專利名稱：一種生物芯片的納米放大檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物芯片領(lǐng)域，特別是一種生物芯片的納米金屬放大檢測(cè)方法。
然而到目前為止，國(guó)內(nèi)外均無(wú)獲得批文的生物芯片產(chǎn)品供應(yīng)市場(chǎng)用于臨床，特別是可直接應(yīng)用于普通實(shí)驗(yàn)室及野外環(huán)境的生物芯片及其檢測(cè)系統(tǒng)尚未見(jiàn)有研制成功的報(bào)道。
其主要原因是使用的方法存在著各種不足。如在標(biāo)記方法上，熒光法是目前使用最多的方法，但它的靈敏度不高、需要避光，雜交完成后要快速檢測(cè)以免熒光淬滅，另外結(jié)果檢測(cè)需用價(jià)格極其昂貴的激光掃描儀等特殊設(shè)備；同位素標(biāo)記法由于需要同位素和放射自顯影，有使用不便，操作復(fù)雜，耗時(shí)較長(zhǎng)、有污染的缺點(diǎn)。由于標(biāo)記技術(shù)和雜交信號(hào)放大技術(shù)的限制，為提高檢測(cè)靈敏度和特異性，通常的做法是在標(biāo)記和分析前對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)程序的擴(kuò)增，最常用的是PCR技術(shù)。然而，用熒光標(biāo)記會(huì)影響PCR擴(kuò)增效率，同位素標(biāo)記常用的如32P和33P半衰期又太短，均不易推廣使用。而且PCR擴(kuò)增既需要設(shè)計(jì)引物，又要PCR儀，需要對(duì)各檢測(cè)對(duì)象的靶序列建立不同的擴(kuò)增體系、擴(kuò)增方法和擴(kuò)增條件，這便大大增加工作量和工作難度。為了解決這些問(wèn)題，國(guó)內(nèi)外不少公司進(jìn)行了各種探索，但目前方法尚未達(dá)到實(shí)際應(yīng)用。
總之，盡管芯片技術(shù)已經(jīng)取得了長(zhǎng)足的發(fā)展，得到世人的矚目，但在樣品的制備、探針合成與固定、分子的標(biāo)記、數(shù)據(jù)的讀取與分析等幾個(gè)方面仍然存在著許多難以解決的問(wèn)題。特別是技術(shù)成本昂貴、復(fù)雜、檢測(cè)靈敏度較低、重復(fù)性差、分析泛圍較狹窄等問(wèn)題限制了該技術(shù)在生物檢測(cè)中的應(yīng)用。而這些問(wèn)題的核心原因主要在這兩個(gè)方面即為提高靈敏度使用的是雜交前信號(hào)放大技術(shù)，以及用于標(biāo)記雜交樣品的信號(hào)報(bào)告分子存在各種不足。
納米直徑的金顆粒用于生命科學(xué)研究中示蹤技術(shù)已有較長(zhǎng)的歷史，由于它具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，可標(biāo)記于蛋白和核酸。同時(shí)，它與銀反應(yīng)后可形成比原來(lái)體積大106倍的黑色顆粒，可以用肉眼觀察或用普通記錄裝置如照相、掃描記錄的特點(diǎn)，近年來(lái)受到了科研人員的重視，特別是用不具備吸附能力離散的納米金作為信號(hào)報(bào)告分子的應(yīng)用則是近年生物信號(hào)檢測(cè)中的一個(gè)重要進(jìn)展。目前，作為信號(hào)報(bào)告分子的納米金多采用的是膠體金。膠體金由于不是具有固定結(jié)構(gòu)的單一分子，其表面在生理pH下帶正電荷，因此，它不需要特別處理就可以同帶負(fù)電荷的寡核苷酸結(jié)合。但是，這種結(jié)合是不牢靠的。后者是由不同數(shù)量的金原子構(gòu)成的一個(gè)大分子復(fù)合體，金原子位于這個(gè)大分子的表面通過(guò)鹵化物離子使其構(gòu)成穩(wěn)定的立體構(gòu)型。由金原子構(gòu)成的納米金顆粒不帶電荷，但由于金原子位于顆粒的表面，對(duì)其進(jìn)行特定修飾就可以使其與核酸形成共價(jià)結(jié)合，那么就將納米金顆粒標(biāo)記到特定的核酸、蛋白上，可作為信號(hào)報(bào)告分子使用。由于是共價(jià)結(jié)合，因此，它比膠體金有更多的優(yōu)越性。
1996年NATURE雜志同時(shí)發(fā)表了兩篇將DNA作為連接分子使納米金自組裝成納米結(jié)晶的報(bào)道，1997年Zehbe報(bào)道了用納米金作為信號(hào)報(bào)告分子的原位雜交技術(shù)，在結(jié)合銀顯影的情況下，可使對(duì)組織中病毒核酸的檢測(cè)靈敏度由10～50個(gè)拷貝提高到1個(gè)拷貝，作者認(rèn)為如此高的靈敏度可以使該方法在很多應(yīng)用中代替原位PCR技術(shù)。但目前尚未見(jiàn)有該技術(shù)用于生物芯片檢測(cè)技術(shù)中的報(bào)道。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是這樣的即一種生物芯片的納米放大檢測(cè)方法，其特征在于方法包括以下三個(gè)步驟(一)、用納米直徑的金屬顆粒標(biāo)記核酸或蛋白；(二)、將標(biāo)記的核酸或蛋白與生物芯片上的探針雜交結(jié)合；(三)、利用能與該標(biāo)記的納米直徑的金屬顆粒發(fā)生金屬相反應(yīng)的金屬試劑與已雜交結(jié)合在生物芯片上的核酸或蛋白上標(biāo)記的納米金屬反應(yīng)，放大納米金屬顆粒并進(jìn)行普通光學(xué)檢測(cè)。
本發(fā)明所使用的術(shù)語(yǔ)“生物芯片”是由生物大分子或組織附著于玻璃、陶瓷、金屬片或尼龍膜、硝酸纖維素膜等基片物質(zhì)上構(gòu)建而成的陣列。生物芯片的實(shí)例包括基因(核酸)芯片、細(xì)胞芯片、蛋白芯片、抗體芯片或組織芯片等。
本發(fā)明所述的核酸包括DNA、RNA、cDNA或肽核酸。
本發(fā)明所述的蛋白包括各種抗體、抗原。
本發(fā)明所使用的術(shù)語(yǔ)“納米直徑的金屬顆?！笔侵钢睆皆?.0-1000nm之間的金屬顆粒。其實(shí)例包括納米金、納米釩、納米鉛或納米銀等，還包括修飾結(jié)合有胺基、巰基、?；蛏锼氐然鶊F(tuán)的納米直徑的金屬顆粒。本發(fā)明使用的優(yōu)選的納米直徑的金屬顆粒是直徑為1.4nm的單順丁烯二乙酰亞胺修飾的納米金。
本發(fā)明所述的能與該標(biāo)記的納米直徑的金屬顆粒發(fā)生金屬相反應(yīng)的金屬試劑包括金、銀、鐵等純的金屬試劑以及含金屬的化合物試劑，如鋰銀、氫醌銀。本發(fā)明使用的優(yōu)選的能與納米金發(fā)生顆粒增強(qiáng)反應(yīng)的金屬試劑是鋰銀。
本發(fā)明上述步驟(一)中，納米直徑的金屬顆粒標(biāo)記核酸的方法包括(1)通過(guò)寡核苷酸接頭實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸的標(biāo)記；
或(2)通過(guò)引物實(shí)現(xiàn)對(duì)產(chǎn)物核酸的標(biāo)記；或(3)直接對(duì)核酸實(shí)現(xiàn)的標(biāo)記。
本發(fā)明所使用的術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸接頭”是指由1-2000個(gè)堿基組成的一段核酸物質(zhì)，包括進(jìn)行了修飾有如巰基、氨基、酰基等基團(tuán)的。本發(fā)明使用的優(yōu)選的與1.4nm的單順丁烯二乙酰亞胺修飾的納米金反應(yīng)的寡核苷酸接頭是5’-AAA AAA AAA AA-(CH2)6-SH-3’。
本發(fā)明所使用的術(shù)語(yǔ)“引物”、“PCR”、“RT-PCR”定義參考《PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南》，C.W.迪芬巴赫，G.S.得維克斯勒。科學(xué)出版社，1998年8月第一版。
本發(fā)明所使用的術(shù)語(yǔ)“產(chǎn)物核酸”是指由PCR或RT-PCR反應(yīng)生成的核酸物質(zhì)，如DNA、cDNA。
上述步驟(一)中的通過(guò)寡核苷酸接頭實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸的標(biāo)記方法的步驟包括(1)、制備納米金屬溶液；(2)、將納米金屬溶液與寡核苷酸混合，納米金屬與寡核苷酸分子數(shù)之比為1-100∶1，反應(yīng)獲得含納米金屬的寡核苷酸接頭；(3)、提取標(biāo)本DNA，通過(guò)去磷酸化反應(yīng)去除DNA的5’端的磷酸基團(tuán)，防止其自身連接；(4)、在連接酶作用下，結(jié)合納米金屬標(biāo)記的寡核苷酸接頭與上述處理的標(biāo)本DNA，獲得納米金屬標(biāo)記的樣本DNA。
所述步驟(一)中通過(guò)引物實(shí)現(xiàn)對(duì)產(chǎn)物核酸標(biāo)記方法中，采用通過(guò)PCR反應(yīng)引物實(shí)現(xiàn)對(duì)產(chǎn)物DNA的標(biāo)記，方法的步驟包括(1)、制備納米金屬溶液；
(2)、將納米金屬溶液與PCR引物混合，納米金屬與引物分子數(shù)之比為1-100∶1，得到納米金屬標(biāo)記的PCR引物；(3)、利用該標(biāo)記引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到納米金屬標(biāo)記的PCR產(chǎn)物DNA。
所述步驟(一)中通過(guò)引物實(shí)現(xiàn)對(duì)產(chǎn)物核酸標(biāo)記方法中，采用通過(guò)RT-PCR反應(yīng)引物實(shí)現(xiàn)對(duì)產(chǎn)物cDNA的標(biāo)記，方法的步驟包括(1)、制備納米金屬溶液；(2)、將納米金屬溶液與RT-PCR引物混合，納米金屬與引物分子數(shù)之比為1-100∶1，得到納米金屬標(biāo)記的RT-PCR引物；(3)、利用該標(biāo)記引物進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，得到納米金屬標(biāo)記的RT-PCR產(chǎn)物cDNA。
上述步驟(一)中采用的直接對(duì)核酸實(shí)現(xiàn)的標(biāo)記方法為通過(guò)與核酸的末端基團(tuán)反應(yīng)，從而使核酸末端修飾有含硫或含二酰亞胺類的化合物，該類化合物可以和納米金屬反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)納米金屬對(duì)核酸的標(biāo)記。
上述步驟(一)中納米直徑的金屬顆粒標(biāo)記蛋白的方法步驟為(1)、制備納米金屬溶液；(2)、納米金屬溶液與還原處理的蛋白混合，納米金屬與蛋白分子數(shù)比不低于5∶1，得到納米金屬標(biāo)記的蛋白。
所述步驟(二)中的納米金屬標(biāo)記的核酸與生物芯片上的探針雜交的步驟是(1)、對(duì)納米金屬標(biāo)記的DNA進(jìn)行變性處理；(2)、滴加變性處理的納米金屬標(biāo)記的DNA于生物芯片表面，進(jìn)行雜交反應(yīng)；
(3)、清洗去除未雜交結(jié)合的納米金屬標(biāo)記的DNA；(4)、干燥處理備用。
所述步驟(二)中的納米金屬標(biāo)記的蛋白與生物芯片上的探針結(jié)合的步驟是(1)、PBS處理生物芯片，以阻斷非特異的蛋白的結(jié)合位點(diǎn)及減少非特異性；(2)、滴加納米金屬標(biāo)記的蛋白于生物芯片上，共育反應(yīng)；(3)、漂洗，去除未結(jié)合的納米金屬標(biāo)記的蛋白；(4)、晾干備用。
所述步驟(三)中包括(1)、滴加金屬相反應(yīng)試劑于芯片表面，進(jìn)行金屬相放大反應(yīng)；(2)、清洗，去除未反應(yīng)的金屬相反應(yīng)試劑；(3)、觀察結(jié)果。本技術(shù)發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與效果如下(1)本發(fā)明采用的納米放大技術(shù)，能夠把雜交的信號(hào)放大到104-8倍，具有高的檢測(cè)靈敏度和特異性。
(2)本發(fā)明采用的納米放大技術(shù)，可以避免PCR反應(yīng)，從而簡(jiǎn)化了樣品的處理過(guò)程，縮短了檢測(cè)時(shí)間。
(3)本發(fā)明采用的納米放大技術(shù)，不需要昂貴的檢測(cè)儀，降低了芯片的使用成本及實(shí)驗(yàn)條件。
總之，該技術(shù)的研制成功將真正實(shí)現(xiàn)芯片技術(shù)的高通量、特異、敏感、快速的特點(diǎn)。可對(duì)常見(jiàn)感染病原菌和難檢病原菌進(jìn)行快速而準(zhǔn)確的檢測(cè)和鑒定，可以進(jìn)行某一或多個(gè)特定基因、或與其相關(guān)的表達(dá)產(chǎn)物的研究，可以進(jìn)行基因和蛋白質(zhì)與疾病關(guān)系的研究、疾病相關(guān)基因的驗(yàn)證以及新藥物的開(kāi)發(fā)與篩選，疾病的分子診斷，治療過(guò)程的追蹤和預(yù)后等方面，為臨床疾病的預(yù)防和治療提供重要的指導(dǎo)作用；同時(shí)該技術(shù)也可以應(yīng)用到在野戰(zhàn)條件下由基層檢驗(yàn)人員實(shí)施戰(zhàn)場(chǎng)病原體分布的調(diào)查、戰(zhàn)傷感染的早期診斷，生物戰(zhàn)劑的早期發(fā)現(xiàn)等方面，將會(huì)產(chǎn)生較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
(2)、納米金溶液與寡核苷酸磷酸鈉緩沖液混合(最終反應(yīng)體系中磷酸鈉緩沖液濃度為的0.01M，含有150mMNaCl、1mMEDTA，pH5-8)，納米金與寡核苷酸分子數(shù)比為1-100∶1，4-37℃共育2-24小時(shí)。制備成含納米金的寡核苷酸接頭。
(3)、超聲斷裂標(biāo)本DNA長(zhǎng)鏈后，在微量離心管中分別加入下面的反應(yīng)液，全量為50μlDNA片段在TE buffer 1-20pmol，10×Alkaline Phosphatasebuffer 5μl，CIAP(10-30U/ul)1-2ul，滅菌水加至50μl。37-50℃、15-120分鐘保溫。苯酚/氯仿(1∶1)抽提1-3次。添加3M的NaCL 2.5μl(終濃度150mM)。添加125μl(2.5倍)冷乙醇，在-20℃保冷30-60分鐘。離心回收沉淀，用200μl 70％冷乙醇洗凈后，減壓干燥。用20μl以下的TE buffer溶解沉淀。
(4)、標(biāo)本DNA加熱至90-100℃，5-20分鐘后，將其迅速冷卻到4℃以下。
(5)、在反應(yīng)Tube管中調(diào)制以下反應(yīng)液，全量50μl。單鏈的樣本DNA 1-2μl，納米金標(biāo)記的寡核苷酸接頭5-10μl，10×T4 RNA Ligase Buffer 10μl，0.1％BSA 3μl，T4 RNA Ligase 40-100U，PEG#6000 終濃度25％，滅菌水加至50μl。在5℃反應(yīng)12-24小時(shí)。加入2μl的0.5M EDTA終止反應(yīng)。所述納米金標(biāo)記的寡核苷酸接頭濃度與單鏈的樣本DNA的分子數(shù)之比不低于5∶1。
實(shí)施例2 通過(guò)PCR反應(yīng)引物實(shí)現(xiàn)對(duì)產(chǎn)物DNA的納米金標(biāo)記步驟如下(1)、溶解納米金6nmol在0.02ml異丙醇或DMSO中，去離子水稀釋至0.2ml。
(2)、納米金溶液分別與待檢DNA特異的PCR引物1和2的磷酸鈉緩沖液混合(最終反應(yīng)體系中磷酸鈉緩沖液的濃度為0.01M，含有150mMNaCl、1mMEDTA，pH5-8)，納米金與引物分子數(shù)比為1-100∶1，4-37℃共育2-24小時(shí)。制備含納米金標(biāo)記的待檢DNA特異的PCR引物1和2。
(3)、反應(yīng)Tube管中加以下反組成(100μl反應(yīng)體系)Taq酶(5U/μl)0.5μl，10×Taq酶Buffer 10μl，MgCl2(25mM)8μl，dNTP(每種各2.5mM)8μl，樣品DNA 1μg，金標(biāo)記引物1(20μM)1-5μl，金標(biāo)記引物2(20μM)1-5μl，加滅菌ddH2O至100μl。
(4)、放到預(yù)熱的PCR儀中，程序如下95℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 45-60秒。進(jìn)行30-40個(gè)循環(huán)。最后72℃延伸10分鐘。
實(shí)施例3 通過(guò)RT-PCR反應(yīng)引物實(shí)現(xiàn)對(duì)產(chǎn)物cDNA的納米金標(biāo)記步驟如下(1)、溶解納米金6nmol在0.02ml異丙醇或DMSO中，去離子水稀釋至0.2ml。
(2)、納米金溶液與聚T引物磷酸鈉緩沖液混合(最終反應(yīng)體系中磷酸鈉緩沖液濃度為的0.01M，含有150mMNaCl、1mMEDTA，pH5-8)，納米金與隨機(jī)引物分子數(shù)比為1-100∶1，4-37℃共育2-24小時(shí)。制備成含納米金標(biāo)記的聚T引物。
(3)、在反應(yīng)Tube管中加以下反應(yīng)液dNTP(每種各2.5mmol/L)2.5μl，0.1mol/L巰基乙醇2.0μl，RNasin(40,000U/ml)0.5μl，納米金標(biāo)記的聚T引物(20-40U/ml)2.0μl，3.0μg RNA(去離子水稀釋)18.8μl。加熱混合物5分鐘至70℃，冰上冷卻。簡(jiǎn)短離心樣品。
(4)、反應(yīng)Tube管中再加入反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液5.0μl，反轉(zhuǎn)錄酶200U1.2μl。致反應(yīng)終體積為2.5μl。37℃保溫60分鐘后，90℃變性5分鐘，冰上冷卻5分鐘。
實(shí)施例4 納米金標(biāo)記蛋白步驟是(1)、溶解蛋白0.15mg在0.1M磷酸鈉緩沖液中，pH6.0，含有5mM EDTA(1ml)，加入MEA(8mg)。室溫孵育1小時(shí)；(2)、凝膠過(guò)濾層析法分離還原的蛋白。洗脫液使用0.02M磷酸鈉，pH6.5，150mMNaCl，1mM EDTA。還原的蛋白在第一個(gè)高峰洗脫液中；(3)、溶解納米金試劑6nmol在0.02ml異丙醇中，去離子水稀釋至0.2ml。
(4)、活性的納米金溶液加入還原的蛋白中，其中納米金與還原蛋白的分子數(shù)之比為10∶1，4-37℃共育2-12小時(shí)；(5)、利用凝膠過(guò)濾層析法從抗體復(fù)合物分離未標(biāo)記的納米金顆粒，洗脫液0.02M磷酸鈉pH7.4、150mMNaCl洗脫。第一個(gè)淡紅色峰為標(biāo)記復(fù)合物，第二個(gè)暗色帶為未結(jié)合的納米金屬。重復(fù)一次能進(jìn)一步得到純化效果。
實(shí)施例5 納米金標(biāo)記的核酸與DNA芯片上的探針雜交步驟是(1)、將制備的DNA芯片置于預(yù)熱的雜交室內(nèi)，加入5.0μl 5×SSC-2g/LSDS于雜交室內(nèi)以保持濕度。
(2)、1.0μl納米金標(biāo)記DNA加入9.0μl雜交緩沖液中，于95℃變性5-10分鐘，立即冰浴。
(3)、滴加DNA樣品雜交緩沖液于芯片表面，加蓋一2cm×cm的蓋玻片，封閉雜交小室，浸入40-60℃水浴中，雜交1-10小時(shí)。
(4)、取出芯片立即浸入室溫的1×SSC-0.1％SDS清洗液中，清洗5分鐘。移入40-60℃ 0.1×SSC-0.1％SDS清洗液中洗滌5-10分鐘。立即再以新鮮0.1×SSC-0.1％SDS清洗5分鐘，后移入0.1×SSC清洗5分鐘，以去除SDS。
(5)、避光干燥。
實(shí)施例6 納米金標(biāo)記的蛋白與蛋白芯片上的探針結(jié)合步驟是(1)、將制備的蛋白芯片置于37℃的濕盒內(nèi)，滴加10.0μl 1％ PBS-BSA緩沖液(20mM磷酸緩沖液pH7.40，含有150mM NaCl，0.5％BSA，0.1％甘油，0.05％Tween 20)芯片上，以阻斷非特異性的蛋白結(jié)合位點(diǎn)及減少非特異性的抗體結(jié)合。
(2)、棄去芯片上的PBS-BSA，不沖洗，滴加10倍PBS-BSA緩沖液稀釋的納米金屬結(jié)合物，共育0.5-3小時(shí)并不時(shí)輕振反應(yīng)液。
(3)、漂洗，PBS-BSA(3×1min)，PBS(3×1min)。
(4)、晾干。實(shí)施例7 信號(hào)放大反應(yīng)試驗(yàn)利用鋰銀試劑與已雜交結(jié)合在生物芯片上的核酸或蛋白上標(biāo)記的納米金反應(yīng)，放大納米金顆粒并用肉眼或普通光學(xué)儀器檢測(cè)的步驟包括(1)、鋰銀試劑2ml加入芯片表面，室溫反應(yīng)3-7分鐘，0.1×SSC清洗5分鐘。晾干。
(2)、普通光學(xué)儀器(如顯微鏡、掃描儀等)或肉眼直接觀察結(jié)果，黑色顆粒即代表雜交陽(yáng)性結(jié)果。實(shí)施例8 通過(guò)寡核苷酸接頭標(biāo)記核酸實(shí)施基因芯片的檢測(cè)試劑單順丁烯二乙酰亞胺修飾的納米金試劑(直徑1.4nm)，鋰銀液購(gòu)自Nanoprobes公司。
3’二硫雙己基脫氧寡核苷酸5’-AAA AAA AAA AA-(CH2)6-SH-3’及銅綠假單胞菌特異探針5’-TCC TAT GGT AAA GAG CGT CCG-3’由上海Sangon公司提供。
DNA提取試劑盒購(gòu)自上海申能博彩生物科技有限公司CIAP及10×T4 RNA Ligase由寶生物公司提供。步驟(1)、DNA芯片自制(參考Linda A.Chrisey，Gil U Lee and C.ElizabethO’Ferrall.Covalent attachment of synthetic DNA to self-assembled monolayerfilms.Nucleic Acids Research，1996，24(15)3031-3039)，制備的DNA芯片置于預(yù)熱的雜交室內(nèi)，加入5.0μl 5×SSC-2g/LSDS于雜交室內(nèi)以保持濕度。
(2)、寡核苷酸9.6nmol與TECP-HCl 6.2mmol，0.1M磷酸鈉緩沖液(pH8.0，含有51mMEDTA)混合。溫度37℃下進(jìn)行還原反應(yīng)。
(3)、溶解納米金6nmol在0.02ml異丙醇中，去離子水稀釋至0.2ml。
(4)、納米金溶液與已還原的SH修飾的寡核苷酸磷酸鈉緩沖液混合(最終反應(yīng)體系中磷酸鈉緩沖液濃度為的0.01M，含有150mMNaCl、1mMEDTA，pH6.5)，納米金與巰基分子數(shù)比為10∶1，4℃共育6小時(shí)，制備成含納米金的寡核苷酸接頭。反應(yīng)產(chǎn)物用HPLC分離純化，第一個(gè)淡紅色峰為標(biāo)記復(fù)合物，重復(fù)一次能進(jìn)一步得到純化效果。標(biāo)記復(fù)合物儲(chǔ)存在0.02M磷酸鈉、150mM NaCl、0.05％疊氮化鈉(pH7.5)。
(5)、病人血液中提取基因組DNA。(參考試劑盒說(shuō)明書(shū))(6)、超聲斷裂標(biāo)本DNA長(zhǎng)鏈后，在微量離心管中分別加入下面的反應(yīng)液，全量為50μlDNA片段在TE緩沖液中1-20pmol，10×Alkaline磷酸緩沖液5μl，CIAP(10-30U/ul)1-2ul，滅菌水加至50μl。37℃、15分鐘保溫。苯酚/氯仿(1∶1)抽提1次。添加3M的NaCL 2.5μl(終濃度150mM)。添加125μl(2.5倍)冷乙醇，在-20℃保冷30分鐘。離心回收沉淀，用200μl 70％冷乙醇洗凈后，減壓干燥。用20μl以下的TE緩沖液溶解沉淀。
(7)、標(biāo)本DNA加熱至98℃，10分鐘后，將其迅速冷卻到4℃以下。
(8)、在反應(yīng)Tube管中調(diào)制以下反應(yīng)液，全量50μl。單鏈的樣本DNA 1-2μl，納米金標(biāo)記的寡核苷酸接頭5-10μl，10×T4 RNA Ligase Buffer 10μl，0.1％BSA 3μl，T4 RNA Ligase 40-100U，PEG#6000 終濃度25％，滅菌水加至50μl。在5℃反應(yīng)12小時(shí)。加入2μl的0.5M EDTA終止反應(yīng)。
(9)、1.0μl金標(biāo)記DNA加入9.0μl雜交緩沖液中，于95℃變性10分鐘，立即冰浴。
(10)、滴加該DNA樣品雜交緩沖液于芯片表面，加蓋一2cm×cm的蓋玻片，封閉雜交小室，浸入42℃水浴中，雜交1小時(shí)。
(11)、取出芯片立即浸入室溫的1×SSC-0.1％SDS清洗液中，清洗5分鐘。移入40℃ 0.1×SSC-0.1％SDS清洗液中洗滌5分鐘。立即再以新鮮0.1×SSC-0.1％SDS清洗5分鐘，后移入0.1×SSC清洗5分鐘，以去除SDS。避光干燥。
(12)、鋰銀液2ml加入芯片表面，室溫反應(yīng)5分鐘，0.1×SSC清洗5分鐘。晾干。
(13)、普通光學(xué)儀器(如顯微鏡、掃描儀等)或肉眼直接觀察結(jié)果，黑色顆粒即代表雜交陽(yáng)性結(jié)果。實(shí)施例9 通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)標(biāo)記產(chǎn)物cDNA實(shí)施基因芯片的檢測(cè)試劑單順丁烯二乙酰亞胺修飾的納米金試劑(直徑1.4nm)，鋰銀液購(gòu)自Nanoprobes公司。
5’二硫雙己基隨機(jī)引物及丙型肝炎病毒特異探針5’-GGG AGT GATCTA TGG TGG AG-3’由上海Sangon公司提供。
RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒購(gòu)自上海申能博彩生物科技有限公司步驟(1)、DNA芯片自制(參考Linda A.Chrisey，Gil U Lee and C.ElizabethO’Ferrall.Covalent attachment of synthetic DNA to self-assembled monolayerfilms.Nucleic Acids Research，1996，24(15)3031-3039)，制備的DNA芯片置于預(yù)熱的雜交室內(nèi)，加入5.0μl 5×SSC-2g/LSDS于雜交室內(nèi)以保持濕度。
(2)、5’二硫雙己基隨機(jī)引物9.6nmol與TECP-HCl 6.2mmol，0.1M磷酸鈉緩沖液(pH8.0，含有51mMEDTA)混合。溫度37℃下進(jìn)行還原反應(yīng)。
(3)、溶解納米金6nmol在0.02ml異丙醇或DMSO中，去離子水稀釋至0.2ml。
(4)、納米金溶液與已還原的SH修飾的隨機(jī)引物磷酸鈉緩沖液混合(最終反應(yīng)體系中磷酸鈉緩沖液濃度為的0.01M，含有150mMNaCl、1mMEDTA，pH6.5)，納米金與巰基分子數(shù)比為10∶1，4℃共育6小時(shí)，制備成含納米金的隨機(jī)引物。反應(yīng)產(chǎn)物用HPLC分離純化，第一個(gè)淡紅色峰為標(biāo)記復(fù)合物，重復(fù)一次能進(jìn)一步得到純化效果。標(biāo)記復(fù)合物儲(chǔ)存在0.02M磷酸鈉、150mMNaCl、0.05％疊氮化鈉(pH7.5)。
(5)、病人血液中提取基因組RNA。(參考試劑盒說(shuō)明書(shū))(6)、在反應(yīng)Tube管中加以下反應(yīng)液dNTP(每種各2.5mmol/L)2.5μl，0.1mol/L巰基乙醇2.0μl，RNasin(40,000U/ml)0.5μl，納米金標(biāo)記的隨機(jī)引物(20-40U/ml)2.0μl，3.0μg RNA(去離子水稀釋)18.8μl。加熱混合物5分鐘至70℃，冰上冷卻。簡(jiǎn)短離心樣品。
(7)、反應(yīng)Tube管中再加入反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液5.0μl，反轉(zhuǎn)錄酶200U1.2μl。致反應(yīng)終體積為2.5μl。37℃保溫60分鐘后，90℃變性5分鐘，冰上冷卻5分鐘。
(8)、1.0μl金標(biāo)記cDNA加入9.0μl雜交緩沖液中。滴加該cDNA樣品雜交緩沖液于芯片表面，加蓋一2cm×cm的蓋玻片，封閉雜交小室，浸入42℃水浴中，雜交1小時(shí)。
(9)、取出芯片立即浸入室溫的1×SSC-0.1％SDS清洗液中，清洗5分鐘。移入40℃ 0.1×SSC-0.1％SDS清洗液中洗滌5分鐘。立即再以新鮮0.1×SSC-0.1％SDS清洗5分鐘，后移入0.1×SSC清洗5分鐘，以去除SDS。避光干燥。
(10)、鋰銀液2ml加入芯片表面，室溫反應(yīng)4分鐘，0.1×SSC清洗5分鐘。晾干。
(11)、普通光學(xué)儀器(如顯微鏡、掃描儀等)或肉眼直接觀察結(jié)果，黑色顆粒即代表雜交陽(yáng)性結(jié)果。實(shí)施例10 通過(guò)PCR反應(yīng)標(biāo)記產(chǎn)物DNA實(shí)施基因芯片的檢測(cè)試劑單順丁烯二乙酰亞胺修飾的納米金試劑(直徑1.4nm)，鋰銀液購(gòu)自Nanoprobes公司。大腸埃希氏菌5’二硫雙己基脫氧寡核苷酸引物15’SH-(CH2)6-TAT GAA CTG TGC GTC ACA GCC-3’，5’二硫雙己基脫氧寡核苷酸引物25’SH-(CH2)6-CAT CAG CAC GTT ATC GAATCC-3’及大腸埃希氏菌特異探針5’-TTC TAC TTT ACT GGC TTTGGT CG-3’由上海Sangon公司提供。
DNA提取試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自上海申能博彩生物科技有限公司步驟(1)、DNA芯片自制(參考Linda A.Chrisey，Gil U Lee and C.ElizabethO’Ferrall.Covalent attachment of synthetic DNA to self-assembled monolayerfilms.Nucleic Acids Research，1996，24(15)3031-3039)，制備的DNA芯片置于預(yù)熱的雜交室內(nèi)，加入5.0μl 5×SSC-2g/LSDS于雜交室內(nèi)以保持濕度。
(2)、寡核苷酸引物1和2各9.6nmol分別與TECP-HCl 6.2mmol，0.1M磷酸鈉緩沖液(pH8.0，含有51mMEDTA)混合。溫度37℃下進(jìn)行還原反應(yīng)。
(3)、溶解納米金6nmol在0.02ml異丙醇或DMSO中，去離子水稀釋至0.2ml。
(4)、納米金溶液分別與已還原的SH修飾的寡核苷酸引物1和2的磷酸鈉緩沖液混合(最終反應(yīng)體系中磷酸鈉緩沖液濃度為的0.01M，含有150mMNaCl、1mMEDTA，pH6.5)，納米金與巰基分子數(shù)比為10∶1，4℃共育6小時(shí)，分別制備成含納米金的寡核苷酸引物1和2。反應(yīng)產(chǎn)物分別用HPLC分離純化，第一個(gè)淡紅色峰為標(biāo)記復(fù)合物，重復(fù)一次能進(jìn)一步得到純化效果。標(biāo)記復(fù)合物儲(chǔ)存在0.02M磷酸鈉、150mM NaCl、0.05％疊氮化鈉(pH7.5)。
(5)、病人血液中提取基因組DNA。(參考試劑盒說(shuō)明書(shū))(6)、反應(yīng)Tube管中加以下反應(yīng)組成(100μl反應(yīng)體系)Taq酶(5U/μl)0.5μl，10×Taq酶Buffer 10μl，MgCl2(25mM)8μl，dNTP(每種各2.5mM)8μl，樣品DNA 1μg，金標(biāo)記引物1(20μM)1-5μl，金標(biāo)記引物2(20μM)1-5μl，加滅菌去離子H2O至100μl。
(7)、放到預(yù)熱的PCR儀中，程序如下95℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 60秒。進(jìn)行32個(gè)循環(huán)。最后72℃延伸10分鐘。
(8)、1.0μl金標(biāo)記PCR產(chǎn)物DNA加入9.0μl雜交緩沖液中。于95℃變性10分鐘，立即冰浴。
(9)、滴加該DNA雜交緩沖液于芯片表面，加蓋一2cm×cm的蓋玻片，封閉雜交小室，浸入42℃水浴中，雜交1小時(shí)。
(10)、取出芯片立即浸入室溫的1×SSC-0.1％SDS清洗液中，清洗5分鐘。移入40℃ 0.1×SSC-0.1％SDS清洗液中洗滌5分鐘。立即再以新鮮0.1×SSC-0.1％SDS清洗5分鐘，后移入0.1×SSC清洗5分鐘，以去除SDS。避光干燥。
(11)、鋰銀液2ml加入芯片表面，室溫反應(yīng)5分鐘，0.1×SSC清洗5分鐘。晾干。
(12)、普通光學(xué)儀器(如顯微鏡、掃描儀等)或肉眼直接觀察結(jié)果，黑色顆粒即代表雜交陽(yáng)性結(jié)果。實(shí)施例11 通過(guò)直接反應(yīng)標(biāo)記核酸實(shí)施基因芯片的檢測(cè)試劑單胺修飾的納米金試劑(直徑1.4nm)，鋰銀液購(gòu)自Nanoprobes公司。
肺炎鏈球菌特異探針5’-TTT CGA GTG TTG CTT TTTATG GGC-3’由上海Sangon公司提供。
EDC(1-ethyl-3，3′-dimethylaminopropyl carbodiimide)購(gòu)自Sigma公司。步驟(1)、DNA芯片自制(參考Linda A.Chrisey，Gil U Lee and C.ElizabethO’Ferrall.Covalent attachment of synthetic DNA to self-assembled monolayerfilms.Nucleic Acids Research，1996，24(15)3031-3039)，制備的DNA芯片置于預(yù)熱的雜交室內(nèi)，加入5.0μl 5×SSC-2g/LSDS于雜交室內(nèi)以保持濕度。
(2)、病人血液中提取基因組DNA。(參考試劑盒說(shuō)明書(shū))(3)、標(biāo)本DNA加熱至98℃，10分鐘后，將其迅速冷卻到4℃以下。
(4)、在反應(yīng)Tube管中加以下反應(yīng)組成變性的DNA-磷酸緩沖液20pmol，EDC 2nmol，1nmol EDTA，pH6.5，去離子水家至50μl，4℃反應(yīng)6小時(shí)。凝膠過(guò)濾層析法分離去除未反應(yīng)的EDC。
(5)、溶解納米金6nmol在0.02ml異丙醇或DMSO中，去離子水稀釋至0.2ml。
(6)、納米金溶液與已經(jīng)修飾反應(yīng)的DNA-磷酸緩沖液(磷酸緩沖液濃度為的0.01M，含有150 mMNaCl、1mMEDTA，pH7.5)混合，納米金與DNA分子數(shù)比為10∶1，4℃共育6小時(shí)。反應(yīng)產(chǎn)物用HPLC分離純化，第一個(gè)淡紅色峰為標(biāo)記復(fù)合物，重復(fù)一次能進(jìn)一步得到純化效果。標(biāo)記復(fù)合物儲(chǔ)存在0.02M磷酸鈉、150mM NaCl、0.05％疊氮化鈉(pH7.5)。
(7)、1.0μl金標(biāo)記DNA加入9.0μl雜交緩沖液中。于95℃變性10分鐘，立即冰浴。
(8)、滴加該DNA雜交緩沖液于芯片表面，加蓋一2cm×cm的蓋玻片，封閉雜交小室，浸入42℃水浴中，雜交1小時(shí)。
(9)、取出芯片立即浸入室溫的1×SSC-0.1％SDS清洗液中，清洗5分鐘。移入40℃ 0.1×SSC-0.1％SDS清洗液中洗滌5分鐘。立即再以新鮮0.1×SSC-0.1％SDS清洗5分鐘，后移入0.1×SSC清洗5分鐘，以去除SDS。避光干燥。
(10)、鋰銀液2ml加入芯片表面，室溫反應(yīng)5分鐘，0.1×SSC清洗5分鐘。晾干。
(11)、普通光學(xué)儀器(如顯微鏡、掃描儀等)或肉眼直接觀察結(jié)果，黑色顆粒即代表雜交陽(yáng)性結(jié)果。實(shí)施例12 利用納米金-銀放大反應(yīng)實(shí)施蛋白芯片的檢測(cè)試劑單胺修飾的納米金試劑(直徑1.4nm)，鋰銀液購(gòu)自Nanoprobes公司。
戊型肝炎抗原購(gòu)自3V診斷技術(shù)公司DTT購(gòu)自Sigma公司。步驟(1)、蛋白芯片自制。(參考Gavin Mac Beath and Stuart L.Schreiber.Printing proteins as microarrys for high-throughput function deternination.Science，2891760-1763.)(2)、病人血清0.5ml在0.1M磷酸鈉緩沖液中，pH6.0，含有5mM EDTA(1ml)，加入MEA(8mg)。室溫孵育1小時(shí)。
(3)、凝膠過(guò)濾層析法分離還原的蛋白。洗脫液使用0.02M磷酸鈉，pH6.5，150mMNaCl，1mM EDTA。還原的蛋白在第一個(gè)高峰洗脫液中。
(4)、溶解納米金屬試劑6nmol在0.02ml異丙醇中，去離子水稀釋至0.2ml。
(5)、活性的納米金屬溶液加入還原的蛋白中，4-37℃共育2-12小時(shí)。
(6)、利用凝膠過(guò)濾層析法從抗體復(fù)合物分離未標(biāo)記的納米金屬顆粒。洗脫液0.02M磷酸鈉pH7.4、150mMNaCl洗脫。第一個(gè)淡紅色峰為標(biāo)記復(fù)合物，第二個(gè)暗色帶為未結(jié)合的納米金屬。重復(fù)一次能進(jìn)一步得到純化效果。
(7)、將制備的蛋白芯片置于37℃的濕盒內(nèi)，滴加10.0μl 1％ PBS-BSA緩沖液(20mM磷酸緩沖液pH7.40，含有150mM NaCl，0.5％BSA，0.1％甘油，0.05％Tween 20)芯片上，以阻斷非特異性的蛋白結(jié)合位點(diǎn)及減少非特異性的抗體結(jié)合。
(8)、棄去芯片上的PBS-BSA，不沖洗，滴加10倍PBS-BSA緩沖液稀釋的納米金屬結(jié)合物，共育0.5-3小時(shí)并不時(shí)輕振反應(yīng)液。
(9)、漂洗，PBS-BSA(3×1min)，PBS(3×1min)。晾干。
(10)、鋰銀液2ml加入芯片表面，室溫反應(yīng)5分鐘，0.1×SSC清洗5分鐘。晾干。
(11)、普通光學(xué)儀器(如顯微鏡、掃描儀等)或肉眼直接觀察結(jié)果，黑色顆粒即代表雜交陽(yáng)性結(jié)果。實(shí)施例13 利用納米金-銀放大反應(yīng)實(shí)施組織芯片的檢測(cè)試劑單胺修飾的納米金試劑(直徑1.4nm)，鋰銀液購(gòu)自Nanoprobes公司。
抗ICAM-1抗體購(gòu)自晶美公司。步驟(1)、組織芯片自制。(參考Nocito A，Kononen J，Kallioniemi OP.Tissuemicroarrays(TMAs)for high-throughput molecular pathology research.Int JCancer.2001 Oct 1；94(1)1-5.)。
(2)、溶解抗體(0.15mg)在0.1M磷酸鈉緩沖液中，pH6.0，含有5mMEDTA(1ml)，加入MEA(8mg)。室溫孵育1小時(shí)。
(3)、凝膠過(guò)濾層析法分離還原的蛋白。洗脫液使用0.02M磷酸鈉，pH6.5，150mMNaCl，1mM EDTA。還原的蛋白在第一個(gè)高峰洗脫液中。
(4)、溶解納米金屬試劑6nmol在0.02ml異丙醇中，去離子水稀釋至0.2ml。
(5)、活性的納米金溶液加入還原的抗體中，4-37℃共育2-12小時(shí)。
(6)、凝膠過(guò)濾層析法從抗體復(fù)合物分離未標(biāo)記的納米金屬顆粒。洗脫液0.02 M磷酸鈉pH7.4、150mMNaCl洗脫。第一個(gè)淡紅色峰為標(biāo)記復(fù)合物，第二個(gè)暗色帶為未結(jié)合的納米金屬。重復(fù)一次能進(jìn)一步得到純化效果。
(7)、將制備的蛋白芯片置于37℃的濕盒內(nèi)，滴加10.0μl 1％ PBS-BSA緩沖液(20mM磷酸緩沖液pH7.40，含有150mM NaCl，0.5％BSA，0.1％甘油，0.05％Tween 20)芯片上，孵育5分鐘，以阻斷非特異性的蛋白結(jié)合位點(diǎn)及減少非特異性的抗體結(jié)合。
(8)、PBS-BSA漂洗1分鐘。
(9)、室溫與納米金復(fù)合物孵育30分鐘。納米金復(fù)合物PBS-BSA稀釋50倍，其中含有1％正常納米金標(biāo)記抗體的同種血清。
(10)、漂洗，PBS-BSA 1分鐘，共3次，PBS漂洗1分鐘，共3次。
(11)、1％戊二醛的PBS固定10分鐘。
(12)、去離子水漂洗5分鐘，2次。
(13)、滴加適量鋰銀試劑染色3分鐘。
(14)、去離子水漂洗5分鐘，2次。
(15)、使用低溫樹(shù)脂常規(guī)方法脫水包埋。
(16)、顯微鏡下觀察結(jié)果。實(shí)施例14 利用納米金標(biāo)記采用原位雜交技術(shù)實(shí)施組織芯片的檢測(cè)試劑單順丁烯二乙酰亞胺修飾的納米金試劑(直徑1.4nm)，鋰銀液購(gòu)自Nanoprobes公司。
SH修飾的IL-8寡核苷酸探針5’-GTT GGC GCA GTG TGG TCC ACTCTC AAT CAT-(CH2)6-SH-3’由上海Sangon公司提供。
蛋白酶K購(gòu)自寶林曼公司。
Buffer I(Ph7.4)自配馬來(lái)酸0.1M，NaCl 0.15M。步驟(1)、組織芯片自制。(參考Nocito A，Kononen J，Kallioniemi OP.Tissuemicroarrays(TMAs)for high-throughput molecular pathology research.Int JCancer.2001 Oct 1；94(1)1-5.)。
(2)、寡核苷酸9.6nmol與TECP-HCl 6.2mmol，0.1M磷酸鈉緩沖液(pH8.0，含有51mMEDTA)混合。溫度37℃下進(jìn)行還原反應(yīng)。
(3)、溶解納米金6nmol在0.02ml異丙醇中，去離子水稀釋至0.2ml。
(4)、納米金溶液與已還原的SH修飾的寡核苷酸磷酸鈉緩沖液混合(最終反應(yīng)體系中磷酸鈉緩沖液濃度為的0.01M，含有150mMNaCl、1mMEDTA，pH6.5)，納米金與巰基分子數(shù)比為10∶1，4℃共育6小時(shí)，制備成含納米金的寡核苷酸探針。反應(yīng)產(chǎn)物用HPLC分離純化，第一個(gè)淡紅色峰為標(biāo)記復(fù)合物，重復(fù)一次能進(jìn)一步得到純化效果。標(biāo)記復(fù)合物儲(chǔ)存在0.02M磷酸鈉、150mM NaCl、0.05％疊氮化鈉(pH7.5)。
(5)、將制備的蛋白芯片置于37℃的濕盒內(nèi)，0.1M PBS漂洗5分鐘3次。
(6)、3％Triton X-100/0.1M PBS漂洗5分鐘以增加組織的通透性。
(7)、2×SSC漂洗5分鐘。
(8)、蛋白酶K(20μg/m1)消化，37℃孵育5分鐘。
(9)、0.1M甘氨酸/0.1MPBS漂洗5分鐘。
(10)、4％多聚甲醛漂洗5分鐘。
(11)、1M PBS漂洗5分鐘×3次，再用2×SSC漂洗10分鐘。
(12)、預(yù)雜交取預(yù)雜交液適量滴加在細(xì)胞片上，置42℃水浴孵育2小時(shí)。
(13)、雜交按1∶50(標(biāo)記的探針液預(yù)雜交液)比例配制雜交液。將雜交液滴加在組織芯片上，再用DEPC水處理的Parafilm膜覆蓋置于濕盒內(nèi)，42℃水浴孵育20小時(shí)。
(14)、取出芯片，去膜，37℃條件下依次在4×SSC、2×SSC、1×SSC、0.5×SSC中各漂洗5分鐘×3次。
(15)、0.1M PBS室溫漂洗5分鐘。
(16)、Buffer I室溫浸洗5分鐘。
(17)、BufferII(含1％封阻劑的Buffer I)37℃孵育1小時(shí)。
(18)、Buffer I室溫漂洗5分鐘。
(19)、滴加滴加適量鋰銀試劑染色3分鐘。
(20)、0.1M PBS充分漂洗，終止反應(yīng)。
(21)、芯片常規(guī)脫水、透明、中性樹(shù)膠封片。
(22)、顯微鏡下觀察結(jié)果。對(duì)比試驗(yàn)1 熒光標(biāo)記檢測(cè)法實(shí)驗(yàn)步驟(1)、DNA芯片自制(參考Linda A.Chrisey，Gil U Lee and C.ElizabethO’Ferrall.Covalent attachment of synthetic DNA to self-assembled monolayerfilms.Nucleic Acids Research，1996，24(15)3031-3039)，制備的DNA芯片置于預(yù)熱的雜交室內(nèi)，加入5.0μl 5×SSC-2g/LSDS于雜交室內(nèi)以保持濕度。
(2)、自金黃色葡萄球菌感染敗血癥患者50μl血清中，參照上海申能博彩生物科技有限公司DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA，取2μl該DNA提取液為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系如下總體積為25μl。50mM KCl，10mMTis-HCl(pH9.0)，5mM MgCl2，200μM dATP，200μM dGTP，200μM dCTP，80μM dTTP，40μM CY5標(biāo)記dUTP，1.25U DNA聚合酶，各0.2μM的上游及下游引物。引物序列為上游5’-gTC ggT ACA CgA TAT TCT TCA Cg-3’，下游5’-CTC TCg TAT gAC Cag CTT Cgg TAC-3’。擴(kuò)增條件為94℃ 5分鐘，以94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 1分鐘循環(huán)40次，72℃延伸10分鐘。電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。
(3)、1.0μl熒光標(biāo)記DNA加入9.0μl雜交緩沖液中，于95℃變性10分鐘，立即冰浴。
(4)、滴加該DNA樣品雜交緩沖液于芯片表面，加蓋一2cm×cm的蓋玻片，封閉雜交小室，浸入42℃水浴中，雜交1小時(shí)。
(5)、取出芯片立即浸入室溫的1×SSC-0.1％SDS清洗液中，清洗5分鐘。移入40℃ 0.1×SSC-0.1％SDS清洗液中洗滌5分鐘。立即再以新鮮0.1×SSC-0.1％SDS清洗5分鐘，后移入0.1×SSC清洗5分鐘，以去除SDS。避光干燥。
(6)、將雜交完畢的芯片用激光共聚焦掃描儀在適當(dāng)條件下掃描檢測(cè)雜交信號(hào)。對(duì)比試驗(yàn)2 同位素標(biāo)記檢測(cè)法實(shí)驗(yàn)步驟(1)、DNA芯片自制(參考Linda A.Chrisey，Gil U Lee and C.ElizabethO’Ferrall.Covalent attachment of synthetic DNA to self-assembled monolayerfilms.Nucleic Acids Research，1996，24(15)3031-3039)，制備的DNA芯片置于預(yù)熱的雜交室內(nèi)，加入5.0μl 5×SSC-2g/LSDS于雜交室內(nèi)以保持濕度。
(2)、自金黃色葡萄球菌感染敗血癥患者50μl血清中，參照上海申能博彩生物科技有限公司DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA，取2μl該DNA提取液為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系如下總體積為25μl。50mM KCl，10mMTis-HCl(pH9.0)，5mM MgCl2，200μM dATP，200μM dGTP，200μM dCTP，200μM dTTP，1.25U DNA聚合酶，各0.2μM的上游及下游引物。引物序列為上游5’-gTC ggT ACA CgA TAT TCT TCA Cg-3’，下游5’-CTC TCg TATgAC Cag CTT Cgg TAC-3’。擴(kuò)增條件為94℃ 5分鐘，以94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 1分鐘循環(huán)40次，72℃延伸10分鐘。電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。
(3)、用博大泰克DNA片段回收純化試劑盒回PCR產(chǎn)物，并采用隨機(jī)引物標(biāo)記法進(jìn)行同位素標(biāo)記。
(4)、1.0μl同位素標(biāo)記DNA加入9.0μl雜交緩沖液中，于95℃變性10分鐘，立即冰浴。
(5)、滴加該DNA樣品雜交緩沖液于芯片表面，加蓋一2cm×cm的蓋玻片，封閉雜交小室，浸入42℃水浴中，雜交1小時(shí)。
(6)、取出芯片立即浸入室溫的1×SSC-0.1％SDS清洗液中，清洗5分鐘。移入40℃ 0.1×SSC-0.1％SDS清洗液中洗滌5分鐘。立即再以新鮮0.1×SSC-0.1％SDS清洗5分鐘，后移入0.1×SSC清洗5分鐘，以去除SDS。避光干燥。
(7)、將雜交完畢的芯片進(jìn)行放射自顯影檢測(cè)雜交信號(hào)。
根據(jù)具體實(shí)施例8方法，采用純培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌提取其DNA與兩種對(duì)比試驗(yàn)進(jìn)行的不同濃度檢測(cè)結(jié)果比較如下(注結(jié)果表示為x∶y，x表示檢出陽(yáng)性次數(shù)，y表示檢測(cè)次數(shù)) 由上述對(duì)比試驗(yàn)的比較可看出(1)本發(fā)明采用的納米放大技術(shù)，能夠把雜交的信號(hào)放大到104-8倍，具有高的檢測(cè)靈敏度和特異性。
(2)本發(fā)明采用的納米放大技術(shù)，可以避免PCR反應(yīng)，從而簡(jiǎn)化了樣品的處理過(guò)程，縮短了檢測(cè)時(shí)間。
(3)本發(fā)明采用的納米放大技術(shù)，無(wú)污染，不需要昂貴的檢測(cè)儀，降低了芯片的使用成本及實(shí)驗(yàn)條件。
權(quán)利要求
1.一種生物芯片的納米放大檢測(cè)方法，其特征在于方法包括以下步驟(一)、用納米直徑的金屬顆粒標(biāo)記核酸或蛋白；(二)、將標(biāo)記的核酸或蛋白與生物芯片上的探針或組織雜交結(jié)合；(三)、利用能與該標(biāo)記的納米直徑的金屬顆粒發(fā)生金屬相反應(yīng)的金屬試劑與已雜交結(jié)合在生物芯片上的核酸或蛋白上標(biāo)記的納米金屬反應(yīng)，放大納米金屬顆粒并進(jìn)行普通光學(xué)檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物芯片的納米放大檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟(一)中納米直徑的金屬顆粒標(biāo)記核酸的方法包括(1)通過(guò)寡核苷酸接頭實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸的標(biāo)記；或(2)通過(guò)引物實(shí)現(xiàn)對(duì)產(chǎn)物核酸的標(biāo)記；或(3)直接對(duì)核酸實(shí)現(xiàn)的標(biāo)記。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的生物芯片的納米放大檢測(cè)方法，其特征在于通過(guò)寡核苷酸接頭實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸的標(biāo)記，方法的步驟包括(1)、制備納米金屬溶液；(2)、將納米金屬溶液與寡核苷酸混合，納米金屬與寡核苷酸分子數(shù)之比為1-100∶1，反應(yīng)獲得含納米金屬的寡核苷酸接頭；(3)、提取標(biāo)本DNA，通過(guò)去磷酸化反應(yīng)去除DNA的5’端的磷酸基團(tuán)，防止其自身連接；(4)、在連接酶作用下，結(jié)合納米金屬標(biāo)記的寡核苷酸接頭與上述處理的標(biāo)本DNA，獲得納米金屬標(biāo)記的樣本DNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的生物芯片的納米放大檢測(cè)方法，其特征在于通過(guò)引物實(shí)現(xiàn)對(duì)產(chǎn)物核酸標(biāo)記方法中，采用通過(guò)PCR反應(yīng)引物實(shí)現(xiàn)對(duì)產(chǎn)物DNA的標(biāo)記，方法的步驟包括(1)、制備納米金屬溶液；(2)、將納米金屬溶液與PCR引物混合，納米金屬與引物分子數(shù)之比為1-100∶1，得到納米金屬標(biāo)記的PCR引物；(3)、利用該標(biāo)記引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到納米金屬標(biāo)記的PCR產(chǎn)物DNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的生物芯片的納米放大檢測(cè)方法，其特征在于通過(guò)引物實(shí)現(xiàn)對(duì)產(chǎn)物核酸的標(biāo)記方法中，采用通過(guò)RT-PCR反應(yīng)引物實(shí)現(xiàn)對(duì)產(chǎn)物cDNA的標(biāo)記，方法的步驟包括(1)、制備納米金屬溶液；(2)、將納米金屬溶液與RT-PCR引物混合，納米金屬與引物分子數(shù)之比為1-100∶1，得到納米金屬標(biāo)記的RT-PCR引物；(3)、利用該標(biāo)記引物進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，得到納米金屬標(biāo)記的RT-PCR產(chǎn)物cDNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的生物芯片的納米放大檢測(cè)方法，其特征在于直接對(duì)核酸實(shí)現(xiàn)的標(biāo)記的方法是通過(guò)與核酸的末端基團(tuán)反應(yīng)，從而使核酸末端修飾有含硫或含二酰亞胺類的化合物，該類化合物可以和納米金屬反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)納米金屬對(duì)核酸的標(biāo)記。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物芯片的納米放大檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟(一)中納米直徑的金屬顆粒標(biāo)記蛋白的方法步驟為(1)、制備納米金屬溶液；(2)、納米金屬溶液與還原處理的蛋白混合，納米金屬與蛋白分子數(shù)之比為不低于5∶1，得到納米金屬標(biāo)記的蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物芯片的納米放大檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟(二)中的納米金屬標(biāo)記的核酸與生物芯片上的探針雜交的步驟是(1)、對(duì)納米金屬標(biāo)記的DNA進(jìn)行變性處理；(2)、滴加變性處理的納米金屬標(biāo)記的DNA于生物芯片表面，進(jìn)行雜交反應(yīng)；(3)、清洗去除未雜交結(jié)合的納米金屬標(biāo)記的DNA；(4)、干燥處理備用。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物芯片的納米放大檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟(二)中的納米金屬標(biāo)記的蛋白與生物芯片上的探針結(jié)合的步驟是(1)、PBS處理生物芯片，以阻斷非特異的蛋白的結(jié)合位點(diǎn)及減少非特異性；(2)、滴加納米金屬標(biāo)記的蛋白于生物芯片上，共育反應(yīng)；(3)、漂洗，去除未結(jié)合的納米金屬標(biāo)記的蛋白；(4)、晾干備用。
全文摘要
本發(fā)明涉及的生物芯片的納米放大檢測(cè)方法，其特征在于方法包括的步驟是用納米直徑的金屬顆粒標(biāo)記核酸或蛋白；將標(biāo)記的核酸或蛋白與生物芯片上的探針或組織雜交結(jié)合；利用能與該標(biāo)記的納米直徑的金屬顆粒發(fā)生金屬相反應(yīng)的金屬試劑與已雜交結(jié)合在生物芯片上的核酸或蛋白上標(biāo)記的納米金屬反應(yīng)，放大納米金屬顆粒并進(jìn)行普通光學(xué)檢測(cè)。本發(fā)明采用的納米放大技術(shù)，能夠把雜交的信號(hào)放大到10
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1390955SQ02133538
公開(kāi)日2003年1月15日 申請(qǐng)日期2002年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月26日
發(fā)明者周元國(guó), 顧大勇, 魯衛(wèi)平, 熊仁平, 劉霞, 申海鷹, 陳星云 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)