專利名稱：確定病人相關(guān)的齲齒的風(fēng)險(xiǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及適于通過測(cè)定乳酸和/或乳酸鹽來(lái)確定病人相關(guān)的齲齒的風(fēng)險(xiǎn)的試驗(yàn)。
已有技術(shù)齲齒是傳染性疾病。最常提到的病原有機(jī)體包括鏈球菌spp.和乳酸桿菌。其中，導(dǎo)致齲齒的微生物具有相同點(diǎn)，即它們吸收并發(fā)酵糖類，例如食物中的糖類，以及分泌酸作為新陳代謝最終產(chǎn)物的。
原則上，必需區(qū)分唾液中由微生物引起的酸釋放和牙斑中的酸釋放，這是因?yàn)檠例X的齲齒損傷按照推理是附著在牙齒表面的微生物形成的酸所導(dǎo)致的，在下文中也稱為牙斑。在牙齒表面處環(huán)境的局部酸化導(dǎo)致羥基磷灰石溶解，并因此在化學(xué)上導(dǎo)致齲齒損傷的形成。
牙斑酸化的速度及其酸化的強(qiáng)烈程度取決于唾液的緩沖能力、牙斑液的緩沖能力、微生物的生長(zhǎng)(Coogan，M.M.，Motlekar，H.B.Journal of the Dentalassociation of South Africa 51，823-827(1996))以及在牙斑中的擴(kuò)散過程(Dawes，C.，Dibdin，G.H.Journal Dental Research 65，89-94(1986))等。
這種生理學(xué)、微生物學(xué)和化學(xué)因素復(fù)雜的相互影響引起牙斑中潛伏的齲齒。這些因素以患者之間各不相同地存在。
現(xiàn)代牙科學(xué)的一個(gè)目的是將患者區(qū)分為各種的風(fēng)險(xiǎn)人群。在齲齒損傷出現(xiàn)之前，早期認(rèn)識(shí)到齲齒的風(fēng)險(xiǎn)是有利的。
由于為了達(dá)到診斷的目的，必須獲得大量的個(gè)人樣品并進(jìn)行分析，因此不可能使用牙斑分析來(lái)確定病人患上齲齒的風(fēng)險(xiǎn)，使之在實(shí)踐中為人所接受。這種試驗(yàn)費(fèi)力且太昂貴，其操作太復(fù)雜。
作為牙斑試驗(yàn)的替換方法，可以通過測(cè)試唾液來(lái)嘗試確定病人患上齲齒的風(fēng)險(xiǎn)。因此，假設(shè)唾液中鏈球菌突變異種和/或乳酸桿菌的可計(jì)量的量和牙斑中鏈球菌突變異種和/或乳酸桿菌的量相關(guān)，因此就可以使用唾液試驗(yàn)來(lái)推斷齲齒對(duì)患者的風(fēng)險(xiǎn)。
可以使用各種方法來(lái)測(cè)定唾液中導(dǎo)致齲齒的微生物，如鏈球菌突變異種和/或乳酸桿菌。
1.通常將樣品在合適的培養(yǎng)基介質(zhì)中孵化若干天之后，來(lái)測(cè)定導(dǎo)致齲齒的微生物，這是因?yàn)樽畛醮嬖诘奈⑸锪坎⒉蛔阋灾苯荧@得結(jié)果。在持續(xù)幾小時(shí)到幾天的時(shí)間內(nèi)繁殖所述微生物之后，計(jì)算集落形成單位(CFU)，并推斷樣品中存在的微生物數(shù)目(Kneist，S.；Klein，C.；Rupf，S.；Eschrich，K.Quintessenz(1999)50-33-43)。
其缺點(diǎn)是唾液中引起齲齒的微生物數(shù)量和齲齒風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)聯(lián)并不是太滿意，這是因?yàn)殛P(guān)鍵在于其新陳代謝活性，而不是微生物的數(shù)量。而且，樣品的孵化會(huì)導(dǎo)致形成病原微生物培養(yǎng)基，它必須采取合適的預(yù)防措施，來(lái)使實(shí)踐中的風(fēng)險(xiǎn)最小。需要特殊的排放。除了那些缺點(diǎn)之外，所述要求達(dá)到微生物診斷的孵化方法昂貴，且很費(fèi)時(shí)。
免疫學(xué)方法是確定唾液中導(dǎo)致齲齒微生物的另一途徑。在這種情況下，使用針對(duì)待測(cè)定微生物表面結(jié)構(gòu)的單克隆或多克隆抗體。
相比部分1中的孵化方法，這些免疫學(xué)方法更加專一、更快且更廉價(jià)，但是就可重復(fù)性來(lái)說(shuō)具有明顯的缺點(diǎn)(Kneist，S.；Klein，C.；Rupf，S.；Eschrich，K.Quintessenz(1999)50-33-43)。例如，唾液不僅包含活的微生物，而且還包含顯著量死去的微生物。在患者之間，死的和活的微生物之間的比率各不相同。事實(shí)是抗體并不能區(qū)分活的微生物和死的微生物，這意味著當(dāng)推斷所評(píng)價(jià)的微生物現(xiàn)有的致病潛力時(shí)存在不可預(yù)測(cè)的偏差范圍(Aass，A.M.；Preus，H.R.Zambon，J.J.，Gjermo，P.Scand J.Dent Res(1994)102，355-360)。而且，唾液中引起齲齒的微生物的數(shù)量和齲齒的風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)聯(lián)并不能令人滿意，這是因?yàn)殛P(guān)鍵在于其新陳代謝的活性，而不是微生物的量，這一點(diǎn)在這種情況下也是存在的。
具有最高靈敏度的方法是以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)為基礎(chǔ)?？梢砸愿咛禺愋猿潭忍綔y(cè)微量的微生物。所述PCR技術(shù)費(fèi)時(shí)，復(fù)雜、昂貴且不易掌握(Rupf，S.，Kneist S.，Merte，K.，Eschrich，K.Eur.J.Oral.Sci(1990)107，75-81)。在這種情況下，也必須作出不能區(qū)分活的和死的微生物的保留。而且，唾液中引起齲齒的微生物量和齲齒風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)聯(lián)的另一保留并不能令人滿意，這是因?yàn)殛P(guān)鍵在于其新陳代謝的活性，而不是微生物的量，這一點(diǎn)在這種情況下也是存在的。
所有為了確定齲齒的風(fēng)險(xiǎn)而測(cè)定唾液中引起齲齒的微生物量的方法存在嚴(yán)重的缺點(diǎn)，即不能獲得所需的發(fā)現(xiàn)-病人患上齲齒的風(fēng)險(xiǎn)-這是因?yàn)椴荒軓耐僖褐写嬖诘囊瘕x齒的微生物的量來(lái)推斷牙斑中齲齒潛在可能性。
由于患者之間唾液的組成各不相同，并對(duì)存在微生物的新陳代謝能力有影響(Minah，G.E.McEnery，M.C.，F(xiàn)lores，J.A.Archivs Oral Biol.(1986)31，633-638)，因此推薦除了測(cè)定引起齲齒的微生物的量以外，也要研究由糖產(chǎn)生的患者唾液的酸化作用。pH的降低是由于微生物的酸釋放，且看作是唾液中微生物的新陳代謝活性的量度。但是，所觀察的唾液pH值降低取決于患者唾液的緩沖能力的水平。因此，建議為了確定病人患上齲齒的風(fēng)險(xiǎn)，唾液的緩沖能力也應(yīng)和引起齲齒的微生物量和唾液中pH的測(cè)量結(jié)合起來(lái)考慮。
但是，臨床經(jīng)驗(yàn)顯示，即使結(jié)合了鏈球菌突變異種/乳酸桿菌的量、pH測(cè)定和緩沖能力，也不能提供齲齒和患者有關(guān)風(fēng)險(xiǎn)的可靠發(fā)現(xiàn)(Kleinfelder andKirchner“Die diagnostische Sicherheit biologischer Speicheltests zurBestimmung des individullen Kariesrisiko”[“用于齲齒個(gè)體風(fēng)險(xiǎn)確定的生物學(xué)唾液試驗(yàn)的診斷可靠性”]Dtsch.Zahnarztliche Zeitschrift(1993)48，646-648)。
說(shuō)明書US-A-3,332,743和EP-A-0097904敘述了從唾液中微生物的新陳代謝活性來(lái)推斷病人患上齲齒的風(fēng)險(xiǎn)的另一嘗試。觀察唾液將刃天青還原成試鹵靈的能力，所述微生物的新陳代謝活性認(rèn)為和試鹵靈形成的速度有關(guān)。從試鹵靈形成的速度可以推斷出病人患上齲齒的風(fēng)險(xiǎn)。刃天青還原成試鹵靈是由微生物脫氫酶引起的。不僅是鏈球菌突變異種和乳酸桿菌具有能將刃天青還原成試鹵靈的脫氫酶。因此，使用刃天青/試鹵靈試驗(yàn)作為用于微生物生存能力的一般試驗(yàn)，因此并不是專門用于通過酸釋放引起口腔環(huán)境酸化的齲齒的病原體，并不能用于確定病人患上齲齒的風(fēng)險(xiǎn)。
如文獻(xiàn)中所述的，用于確定引起齲齒的微生物的新陳代謝活性的另一可能性是酸釋放，例如蟻酸、乙酸、丙酸和乳酸；所述微生物會(huì)損害牙齒的堅(jiān)硬物質(zhì)。哪一種酸和損害牙齒堅(jiān)硬物質(zhì)密切相關(guān)取決于例如營(yíng)養(yǎng)物的供應(yīng)。若存在足夠的葡萄糖，優(yōu)先的是鏈球菌分泌出乳酸，但是當(dāng)葡萄糖的供應(yīng)受限制時(shí)，優(yōu)先形成乙酸、丙酸和蟻酸。
專利說(shuō)明書US-A-4,351,899和US-A-4,254,222說(shuō)明了用于生物體液，尤其是血液中乳酸的酶測(cè)定方法。由于脫氫酶引起的乳酸酶還原，除丙酮酸鹽以外形成了煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)。NADH隨后使用氧化還原指示劑，宜為-+生物和吩嗪衍生物來(lái)確定。將這種方法移植到唾液可以成為用于測(cè)定齲齒微生物新陳代謝活性，并因此確定齲齒風(fēng)險(xiǎn)的快速簡(jiǎn)單的方法。但是在那些說(shuō)明書中所述的方法不能用在唾液的情況，這是因?yàn)樵谕僖褐写嬖诘母狈磻?yīng)嚴(yán)重歪曲了氧化還原反應(yīng)所產(chǎn)生的信號(hào)。即使沒有加入檢測(cè)反應(yīng)所需的脫氫酶，所述氧化還原指示劑被唾液組分和NAD還原，并產(chǎn)生不是由唾液中乳酸鹽存在所引起的信號(hào)。
問題因此，本發(fā)明的問題是提供能評(píng)估目前病人患上齲齒的風(fēng)險(xiǎn)的方法，在所述方法中，避免了已有技術(shù)中已知的缺點(diǎn)。
解決方案令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，齲齒風(fēng)險(xiǎn)增大的患者可以通過本發(fā)明方法所用的試驗(yàn)來(lái)進(jìn)行確定。
綜合這種試驗(yàn)和例如DE-A-19926728中所述的那些診斷性的牙齒印模也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。通過那種方式，不管他們?cè)谕僖褐谢蛏囝^上出現(xiàn)齲齒風(fēng)險(xiǎn)的事實(shí)，可以區(qū)分那些其牙齒上沒有會(huì)導(dǎo)致齲齒風(fēng)險(xiǎn)的牙斑的患者和那些確實(shí)具有實(shí)際風(fēng)險(xiǎn)的患者。
而且，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于可以清晰地確定患者中齲齒的風(fēng)險(xiǎn)，確定合適的定向的藥物處理，并避免過度和過輕的治療。
再者，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是使用唾液試驗(yàn)，可以確定在開始治療時(shí)，例如在學(xué)校和幼兒園中團(tuán)隊(duì)預(yù)防時(shí)是否需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究，例如診斷性的牙齒印模。而且，其優(yōu)點(diǎn)是可以簡(jiǎn)單地監(jiān)控治療的過程。
表述“齲齒的風(fēng)險(xiǎn)”在本發(fā)明中可以理解為患齲齒的患者基本風(fēng)險(xiǎn)，以及取決于天數(shù)和飲食習(xí)慣的風(fēng)險(xiǎn)。為了確定受口腔菌叢基本組成控制的基本風(fēng)險(xiǎn)，在使用本發(fā)明方法之前，患者應(yīng)進(jìn)行簡(jiǎn)單的清潔處理，如漱口和/或牙齒清潔，宜為牙齒清潔。當(dāng)確定取決于天數(shù)和飲食習(xí)慣的風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，并不是必須進(jìn)行清潔處理，但是本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案仍然要進(jìn)行。
說(shuō)明書中，表述“包含”和“包括”是指非排他性的列舉。
本發(fā)明所用的唾液試驗(yàn)是如下令人驚奇的發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)的為了符合合適的預(yù)防條件，乳酸的形成明顯適于作為用于確定主要的病人相關(guān)的齲齒的風(fēng)險(xiǎn)的微生物新陳代謝活性的測(cè)量方法，并可以通過乳酸的量化和半量化來(lái)確定。
在本發(fā)明中，表述“乳酸鹽”被認(rèn)為是L(+)-乳酸鹽，而表述“乳酸鹽脫氫酶(LDH)認(rèn)為是L(+)-乳酸鹽脫氫酶。
為了檢測(cè)乳酸，原則上可以包括產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的化學(xué)、生物化學(xué)或者物理學(xué)反應(yīng)。
令人驚奇的是，發(fā)現(xiàn)氧化還原抑制劑和唾液組分之間不適宜的副反應(yīng)可以通過保持乳酸鹽脫氫酶、唾液和抑制劑即丙酮酸鹽之間的量比率來(lái)抑制。這一發(fā)現(xiàn)令人驚奇的原因是丙酮酸鹽是已知的乳酸脫氫酶抑制劑(見例如Williams，R.A.，Uritani，I.，J.Biochem.1193-1201(1977))。對(duì)本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，與技術(shù)講解相反，為了能將非特異性的唾液的副反應(yīng)抑制在可以通過乳酸鹽脫氫酶和氧化還原抑制劑對(duì)乳酸進(jìn)行酶測(cè)定的范圍內(nèi)，測(cè)量酶(在這個(gè)情況中是乳酸鹽脫氫酶)必須在抑制劑存在下使用。這是一個(gè)不可預(yù)見的解決方法。表述“丙酮酸鹽”認(rèn)為是丙酮酸或其鹽，尤其是其Na或K鹽。
為了借助乳酸鹽脫氫酶來(lái)酶測(cè)定唾液中的乳酸，必須保持唾液和乳酸鹽脫氫酶之間合適的量比率，所述脫氫酶可以從例如細(xì)菌宜為乳酸桿菌、鏈球菌或者葡萄球菌，從動(dòng)物宜為豬、牛類、雞或者兔子，從植物或者從人類組織如胎盤中獲得。每0.1ml唾液應(yīng)使用0.001-100單位的乳酸鹽脫氫酶，宜為0.01-10單位乳酸鹽脫氫酶，更好是0.05-1單位乳酸鹽脫氫酶。
此外，丙酮酸鹽的濃度應(yīng)為0.001-5微摩爾每0.1ml唾液，宜為0.01-2.5微摩爾每0.1ml唾液，更好是0.01-1微摩爾每0.1ml唾液。
1單位乳酸鹽脫氫酶應(yīng)認(rèn)為是每毫克蛋白質(zhì)每分鐘轉(zhuǎn)化1微摩爾丙酮酸鹽。
作為例子，本發(fā)明可以使用以下所述的氧化還原指示劑亞甲基藍(lán)、氯化5-氰基-2，3-二甲苯基-四唑鎓(CTC)、氯化2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓(INT)、8-二甲氨基-2，3-苯并吩噁嗪(Meldola’s藍(lán))、1-甲氧基-吩嗪甲基硫酸鹽(MPMS)、5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4，5-二甲基噻唑基)-3-(4-磺基苯基)-四唑鎓(MTS)、溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓(MTT)、氯化3，3’-(3，3’-二甲氧基-4，4’-聯(lián)苯基)-二[2-(4-硝基苯基-5-苯基)]-2H-四唑鎓(NBT)、硝基-四唑鎓紫羅蘭(NTV)、吩嗪甲基硫酸鹽(PMS)、3’-[1-[(苯基氨基)羰基]-3，4-四唑鎓]二(4-甲氧基-6-硝基)-苯磺酸鈉(XTT)、吩嗪乙基硫酸鹽(PES、WST-1)。
優(yōu)選Meldola’s藍(lán)、PES、PMS、MTS、MTT和XTT；尤其優(yōu)選PES、PMS、MTS和MTT。
在試驗(yàn)混合物中氧化還原指示劑的濃度為0.001-10mmol/l，宜為0.01-5mmol/l，更加宜為0.05-2mmol/l。
根據(jù)需要，在試驗(yàn)中所述氧化還原指示劑可以以固體形式使用，例如，粉末、顆?；蛘咂瑒?。
本發(fā)明中，宜以非限制和非抑制量使用NAD，例如，以整個(gè)試驗(yàn)混合物計(jì)，其量例如為0.01-10mmol/l，宜為0.05-5mmol/l，更加宜為0.1-1mmol/l。
根據(jù)需要，在試驗(yàn)中NAD可以以固體形式使用，例如，粉末、顆?；蛘咂瑒?。
來(lái)自細(xì)菌、動(dòng)物和植物的乳酸鹽脫氫酶具有在4.0-10.0之間的最佳pH。根據(jù)所用的乳酸鹽脫氫酶，必須使用具有不同pH值的合適緩沖溶液。合適的緩沖物質(zhì)如下所述·磷酸鹽，例如磷酸鈉、磷酸氫鈉、磷酸二氫鈉、磷酸鉀、磷酸氫鉀、磷酸二氫鉀、焦磷酸鹽；·碳酸鹽，例如碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀；·乙酸/乙酸鹽；檸檬酸/檸檬酸鹽、二乙基巴比妥酸、三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS)、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸(Glygly)、N-(2-乙酰氨基)-2-氨基-乙基磺酸(ACES)、N-(2-乙酰氨基)亞氨基雙乙酸鹽(ADA)、N，N-二(2-羥乙基)-2-氨基乙基磺酸(BES)、N，N-二(2-羥乙基)甘氨酸(BICINE)、2，2-二(羥乙基)亞氨基三(羥甲基)甲烷(BIS-TRIS)、2-(環(huán)己基氨基)乙基磺酸(CHES)、2-[4-(2-羥乙基-1-哌嗪)]乙基磺酸(HEPES)、3-[4-(2-羥乙基-1-哌嗪基)]-丙基磺酸(HEPPS)、2-嗎啉代乙基磺酸(MES)、3-嗎啉代丙基磺酸(MOPS)、哌嗪-1，4-二(2-乙基磺酸)(PIPES)、N-[三(羥甲基)-甲基]-2-氨基乙基磺酸(TES)、N-三(羥甲基)-甲基]甘氨酸(TRICINE)。
優(yōu)選磷酸緩沖劑、Tris緩沖劑、Glygly緩沖劑和乙酸/乙酸鹽緩沖劑。
根據(jù)所述檢測(cè)反應(yīng)，要求pH值在1-12之間。所述緩沖劑的濃度根據(jù)需要可以為0.001-5.0mol/l，宜為0.01-1.0mol/l，最好為0.1-0.5mol/l。
根據(jù)需要，在所述試驗(yàn)中使用限定量的固體形式如粉末或者片劑形式的緩沖物質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)反應(yīng)溶液的pH調(diào)節(jié)。按需要，緩沖物質(zhì)也可以以液體形式用于所述試驗(yàn)中。
緩沖物質(zhì)、氧化還原指示劑、NAD和乳酸鹽脫氫酶以及其它生產(chǎn)助劑可以作為固體形式的混合或者作為固體和液體形式的混合形式，例如作為1mg-20g、宜為10mg-10g、更好是50mg-5g、更加適宜是100mg-1g的粉末，或者呈片劑形式，例如1-20片，宜為2-10片，更好是3-5片加入。所述片劑的重量例如可以為1mg-2g、宜為10mg-1.5g、很好是100mg-1g。
生產(chǎn)助劑認(rèn)為是例如來(lái)自草藥化學(xué)的助劑，例如葡聚糖、糖、氧化鋁、玻璃、石英、纖維素衍生物、臘、脂肪和鹽。
也可以將緩沖物質(zhì)、氧化還原指示劑、NAD和乳酸鹽脫氫酶以液體狀加入唾液樣品中，若它們?yōu)橐后w時(shí)，可以直接加入其中，或者預(yù)先溶解在溶劑如水、乙醇或者丙醇中?？梢允褂?.001-20ml、宜為0.01-10ml、很適宜的是0.1-1ml的體積。
在例如限定時(shí)間間隔為0.01-60分鐘、宜為0.1-30分鐘，更好是1-10分鐘之后評(píng)估所述可檢測(cè)的信號(hào)，或者終止待測(cè)代謝產(chǎn)物形成和/或可檢測(cè)信號(hào)產(chǎn)生的情況下，以平行連續(xù)工藝進(jìn)行檢測(cè)乳酸的形成和可檢測(cè)信號(hào)的產(chǎn)生。
為了終止的目的，可以考慮例如停止反應(yīng)試劑如抑制劑(例如磷酸鹽)或者突然改變pH，例如通過鹽酸或氫氧化鈉溶液來(lái)抑制的例子；或者加入蛋白酶類或表面活性劑。
在例如限定時(shí)間間隔為0.01-60分鐘、宜為0.1-30分鐘，更好是1-10分鐘之后終止乳酸形成的情況下，所述乳酸的形成也可以在獨(dú)立孵化步驟中進(jìn)行。
為了終止的目的，可以考慮例如停止加入反應(yīng)試劑(如上所述)、或者將樣品的溫度加熱至50-100℃，或者停止加入反應(yīng)試劑和升高溫度相結(jié)合。
為了終止微生物形成乳酸，可以使用各種方法，例如·用高能光如UV進(jìn)行照射·放射性處理·熱處理·pH變化，例如通過加入酸或堿·加入表面活性劑·加入抑制劑，如重金屬鹽、烷化劑·加入殺死微生物的物質(zhì)，例如溶菌酶、三氯生、洗必太、滔羅定(taurolidine)·除去所研究唾液樣品中的微生物，例如使用消毒濾網(wǎng)的超濾、微濾或者離心分離或者兩種或多種方法的組合。
為了進(jìn)行本發(fā)明的試驗(yàn)，例如將0.001-20ml、宜為0.01-10ml，更好為0.1-1ml的唾液轉(zhuǎn)移到反應(yīng)容器中。通常，所用唾液的量必須至少足夠用于獲得及為產(chǎn)生信號(hào)的添加劑的結(jié)果的可檢測(cè)的信號(hào)，來(lái)進(jìn)行乳酸鹽測(cè)定。
有利的是，也可以將來(lái)自口腔區(qū)域的微生物通過機(jī)械作用轉(zhuǎn)移到唾液中，然后將唾液樣品轉(zhuǎn)移到反應(yīng)容器中。例如，使用合適的器具如壓舌板或者刮刀從其上釋放舌頭的舌層，僅在此后取出所述樣品。
也可以將借助合適取樣器具從口腔合適位置獲得的微生物樣本，而不是直接的唾液樣本，并對(duì)該樣本而不是唾液進(jìn)行本發(fā)明的基本方法。在這種情況下，優(yōu)選從0.01-25cm2，宜為0.1-10cm2，更好是1-5cm2的舌頭區(qū)域借助棉簽、藥簽或者其它吸收材料和器具取出舌頭上的舌層(coating)。通常，所述舌頭涂層必須從舌頭區(qū)域上取出，其量必須至少足夠用于獲得作為產(chǎn)生信號(hào)的添加劑的結(jié)果的可檢測(cè)的信號(hào)，來(lái)進(jìn)行乳酸鹽測(cè)定。
有利的是，為了使患者有關(guān)的患者唾液中的可檢測(cè)信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化，往唾液中加入最大可能形成乳酸的物質(zhì)，例如糖、宜為蔗糖和葡萄糖。這些物質(zhì)可以以固體或液體的形式或者固體和液體的混合形式加入。
在唾液取樣或者取出舌頭舌層之前，例如可以用糖溶液如含糖量為0.1-70％，宜為1-50％，更好是5-30％的葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖和麥芽糖水溶液漱口。
其它優(yōu)點(diǎn)是可以往唾液樣品本身加入到達(dá)0.1-70％糖，1-50％糖，宜為5-30％糖飽和度的糖，如葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖和麥芽糖。
也可以在唾液取樣和取出舌頭舌層之前，將0.1-10g，宜為0.5-5g，更好是1-2g呈例如立方糖、粉末糖或糖片形式的糖溶解在口腔中。
為了使用棉簽、藥簽或其它吸收材料取出舌頭舌層，有利的是用包含0.1-70％糖，宜為1-50％糖，更好是5-30％糖的溶液浸泡后者，并在干燥之后再使用。
在本發(fā)明方法的其它優(yōu)選實(shí)施方案中，例如用于取出舌頭舌層的棉簽、藥簽或者其它吸收材料可以包含一種或多種診斷組分，例如上文所述的蔗糖、NAD、MTP、PMS、LDH或者丙酮酸鹽。其中，優(yōu)選使用本文所述的NAD。
在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于取出舌頭舌層的棉簽、藥簽或其它吸收材包含上述的至少一種糖的溶液和至少一種診斷組分，如NAD。
如DE 29714246U中所述的，實(shí)際上本發(fā)明可以例如以氣泡包裝的形式獲得。這種表達(dá)方式允許本發(fā)明的方法以尤其簡(jiǎn)單的方式進(jìn)行。
本發(fā)明也涉及使用診斷印?；旌衔镂恢锰禺?location-specific)確定病人相關(guān)的齲齒的風(fēng)險(xiǎn)的方法。
在這種情況下，首先通過上述本發(fā)明的方法確定病人相關(guān)的齲齒的風(fēng)險(xiǎn)，如果是正風(fēng)險(xiǎn)，使用診斷印?；旌衔飶闹辽僖粋€(gè)顎區(qū)域，例如上顎和/或下顎取出印模。
合適的診斷印?；旌衔锸抢鐏?lái)自DE-A-19926728的那些，尤其是藻酸鹽、聚醚、聚硅氧烷或者聚醚-聚硅氧烷基的化合物。這種化合物是可以硬化的，或者形成薄膜的載體材料，它們包含0.0001-10重量％優(yōu)選量用于位置特異和物質(zhì)特異口內(nèi)診斷的添加劑。根據(jù)該說(shuō)明書，合適的診斷添加劑是染料指示劑、抗體、酶和那些熟知診斷試驗(yàn)體系發(fā)展的技術(shù)人員熟悉的任何其它物質(zhì)。
在完全硬化的印模材料中，這種?；衔锍尸F(xiàn)可檢測(cè)信號(hào)，例如在存在齲齒增大風(fēng)險(xiǎn)的位置出現(xiàn)顏色。為此，選擇使用促進(jìn)齲齒微生物的代謝產(chǎn)物作為所用檢測(cè)方法中的活性種類。
在這種情況下，可以使用例如預(yù)制的診斷印?；旌衔?。但是，也可以使用其它常規(guī)的印?；旌衔?，進(jìn)行治療的人通過加入有診斷效果的物質(zhì)可以將其轉(zhuǎn)化成具有診斷功能的印模混合物。
以下，通過實(shí)施例更加詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不局限于此。
實(shí)施例應(yīng)用實(shí)施例1為了混合產(chǎn)生信號(hào)的溶液，使用吸液管將0.1mlNAD溶液(30mmol/l原液NAD在50mmol/lGlygly緩沖液中，pH9.0)0.1mlMTT(1.5mmol/l原液MTT在50mmol/lGlygly緩沖液中，pH9.0)、0.1ml PMS溶液(1.0mmol/l原液PMS在50mmol/lGlygly緩沖液中，pH9.0)、0.1mlLDH溶液(60單位/ml原液乳酸鹽脫氫酶(LDH)在50mmol/lGlygly緩沖液中，pH9.0)和0.1ml丙酮酸鹽溶液(25mmol/l原液丙酮酸鹽在50mmol/lGlygly緩沖液中，pH9.0)轉(zhuǎn)移到具有螺旋封蓋的塑料試驗(yàn)管中，關(guān)閉螺旋蓋并振蕩5秒。
患者從嘴中收集唾液，并將至少lml唾液轉(zhuǎn)移到具有螺旋封蓋的5ml塑料試驗(yàn)管中。使用吸液管，將0.6ml轉(zhuǎn)移到已經(jīng)包含0.25g蔗糖的反應(yīng)容器中。用螺旋蓋封閉所述反應(yīng)容器，并振蕩5秒。
3分鐘后，將產(chǎn)生信號(hào)的溶液加入反應(yīng)容器的唾液樣品中。將所述封閉的反應(yīng)容器振蕩5秒。3分鐘后，往反應(yīng)容器中加入0.4ml乙酸溶液(在水中的1mol/l原液乙酸)來(lái)終止所述可檢測(cè)信號(hào)的產(chǎn)生。反應(yīng)過程可伴隨著顏色從黃到藍(lán)的變化來(lái)跟蹤。黃色表明沒有齲齒風(fēng)險(xiǎn)，且藍(lán)色越強(qiáng)表明齲齒的風(fēng)險(xiǎn)越高。
在入射光波長(zhǎng)為570nm的條件下，使用體積為1ml的塑料杯在UVIKON930分光光度計(jì)中測(cè)量消光ΔE/分鐘為0.957。
對(duì)比例1a如應(yīng)用實(shí)施例1所述進(jìn)行對(duì)比例1a，但是沒有加入丙酮酸鹽。測(cè)得消光度為3.3。
對(duì)比例1b如應(yīng)用實(shí)施例1所述進(jìn)行對(duì)比例1b，但是沒有加入丙酮酸鹽和LDH。測(cè)得消光度為0.815。
對(duì)比例1c如應(yīng)用實(shí)施例1所述進(jìn)行對(duì)比例1c，但是沒有加入LDH。測(cè)得消光度為0.156。
對(duì)比例1a-1c以及應(yīng)用實(shí)施例1表明即使丙酮酸鹽確實(shí)抑制LDH(對(duì)比例1a)，由丙酮酸鹽產(chǎn)生的抑制作用通過增大LDH的加入量(對(duì)比例1b)過補(bǔ)償，不過抑制了一種或多種未知的副反應(yīng)(對(duì)比例1c)。
應(yīng)用實(shí)施例2為了混合產(chǎn)生信號(hào)的溶液，使用吸液管將0.1mlNAD溶液(30mmol/l原液NAD在50mmol/lGlygly緩沖液中，pH9.0)、0.1mlMTT(1.5mmol/l原液MTT在50mmol/lGlygly緩沖液中，pH9.0)、0.1ml PMS溶液(1.0mmol/l原液PMS在50mmol/lGlygly緩沖液中，pH9.0)、0.1mlLDH溶液(40單位/ml原液乳酸鹽脫氫酶(LDH)在50mmol/lGlygly緩沖液中，pH9.0)和0.1ml丙酮酸鹽溶液(2.5mmol/l原液丙酮酸鹽在50mmol/lGlygly緩沖液中，pH9.0)轉(zhuǎn)移到具有螺旋封蓋的塑料試驗(yàn)管中，關(guān)閉螺旋蓋并振蕩5秒。
使用吸液管，將100微升轉(zhuǎn)移到2cm×0.6cm×0.78cm的吸收藥簽上，并冷凍干燥。將所述干燥的藥簽表面對(duì)表面地粘到聚酯帶(7cm×0.6cm×0.25cm)的一端。如應(yīng)用實(shí)施例1第二段所述的，在反應(yīng)容器中已經(jīng)預(yù)先制備了唾液樣品。將所述試驗(yàn)帶上的藥簽完全引入唾液樣品中。3分鐘之后，將所述試驗(yàn)帶藥簽浸漬在包含2ml終止試劑的容器中，所述終止試劑由pH為7.5的50mmol/l磷酸氫鈉溶液組成。在所述試驗(yàn)帶上藥簽的藍(lán)色越強(qiáng)，齲齒的風(fēng)險(xiǎn)就越高。
應(yīng)用實(shí)施例3如應(yīng)用實(shí)施例2第一段所述，制備產(chǎn)生信號(hào)的溶液?；颊咴试S將糖溶解在嘴中，并收集嘴中的唾液。將棉簽(例如，Q-Tip)伸入嘴中，并放置5秒，使其浸漬充滿唾液。將所述棉簽浸泡唾液的的棉絮區(qū)域浸漬在產(chǎn)生信號(hào)的溶液中，并留在那里3分鐘。然后評(píng)價(jià)在棉簽的棉絮區(qū)域中產(chǎn)生的藍(lán)色。所述藍(lán)色越強(qiáng)，表明齲齒的風(fēng)險(xiǎn)越高。
應(yīng)用實(shí)施例4如應(yīng)用實(shí)施例2第一段所述制備試驗(yàn)帶?；颊咴试S將立方糖溶解在嘴中。將所述試驗(yàn)帶放入嘴中，并將吸收藥簽置于舌頭的中部，并進(jìn)行摩擦，從舌頭上獲得舌層。將所述試驗(yàn)帶的吸收藥簽浸漬在產(chǎn)生信號(hào)的溶液中，并留在那里3分鐘。然后評(píng)價(jià)在藥簽上產(chǎn)生的藍(lán)色。所述藍(lán)色越強(qiáng)，表明齲齒的風(fēng)險(xiǎn)越高。
應(yīng)用實(shí)施例5如應(yīng)用實(shí)施例1-4所述的，在這種成套組件中包含用于進(jìn)行所述唾液試驗(yàn)的成分。在袋中包含20g藻酸鹽，用于診斷印模。將所述藻酸鹽轉(zhuǎn)移到攪拌碗(250ml)中。將根據(jù)DE-A-19926728所制備的并包含0.26g甘氨酰甘氨酸、0.24g三(羥甲基)氨基甲烷、36mgNAD、0.9mg吩嗪甲基硫酸鹽、3mg溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓(MTT)和1850單位的乳酸鹽脫氫酶的產(chǎn)生信號(hào)的溶液置于容器中，借助所述溶液可以觀察到因牙斑上引起齲齒的微生物所導(dǎo)致的乳酸釋放。將所述產(chǎn)生信號(hào)的溶液加入藻酸鹽中。并立刻用手工刮刀混合所述混合物知道均勻(約30分鐘)。同時(shí)，制備所述印?；旌衔铮颊咴试S將立方糖溶解在嘴中。將所述印?；旌衔锛尤胗∧５鬃?。為了取出所述印模，將所述印模底座壓在上顎或者下顎上，并留在那里3分鐘。將所述印模從最終取出。牙齒上攜帶新陳代謝活性、會(huì)引起齲齒的微生物的位置通過印?；旌衔锷系乃{(lán)點(diǎn)和藍(lán)色區(qū)域顯示出來(lái)。所述藍(lán)色越強(qiáng)，表明齲齒的局部風(fēng)險(xiǎn)越高。唾液試驗(yàn)確定的齲齒風(fēng)險(xiǎn)可以和牙齒上存在的齲齒風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行比較。
應(yīng)用實(shí)施例6使用DE 2971246U中的水泡。用50重量％糖溶液浸漬棉簽(例如，Q-Tip)。將所述棉簽置于嘴中，并在舌頭中部進(jìn)行摩擦和旋轉(zhuǎn)，從舌頭上獲得舌層。將棉簽引入水泡(blister)的第一儲(chǔ)液池中。通過擠壓所述第二儲(chǔ)液池，將應(yīng)用實(shí)施例2第一段所制備的產(chǎn)生信號(hào)的溶液流入所述第一儲(chǔ)液池中。通過旋轉(zhuǎn)所述棉簽，用產(chǎn)生信號(hào)的溶液潤(rùn)濕所述具有唾液樣品的區(qū)域。3分鐘之后從水泡中取出所述棉簽。
對(duì)比例1制備對(duì)比例1和2，來(lái)顯示在專利申請(qǐng)US4,351,899和US4,254,222的論述不適于確定病人患上齲齒的風(fēng)險(xiǎn)。
在專利申請(qǐng)US4,351,899和US4,254,222的論述中，包含0.6微摩爾乳酸鹽、0.6微摩爾NAD、0.03微摩爾MTT、0.02微摩爾PMS和0.6單位乳酸鹽脫氫酶的0.1mlGlygly緩沖溶液pH9.0加入100微升唾液中，并進(jìn)行徹底地混合。在570nm下，使用微量板讀出器(來(lái)自Molecular Device)進(jìn)行反應(yīng)過程。測(cè)得消光度增加為0.6/分鐘。在沒有唾液的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，測(cè)得消光度的改變?yōu)?.1/分鐘。結(jié)果唾液抑制信號(hào)形成所需的酶乳酸鹽脫氫酶至45％。
對(duì)比例2在專利申請(qǐng)US4,351,899和US4,254,222的論述中，將包含0.6微摩爾乳酸鹽、0.6微摩爾NAD、0.03微摩爾MTT和0.02微摩爾PMS的0.1mlGlygly緩沖溶液pH9.0加入100微升唾液中，并進(jìn)行徹底地混合。在570nm下，使用微量板讀出器(來(lái)自Molecular Device)進(jìn)行反應(yīng)過程。即使沒有乳酸鹽脫氫酶的存在，測(cè)得消光度增加為0.4/分鐘。在存在0.3單位乳酸鹽脫氫酶的比較實(shí)驗(yàn)中，測(cè)得消光度的改變?yōu)?.2/分鐘。結(jié)果唾液包含其本身能還原氧化還原指示劑PMS/MTT并因此歪曲測(cè)量信號(hào)50％的組分。
權(quán)利要求
1.在來(lái)自口腔的樣品中使用乳酸和/或乳酸鹽來(lái)確定病人相關(guān)的齲齒的風(fēng)險(xiǎn)的方法，其特征在于，當(dāng)樣品體積為0.1ml的生物液體時(shí)，加入0.001～100單位乳酸鹽脫氫酶，并加入濃度為0.001-5微摩爾每0.1樣品體積的丙酮酸鹽，當(dāng)從0.01-25cm2的口腔表面獲得的生物膜時(shí)，加入0.001-100單位乳酸鹽脫氫酶，其中在上述兩種情況下，以整個(gè)試驗(yàn)混合物計(jì)，NAD的存在濃度為0.01-10mmol/l，隨后測(cè)量所產(chǎn)生的NADH的量。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在至少一個(gè)口腔區(qū)域中，僅在將微生物通過機(jī)械作用轉(zhuǎn)移到唾液中之后取出所述樣品體積。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述口腔區(qū)域是舌頭。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在進(jìn)行取樣之前，將引起或增加乳酸和/或乳酸鹽形成，或者阻止或者妨礙不利于乳酸和/或乳酸鹽的物質(zhì)形成的物質(zhì)加入唾液中。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，在進(jìn)行所述檢測(cè)方法之前，加入至少一種緩沖溶液。
6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在從口腔中取出樣品體積之后，往樣品中加入丙酮酸鹽。
7.用于位置特異性確定病人相關(guān)的齲齒的風(fēng)險(xiǎn)的方法，其特征在于，使用上述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，隨后使用診斷性印?；旌衔锶〉糜∧?，所述混合物包含形成薄膜的載體材料和診斷物質(zhì)。
8.一種成套組件，所述組件包括·至少一個(gè)樣品管，·至少一個(gè)吸取裝置，·至少一種緩沖物質(zhì)，·其量為0.001-100單位每0.1ml樣品體積的乳酸鹽脫氫酶，·以整個(gè)試驗(yàn)混合物計(jì)，濃度為0.01-10mM的NAD。
9.權(quán)利要求8所述的成套組件，所述組件還包括·濃度為0.001-5微摩爾每0.1ml樣品量的丙酮酸鹽。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過確定唾液中乳酸和/或乳酸鹽來(lái)確定病人相關(guān)的齲齒的風(fēng)險(xiǎn)的方法，以及用于局部明確確定病人相關(guān)的齲齒的風(fēng)險(xiǎn)的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK1646699SQ02805302
公開日2005年7月27日 申請(qǐng)日期2002年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月23日
發(fā)明者I·哈伯林, I·瓦格納, R·古根伯格, T·博克坎普, C·施泰因拜斯, M·巴德－丹齊格 申請(qǐng)人:3M埃斯佩股份公司