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雙岐桿菌的絲氨酸蛋白酶抑制劑的制作方法

文檔序號:602187閱讀:278來源:國知局
專利名稱:雙岐桿菌的絲氨酸蛋白酶抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及雙歧桿菌的新基因以及此基因編碼的多肽。特別地,本發(fā)明是關(guān)于屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serpin)超家族的一個基因及其在細(xì)菌絲氨酸蛋白酶抑制劑生產(chǎn)中的應(yīng)用。同樣提供生產(chǎn)細(xì)菌絲氨酸蛋白酶抑制劑多核苷酸和/或多肽的載體、宿主細(xì)胞、以及方法。
乳酸菌可用于長時間儲存和制備食物原料,這主要得益于它的低pH及其發(fā)酵活性期內(nèi)產(chǎn)生的產(chǎn)物的作用。此外,乳酸菌與多種食品產(chǎn)物的生產(chǎn)相關(guān),例如奶酪或酸奶。
最近,乳酸菌特別是乳酸桿菌和雙歧桿菌引起很大的關(guān)注,這是由于已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它們的一些菌株在人和動物的攝食過程中展現(xiàn)出一些很有價值的特性。這些菌株通常被認(rèn)為是益生菌,發(fā)現(xiàn)它們能夠在胃腸道中普遍存在的嚴(yán)苛環(huán)境條件下存活,并且能夠至少在腸粘膜上短暫集群,在這里它們對摻入它們的生物的產(chǎn)生陽性反應(yīng)。
在EP 0 768 375中公開了雙歧桿菌屬的這樣一株益生菌株,此菌株可以移植入腸道菌群中。據(jù)報導(dǎo),此雙歧桿菌可以輔助宿主的免疫調(diào)節(jié),并且可以競爭性地排除致病菌對腸細(xì)胞的粘附,從而可以支持個體健康的維持。
此外,在參考文獻(xiàn)EP 0 577 903中使用了具有替代幽門螺桿菌能力的乳酸菌,而幽門螺旋菌是公認(rèn)的潰瘍發(fā)展原因。
并且,在WO 97/00078中公開的一個特有的乳酸桿菌菌株就是這樣的益生菌,命名為乳酸桿菌GG(ATCC 53103)。此微生物可用來防止或治療食物引起的過敏反應(yīng)。
考慮到這些益生菌株可提供有價值的特性,特別希望能得到關(guān)于這些菌株生物學(xué)方面的詳細(xì)信息,尤其是關(guān)于其與宿主的相互作用、它們能在腸道不同環(huán)境中生存的現(xiàn)象以及它們粘附腸粘膜的能力。特別地,其在免疫系統(tǒng)增強(qiáng)和防御病原體方面的作用引起了很大關(guān)注。
因此,本發(fā)明的一個問題就是提供關(guān)于展示出對人和/或動物有益的特性的細(xì)菌菌株資料并進(jìn)行說明。
在研究益生菌雙歧桿菌BL29菌株基因組過程中,本發(fā)明的發(fā)明者們驚訝地發(fā)現(xiàn)了一個展示出與絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族基因具有中等程度的同源性的基因(絲氨酸蛋白酶抑制劑)。目前為止僅在更高等生物體的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)這種類型的基因,例如人和植物細(xì)胞,但在細(xì)菌中沒有發(fā)現(xiàn)。
結(jié)果,本發(fā)明提供了一種核酸,此核酸為SEQ ID.NO.1或編碼功能性多肽的其部分或變體,此變體與SEQ ID.NO.1具有約75%的同源性,優(yōu)選80%,更優(yōu)選85%,甚至更優(yōu)選90%,甚至更優(yōu)選95%。
依照一個替代性實施方案,本發(fā)明也涉及多肽SEQ ID.NO.2或其功能性部分或變體,此變體與SEQ ID.NO.2具有約75%的同源性,優(yōu)選80%,更優(yōu)選85%,甚至更優(yōu)選90%,甚至更優(yōu)選95%。
絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serpins)包含不同的蛋白群,而此蛋白形成了包含100多個成員在內(nèi)的超家族。多數(shù)絲氨酸蛋白酶抑制劑充當(dāng)?shù)鞍酌敢种苿┎⑴c對一些蛋白酶活化的生理過程的調(diào)節(jié),其對于個體非常重要,例如血液凝固、補(bǔ)體介導(dǎo)的溶解、免疫應(yīng)答、腎小球腎炎、痛覺、炎癥、胰腺炎、癌癥、受精調(diào)節(jié)、細(xì)菌感染和病毒成熟。雖然絲氨酸蛋白酶抑制劑的主要功能體現(xiàn)在對絲氨酸蛋白酶活性的中和上,但發(fā)現(xiàn)這些多肽在細(xì)胞外基質(zhì)重塑和細(xì)胞遷移過程中也起作用。
絲氨酸蛋白酶抑制劑的示例包括α1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶III、纖溶酶原激活劑抑制劑1(PAI-1)或纖溶酶原激活劑抑制劑2。
到目前為止絲氨酸蛋白酶抑制劑是進(jìn)行了大量研究的實驗對象,它們都有一個共有的特征環(huán),稱為反應(yīng)位點環(huán)(RSL),其從包含相關(guān)絲氨酸蛋白酶活性位點的識別序列的分子表面向外延伸。據(jù)認(rèn)為,每個抑制劑的特異性主要由絲氨酸蛋白酶抑制劑的潛在切割位點氨基末端側(cè)緊鄰的氨基酸的身份所確定。已知這個氨基酸是Pi位點殘基,據(jù)認(rèn)為它與絲氨酸蛋白酶的活性位點的絲氨酸形成酰基鍵。
絲氨酸蛋白酶抑制劑似乎作為“自殺抑制劑”而與靶蛋白酶形成1∶1的化學(xué)數(shù)量復(fù)合物,從而阻斷它們的活性。依照目前的資料顯示抑制劑在反應(yīng)中心被切割,并且復(fù)合物最有可能作為共價酰基-酶復(fù)合物被捕獲。
由于絲氨酸蛋白酶抑制劑參與較高級的生物的復(fù)雜生物學(xué)過程,例如免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)或炎癥反應(yīng)或甚至細(xì)胞外基質(zhì)的重塑,所以就沒有預(yù)想到它們出現(xiàn)在原核生物中。事實上,到目前為止沒有源自于原核細(xì)胞的絲氨酸蛋白酶抑制劑的報道。
因此,本發(fā)明者第一次發(fā)現(xiàn)一些細(xì)菌細(xì)胞可能也包含絲氨酸蛋白酶抑制劑。不受任何理論的約束,目前假定衍生該抑制劑的雙歧桿菌菌株的益生特性如免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)或已知的特性至少部分歸因于絲氨酸蛋白酶抑制劑的存在。
在本申請的上下文中,本發(fā)明中的核酸指定為多核苷酸SEQ.ID.NO.1或可產(chǎn)生功能性多肽的其部分或變體。為了此目的,可在SEQ.ID.NO.1所示的核酸的末端進(jìn)行一定程度的截短,其產(chǎn)生的多肽仍然能產(chǎn)生生物學(xué)功能。同樣的,在所得到的多肽仍然保持生物學(xué)的功能的前提下,可通過一個或多個核苷酸的缺失、添加或取代而對核酸進(jìn)行修飾。
同樣的,此處描述的多肽也是如此。根據(jù)本發(fā)明,術(shù)語多肽指定為SEQ ID NO.2或其功能性部分或變體。因此,可在SEQ ID NO.2中所示的多肽的末端進(jìn)行一定程度的截短,該多肽仍然能產(chǎn)生生物學(xué)功能。同樣的,在所得到的多肽仍然保持生物學(xué)的功能的前提下,可通過一個或多個氨基酸的缺失、添加或取代而對多肽進(jìn)行修飾。
根據(jù)一種實施方案,以上提及的核酸可插入到合適的宿主細(xì)胞并在其中表達(dá)。為了此目的,本發(fā)明的核酸可插入到允許其在所需宿主細(xì)胞中增殖和/或表達(dá)并允許其插入的合適載體中。此載體應(yīng)包含一個能夠穩(wěn)定增殖的標(biāo)記基因。
同樣地,利用同源重組現(xiàn)象或其他僅允許核酸插入到宿主的染色體上的技術(shù)也可將本發(fā)明的核酸包含在宿主基因組中。這些技術(shù)在如EP 93 105 303.7中有描述,其內(nèi)容在此處引用作為參考。
依賴于是否基因產(chǎn)物將過量表達(dá),也即為了收集和純化多肽,或表達(dá)至一定程度從而通過載體系統(tǒng)如微生物遞送給個體,可將本發(fā)明的核酸置于內(nèi)源或外源調(diào)節(jié)子如啟動子控制之下。調(diào)節(jié)子如啟動子優(yōu)選為可調(diào)節(jié)的和/或可誘導(dǎo)的,并且可通過公認(rèn)的且易操作的方法將其與編碼分子進(jìn)行可操作性連接。
然后,將這些重組的構(gòu)建體導(dǎo)入以在合適的宿主細(xì)胞,如原核宿主細(xì)胞如大腸桿菌、乳酸桿菌、鏈球菌或雙歧桿菌或真核宿主細(xì)胞如釀酒酵母、昆蟲細(xì)胞、CHO或COS細(xì)胞中表達(dá),并在允許異源基因表達(dá)的環(huán)境中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。應(yīng)該明白,本核發(fā)明中的多核苷酸的基因產(chǎn)物在真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)時會進(jìn)行糖基化。
本發(fā)明另一個方面也包括至少包含本發(fā)明的核酸的一個拷貝的重組微生物。此核酸可包含在用來向個體遞送靶物質(zhì)的微生物中。在此方面,益生菌是適合的,因為它們能夠通過個體的胃腸道并至少可短暫植入宿主的腸粘膜中。在這個位點上,它能夠發(fā)揮衍生其的本發(fā)明的益生菌株BL29的生物學(xué)功能。不受任何理論的約束,目前認(rèn)為此核酸的基因產(chǎn)物參與雙歧桿菌BL29菌株所顯示的抗炎活性。同樣,任何已包含本發(fā)明的核酸的菌株都可作為宿主細(xì)胞,其中也可能包括額外的靶核酸拷貝。
宿主細(xì)胞可表達(dá)本發(fā)明中的核酸的基因產(chǎn)物。因而宿主細(xì)胞可以用來大量合成本發(fā)明的多肽。
本發(fā)明的“宿主細(xì)胞”可以通過重組方法得到,因為可將本發(fā)明的核酸插入到合適的細(xì)胞中。然而,為了增加含有此類多肽的雙歧桿菌中的雙歧桿菌-絲氨酸蛋白酶抑制劑量,雙歧桿菌本身可經(jīng)由普通突變篩選技術(shù)從而使得具有提高的相應(yīng)基因產(chǎn)物量。
蛋白分離可通過已知的方法從宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞培養(yǎng)物上清中進(jìn)行。Ausubel I.,F(xiàn)rederick M.,Current Protocols in Mol.Biol.(1992),John Wiley and Sons,New York中對這些方法進(jìn)行了描述。可運(yùn)用已知的包括免疫沉淀、凝膠過濾、離子交換層析、層析聚焦、等電聚焦、選擇性沉淀、電泳等在內(nèi)的蛋白純化技術(shù),通過親和層析從重組產(chǎn)物中純化多肽。
本發(fā)明進(jìn)一步包括檢測本發(fā)明的核酸或多肽的方法,此方法包括利用本發(fā)明中的任一核酸分子孵育樣品如細(xì)胞裂解物或RNA樣品的逆轉(zhuǎn)錄物,并確定該核酸分子在嚴(yán)格條件下與靶核酸分子的雜交從而確定核酸分子的存在,或利用抗體,優(yōu)選抗本發(fā)明的多肽的單克隆抗體。也可利用PCR技術(shù),優(yōu)選應(yīng)用通過如Roche Diagnostics GmbH,DE的LightCycler TM進(jìn)行的定量RT-PCR對基因進(jìn)行定量檢測。
由于絲氨酸蛋白酶抑制劑基因似乎與細(xì)菌菌株的益生活性有關(guān),本發(fā)明中的核酸和/或多核苷酸同樣可用于尋找可展示益生活性的額外菌株。
為了確定給定的細(xì)菌菌株是否合適,可確定與細(xì)菌菌株的一種或多種靶核酸進(jìn)行雜交的核酸的大約量。可很容易通過如檢測雜交作用的可視檢查定性確定雜交的大約量。例如,如果利用凝膠解析可與樣品中靶核酸雜交的標(biāo)記核酸,生成的條帶就可進(jìn)行可視檢測。同樣的,F(xiàn)ACS抗體應(yīng)用可用于進(jìn)行定量測量。
本發(fā)明的核酸或多肽可用于對可影響與絲氨酸蛋白酶活性相關(guān)的生物學(xué)過程的分子進(jìn)行鑒定、表征和/或純化。絲氨酸蛋白酶參與的生物學(xué)過程示例包括凝血、纖維蛋白溶解、免疫反應(yīng)、補(bǔ)體激活、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)更新、細(xì)胞遷移和激素原激活、癌癥轉(zhuǎn)移。
同樣的,本發(fā)明的核酸或多肽也可用于開發(fā)在治療和/或診斷涉及絲氨酸蛋白酶活性的疾病狀態(tài)中最終適用的分子。一旦了解了本發(fā)明中的絲氨酸蛋白酶抑制劑與靶蛋白酶的相互作用,就可設(shè)計蛋白酶的激動劑或拮抗劑以及絲氨酸蛋白酶抑制劑的激動劑或拮抗劑。如上所述,本發(fā)明考慮的疾病狀態(tài)的非限制性示例為異常凝血、異常纖維蛋白溶解、免疫反應(yīng)、補(bǔ)體激活、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)更新、細(xì)胞遷移和激素原激活、癌癥轉(zhuǎn)移。
多種模型系統(tǒng)的應(yīng)用或結(jié)構(gòu)研究能夠開發(fā)用于調(diào)節(jié)本發(fā)明中的絲氨酸蛋白酶抑制劑和與之結(jié)合的蛋白酶的功能的激動劑或拮抗劑??梢韵胂?,它們可為肽、突變的配體、可與本發(fā)明中的絲氨酸蛋白酶抑制劑相互作用的抗體或其他分子。
在適于表達(dá)多肽并收集和純化多肽的條件下,通過在合適的宿主中表達(dá)本發(fā)明的核酸或包含此核酸的載體,本發(fā)明的核酸一般可用來合成用于大規(guī)模生產(chǎn)的多肽。
以下實施例例證了本發(fā)明,而沒有對其進(jìn)行限制。
實施例1絲氨酸蛋白酶抑制劑基因的分離在對插入的克隆進(jìn)行熒光自動化序列分析和利用軟件程序?qū)@些核苷酸片段序列(插入序列)進(jìn)行組裝后,在利用定向測序法對長雙歧桿菌BL29基因組序列進(jìn)行分析的過程中發(fā)現(xiàn)了一個開放閱讀框。為了完成這些操作,產(chǎn)生了基因組片段,連接到合適的用來擴(kuò)增和繁殖的載體上,并對相應(yīng)片段進(jìn)行測序。通過合適的軟件對片段的重疊和最后排序及其核苷酸序列進(jìn)行評定。
利用以下算法評定了蛋白和/或核酸序列的同源性(1)BLASTP將氨基酸詢問序列與蛋白序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較(2)BLASTN將核苷酸詢問序列與核苷酸序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較(3)BLASTX將在所有閱讀框中翻譯的核苷酸詢問序列與蛋白序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較(4)TBLASTN將蛋白詢問序列與在所有閱讀框內(nèi)動態(tài)翻譯的核苷酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較已經(jīng)注意到與已知的鼠絲氨酸蛋白酶抑制劑α-2-抗纖溶酶具有約43%的中度總體同源性。而此多肽展示出與反應(yīng)位點環(huán)(RSL)具有約63%的同源性。
實施例2雙歧桿菌絲氨酸蛋白酶抑制劑基因的克隆和多肽的分離依照普通的技術(shù),將編碼從其信號肽上去除的推定的雙歧桿菌絲氨酸蛋白酶抑制劑的核酸克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pDEST 17(Invitrogen Life Technologies)上并在大腸桿菌中制備了相應(yīng)的蛋白以作為6-His標(biāo)記的融合蛋白(Janknecht R et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88(20)pp 8972-8976)。
按照Quiagen的QIA-Expressionist手冊中的指導(dǎo)說明,在鎳-氨三乙酸基質(zhì)上利用金屬親和層析將6-His標(biāo)記的融合蛋白純化至均勻,并用于在兔中進(jìn)行功能研究和多克隆抗體產(chǎn)生的研究。
實施例3在BL29中表達(dá)的絲氨酸蛋白酶抑制劑樣蛋白的潛在的抗炎活性利用體外溶血測定法鑒定實施例2中分離得到的多肽作為絲氨酸蛋白酶抑制劑的活性。
為了此目的,將50μL連續(xù)雙倍稀釋的人AB血清(Sigma)與50μL 1.7%的綿羊抗體激活的綿羊紅細(xì)胞懸液在96孔微量滴定板中混合。為了評估重組絲氨酸蛋白酶抑制劑的抗溶血活性,每孔加入1μg重組蛋白并且在37℃孵育混合物1小時。然后將滴定板離心,以沉淀完整的細(xì)胞沉淀并將細(xì)胞碎屑和上清轉(zhuǎn)入另一新板中。溶血活性是通過測定在450nm釋放血紅蛋白的吸光度來測定。
將雙歧桿菌絲氨酸蛋白酶抑制劑活性與人的絲氨酸蛋白酶抑制劑α1-抗胰蛋白酶(5μg/孔)進(jìn)行了比較。以蒸餾水作為陽性對照獲得了100%的紅細(xì)胞溶解,人失活A(yù)B血清作為陰性對照(由于補(bǔ)體失活而無溶解)。
結(jié)果清楚地表明,從雙歧桿菌獲得的重組絲氨酸蛋白酶抑制劑與人α1-抗胰蛋白酶抑制紅細(xì)胞溶解的程度相同,α1-抗胰蛋白酶是一種已知的絲氨酸蛋白酶抑制子。
序列表SEQ.Id.No.1絲氨酸蛋白酶抑制劑核苷酸ATGAGCGAGCAACTGATGGAACAGTACCGGTTGCGCGGACAACGCAAATGCCGTAACGCTTGTATCGCCGCCATCGTGACAGTAGTGCTTGTCCTTGCCGTCGCCGGCGGCGTATGGTGGACGGCCGGCGATGGCAGCGCATTGGTTCGCAATATGTTCAAGCCGAAGGCCACGCCTGCCACGCAGCCGGTAGTCAACAGCACCGCAACCTTCGCCTACCGCACCGCACCGGAATTCCTGGCGATGGAAGCCGGCGACCGAGGCACCGGCAATGTGAACTACTCTCCTGCTTCGATGTGGATGGCGTTGGCCATCGCCGCGCAGGGCGCCAATGGCACGACCCGCTCGCAACTGAACGAACTGCTGGGCTCCGGTTCGCTGACCGATAGCGACTACCAATCGCTGCTAAGTTCGATCAACGGGCAATATTCGGGGGCGAAATCCGAGATGAGCGCCGCGAACTCGCTGTGGATTGATGACGACTACTCTCTTGCCAGCGATTACCAATCCACCGTCAAGAAGATGTTCGAGGCCGAAGTCACCACGTTACCGTTCGACGATCAGGCCGCCGCCAAGATGTCCGATTGGATTGCCAAGCATACGAATGGTTCGCTCAAGCCGAAGATCACGCTGCGTGACCGTGAAGTCCTGTCCATCATCAACACCGTCTATGCGGATGGCCGCTGGAAGGATCCGTTCGAAGAGCAGTCCACCGGCAACGGCACCTTCCACGGCGAAGCCGGAGATGCTCAGGTGCCGATGATGCACCAGACCTTCAGCCAAATGGCTTACGGACATGATGAGTACAACACTTGGCAGCGGGTGGAGATTCCGTTCGACAACGGCGGCAATCTGGCCATCGTGCTGCCGGCCGAAGGGCATTTCGACGAGTTGGCCGGCGATGCCGAGAAGCTCAGTTGGGCGTTCGGTACATGCTCGACGGCATCCCTTGGCGAGGGCGCAATGGGTTGCGCCGCGGACAGTATGCCCGGCTGGGGCGTCTCCGTCAACTCGGTCATGGTGAACGTCACGCTACCGCGATTCACCATCGACAGCATGTTCGACTCGGAAGCCACCATCAAGGCATTCGAAAAACTGGGGGTGACCGATGCGTTCAGTGCAGGCGACGCCGACTTCACCAAGATGATCGACACCGGTTCGCACGGCGAGAACCTGTATATCGGCTCGATTCTGCAAGGCACGCGCATCGAGGTGAACGAAGCCGGCGCCAAGGCCATGTCCTTCACCAAGGTCGGCGCAGACTCCGTTAGCGCGCCGGTGGACAACGTCGAGTTCACGGTGGATCGCCCATTTCTGTATTCGTACGTCACCCCGGACGGCATACCATTATTCATCGGTGCGGTGCGCAACCTCGGCGGAGTCGGTGGAGAAAAC
SEQ.ID.No.2絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白序列MetSerGluGlnLeuMetGluGlnTyrArgLeuArgGlyGlnArgLysCysArgAsnAlaCysIleAlaAlaIleValThrValValLeuValLeuAlaValAlaGlyGlyValTrpTrpThrAlaGlyAspGlySerAlaLeuValArgAsnMetPheLysProLysAlaThrProAlaThrGlnProValValAsnSerThrAlaThrPheAlaTyrArgThrAlaProGluPheLeuAlaMetGluAlaGlyAspArgGlyThrGlyAsnValAsnTyrSerProAlaSerMetTrpMetAlaLeuAlaIleAlaAlaGlnGlyAlaAsnGlyThrThrArgSerGlnLeuAsnGluLeuLeuGlySerGlySerLeuThrAspSerAspTyrGlnSerLeuLeuSerSerIleAsnGlyGlnTyrSerGlyAlaLysSerGluMetSerAlaAlaAsnSerLeuTrpIleAspAspAspTyrSerLeuAlaSerAspTyrGlnSerThrValLysLysMetPheGluAlaGluValThrThrLeuProPheAspAspGlnAlaAlaAlaLysMetSerAspTrpIleAlaLysHisThrAsnGlySerLeuLysProLysIleThrLeuArgAspArgGluValLeuSerIleIleAsnThrValTyrAlaAspGlyArgTrpLysAspProPheGluGluGlnSerThrGlyAsnGlyThrPheHisGlyGluAlaGlyAspAlaGlnValProMetMetHisGlnThrPheSerGlnMetAlaTyrGlyHisAspGluTyrAsnThrTrpGlnArgValGluIleProPheAspAsnGlyGlyAsnLeuAlaIleValLeuProAlaGluGlyHisPheAspGluLeuAlaGlyAspAlaGluLysLeuSerTrpAlaPheGlyThrCysSerThrAlaSerLeuGlyGluGlyAlaMetGlyCysAlaAlaAspSerMetProGlyTrpGlyValSerValAsnSerValMetValAsnValThrLeuProArgPheThrIleAspSerMetPheAspSerGluAlaThrIleLysAlaPheGluLysLeuGlyValThrAspAlaPheSerAlaGlyAspAlaAspPheThrLysMetIleAspThrGlySerHisGlyGluAsnLeuTyrIleGlySerIleLeuGlnGlyThrArgIleGluValAsnGluAlaGlyAlaLysAlaMetSerPheThrLysValGlyAlaAspSerValSerAlaProValAspAsnValGluPheThrValAspArgProPheLeuTyrSerTyrValThrProAspGlyIleProLeuPheIleGlyAlaValArgAsnLeuGlyGlyValGlyGlyGluAsn
權(quán)利要求
1.SEQ ID.NO.1所示核酸或其編碼功能性多肽的部分或變體,此變體與SEQ ID.NO.1具有約75%的同源性,優(yōu)選80%,更優(yōu)選85%,甚至更優(yōu)選90%,甚至更優(yōu)選95%的同源性。
2.SEQ ID.NO.2所示多肽或其功能性部分或變體,此變體與SEQID.NO.2具有約75%的同源性,優(yōu)選80%,更優(yōu)選85%,甚至更優(yōu)選90%,甚至更優(yōu)選95%的同源性。
3.包含權(quán)利要求1中的核酸的載體。
4.包含權(quán)利要求1中的核酸的一個或多個拷貝或權(quán)利要求3中的載體的宿主細(xì)胞。
5.權(quán)利要求4中的宿主細(xì)胞,其中表達(dá)了權(quán)利要求2中的多肽。
6.權(quán)利要求1或2中的核酸或多肽在鑒定、表征和/或純化可影響與絲氨酸蛋白酶活性相關(guān)的生物學(xué)過程的分子中的用途。
7.權(quán)利要求1或2中的核酸或多肽在開發(fā)用于治療和診斷涉及絲氨酸蛋白酶活性的疾病狀態(tài)的分子中的用途。
8.權(quán)利要求1中的核酸或權(quán)利要求2中的多肽在制備用于治療和診斷涉及絲氨酸蛋白酶活性的疾病狀態(tài)的載體中的用途。
9.權(quán)利要求8中的用途,其中載體是藥物、食品或食品添加劑。
10.權(quán)利要求6到9中任一項的用途,其中生物學(xué)過程或疾病狀態(tài)選自凝血、纖維蛋白溶解、免疫反應(yīng)、補(bǔ)體激活、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)的更新、細(xì)胞遷移和激素原激活、癌癥轉(zhuǎn)移。
11.制備權(quán)利要求2中的多肽的方法,包括在合適的宿主中表達(dá)權(quán)利要求1中的核酸或權(quán)利要求3中的載體并對獲得的多肽進(jìn)行純化。
12.用于檢測益生菌菌株的方法,包括用權(quán)利要求1中的核酸或抗權(quán)利要求2中多肽的抗體篩選微生物中所述核酸或所述多肽的存在,并確定微生物中絲氨酸蛋白酶抑制劑的存在。
13.制備可表達(dá)或過量表達(dá)由權(quán)利要求1中的核酸編碼的絲氨酸蛋白酶抑制劑的方法,包括用權(quán)利要求1的核酸轉(zhuǎn)化微生物和表達(dá)編碼絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽的基因。
14.食品或藥品,其包含權(quán)利要求1中的核酸、權(quán)利要求2中的多肽、權(quán)利要求3中的載體或權(quán)利要求4或5中任一項的宿主細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及雙歧桿菌的新基因及此基因編碼的多肽。特別地,本發(fā)明是涉及屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族的基因以及此基因在細(xì)菌絲氨酸蛋白酶抑制劑生產(chǎn)中的應(yīng)用。同樣的,本發(fā)明提供了生產(chǎn)細(xì)菌絲氨酸蛋白酶抑制劑多核苷酸和/或多肽的載體、宿主細(xì)胞以及方法。
文檔編號C12N9/99GK1518598SQ02804318
公開日2004年8月4日 申請日期2002年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月30日
發(fā)明者F·阿里戈尼, S·布盧姆, M·德利, M·A·舍爾, E·施夫林, F 阿里戈尼, 舍爾, 蛄 申請人:雀巢制品公司
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