絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶在Morris肝細(xì)胞瘤7777和大鼠肝臟中的比較)，Cancer Research，1984，44(5)，1918-23)。
本發(fā)明的方法證明，SPT在某些腫瘤中惡性腫瘤細(xì)胞周?chē)谂囵B(yǎng)的增殖性成纖維細(xì)胞和宿主“反應(yīng)性”基質(zhì)成纖維細(xì)胞中是高豐度表達(dá)的，這一現(xiàn)象在正常組織的周?chē)|(zhì)成纖維細(xì)胞沒(méi)有觀察到。在許多侵襲性癌中見(jiàn)到突出的基質(zhì)反應(yīng)(結(jié)締組織生成)，提示基質(zhì)細(xì)胞在癌癥發(fā)病機(jī)理方面起作用(M.Gregoire，B.Lieubeau，The role offibroblasts in tumor behavior(成纖維細(xì)胞在腫瘤行為中的作用)，Cancer Metastasis Rev.，1995，14(4)，339-50)。反應(yīng)性成纖維細(xì)胞，也被稱(chēng)為肌成纖維細(xì)胞，通常與起源上皮的不同癌癥相關(guān)并且影響癌細(xì)胞的侵入和轉(zhuǎn)移潛力(M.Gregoire，1995)。本發(fā)明的方法還證明，SPT亞基在若干已建立的人類(lèi)腫瘤細(xì)胞系和原位人類(lèi)惡性腫瘤細(xì)胞中高度表達(dá)。另外，觀察到在增殖性成纖維細(xì)胞和惡性腫瘤細(xì)胞中的SPT亞細(xì)胞定位變化。
目前，核脂質(zhì)代謝在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)中的作用變得顯而易見(jiàn)。已經(jīng)表明二酰甘油激酶一一種參與磷脂代謝的酶定位于細(xì)胞核并且參與核信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。也已經(jīng)表明鞘氨醇激酶(SPHK)在促細(xì)胞分裂刺激24小時(shí)內(nèi)定位于3T3細(xì)胞的細(xì)胞核，并且在所述處理后核SPHK活性增加(Kleuser B.，Maceyka M.，Milstien S.和Spiegel S.，Stimulation ofnuclear sphingosine kinase activity by platelet-derived growth factor(用血小板衍生生長(zhǎng)因子刺激核鞘氨醇激酶活性)，F(xiàn)EBS Lett.，2001，503(1)，85-90)。已經(jīng)表明鞘脂代謝物存在于核制備物中并且在其中有活性，支持鞘脂在介導(dǎo)細(xì)胞核內(nèi)的細(xì)胞活性中起調(diào)節(jié)作用的構(gòu)思。我們的研究工作證明了SPT在增殖性成纖維細(xì)胞和惡性腫瘤細(xì)胞中的核相關(guān)性。這代表參與刺激時(shí)與細(xì)胞核相關(guān)的鞘脂代謝的第二種酶。這些數(shù)據(jù)表明，鞘脂作為除先前報(bào)道的、在胞質(zhì)信號(hào)級(jí)聯(lián)中的活性之外在細(xì)胞核內(nèi)作為信號(hào)分子以及作為胞間信號(hào)分子的作用。
由于SPT活性隨細(xì)胞生理狀態(tài)的變化而改變，因此必須測(cè)定該酶在正常組織中的基礎(chǔ)水平。SPT1亞基和SPT2亞基的分布可以用作細(xì)胞活性的潛在標(biāo)記，其中高水平的所述酶可以反映出代謝活性(例如嗜中性粒細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、神經(jīng)元傳遞、胞吐作用)或細(xì)胞增殖增加。在正常組織和細(xì)胞類(lèi)型中測(cè)定的SPT1和SPT2水平可以隨后用來(lái)分析異常狀態(tài)下的細(xì)胞類(lèi)型。病理生理狀態(tài)下例如癌癥、炎癥(例如潰瘍性結(jié)腸炎、炎性腸綜合征、節(jié)段性回腸炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、中風(fēng)、哮喘)和血管損傷(例如再狹窄)SPT表達(dá)增加的相關(guān)性，使其為激發(fā)性治療靶。因此，SPT的調(diào)節(jié)可以廣泛涉及細(xì)胞反應(yīng)和病理學(xué)，因?yàn)槠渥鳛榇呋手x級(jí)聯(lián)的關(guān)鍵步驟和限速步驟的酶的突出位置所致。
美國(guó)專(zhuān)利6,090,565描述了一種鑒定特殊鞘糖脂種類(lèi)(準(zhǔn)確的說(shuō)是選自N-二十四酰(木素酰)一糖基神經(jīng)酰胺、N-二十四酰(神經(jīng)酰)一糖基神經(jīng)酰胺、N-二十二酰一糖基神經(jīng)酰胺和N-亞麻酰一糖基神經(jīng)酰胺的糖基神經(jīng)酰胺)及其導(dǎo)致增強(qiáng)的抗腫瘤藥化學(xué)敏感性降低的方法，所述鞘糖脂種類(lèi)為某些類(lèi)型的癌細(xì)胞(選自淋巴瘤、黑素瘤、肉瘤、白血病、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、肝細(xì)胞瘤、骨髓瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、間皮瘤或癌)中多藥耐藥性的特征。鑒定方法包括色譜法；使癌細(xì)胞與在免疫學(xué)上與所述鞘糖脂種類(lèi)的表位結(jié)合的抗體或含抗體組分的混合物接觸；或者使癌細(xì)胞與與糖基神經(jīng)酰胺有免疫反應(yīng)的純化抗體接觸。
美國(guó)專(zhuān)利6,190,894描述了一種增強(qiáng)生理活性物質(zhì)穿入用于經(jīng)皮或透皮遞藥的方法和制劑，所述方法包括用上皮屏障破壞量的至少一種選自以下的藥物破壞上皮屏障功能神經(jīng)酰胺合成抑制劑、葡糖基神經(jīng)酰胺合成抑制劑、?；窠?jīng)酰胺合成抑制劑、鞘磷脂合成抑制劑、脂肪酸合成抑制劑、膽固醇合成抑制劑、磷脂和鞘糖脂(包括葡糖基神經(jīng)酰胺、?；窠?jīng)酰胺和鞘磷脂)降解的抑制劑、游離脂肪酸、神經(jīng)酰胺、?；窠?jīng)酰胺、葡糖基神經(jīng)酰胺和鞘磷脂)降解酶的抑制劑或者游離脂肪酸、神經(jīng)酰胺和膽固醇代謝酶的抑制劑和/或刺激劑。
發(fā)明概述在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種用于測(cè)量哺乳動(dòng)物細(xì)胞絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶表達(dá)水平的方法，所述方法包括(a)使絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶特異性化合物與一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞接觸，以形成大量的化合物-絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物；且(b)通過(guò)檢測(cè)存在的所述復(fù)合物，測(cè)量由所述細(xì)胞表達(dá)的絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶水平。
在第二個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種用于測(cè)量哺乳動(dòng)物細(xì)胞絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的方法，所述方法包括(a)使絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶特異性化合物與以基礎(chǔ)水平表達(dá)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的第一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞接觸，以形成第一種大量的化合物-絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物；(b)使絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶特異性化合物與過(guò)度增殖性地表達(dá)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的第二種哺乳動(dòng)物細(xì)胞接觸，以形成第二種大量的化合物-絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物；(c)通過(guò)檢測(cè)所述第一種和第二種大量復(fù)合物的存在，測(cè)定由所述第一種和第二種細(xì)胞表達(dá)的絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶水平；且(d)測(cè)量所述第一種和第二種細(xì)胞表達(dá)的絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶水平差異。
所測(cè)得的所述第一種和第二種細(xì)胞表達(dá)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的水平差異用來(lái)例如檢測(cè)或診斷癌癥、診斷癌癥的轉(zhuǎn)移潛力、監(jiān)測(cè)癌癥的預(yù)后和進(jìn)程、或者監(jiān)測(cè)癌癥治療的治療功效。所述癌癥包括但不限于乳腺癌、結(jié)腸癌、類(lèi)癌瘤、胃癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝細(xì)胞瘤、平滑肌肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、間皮瘤、骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、甲狀腺癌、腎細(xì)胞癌、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、未分化癌和白血病。
所測(cè)得的所述第一種和第二種細(xì)胞表達(dá)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的水平差異也可以用來(lái)檢測(cè)或診斷包括但不限于再狹窄在內(nèi)的血管損傷的存在。
所測(cè)得的所述第一種和第二種細(xì)胞表達(dá)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的水平差異還用來(lái)檢測(cè)或診斷包括但不限于由以下疾病引起的炎癥在內(nèi)的炎癥的存在潰瘍性結(jié)腸炎、炎性腸綜合征、節(jié)段性回腸炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、中風(fēng)或哮喘。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法提供一種用于對(duì)組織進(jìn)行體內(nèi)成象的方法，所述方法包括(a)給予哺乳動(dòng)物一種絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶特異性化合物，其中所述化合物包含一個(gè)可檢測(cè)標(biāo)記，并且其中所述化合物與過(guò)度增殖性地表達(dá)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的哺乳動(dòng)物細(xì)胞結(jié)合；且(b)通過(guò)對(duì)所述可檢測(cè)標(biāo)記進(jìn)行成象，確定在所述哺乳動(dòng)物組織內(nèi)的細(xì)胞位置。
在再一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種用于篩選抑制絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的治療上有效的化合物的方法，所述方法包括(a)使絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶特異性化合物與過(guò)度增殖性地表達(dá)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的第一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞接觸，以形成第一種大量的化合物-絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物；(b)使一種潛在的絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑化合物與過(guò)度增殖性地表達(dá)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的第二種哺乳動(dòng)物細(xì)胞接觸，以形成第二種大量的化合物-絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物；(c)通過(guò)檢測(cè)所述第一種和第二種大量的化合物-絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的存在，測(cè)定由所述第一種和第二種細(xì)胞表達(dá)的絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶水平；且(d)測(cè)量所述第一種和第二種細(xì)胞表達(dá)的絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶水平差異，以確定所述潛在抑制劑化合物是否抑制絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶表達(dá)。
本發(fā)明包括的絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶特異性化合物包括但不限于與絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)合的化合物、與絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)合的單特異性抗體或與絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶mRNA雜交的核酸。
表達(dá)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括但不限于腎上腺細(xì)胞、腦細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、結(jié)腸細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、心臟細(xì)胞、免疫細(xì)胞、腎細(xì)胞、肝細(xì)胞、肺細(xì)胞、卵巢細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、前列腺細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、脾細(xì)胞、胃細(xì)胞、睪丸細(xì)胞、甲狀腺細(xì)胞、子宮細(xì)胞或血管細(xì)胞。優(yōu)選的表達(dá)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的上皮細(xì)胞包括但不限于內(nèi)皮細(xì)胞、非神經(jīng)膠質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞、結(jié)腸細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、腎近端小管細(xì)胞、前列腺平滑肌、子宮平滑肌或睪丸平滑肌。優(yōu)選的表達(dá)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的免疫細(xì)胞包括多形核白細(xì)胞(PMN)、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、上皮樣細(xì)胞、巨細(xì)胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、枯否氏細(xì)胞或塵細(xì)胞。
以基礎(chǔ)水平表達(dá)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括但不限于腎上腺細(xì)胞(皮質(zhì)、髓質(zhì)(嗜鉻性))、腦細(xì)胞(神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突細(xì)胞或浦肯野細(xì)胞)、乳腺細(xì)胞(上皮)、結(jié)腸細(xì)胞(上皮、粘膜巨噬細(xì)胞或平滑肌)、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、心臟細(xì)胞(心肌細(xì)胞或肌內(nèi)膜)、免疫細(xì)胞、腎細(xì)胞(腎小球內(nèi)皮細(xì)胞或上皮(遠(yuǎn)端小管或近端小管))、肝細(xì)胞(肝細(xì)胞或內(nèi)皮)、肺細(xì)胞(上皮、內(nèi)皮或巨噬細(xì)胞(塵細(xì)胞))、卵巢細(xì)胞(上皮、皮層基質(zhì)或肌成纖維細(xì)胞)、胰細(xì)胞(胰島或腺泡細(xì)胞)、前列腺細(xì)胞(上皮或平滑肌)、皮膚細(xì)胞(表皮或真皮)、脾細(xì)胞(竇樣內(nèi)皮、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或PMN)、胃細(xì)胞(上皮、粘膜巨噬細(xì)胞或平滑肌)、睪丸細(xì)胞(生精上皮、支持細(xì)胞或萊迪希氏細(xì)胞)、甲狀腺細(xì)胞(上皮)、子宮細(xì)胞(上皮或子宮肌膜)或血管細(xì)胞(內(nèi)皮或平滑肌)。
過(guò)度增殖性地表達(dá)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括但不限于上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、癌細(xì)胞(選自乳腺癌、結(jié)腸癌、類(lèi)癌瘤、胃癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝細(xì)胞瘤、平滑肌肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、間皮瘤、骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、甲狀腺癌、腎細(xì)胞癌、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、未分化癌或白血病)、免疫細(xì)胞或腫瘤微環(huán)境內(nèi)的細(xì)胞。
本發(fā)明方法的再一實(shí)施方案包括一種用于治療其需要患者的絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)性疾病的方法，所述方法包括將治療有效量的一種絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑化合物的藥用制劑給予所述患者；其中任選所述絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑化合物有細(xì)胞毒性。優(yōu)選的絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑化合物包括但不限于絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶特異性化合物。在本發(fā)明該方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將所述藥用制劑涂在氣囊導(dǎo)管或支架上并讓其以時(shí)間依賴(lài)性方式釋放。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示免疫印跡分析的結(jié)果，用于評(píng)價(jià)針對(duì)人SPT1和SPT2產(chǎn)生的肽特異性多克隆抗體的特異性。
圖2顯示正常人腦組織中的SPT表達(dá)(放大600倍)。
圖3顯示正常人結(jié)腸組織中的SPT表達(dá)(放大600倍)。
圖4顯示正常人腎上腺組織中的SPT表達(dá)(放大600倍)。
圖5顯示正常人腎臟組織中的SPT表達(dá)(放大600倍)。
圖6顯示正常人子宮組織中的SPT表達(dá)(放大600倍)。
圖7顯示SPT1和SPT2分別與正常人結(jié)腸組織中的拓?fù)洚悩?gòu)酶的共表達(dá)(放大600倍)。
圖8顯示分會(huì)合成纖維細(xì)胞中的SPT1和SPT2表達(dá)(放大300倍，圖8A和圖8B；放大600倍，圖8C和圖8D)。
圖9顯示休眠成纖維細(xì)胞和創(chuàng)傷成纖維細(xì)胞中的SPT1和SPT2表達(dá)(放大300倍，圖9A-9F；放大600倍，圖9G-9L)。
圖10顯示成纖維細(xì)胞的雙重染色(IF:IF)(放大1500倍)。
圖11顯示人類(lèi)腫瘤細(xì)胞系中的SPT表達(dá)(放大900倍)。
圖12顯示人類(lèi)惡性結(jié)腸癌組織、未分化癌組織、甲狀腺癌組織和肉瘤組織中的SPT表達(dá)(放大600倍)。
圖13顯示14天內(nèi)的大鼠氣囊血管成形術(shù)模型血管損傷的表征。
圖14顯示血管成形術(shù)后1天、3天、7天和3個(gè)月的血管損傷反應(yīng)的時(shí)程。
圖15顯示肌成纖維細(xì)胞在對(duì)所述血管成形術(shù)應(yīng)答時(shí)在血管外膜和基質(zhì)重建模時(shí)的去分化和增殖。
圖16顯示炎性結(jié)腸中的活化巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。
圖17顯示從頭鞘脂合成途徑。
發(fā)明詳述如上所述，以基礎(chǔ)水平表達(dá)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括但不限于腎上腺細(xì)胞(髓質(zhì)(嗜鉻性))、腦細(xì)胞(神經(jīng)元或浦肯野細(xì)胞)、乳腺細(xì)胞(上皮)、結(jié)腸細(xì)胞(上皮、粘膜巨噬細(xì)胞或平滑肌)、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、心臟細(xì)胞(肌內(nèi)膜)、免疫細(xì)胞、腎細(xì)胞(腎小球內(nèi)皮細(xì)胞或上皮(近端小管))、肝細(xì)胞(內(nèi)皮)、肺細(xì)胞(上皮、內(nèi)皮或巨噬細(xì)胞(塵細(xì)胞))、卵巢細(xì)胞(皮層基質(zhì)或肌成纖維細(xì)胞)、胰細(xì)胞(腺泡細(xì)胞)、前列腺細(xì)胞(上皮或平滑肌)、皮膚細(xì)胞(表皮)、脾細(xì)胞(竇樣內(nèi)皮、巨噬細(xì)胞或PMN)、胃細(xì)胞(上皮、粘膜巨噬細(xì)胞或平滑肌)、睪丸細(xì)胞(生精上皮、支持細(xì)胞或萊迪希氏細(xì)胞)、甲狀腺細(xì)胞(上皮)、子宮細(xì)胞(上皮或子宮肌膜)或血管細(xì)胞(內(nèi)皮或平滑肌)。
以基礎(chǔ)水平表達(dá)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括腎上腺細(xì)胞(髓質(zhì)(嗜鉻性))、腦細(xì)胞(神經(jīng)元或浦肯野細(xì)胞)、乳腺細(xì)胞(上皮)、結(jié)腸細(xì)胞(上皮、粘膜巨噬細(xì)胞或平滑肌)、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、腎細(xì)胞(腎小球內(nèi)皮細(xì)胞或上皮(近端小管))、肝細(xì)胞(內(nèi)皮)、肺細(xì)胞(上皮、內(nèi)皮或巨噬細(xì)胞(塵細(xì)胞))、卵巢細(xì)胞(皮層基質(zhì)或肌成纖維細(xì)胞)、胰細(xì)胞(腺泡細(xì)胞)、前列腺細(xì)胞(上皮或平滑肌)、脾細(xì)胞(竇樣內(nèi)皮、巨噬細(xì)胞或PMN)、胃細(xì)胞(上皮、粘膜巨噬細(xì)胞或平滑肌)、睪丸細(xì)胞(萊迪希氏細(xì)胞)、甲狀腺細(xì)胞(上皮)、子宮細(xì)胞(上皮或子宮肌膜)或血管細(xì)胞(內(nèi)皮或平滑肌)。
以基礎(chǔ)水平表達(dá)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的更優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括腎上腺細(xì)胞(髓質(zhì)(嗜鉻性))、腦細(xì)胞(神經(jīng)元)、結(jié)腸細(xì)胞(粘膜巨噬細(xì)胞)、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、腎細(xì)胞(上皮(近端小管))、肺細(xì)胞(巨噬細(xì)胞(塵細(xì)胞))、卵巢細(xì)胞(皮層基質(zhì))、脾細(xì)胞(竇樣內(nèi)皮)或胃細(xì)胞(上皮或粘膜巨噬細(xì)胞)。
再如上所述，過(guò)度增殖性地表達(dá)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括但不限于上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、癌細(xì)胞(選自乳腺癌、結(jié)腸癌、類(lèi)癌瘤、胃癌、平滑肌肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、甲狀腺癌、腎細(xì)胞癌、肉瘤、未分化癌或白血病)、免疫細(xì)胞或腫瘤微環(huán)境內(nèi)的細(xì)胞。
過(guò)度增殖性地表達(dá)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、癌細(xì)胞(選自乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、平滑肌肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、甲狀腺癌、腎細(xì)胞癌、肉瘤、未分化癌或白血病)、免疫細(xì)胞或腫瘤微環(huán)境內(nèi)的細(xì)胞。
過(guò)度增殖性地表達(dá)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的更優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、癌細(xì)胞(選自乳腺癌、結(jié)腸癌、平滑肌肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、甲狀腺癌、肉瘤或未分化癌)、免疫細(xì)胞或腫瘤微環(huán)境內(nèi)的細(xì)胞。
特別優(yōu)選的過(guò)度增殖性地表達(dá)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的上皮細(xì)胞包括內(nèi)皮細(xì)胞、非神經(jīng)膠質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞、結(jié)腸細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、腎近端小管細(xì)胞、前列腺平滑肌、子宮平滑肌或睪丸平滑肌。
關(guān)于過(guò)度增殖性地表達(dá)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的免疫細(xì)胞，優(yōu)選的細(xì)胞包括PMN、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、上皮樣細(xì)胞、巨細(xì)胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、枯否氏細(xì)胞或塵細(xì)胞。
優(yōu)選的過(guò)度增殖性地表達(dá)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的腫瘤微環(huán)境內(nèi)的細(xì)胞包括基質(zhì)成纖維細(xì)胞、基質(zhì)單核細(xì)胞或肌成纖維細(xì)胞。
如上所述，優(yōu)選的絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶特異性化合物包括任選用細(xì)胞毒性劑標(biāo)記的單特異性抗體或任選與絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶mRNA雜交的核酸。
本發(fā)明首次提供所述絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶在某些組織疾病狀態(tài)下被正調(diào)節(jié)的證據(jù)。具體地說(shuō)，構(gòu)成SPT酶的SPT1(一種登記號(hào)為NP006406的多肽)和SPT2(或者稱(chēng)為ICB2，一種登記號(hào)為NP004854的多肽)兩種蛋白亞基在發(fā)生細(xì)胞過(guò)度增殖的疾病狀態(tài)下被正調(diào)節(jié)或者在非調(diào)節(jié)性過(guò)量表達(dá)SPT1或SPT2的細(xì)胞中被正調(diào)節(jié)(因而進(jìn)一步使細(xì)胞過(guò)度增殖)。
因此，檢測(cè)細(xì)胞中SPT1或SPT2的存在并測(cè)量SPT1或SPT2的量或者檢測(cè)體內(nèi)SPT1或SPT2的存在提供一種用于診斷或監(jiān)測(cè)疾病狀態(tài)的方法，所述疾病狀態(tài)包括但不限于癌癥和腫瘤轉(zhuǎn)移、炎癥或血管損傷(如再狹窄)。因此，抑制SPT1或SPT2的正調(diào)節(jié)或非調(diào)節(jié)性過(guò)量表達(dá)提供一種用于治療由SPT1或SPT2表達(dá)介導(dǎo)的疾病狀態(tài)的方法。
在所述癌癥相關(guān)疾病中的許多疾病的特征為絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的過(guò)量表達(dá)，如在過(guò)度增殖性上皮細(xì)胞、過(guò)度增殖性間充質(zhì)細(xì)胞、某些免疫細(xì)胞或腫瘤微環(huán)境細(xì)胞中。
其中SPT1和/或SPT2以高于正常細(xì)胞中的量表達(dá)的特定過(guò)度增殖性上皮細(xì)胞包括但不限于內(nèi)皮細(xì)胞、非神經(jīng)膠質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞、結(jié)腸細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、腎近端小管或前列腺、子宮或睪丸的平滑肌。
其中SPT1和/或SPT2以高于正常細(xì)胞中的量表達(dá)的特定過(guò)度增殖性間充質(zhì)細(xì)胞包括但不限于肉瘤癌細(xì)胞。
表達(dá)升高量的絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的特定免疫細(xì)胞包括但不限于PMN、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和特化巨噬細(xì)胞例如上皮樣細(xì)胞、巨細(xì)胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、枯否氏細(xì)胞或塵細(xì)胞。
其它非常接近過(guò)度增殖性地表達(dá)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)移性腫瘤微環(huán)境內(nèi)的細(xì)胞包括但不限于基質(zhì)成纖維細(xì)胞、基質(zhì)單核細(xì)胞或肌成纖維細(xì)胞。
使用本發(fā)明描述的方法或者通過(guò)本領(lǐng)域熟知的其它方法，可以檢測(cè)其它過(guò)度增殖性地表達(dá)SPT1和/或SPT2的過(guò)度增殖性上皮細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞(meschymal)或免疫細(xì)胞。
術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞”是指適合于所述檢測(cè)方法靈敏度的至少一種細(xì)胞，但包括多種細(xì)胞或某部分細(xì)胞。適合于本發(fā)明的細(xì)胞可以作為分離的、純化的細(xì)胞群體存在或者作為機(jī)體構(gòu)造組織活組織檢查的一部分存在。細(xì)胞部分可以是獨(dú)立部分，例如活組織檢查的組織切片細(xì)胞部分。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“正調(diào)節(jié)”或“過(guò)度增殖性地表達(dá)”是指，與參比樣品相比，在靶組織中可以檢測(cè)到較高量的SPT1或SPT2基因產(chǎn)物。本文所用的“參比樣品”是指證明無(wú)可檢測(cè)疾病的樣品，可以包括例如得自組織檔案的保藏的組織切片。具體地說(shuō)，參比樣品可以是檔案樣品，其中SPT的量用來(lái)確定疾病狀態(tài)的進(jìn)程。樣品可以是含有絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞碎片，或者樣品可以是較大組成的組分，例如活組織檢查的組織切片，其中目標(biāo)細(xì)胞可能屬于不同細(xì)胞類(lèi)型視野中的一種或多種細(xì)胞亞型。
短語(yǔ)“絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶特異性化合物”是指例如與絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)合的親和力是與其它蛋白質(zhì)或核酸結(jié)合的親和力的20倍或20倍以上的合成或天然氨基酸多肽、蛋白質(zhì)、合成有機(jī)小分子或脫氧核糖核酸或核糖核酸序列。例如但不限于針對(duì)所述絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶蛋白或其肽片段產(chǎn)生的多克隆抗體或單克隆抗體(包括經(jīng)典或噬菌體展示抗體)或者與絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶mRNA雜交的核酸適合用于本發(fā)明。
對(duì)于本發(fā)明實(shí)施方案的蛋白質(zhì)測(cè)量和體內(nèi)成象，化合物可以是通過(guò)直接檢測(cè)方法或者是通過(guò)間接檢測(cè)方法例如通過(guò)第二標(biāo)記化合物檢測(cè)的標(biāo)記化合物。對(duì)于涉及治療SPT介導(dǎo)疾病的方法，所述SPT特異性化合物可以是抑制劑、反義核苷酸或用細(xì)胞毒性劑標(biāo)記的化合物。小分子抑制劑是已知的并且一般基于與絲氨酸或鞘氨醇的結(jié)構(gòu)同源性。
絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑化合物的實(shí)例包括但不限于多球殼菌素(CAS注冊(cè)號(hào)為35891-70-4)、3-氯-D-丙氨酸(CAS注冊(cè)號(hào)為39217-38-4)、L-環(huán)絲氨酸(CAS注冊(cè)號(hào)為339-72-0)和D-絲氨酸(312-84-5)。用測(cè)量絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶酶活性的方法發(fā)現(xiàn)了多種新型抑制劑。用細(xì)胞毒性劑標(biāo)記的化合物包括例如用細(xì)胞毒性劑標(biāo)記且與絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶有免疫學(xué)反應(yīng)的抗體。用細(xì)胞毒性劑標(biāo)記抗體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。
短語(yǔ)“標(biāo)記化合物”是指能夠測(cè)量的部分，包括放射性原子、酶、熒光分子或替代標(biāo)記例如生物素。用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)，將蛋白質(zhì)、肽、糖和核酸與可檢測(cè)標(biāo)記綴合，描述于例如G.T.Hermanson的Bioconjugate Techniques，Academic Press出版社，1996。在本發(fā)明中可用作標(biāo)記的具體放射性同位素是3H、125I、131I、35S、32P、33P、212-Bi、90Y、88Y、99Tc、67Cu、18Re、186Re、66Ga、67Ga、111In、114mIn、115In或10B及本領(lǐng)域已知的其它放射性同位素。通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法，例如酪氨酸殘基的碘化、絲氨酸或蘇氨酸殘基的磷酸化或者利用放射性氨基酸前體加入氚、碳或硫，可以在多肽中引入放射性同位素。利用在多肽上交聯(lián)金屬螯合部分的雙功能螯合劑引入其它放射性原子。適合用于本發(fā)明的酶的具體實(shí)例是辣根過(guò)氧化物酶、堿基磷酸酶或熒光素酶?？蓹z測(cè)標(biāo)記的優(yōu)選實(shí)例是切割底物以產(chǎn)生顯色產(chǎn)物或發(fā)光產(chǎn)物的酶。可用于本發(fā)明方法的熒光分子的具體實(shí)例包括但不限于香豆素、呫噸染料諸如熒光素、對(duì)甲氨基酚和羅丹明、試鹵靈、花青染料bimanes、吖啶、異吲哚、丹酰染料、氨基鄰苯二甲酰肼諸如魯米諾和異魯米諾衍生物、氨基鄰苯二甲酰亞胺、氨基萘二甲酰亞胺、氨基苯并呋喃、氨基喹啉、dicanohydroquinones以及銪和鋱絡(luò)合物和相關(guān)化合物。通過(guò)觀察放射性原子或熒光(flourogenic)分子的存在，或者通過(guò)觀察顯色底物或發(fā)光底物的酶活性，進(jìn)行直接測(cè)量。通過(guò)將包括標(biāo)記在內(nèi)的額外化合物加入到試驗(yàn)樣品中以便其可以與結(jié)合所述試驗(yàn)樣品的化合物相互作用，進(jìn)行間接測(cè)量。眾所周知的實(shí)例是當(dāng)所述標(biāo)記化合物包含生物素而第二化合物包含抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白和可檢測(cè)標(biāo)記時(shí)。眾所周知第二個(gè)實(shí)例是當(dāng)?shù)谝豢贵w用來(lái)與所述絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶蛋白結(jié)合并且用包含一種可檢測(cè)標(biāo)記的第二抗抗體進(jìn)行檢測(cè)。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及用于測(cè)量細(xì)胞過(guò)度增殖性地表達(dá)的SPT1或SPT2的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞與一種絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶特異性化合物接觸，并且測(cè)量或檢測(cè)作為所述SPT結(jié)合化合物的結(jié)果形成的絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-化合物復(fù)合物。通過(guò)將所述細(xì)胞中絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的量的變化與參比樣品進(jìn)行比較，可以進(jìn)一步定義絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的檢測(cè)方法。最好是采用本文描述的方法，SPT1或SPT2的表達(dá)可以用來(lái)確定組織是否含有在所述細(xì)胞中過(guò)度增殖性地表達(dá)SPT1或SPT2的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法用來(lái)診斷癌癥或轉(zhuǎn)移性.腫瘤、監(jiān)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移的預(yù)后和進(jìn)程或者監(jiān)測(cè)癌癥或轉(zhuǎn)移性腫瘤的任何干預(yù)或治療的治療功效。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法用來(lái)診斷血管損傷(如再狹窄中)或炎癥的存在或者監(jiān)測(cè)再狹窄或炎癥的任何干預(yù)或治療的治療功效。
本發(fā)明中描述的新方法描述了在各種病理生理狀態(tài)下如何可以顯現(xiàn)SPTI或SPT2蛋白的正調(diào)節(jié)。顯現(xiàn)這種正調(diào)節(jié)的方法也可適用于SPT1或SPT2核酸，并且可以用本領(lǐng)域熟知的方法來(lái)進(jìn)行，所述本領(lǐng)域熟知的方法包括但不限于標(biāo)記核酸探針的雜交技術(shù)或定量RT-PCR。用本領(lǐng)域熟知的方法，包括但不限于親和檢測(cè)法、蛋白質(zhì)印跡法、熒光流式細(xì)胞術(shù)方法或免疫組織學(xué)/免疫細(xì)胞學(xué)方法，可以進(jìn)行顯現(xiàn)SPT1或SPT2蛋白的其它方法。
一般而言，在這些技術(shù)中，目標(biāo)蛋白用特異性探針進(jìn)行標(biāo)記并且通過(guò)在所述樣品中摻入探針的程度進(jìn)行檢測(cè)。在流式細(xì)胞術(shù)中，分析溶液中的細(xì)胞，而在細(xì)胞成象技術(shù)中，比較細(xì)胞視野內(nèi)的探針結(jié)合量。在一個(gè)總的來(lái)講優(yōu)選的實(shí)施方案中，將抗體作為探針使用并用可檢測(cè)探針例如放射性原子或熒光分子進(jìn)行標(biāo)記。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及通過(guò)體內(nèi)成象檢測(cè)SPT。因此，將一種經(jīng)標(biāo)記的絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶特異性化合物給予哺乳動(dòng)物，所述標(biāo)記化合物與SPT1或SPT2結(jié)合并且測(cè)量所述標(biāo)記化合物的位置，作為一種對(duì)過(guò)度增殖性細(xì)胞的位置進(jìn)行成象的方法。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，用放射性原子標(biāo)記抗體，用所述標(biāo)記抗體測(cè)量體內(nèi)SPT1或SPT2蛋白的存在，這是本領(lǐng)域眾所周知的。采用該方法，通過(guò)自動(dòng)放射技術(shù)或者采用將光子發(fā)射轉(zhuǎn)換成聽(tīng)覺(jué)報(bào)告的裝置通過(guò)聽(tīng)覺(jué)信號(hào)，對(duì)轉(zhuǎn)移性腫瘤的存在和位置進(jìn)行可視成象，如Martin等的美國(guó)專(zhuān)利4,782,840中所描述的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以用吸收約300nm至約1300nm范圍內(nèi)的光的生色團(tuán)標(biāo)記探針(特別是抗體)，從而所述SPT1或SPT2可以用熒光檢測(cè)進(jìn)行成象。吸收300-1300nm范圍內(nèi)的光的生色團(tuán)種類(lèi)描述于Towler等的PCT申請(qǐng)PCT/GB98/02833。
本發(fā)明的另一方面涉及治療因過(guò)度增殖性細(xì)胞中存在正調(diào)節(jié)的SPT而介導(dǎo)的疾病狀態(tài)。疾病的治療方法包括抑制SPT酶活性、降低所述細(xì)胞內(nèi)SPT表達(dá)的量或者使所述過(guò)度增殖性細(xì)胞與一種細(xì)胞毒性絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶化合物接觸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抑制劑是絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶酶活性的一種小分子抑制劑。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，限制或阻止轉(zhuǎn)移性腫瘤的進(jìn)程的方法包括給予一種降低絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的化合物。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，用與或者SPT1 mRNA或者所述SPT2 mRNA雜交的反義核酸來(lái)降低所述絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述過(guò)度增殖性細(xì)胞用一種經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞毒性絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶特異性化合物進(jìn)行治療。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，用所述細(xì)胞毒性絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶特異性化合物限制或阻止轉(zhuǎn)移性腫瘤的進(jìn)程。
最好將絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑和至少一種其它含有和不含鉑的抗腫瘤藥給予惡性腫瘤患者。例如但并不限制本發(fā)明，可以在一個(gè)給藥方案中給予抗絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶化合物和諸如DNA烷化劑的細(xì)胞毒性化合物或抗血管生成化合物。優(yōu)選的抗腫瘤藥選自克拉屈濱(2-氯-2′-脫氧-(β)-D-腺苷)、苯丁酸氮芥(4-[雙(2-氯乙基)氨基]苯丁酸)、DTIC-Dome(5-(3，3-二甲基-1-三氮烯基)-咪唑-4-甲酰胺)、鉑化療藥和非鉑化療藥。含鉑的抗腫瘤藥包括但不限于順鉑(順式-二氯雙胺鉑)。不含鉑的抗腫瘤藥包括但不限于環(huán)磷酰胺、氟尿嘧啶、表柔比星、甲氨蝶呤、長(zhǎng)春新堿、多柔比星、博來(lái)霉素和依托泊苷。每種抗腫瘤藥都以治療有效量給予，這些是本領(lǐng)域眾所周知的，并且根據(jù)所使用的藥物、惡性腫瘤的類(lèi)型和其它因素而變化。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，將絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑涂在氣囊導(dǎo)管或支架上致使其以定點(diǎn)和時(shí)間依賴(lài)性方式釋放。這樣的裝置可用于通過(guò)抑制絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶而防止再狹窄的出現(xiàn)，從而防止內(nèi)皮的過(guò)度增殖。SPT介導(dǎo)的疾病的治療方法包括將小分子治療藥或抑制劑化合物直接或間接傳遞或“接種”到其中細(xì)胞過(guò)度增殖出現(xiàn)時(shí)SPT表達(dá)被正調(diào)節(jié)的疾病狀態(tài)的組織或非調(diào)節(jié)性過(guò)量表達(dá)SPT的細(xì)胞中。
本發(fā)明的藥用組合物按照常規(guī)制藥技術(shù)來(lái)制備。在本發(fā)明的組合物中可以使用藥學(xué)上可接受的載體。所述組合物可以采用多種多樣的形式，這取決于給藥所需的制劑形式，包括但不限于靜脈內(nèi)(快速注射和輸注)給藥、口服給藥、經(jīng)鼻給藥、透皮給藥、閉合或不閉合的局部給藥、腹膜內(nèi)給藥、皮下給藥、肌內(nèi)給藥或胃腸外給藥，所有使用形式是藥學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。在制備口服給藥形式的組合物時(shí)，可以使用常用的藥用載體中的一種或多種，例如就口服液體制劑(例如混懸劑、酏劑和溶液劑)而言為水、二醇類(lèi)、油、醇類(lèi)、矯味劑、防腐劑、著色劑、糖漿等；或者例如就口服固體制劑(例如散劑、膠囊劑和片劑)而言為淀粉、糖、稀釋劑、制粒劑、潤(rùn)滑劑、粘合劑、崩解劑等載體。
另一方面，所述絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶抑制性化合物可以通過(guò)注射由溶于惰性液體載體中的有效成分組成的制劑而胃腸外給予。所述注射用制劑可以包括與合適的惰性液體載體混合的有效成分?？山邮艿囊后w載體包括植物油，例如花生油、棉籽油、芝麻油等；以及有機(jī)溶劑，例如solketal、甘油甲縮醛等。作為一個(gè)替代方案，也可以使用水性胃腸外制劑。例如，可接受的水性溶性包括水、Ringer氏溶液和等滲水性鹽溶液。此外，通?？梢允褂脽o(wú)菌非揮發(fā)性油作為所述水性制劑中的溶劑或懸浮劑。所述制劑通過(guò)將所述有效成分溶于或懸浮于所述液體載體中來(lái)制備，使所述終制劑含有0.005-10％(重量)有效成分。適當(dāng)時(shí)可以使用其它添加劑，包括防腐劑、等滲劑、增溶劑、穩(wěn)定劑和鎮(zhèn)痛劑。
本發(fā)明的方法中所使用的化合物也可以以脂質(zhì)體遞藥系統(tǒng)的形式給予，所述脂質(zhì)體遞藥系統(tǒng)例如小單層脂質(zhì)體、大單層脂質(zhì)體和多層脂質(zhì)體。本領(lǐng)域眾所周知的含脂質(zhì)體的遞藥系統(tǒng)用各種各樣的磷脂例如膽固醇、硬脂酰胺或磷脂酰膽堿來(lái)制備。
本文所用的本發(fā)明藥用組合物或其中的化合物的“治療有效量”，是指抑制所述絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶活性的功能的量。本發(fā)明的藥用組合物一般每劑量單位(例如一片、一粒膠囊、一包散劑、一個(gè)注射劑、一茶匙等)含有約0.001mg/kg至約100mg/kg。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥用組合物每劑量單位含有約0.01mg/kg至約50mg/kg化合物，優(yōu)選含有約0.05mg/kg至約20mg/kg。用于確定本發(fā)明藥用組合物的治療有效量的方法是本領(lǐng)域已知的。將所述藥用組合物給予人類(lèi)的有效量例如可以根據(jù)動(dòng)物研究的結(jié)果用數(shù)學(xué)方法確定。此外，可以通過(guò)局部應(yīng)用合適的鼻內(nèi)載體或者通過(guò)透皮途徑，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的那些透皮貼劑形式，以鼻內(nèi)形式給予本發(fā)明的化合物。為了以透皮遞藥系統(tǒng)的形式給藥，整個(gè)給藥方案中，給藥當(dāng)然將是連續(xù)的而不是間歇性的。
生物學(xué)實(shí)施例以下實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，然而并不是用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1細(xì)胞標(biāo)識(shí)抗體抗體生產(chǎn)運(yùn)用通過(guò)Hopp/Woods的算法預(yù)測(cè)的抗原肽序列，產(chǎn)生抗所述SPT亞基的兔多克隆抗體。針對(duì)人SPT1亞基(登記號(hào)為Y08685)的抗體生產(chǎn)所用的肽是SEQ.ID.NO.1(KLQERSDLTVKEKEEC，對(duì)應(yīng)于殘基45-59)；和SEQ.ID.NO.2(KEQEIEDQKNPRKARC，對(duì)應(yīng)于殘基222-236)。作為人SPT2亞基(登記號(hào)為Y08686)的抗原使用的肽是SEQ.ID.NO.3(CGKYSRHRLVPLLDRPF，對(duì)應(yīng)于殘基538-552)；和SEQ.ID.NO.4(CGDRPFDETTYEETED，對(duì)應(yīng)于殘基549-561)。
將一個(gè)半胱氨酸和一個(gè)甘氨酸加入到這些肽的氨基末端，可供用于KLH綴合并且減少進(jìn)行偶聯(lián)時(shí)的位阻。分別針對(duì)每種SPT亞基的肽產(chǎn)生兔多克隆抗體。合并所得的免疫血清，將混合的多克隆抗血清用作針對(duì)所述特異性SPT亞基的抗體源。使用2μg/mL IgG部分。
抗體表征通過(guò)免疫印跡分析，評(píng)價(jià)所述兔抗SPT1多克隆抗體或兔抗SPT2多克隆抗體的特異性。制備HEK 293細(xì)胞的微粒體膜。50微克微粒體膜蛋白在SDS-聚丙烯酰胺凝膠的4條泳道的每條泳道中進(jìn)行分級(jí)分離。在轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜后，所述膜用如上所述制備的以1∶1000稀釋的肽特異性多克隆抗體探測(cè)。用堿性磷酸酶綴合的山羊抗兔IgG(Santa Cruz)檢測(cè)結(jié)合的抗體。
圖1表明所述抗體識(shí)別HEK293微粒體膜制備物中預(yù)測(cè)分子量的SPT1和SPT2蛋白并且不與所述制備物中所含有的其它蛋白反應(yīng)。
在正常人體組織中使用表1中所示的抗波形蛋白的初次單克隆抗體和多克隆抗體，來(lái)證明組織的抗原性和試劑質(zhì)量。陰性對(duì)照包括用同一種IgG同種型非免疫血清取代所述初次抗體。
表1名稱(chēng) 類(lèi)型 效價(jià) 銷(xiāo)售商非免疫血清多克隆抗體，IgG 2.0μg/mlVector Labs，CA非免疫血清單克隆抗體，IgM 2.5μg/mlVector Labs，CA免疫前血清多克隆抗體，IgG 2.0μg/mlRWJPRI，NJSPT1 多克隆抗體，IgG 2.0μg/mlRWJPRI，NJSPT2 多克隆抗體，IgG 2.0μg/mlRWJPRI，NJ平滑肌肌動(dòng)蛋白單克隆抗體，IgM 2.0μg/mlDako，CA波形蛋白 單克隆抗體，IgM 2.0μg/mlDako，CA在過(guò)度增殖性人體組織中使用表2中所示的抗波形蛋白的初次單克隆抗體和多克隆抗體，來(lái)證明組織的抗原性和試劑質(zhì)量。陰性對(duì)照包括用同一種IgG同種型非免疫血清取代所述初次抗體。另外，作為另一陰性對(duì)照，所述抗體用其10倍效價(jià)過(guò)量的抗原中的特異性抗原預(yù)吸附過(guò)夜。
表2名稱(chēng) 類(lèi)型效價(jià) 銷(xiāo)售商拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα單克隆抗體，IgM 1.0μg/mL Pharmingen，CA巨噬細(xì)胞(CD68) 單克隆抗體，IgM 1.0μg/mL Dako，CA免疫前血清(SPT-1)多克隆抗體，IgG 2.0μg/mL RWJPRI，NJ免疫前血清(SPT-2)單克隆抗體，IgM 1.0μg/mL RWJPRI，NJSPT-1多克隆抗體，IgG 2.0μg/mL RWJPRI，NJSPT-2多克隆抗體，IgG 1.0μg/mL RWJPRI，NJ平滑肌肌動(dòng)蛋白 單克隆抗體，IgM 2.0μg/mL Dako，CA波形蛋白 單克隆抗體，IgM 2.0μg/mL Dako，CA實(shí)施例2正常人體組織的免疫組織化學(xué)(IHC)市售的人正常和腫瘤棋盤(pán)組織玻片(Dako，Carpenteria，CA；Biomeda，F(xiàn)oster City，CA)進(jìn)行脫蠟、水合和加工，供常規(guī)IHC用。簡(jiǎn)而言之，玻片在Target(Dako)中經(jīng)微波處理，冷卻，先置于磷酸緩沖鹽溶液(pH 7.4，PBS)中，然后置于3.0％H2O2中。通過(guò)抗生物素蛋白-生物素封閉系統(tǒng)，按照生產(chǎn)商的說(shuō)明(Vector Labs，Burlingame，CA)，對(duì)玻片進(jìn)行處理，然后將其置于PBS中。所有試劑的保溫和洗滌都在室溫下進(jìn)行。讓正常封閉血清(Vector Labs)在所有玻片上保留10分鐘。在PBS中進(jìn)行簡(jiǎn)單地沖洗后，讓初次抗體(表1)在各玻片上保留30分鐘。洗滌所述玻片，讓生物素化第二抗體山羊抗兔(多克隆抗體)或馬抗小鼠抗體(單克隆抗體)在所述組織切片上保留30分鐘(Vector Labs)。在PBS中沖洗后，加入抗生物素蛋白-辣根過(guò)氧化物酶-生物素復(fù)合物試劑(ABC，Vector Labs)達(dá)30分鐘。洗滌玻片，用色素原3，3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB，Biomeda)處理，在蒸餾水中沖洗，然后用蘇木精進(jìn)行復(fù)染。
雙重免疫組織化學(xué)標(biāo)記(IHC:IHC)同時(shí)雙重免疫組織化學(xué)標(biāo)記(IHC:IHC)方案先前已經(jīng)發(fā)表并且與單免疫組織化學(xué)標(biāo)記所述的方案相似，只是玻片在第一抗原檢測(cè)方案的第二個(gè)色素原步驟之后不進(jìn)行復(fù)染。而是將玻片置于PBS中。
通過(guò)堿性磷酸酶-固紅(Vector Labs，CA；Dako，CA)系統(tǒng)檢測(cè)第二抗原。將初次抗體在室溫下在所述玻片上保留30分鐘。在簡(jiǎn)單洗滌后，在室溫下加入第二生物素化抗體達(dá)30分鐘。然后將所述玻片在PBS中洗滌，然后將所述鏈霉抗生物素蛋白-堿性磷酸酶(Vector Labs，CA)試劑在室溫下在所述玻片上保留30分鐘。洗滌后，將所述固紅色素原(Dako，CA)在所述玻片上保留2次5分鐘。接下來(lái)，所述玻片在蘇木精中進(jìn)行常規(guī)復(fù)染，洗滌，然后在基于水的封固劑(Dako，CA)中覆蓋，以便在BX-50 Olympus光學(xué)顯微鏡下觀測(cè)。
進(jìn)行多個(gè)對(duì)照，以確保所述玻片上的標(biāo)記得到恰當(dāng)解釋。初次抗體用正確種同種型取代，以控制所述檢測(cè)系統(tǒng)。就另一組對(duì)照而言，省去第一初次抗體而對(duì)第二初次抗體進(jìn)行加工，反之亦然。
SPT1抗體和SPT2抗體的特異性產(chǎn)生對(duì)兩種人SPT亞基特異性的兔多克隆抗體，并且在圖1所示的免疫印跡中證明所述抗體的特異性。
50微克HEK 293微粒體膜蛋白在SDS-聚丙烯酰胺凝膠的4條泳道上進(jìn)行分級(jí)分離。在將所述蛋白轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜后，切下這4條泳道，分別用以1∶1000稀釋的來(lái)自以下的G蛋白純化抗體探測(cè)SPT1免疫前血清(Pre SPT1)、SPT1抗血清(SPT1)、SPT2免疫前血清(Pre SPT2)或SPT2抗血清(SPT2)。用1∶2000稀釋的堿性磷酸酶綴合的山羊抗兔IgG檢測(cè)結(jié)合的抗體。圖1顯示一條預(yù)期分子量的SPT1(55kD)和SPT2(65kD)條帶。
從野生型HEK細(xì)胞獲得的微粒體膜部分通過(guò)SDS-PAGE分離，蛋白質(zhì)印跡或者用免疫前血清或者用SPT特異性多克隆抗體探測(cè)。觀察到預(yù)期分子量的單免疫反應(yīng)性條帶，準(zhǔn)確地說(shuō)，對(duì)于SPT1而言Mr～55kDa(第3泳道)，而對(duì)于SPT2而言Mr～65kDa(第5泳道)；用免疫前血清沒(méi)有觀察到非特異性結(jié)合(第2泳道和第4泳道)。
SPT1和SPT2的組織分布用IHC獲得正常人體組織中SPT1和SPT2蛋白表達(dá)的分析，SPT1和SPT2在人體組織中的分布示于表3中。表3沒(méi)有反映出SPT1和SPT2免疫標(biāo)記之間觀察到的差異。
福爾馬林固定的、石蠟包埋的組織以多組織形式使用，以消除潛在的染色人為因素，例如玻片間及操作間的變異性。表1列舉了除實(shí)驗(yàn)抗體以外的陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。陽(yáng)性標(biāo)記由褐色染色強(qiáng)度限定，并且依照以下標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)1)無(wú)免疫反應(yīng)性評(píng)價(jià)為陰性(N)；2)淺褐色免疫反應(yīng)性評(píng)價(jià)為弱(W)；3)褐色免疫反應(yīng)性評(píng)價(jià)為中度(M)；而4)深褐色免疫反應(yīng)性評(píng)價(jià)為強(qiáng)(S)。陰性對(duì)照不產(chǎn)生可觀察標(biāo)記。正常人體組織中100倍視野內(nèi)SPT1和SPT2的標(biāo)記細(xì)胞數(shù)為n＝2-10)；陰性(N)沒(méi)有標(biāo)記細(xì)胞；弱(W)有1-10個(gè)標(biāo)記細(xì)胞；中度(M)有11-20個(gè)標(biāo)記細(xì)胞；強(qiáng)(S)有大于20個(gè)標(biāo)記細(xì)胞。
表3組織 細(xì)胞類(lèi)型SPT1 SPT2腎上腺皮質(zhì)NN髓質(zhì)(嗜鉻性細(xì)胞)SS腦神經(jīng)元 SS星形膠質(zhì)細(xì)胞NN
少突細(xì)胞NN浦肯野細(xì)胞 MM乳腺 上皮MM結(jié)腸 上皮MM粘膜巨噬細(xì)胞SS平滑肌 MM心臟 心肌細(xì)胞NN肌內(nèi)膜 WW腎臟 腎小球內(nèi)皮細(xì)胞 MM上皮遠(yuǎn)端小管 NN上皮近端小管 SS肝臟 肝細(xì)胞 NN內(nèi)皮MM肺上皮MM內(nèi)皮MM巨噬細(xì)胞(塵細(xì)胞)SS卵巢 上皮NN皮層基質(zhì)SS肌成纖維細(xì)胞MM胰腺 胰島NN腺泡細(xì)胞MM前列腺上皮MM平滑肌 MM皮膚 表皮WW真皮NN脾臟 竇樣內(nèi)皮SS淋巴細(xì)胞NN巨噬細(xì)胞、PMN MM
胃上皮SS粘膜巨噬細(xì)胞SS平滑肌 MM睪丸 生精上皮WW支持細(xì)胞WW萊迪希氏細(xì)胞MM甲狀腺上皮MM子宮 上皮MM子宮肌膜MM血管 內(nèi)皮MM平滑肌 MM一般而言，位于人體組織中的血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞對(duì)SPT1和SPT2的免疫陽(yáng)性為中度。除所述卵巢上皮之外，所有被測(cè)組織中的上皮細(xì)胞對(duì)SPT1和SPT2的免疫陽(yáng)性為中度至強(qiáng)。另外，來(lái)自結(jié)腸、肺和胃的粘膜巨噬細(xì)胞對(duì)SPT1和SPT2的免疫陽(yáng)性為強(qiáng)。在脾臟中，除所述巨噬細(xì)胞外，觀察到所述淋巴細(xì)胞中的多形核細(xì)胞(PMN)對(duì)SPT1和SPT2的染色均為陽(yáng)性，便沒(méi)有觀察到反應(yīng)性。結(jié)腸、肺、前列腺、胃、甲狀腺、子宮和血管組織對(duì)SPT1和SPT2的免疫陽(yáng)性為中度至強(qiáng)。然而，在皮膚和心臟組織中，SPT1和SPT2弱存在或者完全不可檢測(cè)。
圖2-7表示通過(guò)免疫組織化學(xué)測(cè)試SPT1和SPT2表達(dá)的某些正常人體組織。
圖2顯示分別用免疫前血清(圖2A)、SPT1特異性抗體(圖2B)和SPT2特異性抗體(圖2C)免疫標(biāo)記的正常大腦。在大腦皮質(zhì)中，錐形神經(jīng)元對(duì)于SPT1和SPT2顯示陽(yáng)性胞內(nèi)免疫反應(yīng)性。SPT1和SPT2均位于神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)并且兩個(gè)亞基的表達(dá)水平似乎相似。人小腦中發(fā)現(xiàn)的浦肯野細(xì)胞對(duì)SPT1和SPT2的免疫陽(yáng)性為中度(數(shù)據(jù)未顯示)。相反，SPT1和SPT2在其它神經(jīng)元細(xì)胞類(lèi)型例如星形膠質(zhì)細(xì)胞、小神經(jīng)膠質(zhì)和少突膠質(zhì)細(xì)胞中不可檢測(cè)。
圖3顯示分別用免疫前血清(圖3A)、SPT1抗體(圖3B)和SPT2抗體(圖3C)免疫標(biāo)記的正常人大腸。上皮細(xì)胞(小箭頭)和巨噬細(xì)胞(大箭頭)對(duì)SPT1(圖3B)和SPT2(圖3C)的胞內(nèi)免疫反應(yīng)性為陽(yáng)性。同在神經(jīng)元中一樣，SPT1和SPT2的表達(dá)主要為胞質(zhì)性的。與SPT2在上皮細(xì)胞中的中度表達(dá)相比，粘膜巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)SPT2的免疫反應(yīng)性強(qiáng)得多。在用免疫前血清染色時(shí)在任何細(xì)胞類(lèi)型中都沒(méi)有觀察到免疫反應(yīng)性(3A)。SPT在結(jié)腸(圖3A和圖3B)和胃的粘膜巨噬細(xì)胞及塵細(xì)胞(肺泡巨噬細(xì)胞)中的高表達(dá)(表3)可能是由于這些巨噬細(xì)胞與易暴露于環(huán)境并因此可能被激活的組織相關(guān)的事實(shí)。
圖4顯示分別用免疫前血清(圖4A)或者SPT1特異性抗體(圖4B)和SPT2特異性抗體(圖4C)免疫標(biāo)記的正常人腎上腺。腎上腺髓質(zhì)的嗜鉻性細(xì)胞(大箭頭)、血管平滑肌細(xì)胞(箭頭)和內(nèi)皮(小箭頭)對(duì)SPT1和SPT2顯示強(qiáng)陽(yáng)性胞質(zhì)免疫反應(yīng)性。SPT1和SPT2表達(dá)在腎上腺皮質(zhì)中不可檢測(cè)。內(nèi)皮和嗜鉻性細(xì)胞中的SPT2表達(dá)比SPT1的表達(dá)高。另外，除胞質(zhì)外，在嗜鉻性細(xì)胞核中還可以清楚地觀察到SPT2表達(dá)?？蓹z測(cè)的SPT1或SPT2免疫標(biāo)記在支持基質(zhì)成纖維細(xì)胞中不存在。
圖5顯示用免疫前血清(圖5A)、SPT1特異性抗體(圖5B)和SPT2特異性抗體(圖5C)免疫標(biāo)記正常人腎。近端小管(箭頭)對(duì)SPT1和SPT2顯示陽(yáng)性免疫反應(yīng)性。SPT1代表不同于SPT2在相同細(xì)胞類(lèi)型中的點(diǎn)狀標(biāo)記模式的近端小管上皮細(xì)胞中的彌散性胞內(nèi)標(biāo)記模式。SPT1表達(dá)在胞質(zhì)中是彌散性的，而SPT2免疫染色點(diǎn)狀更多，但總體較SPT1弱。用免疫前血清沒(méi)有觀察到免疫反應(yīng)性。圖5C顯示位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細(xì)胞溶膠一側(cè)的SPT活性及SPT2表達(dá)在腎近端小管上皮中的點(diǎn)狀出現(xiàn)，因此提示SPT2表達(dá)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)，圖6顯示分別用免疫前血清(圖6A)或者SPT1特異性抗體(圖6B)和SPT2特異性抗體(圖6C)免疫標(biāo)記的幾種正常人子宮組織樣品。子宮基質(zhì)性平滑肌細(xì)胞(大箭頭)和內(nèi)皮(小箭頭)對(duì)SPT1和SPT2顯示陽(yáng)性免疫反應(yīng)性，在內(nèi)皮細(xì)胞中SPT2表達(dá)較高(與SPT1相比)。用免疫前血清沒(méi)有觀察到免疫反應(yīng)性。
本發(fā)明的方法表明SPT1和SPT2在下述細(xì)胞中被表達(dá)代謝活性細(xì)胞(例如在自主神經(jīng)刺激時(shí)分泌腎上腺素和去甲腎上腺素的腎上腺嗜鉻性細(xì)胞)和神經(jīng)元和卵巢皮層基質(zhì)細(xì)胞。由于在增殖性細(xì)胞類(lèi)型例如胃、肺(數(shù)據(jù)未顯示)、腎近端小管和結(jié)腸腔上皮中觀察到SPT1和SPT2陽(yáng)性標(biāo)記，因此對(duì)人大腸進(jìn)行雙重免疫組織化學(xué)標(biāo)記。
圖7顯示用抗拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα的抗體(紅色)(一種細(xì)胞增殖和SPT1的標(biāo)記)(圖7A)和SPT2特異性抗體(褐色)(圖7B)雙重免疫組織化學(xué)標(biāo)記人大腸。箭頭顯示紅色和褐色標(biāo)記細(xì)胞的共定位，表明SPT1和SPT2在增殖性上皮細(xì)胞(大箭頭)中被表達(dá)。小箭頭顯示在巨噬細(xì)胞中存在SPT1(圖7A)和SPT2(圖7B)。
結(jié)果本發(fā)明的方法表征了絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶亞基SPT1和SPT2在正常人體組織中的分布并且深入了解了SPT1和SPT2的相似性和可能的功能。在SPT1和SPT2表達(dá)時(shí)觀察到的差異表明，SPT的定位和表達(dá)水平可能與細(xì)胞的生理狀態(tài)相關(guān)。
代謝活性細(xì)胞和增殖性細(xì)胞表達(dá)高水平的SPT。同一組織內(nèi)的相同細(xì)胞類(lèi)型在SPT1和SPT2表達(dá)之間的差異提示，每個(gè)亞基一定有特異性、可能獨(dú)立的功能，實(shí)現(xiàn)SPT活性。與酵母不同，鼠SPT2僅在人HEK293細(xì)胞中的過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致SPT活性的相應(yīng)增加，而僅SPT1不增加SPT活性(Weiss和Stofiel，1997)。除SPT1和SPT2外，人SPT也可能具有額外的組分，如酵母中的Tsc3p蛋白。另外，SPT2在細(xì)胞核中的定位可能表明，SPT2與其它核蛋白相關(guān)或者被修飾并且被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核。因此，分析SPT1和SPT2表達(dá)的動(dòng)力學(xué)差異將有助于闡明SPT活性。
正常細(xì)胞中SPT表達(dá)的知識(shí)可以用于測(cè)量增生性疾病例如癌癥的異常細(xì)胞活性。SPT表達(dá)的絕對(duì)水平和酶活性的定位可能為細(xì)胞生理學(xué)發(fā)生改變的特征。在病理生理病癥例如血管增生(D.J.Uhlinger、J.M.Carton、D.C.Argentieri、B.P.Damiano和M.R.D′Andrea，Increased Expression of Serine Palmitoyltransferase(SPT)in Balloon-injured Rat Carotid Artery(氣囊損傷性大鼠頸動(dòng)脈中絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(SPT)的表達(dá)增加)，Thromb.Haem.，2001，86，1320-6)、傷口愈合和腫瘤中觀察到的SPT活性增加提示針對(duì)SPT的治療潛力。在這些病癥中抑制或降低SPT活性可能影響與所述病癥相關(guān)的癥狀。在豬上皮腎細(xì)胞LLC-PK1中，串珠鐮孢菌素誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和抗增殖效應(yīng)在用SPT1特異性抑制劑如多球殼菌素治療所述細(xì)胞后被降低。在同一研究中，將多球殼菌素腹膜內(nèi)給予BALB/C小鼠，降低游離鞘氨醇累積，在腎臟中降低60％而沒(méi)有明顯的臨床副作用。因此，SPT抑制劑例如多球殼菌素在治療增生性疾病例如癌癥中可能具有重要的治療潛力并且可能影響與諸如炎癥和血管損傷的病癥相關(guān)的各種病理生理。
本發(fā)明的方法提供SPT1和SPT2表達(dá)在正常人體組織中的首次直接免疫定位和比較并且是針對(duì)闡明SPT活性在所述細(xì)胞中的復(fù)雜性的關(guān)鍵性步驟。了解這些組分在SPT活性中的作用在確定在各種疾病狀態(tài)例如癌癥和再狹窄中調(diào)節(jié)多種關(guān)鍵性的鞘脂介導(dǎo)的細(xì)胞功能和應(yīng)答是必不可少的。
實(shí)施例3過(guò)度增殖性人體組織的免疫組織化學(xué)采用實(shí)施例2的IHC程序，利用IHC在福爾馬林固定的、石蠟包埋的組織上定位SPT1和SPT2蛋白。正常人體組織和惡性人體組織同時(shí)以多組織形式進(jìn)行分析，以消除染色人為因素，例如玻片間及操作間的易變性。
細(xì)胞培養(yǎng)人類(lèi)新生兒皮膚成纖維細(xì)胞及其培養(yǎng)基得自Clonetics/Bio Whittaker(Walkersville，MD)。將細(xì)胞懸浮液(5×104/mL)接種到4孔分室玻片(NUNC，Naperville，IL)中，供免疫細(xì)胞化學(xué)用。為了模擬體外經(jīng)分化的休眠成纖維細(xì)胞的體內(nèi)活化，使用刮傷模型。簡(jiǎn)而言之，將細(xì)胞孵育2天(接近會(huì)合，增殖狀態(tài))、9天(過(guò)度會(huì)合，休眠狀態(tài))，或者將第9天休眠培養(yǎng)物用移液管管尖機(jī)械刮傷。為了評(píng)價(jià)創(chuàng)傷反應(yīng)時(shí)的表達(dá)，將所述細(xì)胞在創(chuàng)傷后再培養(yǎng)5天。
免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)4室培養(yǎng)玻片用10％中性緩沖福爾馬林在室溫下固定10分鐘，在PBS中沖洗，然后分析ICC。用含有tween-20(Research Genetics，Huntsville，AL)的自動(dòng)裝置緩沖液，進(jìn)行所有洗滌步驟。
雙重免疫組織化學(xué)(IHC:IHC)為了測(cè)定SPT是否在增殖性細(xì)胞中共定位，使用IHC:IHC同時(shí)檢測(cè)SPT1或SPT2表達(dá)并且檢測(cè)增殖標(biāo)記即增殖性細(xì)胞核抗原(PCNA)。簡(jiǎn)而言之，如上所述，將玻片根據(jù)單IHC標(biāo)記方案首先處理，以檢測(cè)SPT-1或SPT-2。不用蘇木精處理所述玻片，而將PCNA抗體(Pharminigen，San Diego，CA)在組織上保留30分鐘。在用PBS洗滌數(shù)次后，將生物素化馬抗小鼠第抗體(Vector Labs)進(jìn)行相似地保溫。用堿性磷酸酶檢測(cè)系統(tǒng)，通過(guò)與堿性磷酸酶綴合的ABC(VectorLabs)一起保溫，然后用固紅色素原(Sigma)顯色，顯現(xiàn)PCNA陽(yáng)性細(xì)胞的存在。然后玻片進(jìn)行常規(guī)復(fù)染和固定。
表4表示SPT1和SPT2在各種各樣的人惡性腫瘤組織中的免疫定位。陽(yáng)性標(biāo)記由呈現(xiàn)褐色染色限定，并且在18種不同人類(lèi)腫瘤中、在放大100倍的視野中根據(jù)SPT1和SPT2的標(biāo)記細(xì)胞數(shù)評(píng)價(jià)。5種癌(結(jié)腸癌、卵巢癌、胰腺癌、甲狀腺癌、未分化癌)和2種肉瘤都證明這兩種SPT亞基的強(qiáng)過(guò)量表達(dá)。陰性對(duì)照不產(chǎn)生可觀察標(biāo)記。在惡性人體組織中、在放大100倍的視野中SPT1和SPT2的標(biāo)記細(xì)胞數(shù)為n＝2-10)；陰性(N)沒(méi)有標(biāo)記細(xì)胞；弱(W)有1-10個(gè)標(biāo)記細(xì)胞；中度(M)有11-20個(gè)標(biāo)記細(xì)胞；強(qiáng)(S)有大于20個(gè)標(biāo)記細(xì)胞。
表4組織 SPT-1SPT-2乳腺癌NN結(jié)腸癌SS類(lèi)癌瘤WW胃癌 MM平滑肌肉瘤SS肝癌 NN肺癌 NN淋巴瘤NN黑素瘤NN間皮瘤NN卵巢癌SS胰腺癌SS前列腺癌 NN甲狀腺癌 SS腎細(xì)胞癌 NN橫紋肌肉瘤NN肉瘤 SS未分化癌 SS圖8-12表示通過(guò)免疫組織化學(xué)測(cè)試SPT1和SPT2表達(dá)的某些過(guò)度增殖性人體組織。
圖8顯示通過(guò)ICC免疫標(biāo)記分會(huì)合人皮膚成纖維細(xì)胞，以觀察SPT1和SPT2的細(xì)胞表達(dá)和定位。分別與陰性對(duì)照標(biāo)記細(xì)胞(圖8A)和PCNA標(biāo)記細(xì)胞(圖8B)相比，SPT1標(biāo)記細(xì)胞(圖8C)和SPT2標(biāo)記細(xì)胞(圖8D)的結(jié)果表明，SPT1和SPT2過(guò)量表達(dá)與增殖性成纖維細(xì)胞的細(xì)胞核相關(guān)。
圖9顯示分化的休眠成纖維細(xì)胞體外創(chuàng)傷模型的結(jié)果。用所述模型模擬體內(nèi)組織活化，以進(jìn)一步表征SPT在增殖性細(xì)胞中的表達(dá)。將休眠成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物與經(jīng)過(guò)機(jī)械刮傷并讓其恢復(fù)5天(創(chuàng)傷狀態(tài))的匯合培養(yǎng)物進(jìn)行比較。圖9顯示在第9天或第14天用陰性對(duì)照(圖9A和圖9B)和PCNA(圖9D和圖9E)抗體免疫標(biāo)記的休眠培養(yǎng)物中通過(guò)ICC沒(méi)有SPT標(biāo)記。用SPT1抗體(圖9G和圖9H)和SPT2抗體(圖9J和圖9K)觀察到淺彌散性標(biāo)記。受傷14天的成纖維細(xì)胞(圖9C、9F、9I和9L)對(duì)PCNA(圖9F)、SPT1(圖9I)和SPT2(圖9L)顯示強(qiáng)免疫標(biāo)記。在SPT1和SPT2免疫標(biāo)記細(xì)胞中最突出的觀察結(jié)果是受傷14天的成纖維細(xì)胞(圖9I和圖9L)中致密核相關(guān)標(biāo)記，這在第9天休眠細(xì)胞(圖9G和圖9J)和第14天休眠細(xì)胞(圖9H和圖9K)中卻不存在。
圖10顯示用來(lái)顯示PCNA(圖10B和圖10D)與增加的SPT1(圖10A)和SPT2(圖10C)表達(dá)相符的核雙重染色(IF:IF)。箭頭指示檢測(cè)到PCNA的細(xì)胞。表達(dá)SPT的標(biāo)記細(xì)胞與細(xì)胞核相關(guān)并且顯示強(qiáng)SPT表達(dá)。箭頭指示缺乏PCNA標(biāo)記、具有彌散性SPT標(biāo)記、顯示與細(xì)胞核沒(méi)有特異性關(guān)系的細(xì)胞。根據(jù)在核雙重染色和體外創(chuàng)傷模型中觀察到的表達(dá)模式，SPT表達(dá)似乎在增殖性細(xì)胞中增加，并且SPT1和SPT2的表達(dá)與細(xì)胞核相關(guān)。SPT1和SPT2在氣囊損傷性大鼠頸動(dòng)脈的去分化成纖維細(xì)胞和增殖性血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)增加最近也有報(bào)道(Uhlinger DJ、Carton JM、Argentieri DC和Damiano BP，R.DAM Increased Expression of Serine Palmitoyltransferase(SPT)inBalloon-injured Rat Carotid Artery(氣囊損傷性大鼠頸動(dòng)脈中絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(SPT)的表達(dá)增加)，Thrombosis and Haemostasis，2001，861220-6)。
圖11顯示3個(gè)很好建立的癌細(xì)胞系Jurkat(圖11A、圖11B和圖11C)、HT-29(圖11D、圖11E和圖11F)和SH-SY 5Y(圖11G、圖11H和圖11I)中的致密SPT免疫標(biāo)記。在體外和體內(nèi)創(chuàng)傷修復(fù)模型中觀察到的SPT1和SPT2表達(dá)增加證明，創(chuàng)傷修復(fù)反應(yīng)和腫瘤形成之間的平行關(guān)系。對(duì)于用ICC根據(jù)SPT1和SPT2的過(guò)量表達(dá)篩選的幾種癌細(xì)胞系，表4所示的5種癌(結(jié)腸癌、卵巢癌、胰腺癌、甲狀腺癌和未分化癌)和2種肉瘤的結(jié)果都證明這兩種SPT亞基的強(qiáng)過(guò)量表達(dá)；其它腫瘤幾乎不表達(dá)SPT1或SPT2或者SPT1或SPT2的水平不可檢測(cè)。
圖12顯示用IHC和抗免疫前血清(圖12A)、SPT1(圖12B)和SPT2(圖12C)的抗體處理的人惡性結(jié)腸癌組織。在所述惡性腫瘤細(xì)胞中觀察到SPT1(小箭頭)和SPT2(小箭頭)的強(qiáng)胞內(nèi)標(biāo)記。另外，在靠近所述腫瘤的基質(zhì)成纖維細(xì)胞(大箭頭)中觀察到免疫染色。人惡性未分化癌組織(圖12D、圖13E和圖12F)用IHC和抗免疫前血清(圖12D)、SPT1(圖12E)和SPT2(圖12F)的抗體進(jìn)行處理。在與更弱的SPT2信號(hào)(圖12F)相比，在未分化的人癌組織中似乎是一種強(qiáng)SPT1信號(hào)(箭頭，圖12E)。組織樣品中信號(hào)強(qiáng)度的比較可能是相關(guān)的。由于通過(guò)兩種SPT亞基(或者是催化亞基或者是調(diào)節(jié)亞基)發(fā)揮的酶活性作用仍不清楚，因此沒(méi)有證據(jù)證明無(wú)論是增強(qiáng)的SPT1表達(dá)還是SPT1表達(dá)與SPT2表達(dá)之比對(duì)于細(xì)胞反應(yīng)是關(guān)鍵性的。圖12G、圖12H和圖12I顯示用抗免疫前血清(圖12G)、SPT1(圖12H)和SPT2(圖12I)的抗體處理的人惡性甲狀腺癌組織。SPT特異性染色在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)。SPT1和SPT2信號(hào)(箭頭)的強(qiáng)度在細(xì)胞間有所變化。某些惡性腫瘤細(xì)胞表達(dá)非常高水平的SPT亞基，表明在腫瘤細(xì)胞中可能需要所述亞基的各種表達(dá)水平。圖12J、圖12K和圖12L顯示人惡性肉瘤組織。SPT1和SPT2(箭頭)在該惡性腫瘤中高豐度地表達(dá)。
這些結(jié)果表明，SPT在癌細(xì)胞中的過(guò)量表達(dá)并不限于來(lái)源于上皮細(xì)胞的那些癌細(xì)胞例如癌。來(lái)源于間充質(zhì)細(xì)胞、諸如肉瘤的癌癥也似乎增加SPT亞基的表達(dá)。
結(jié)果本發(fā)明研制的抗人SPT1和SPT2的抗體涉及一種用來(lái)觀察這些酶亞基在正常人體組織中表達(dá)以及在氣囊損傷性大鼠頸動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞和活化成纖維細(xì)胞和證明SPT1和SPT2在體外創(chuàng)傷模型中的表達(dá)增加的受傷的人皮膚成纖維細(xì)胞的增殖性細(xì)胞中升高的表達(dá)水平的方法，表明這兩種SPT亞基的不同細(xì)胞正調(diào)節(jié)和強(qiáng)免疫染色標(biāo)記。休眠非增殖性成纖維細(xì)胞僅顯示全部細(xì)胞為淺的彌散性SPT1和SPT2染色。另外，顯然顯著量的增加的SPT1和SPT2免疫標(biāo)記與細(xì)胞核相關(guān)。SPT的核定位涉及鞘脂核信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如對(duì)于有絲分裂發(fā)生而言)也是可能的。觀察到鞘氨醇激酶轉(zhuǎn)運(yùn)到用PDGF處理的成纖維細(xì)胞的細(xì)胞核，支持鞘脂參與增殖細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞核信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的假說(shuō)。
本發(fā)明的方法涉及一種用于比較正常人體組織和過(guò)度增殖性人體組織中的SPT表達(dá)的方法并且支持越來(lái)越多的報(bào)道，即參與細(xì)胞創(chuàng)傷修復(fù)反應(yīng)的某些關(guān)鍵分子也參與腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。
SPT亞基在幾個(gè)已很好建立的人腫瘤細(xì)胞系(包括淋巴瘤、腺癌和成神經(jīng)細(xì)胞瘤)中高豐度地表達(dá)。本發(fā)明的方法提供了SPT1和SPT2在惡性癌細(xì)胞以及形成腫瘤微環(huán)境的細(xì)胞類(lèi)型例如反應(yīng)性基質(zhì)成纖維細(xì)胞和局限性巨噬細(xì)胞中表達(dá)增加的形態(tài)學(xué)證據(jù)。在相似的正常組織的基質(zhì)成纖維細(xì)胞沒(méi)有檢測(cè)到SPT1和SPT2。SPT亞基在這些細(xì)胞類(lèi)型中升高的水平提示SPT在細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性和增殖中的作用。
也觀察到SPT在參與炎癥反應(yīng)的活化白細(xì)胞中表達(dá)增加(2)。已經(jīng)證明SPT在人巨噬細(xì)胞中的正調(diào)節(jié)增加通過(guò)鞘脂生物合成途徑的流入。SPT在人惡性腫瘤中的表達(dá)增加可以為通過(guò)在經(jīng)歷腫瘤轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和周?chē)h(huán)境的細(xì)胞中發(fā)生的鞘脂生物合成途徑調(diào)節(jié)流入的特征。鞘脂涉及增殖和轉(zhuǎn)移過(guò)程。細(xì)胞表面各種鞘糖脂表達(dá)的變化與獲得并保持癌癥表型、腫瘤進(jìn)程和轉(zhuǎn)移相關(guān)。
本發(fā)明的方法也首次提供SPT1和SPT2蛋白在人惡性腫瘤細(xì)胞、局限性巨噬細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞周?chē)摹胺磻?yīng)性”基質(zhì)成纖維細(xì)胞中表達(dá)的原位組織學(xué)比較。升高的SPT水平提示，腫瘤以及形成腫瘤微環(huán)境(TME)的細(xì)胞類(lèi)型內(nèi)某些異常細(xì)胞活性的可能機(jī)制。SPT亞基在增殖性成纖維細(xì)胞的亞細(xì)胞定位從彌散性胞質(zhì)質(zhì)至核相關(guān)性所觀察到的變化提示該酶的功能作用。另外，SPT水平和細(xì)胞定位可能與特殊的腫瘤類(lèi)型相關(guān)，并且SPT1和SPT2在腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)成纖維細(xì)胞中的相對(duì)量可能是臨床相關(guān)的。TME細(xì)胞中的SPT1和SPT2可以是轉(zhuǎn)移活動(dòng)的一種有效預(yù)測(cè)指征，從而具有診斷和預(yù)后價(jià)值。更為重要的是，這些數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明的方法可以進(jìn)一步作為篩選方法使用，以鑒定針對(duì)某些腫瘤具有治療用途的新型SPT抑制劑化合物。
實(shí)施例4檢測(cè)內(nèi)皮組織中的SPTI和SPT2氣囊血管成形術(shù)大鼠模型采用前述方法，通過(guò)大鼠頸總動(dòng)脈的氣囊導(dǎo)管吹脹法誘導(dǎo)血管損傷。重350-450gm的雄性Sprague Dawley大鼠用氯胺酮/賽拉嗪(75/5mg/kg，i.m.)麻醉。采用無(wú)菌技術(shù)，將2F栓子切除術(shù)導(dǎo)管(BaxterHealthcare，Irvine，CA)通過(guò)外頸動(dòng)脈插入左頸總動(dòng)脈中。氣囊尖后接主動(dòng)脈，充氣至30p.s.i，然后用扭曲運(yùn)動(dòng)緩慢抽出。該步驟總共重復(fù)3次。取出導(dǎo)管，牢固地結(jié)扎外頸動(dòng)脈。損傷后1天、3天、7天和14天，大鼠用氯胺酮/賽拉嗪(75/5mg/kg，i.m.)麻醉。靜脈內(nèi)給予1ml含有1000U肝素的5％Evan氏藍(lán)溶液。10分種后，通過(guò)主動(dòng)脈給大鼠輸注100mmHg鹽水達(dá)10分鐘，然后輸注含4％低聚甲醛的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。取出左右頸總動(dòng)脈，并且進(jìn)行制備，供石蠟包埋法用。完全血栓性閉塞的頸動(dòng)脈以及在受傷區(qū)段未被染成藍(lán)色的頸動(dòng)脈不進(jìn)行分析。
組織制備將組織切片(5μM)固定在玻片上，得自頸動(dòng)脈中部的代表性切片用蘇木精和伊紅染色?？拷驇缀蹩拷那衅酶牧嫉膃lastin-vanGieson染色(Sigma，St.Louis，MO)對(duì)彈性蛋白和膠原蛋白進(jìn)行組織化學(xué)染色。其它靠近或幾乎靠近的切片用來(lái)進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。
雙重免疫組織化學(xué)標(biāo)記受傷的和正常的頸動(dòng)脈的切片用針對(duì)人SPT1產(chǎn)生的肽特異性多克隆抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)標(biāo)記，在獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中，如實(shí)施例2中所述的方法，用針對(duì)人SPT2的抗肽抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)標(biāo)記。各切片也用抗因子VIII相關(guān)抗原、平滑肌肌動(dòng)蛋白和PCNA的抗體標(biāo)記。進(jìn)行一系列的對(duì)照，以確保對(duì)標(biāo)記的適當(dāng)解釋。初次抗體用適當(dāng)種的同種型取代，以控制檢測(cè)系統(tǒng)。在另一組對(duì)照中，省去第一初次抗體而對(duì)第二初次抗體進(jìn)行加工，反之亦然。
對(duì)于同時(shí)雙重免疫組織化學(xué)標(biāo)記(IHC:IHC)，每種免疫組織化學(xué)標(biāo)記方法在同一切片上順序進(jìn)行，然后復(fù)染。第二抗原通過(guò)堿性磷酸酶-FAST RED(Dako)系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)。在初次免疫組織化學(xué)標(biāo)記后，將針對(duì)第二標(biāo)記的初次抗體在室溫下在所述玻片上保留30分鐘。簡(jiǎn)單地洗滌之后，在室溫下加入第二生物素化抗體達(dá)30分鐘。然后將玻片在PBS中洗滌，在室溫下將鏈霉抗生物素蛋白-堿性磷酸酶試劑(Vector Labs)在所述玻片上保留30分鐘。洗滌后，將玻片暴露于FASTRED CHROMOGEN(Dako)。然后所述玻片用蘇木精復(fù)染，洗滌，然后在基于水的封固劑(Dako)中覆蓋，以便在光學(xué)顯微鏡下觀測(cè)。
在正常血管中，SPT標(biāo)記在內(nèi)側(cè)平滑肌和內(nèi)皮中是彌散不規(guī)則的。損傷后1天和3天，在出現(xiàn)新內(nèi)膜之前，SPT1和SPT2標(biāo)記在靠近損害或壞死的平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞中增加。另外，增殖性外膜肌成纖維細(xì)胞強(qiáng)標(biāo)記SPT1和SPT2。損傷后7天和14天，受傷血管的基質(zhì)和新內(nèi)膜增加了所述新內(nèi)膜腔邊最致密的SPT標(biāo)記。這種腔邊已有描述并且顯示包括活動(dòng)性增殖平滑肌細(xì)胞。雙重免疫組織化學(xué)標(biāo)記證實(shí)，SPT在密度最高的PCNA陽(yáng)性細(xì)胞的區(qū)內(nèi)表達(dá)最高。
圖13顯示在氣囊血管成形術(shù)后14天在大鼠模型中觀察到的典型病斑。與未受傷的動(dòng)脈(右圖)相比，觀察到明顯的基質(zhì)增厚以及在氣囊損傷的動(dòng)脈中存在突出的新內(nèi)膜(左圖)。在受傷動(dòng)脈的基質(zhì)和新內(nèi)膜以及未受傷的動(dòng)脈的基質(zhì)中都存在平滑肌肌動(dòng)蛋白標(biāo)記(圖13C)。在腔邊標(biāo)記最大的受傷血管的基質(zhì)和新內(nèi)膜中觀察到PCNA陽(yáng)性細(xì)胞(圖13E，箭頭)。未受傷血管不表達(dá)多種PCNA陽(yáng)性細(xì)胞(圖13F)。未受傷頸動(dòng)脈中的SPT標(biāo)記僅沿完整內(nèi)皮層顯而易見(jiàn)(箭頭，圖13H和圖13J)。動(dòng)脈損傷后14天，SPT1和SPT2標(biāo)記從腔細(xì)胞向下延伸通過(guò)所述新內(nèi)膜。SPT2標(biāo)記似乎更加致密，尤其是在腔邊。這些數(shù)據(jù)證明，在對(duì)血管損傷應(yīng)答時(shí)存在SPT1和SPT2的特異性正調(diào)節(jié)。在與下述細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞中觀察到SPT1和SPT2的正調(diào)節(jié)基質(zhì)平滑肌損害、增殖性外膜肌成纖維細(xì)胞和新內(nèi)膜的平滑肌細(xì)胞、特別在所述新內(nèi)膜的增殖性腔邊的那些平滑肌細(xì)胞。
圖14通過(guò)檢查血管成形術(shù)后第1天、第3天、第7天和3個(gè)月PCNA、SPT1和SPT2表達(dá)顯示血管損傷的時(shí)程。在第3天，PCNA標(biāo)記在受傷基質(zhì)的平滑肌細(xì)胞(參見(jiàn)箭頭)中顯而易見(jiàn)(圖14D)。在基質(zhì)(大箭頭)以及沿腔邊沉積的血小板(小箭頭)中觀察到SPT1陽(yáng)性免疫反應(yīng)性(圖14E)和SPT2陽(yáng)性免疫反應(yīng)性(圖14F)。在第7天，PCNA標(biāo)記變得明顯得多。標(biāo)記在早期新內(nèi)膜中最致密，但也存在于受傷血管的基質(zhì)中(圖14G)。與第7天在所述基質(zhì)的淺SPT1和SPT2免疫標(biāo)記相比，致密SPT1(圖14H)和SPT2(圖14I)免疫標(biāo)記位于所述受傷血管的新內(nèi)膜中。因此，SPT的表達(dá)與似乎活動(dòng)性增殖平滑肌細(xì)胞相一致。損傷后3個(gè)月，對(duì)PCNA、SPT1和SPT2的標(biāo)記限于所述新內(nèi)膜腔邊的倒數(shù)第二層。
圖15顯示肌成纖維細(xì)胞在對(duì)血管成形術(shù)應(yīng)答時(shí)外膜和基質(zhì)重建模中的去分化和增殖。在未受傷頸動(dòng)脈(圖15A)和受傷第3天的血管(圖15B)的蘇木精和伊紅染色后，受傷血管的外膜比對(duì)照血管外膜更厚且細(xì)胞更多。免疫組織化學(xué)特征用來(lái)顯示受傷血管和抗體對(duì)SMA(圖15C)、PCNA(圖15D)、SPT1(圖15E)和SPT2(圖15F)的應(yīng)答。SMA陽(yáng)性免疫標(biāo)記指示在所述外膜中存在去分化反應(yīng)性肌成纖維細(xì)胞，而在對(duì)照血管中沒(méi)有觀察到這一現(xiàn)象。在所述外膜中也觀察到明顯的PCNA陽(yáng)性免疫標(biāo)記(箭頭)(圖15D)，證明存在反應(yīng)性成纖維細(xì)胞。在所述外膜(箭頭)內(nèi)的肌成纖維細(xì)胞中也觀察到明顯的SPT1免疫標(biāo)記(圖15E)和SPT2免疫標(biāo)記(圖15F)。這些特征性創(chuàng)傷應(yīng)答變化與在各種各樣的癌中觀察到的結(jié)果相似，并且表明SPT可能參與成纖維細(xì)胞的增生和瘤形成所共有的信號(hào)途徑。
實(shí)施例5體內(nèi)再狹窄模型重350-450gm的雄性Sprague Dawley大鼠用氯胺酮/賽拉嗪(75/5mg/kg，i.m.)麻醉。采用前述方法(Damiano等，1999)，通過(guò)大鼠頸總動(dòng)脈的氣囊導(dǎo)管吹脹法誘導(dǎo)血管損傷。一組大鼠用在第0天、第2天、第5天和第10天腹膜內(nèi)注射的0.5mg/kg絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑多球殼菌素治療。在第1天、第3天、第7天和第14天處死動(dòng)物，以評(píng)價(jià)頸動(dòng)脈再狹窄損傷的組織病理學(xué)并且用免疫組織化學(xué)法檢查所述絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶亞基在受傷切片和對(duì)照切片中的表達(dá)。在經(jīng)治療的動(dòng)物中再狹窄損傷(即血管變窄)程度的降低是SPT抑制劑功效的指標(biāo)。
實(shí)施例6B16肺轉(zhuǎn)移模型讓B16-F10小鼠黑素瘤細(xì)胞(ICLC目錄編號(hào)ATL99010)在標(biāo)準(zhǔn)條件下生長(zhǎng)，作為單層組織培養(yǎng)物。將大約2×106細(xì)胞靜脈內(nèi)注射到4-8周齡C57BL/6小鼠的尾靜脈中。在一組小鼠中，在第0天、第2天和第5天，同時(shí)腹膜內(nèi)給予約0.5mg/kg濃度的絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑例如多球殼菌素。對(duì)照組注射溶劑溶媒。腫瘤注射后讓小鼠生存9天，以讓所述腫瘤建立，然后使小鼠安樂(lè)死。取出肺，在Bouin氏溶液中固定，使用解剖顯微鏡對(duì)肺轉(zhuǎn)移腫瘤數(shù)計(jì)數(shù)。肺轉(zhuǎn)移腫瘤數(shù)減少表示SPT抑制劑阻止B16-F10腫瘤在小鼠中的建立。
實(shí)施例7檢測(cè)炎性結(jié)腸-大鼠結(jié)腸炎模型中的SPT2所述動(dòng)物用氟烷麻醉，其結(jié)腸用乙醇(30％，1ml，約30秒)洗滌，以破壞粘膜屏障，然且用鹽水沖洗(1ml)。然后或者將酵母聚糖(1ml，25mg/ml，Sigma，St.Louis，MO)或者將等體積的溶媒(鹽水)通過(guò)肛門(mén)內(nèi)插入深約7-8cm的管飼法針滴注到結(jié)腸中。結(jié)腸內(nèi)滴注后20小時(shí)處死所述酵母聚糖動(dòng)物。給所述動(dòng)物經(jīng)賁門(mén)灌注固定劑。取出結(jié)腸并在同一溶液中進(jìn)行后固定。
組織制備從該模型的結(jié)腸遠(yuǎn)端即已知有結(jié)腸炎反應(yīng)的部位，切取大約3個(gè)連續(xù)的1cm切片，在每種動(dòng)物一種石蠟封閉劑中包埋，同時(shí)進(jìn)行觀察。從每種石蠟封閉劑中切取組織切片(5μM)。將各切片固定在玻片上并用SPT1和SPT2特異性抗體處理，供免疫組織化學(xué)分析用。用髓過(guò)氧化物酶和巨噬細(xì)胞特異性抗體，用巨噬細(xì)胞特異性抗體MAC-1，用另外的免疫組織化學(xué)標(biāo)記證實(shí)多形核白細(xì)胞(PMN)的存在。
圖16說(shuō)明炎性結(jié)腸中的白細(xì)胞浸潤(rùn)。上圖(圖16A)的箭頭指示具有增強(qiáng)水平的SPT2的活化巨噬細(xì)胞。下圖(圖16B)顯示炎性結(jié)腸腔面上的嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。箭頭指示表現(xiàn)出增強(qiáng)的SPT2表達(dá)的視野多種活化嗜中性粒細(xì)胞中的三種嗜中性粒細(xì)胞。根據(jù)SPT1免疫標(biāo)記獲得相似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。除明顯存在SPT1和SPT2免疫陽(yáng)性PMN和巨噬細(xì)胞外，還觀察到遷移性上皮舌上的陽(yáng)性免疫標(biāo)記，似乎從正常上皮遷移而來(lái)(數(shù)據(jù)未顯示)，提示SPT1和SPT2不僅存在于炎性細(xì)胞中，而且也存在于增殖性上皮細(xì)胞(也許作用在于使傷口愈合)中。
雖然先前的說(shuō)明書(shū)敘述了本發(fā)明的原理、提供用于說(shuō)明的實(shí)施例，但是人們將會(huì)理解，就本說(shuō)明書(shū)而論，對(duì)本發(fā)明各個(gè)方面的進(jìn)一步修改是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的，并且本發(fā)明的實(shí)施包括以下權(quán)利要求書(shū)范圍內(nèi)進(jìn)行的所有通常的變化、替代實(shí)施方案、改進(jìn)和/或修改及其解釋為包括所有這樣的變化的等同實(shí)施方案。
權(quán)利要求
1.一種用于測(cè)量哺乳動(dòng)物細(xì)胞絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶表達(dá)水平的方法，所述方法包括(a)使絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶特異性化合物與一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞接觸，形成大量的化合物-絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物；(b)通過(guò)檢測(cè)存在的所述復(fù)合物，測(cè)量由所述細(xì)胞表達(dá)的絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶水平。
2.一種用于測(cè)量哺乳動(dòng)物細(xì)胞絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的方法，所述方法包括(a)使絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶特異性化合物與以基礎(chǔ)水平表達(dá)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的第一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞接觸，形成第一種大量的化合物-絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物；(b)使絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶特異性化合物與過(guò)度增殖性地表達(dá)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的第二種哺乳動(dòng)物細(xì)胞接觸，形成第二種大量的化合物-絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物；(c)通過(guò)檢測(cè)存在的所述第一種和第二種大量復(fù)合物，測(cè)定所述第一種和第二種細(xì)胞表達(dá)的絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶水平；(d)測(cè)量所述第一種和第二種細(xì)胞表達(dá)的絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶水平差異。
3.一種用于組織體內(nèi)成象的方法，所述方法包括(a)給予哺乳動(dòng)物一種絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶特異性化合物，其中所述化合物包含一個(gè)可檢測(cè)標(biāo)記，并且其中所述化合物與過(guò)度增殖性地表達(dá)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的哺乳動(dòng)物細(xì)胞結(jié)合；(b)通過(guò)對(duì)所述可檢測(cè)標(biāo)記成象，確定在哺乳動(dòng)物組織內(nèi)的細(xì)胞定位。
4.權(quán)利要求2的方法，所述方法還包括下述步驟應(yīng)用所測(cè)得的所述第一種和第二種細(xì)胞表達(dá)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的水平差異檢測(cè)、診斷癌癥，診斷癌癥的轉(zhuǎn)移潛力，監(jiān)測(cè)癌癥的預(yù)后和進(jìn)程，或者監(jiān)測(cè)癌癥治療的治療功效。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述癌癥選自乳腺癌、結(jié)腸癌、類(lèi)癌瘤、胃癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝細(xì)胞瘤、平滑肌肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、間皮瘤、骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、甲狀腺癌、腎細(xì)胞癌、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、未分化癌和白血病。
6.權(quán)利要求2的方法，所述方法還包括下述步驟應(yīng)用所測(cè)得的所述第一種和第二種細(xì)胞表達(dá)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的水平差異檢測(cè)或診斷是否存在血管損傷。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述血管損傷為再狹窄。
8.權(quán)利要求2的方法，所述方法還包括下述步驟應(yīng)用所測(cè)得的所述第一種和第二種細(xì)胞表達(dá)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的水平差異檢測(cè)或診斷是否存在炎癥。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述炎癥為以下疾病的炎癥潰瘍性結(jié)腸炎、炎性腸綜合征、節(jié)段性回腸炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、中風(fēng)或哮喘。
10.一種用于篩選抑制絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的治療上有效的化合物的方法，所述方法包括(a)使絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶特異性化合物與過(guò)度增殖性地表達(dá)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的第一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞接觸，形成第一種大量的化合物-絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物；(b)使一種潛在的絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑化合物與過(guò)度增殖性地表達(dá)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的第二種哺乳動(dòng)物細(xì)胞接觸，形成第二種大量的化合物-絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物；(c)通過(guò)檢測(cè)存在的所述第一種和第二種大量的化合物-絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物，測(cè)定所述第一種和第二種細(xì)胞表達(dá)的絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶水平；(d)測(cè)量所述第一種和第二種細(xì)胞表達(dá)的絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶水平差異，以確定所述潛在抑制劑化合物是否抑制絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶表達(dá)。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶特異性化合物選自與絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)合的化合物、與絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)合的單特異性抗體和與絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶mRNA雜交的核酸。
12.權(quán)利要求2的方法，其中所述絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶特異性化合物選自與絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)合的化合物、與絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)合的單特異性抗體和與絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶mRNA雜交的核酸。
13.權(quán)利要求3的方法，其中所述絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶特異性化合物選自與絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)合的化合物、與絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)合的單特異性抗體和與絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶mRNA雜交的核酸。
14.權(quán)利要求10的方法，其中所述絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶特異性化合物選自與絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)合的化合物、與絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)合的單特異性抗體和與絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶mRNA雜交的核酸。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述表達(dá)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自腎上腺細(xì)胞、腦細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、結(jié)腸細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、心臟細(xì)胞、免疫細(xì)胞、腎細(xì)胞、肝細(xì)胞、肺細(xì)胞、卵巢細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、前列腺細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、脾細(xì)胞、胃細(xì)胞、睪丸細(xì)胞、甲狀腺細(xì)胞、子宮細(xì)胞和血管細(xì)胞。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述上皮細(xì)胞選自?xún)?nèi)皮細(xì)胞、非神經(jīng)膠質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞、結(jié)腸細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、腎近端小管細(xì)胞、前列腺平滑肌細(xì)胞、子宮平滑肌細(xì)胞和睪丸平滑肌細(xì)胞。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所述免疫細(xì)胞選自多形核白細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、上皮樣細(xì)胞、巨細(xì)胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、枯否氏細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞。
18.權(quán)利要求2的方法，其中所述以基礎(chǔ)水平表達(dá)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自腎上腺細(xì)胞、腦細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、結(jié)腸細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、心臟細(xì)胞、免疫細(xì)胞、腎細(xì)胞、肝細(xì)胞、肺細(xì)胞、卵巢細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、前列腺細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、脾細(xì)胞、胃細(xì)胞、睪丸細(xì)胞、甲狀腺細(xì)胞、子宮細(xì)胞和血管細(xì)胞。
19.權(quán)利要求2的方法，其中所述過(guò)度增殖性地表達(dá)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、癌細(xì)胞、免疫細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境內(nèi)的細(xì)胞。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述癌細(xì)胞選自乳腺癌、結(jié)腸癌、類(lèi)癌瘤、胃癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝細(xì)胞瘤、平滑肌肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、間皮瘤、骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、甲狀腺癌、腎細(xì)胞癌、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、未分化癌和白血病。
21.權(quán)利要求19的方法，其中所述上皮細(xì)胞選自?xún)?nèi)皮細(xì)胞、非神經(jīng)膠質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞、結(jié)腸細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、腎近端小管細(xì)胞、前列腺平滑肌細(xì)胞、子宮平滑肌細(xì)胞和睪丸平滑肌細(xì)胞。
22.權(quán)利要求19的方法，其中所述免疫細(xì)胞選自多形核白細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、上皮樣細(xì)胞、巨細(xì)胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、枯否氏細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞。
23.權(quán)利要求19的方法，其中所述腫瘤微環(huán)境內(nèi)的細(xì)胞選自基質(zhì)成纖維細(xì)胞、基質(zhì)單核細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞。
24.一種用于治療其需要患者絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)性疾病的方法，所述方法包括將治療有效量的絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑化合物藥用制劑給予所述患者；其中任選的是，所述絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑化合物具有細(xì)胞毒性。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑化合物是一種絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶特異性化合物。
26.權(quán)利要求24的方法，其中所述絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)性疾病選自癌癥、炎癥和血管損傷。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述癌癥選自乳腺癌、結(jié)腸癌、類(lèi)癌瘤、胃癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝細(xì)胞瘤、平滑肌肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、間皮瘤、骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、甲狀腺癌、腎細(xì)胞癌、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、未分化癌和白血病。
28.權(quán)利要求26的方法，其中所述炎癥是以下疾病的炎癥潰瘍性結(jié)腸炎、炎性腸綜合征、節(jié)段性回腸炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、中風(fēng)或哮喘。
29.權(quán)利要求26的方法，其中所述血管損傷是再狹窄性血管損傷。
30.權(quán)利要求25的方法，其中所述絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶特異性化合物選自任選用細(xì)胞毒性劑標(biāo)記的單特異性抗體和與絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶mRNA任選雜交的核酸。
31.權(quán)利要求24的方法，其中將所述藥用制劑涂被在氣囊導(dǎo)管或支架上并且以時(shí)間依賴(lài)性方式釋放。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于比較性測(cè)量哺乳動(dòng)物組織中正常與過(guò)度增殖性絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶表達(dá)水平的方法及其應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N9/10GK1610751SQ02810014
公開(kāi)日2005年4月27日 申請(qǐng)日期2002年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月20日
發(fā)明者J·M·卡頓, M·R·德安德雷, D·J·厄林格 申請(qǐng)人:奧索·麥克尼爾藥品公司