專(zhuān)利名稱(chēng)：控制植物根系發(fā)育基因的啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物啟動(dòng)子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
農(nóng)作物的生長(zhǎng)與發(fā)育都需要依賴(lài)根系從土壤中吸收水分和無(wú)機(jī)鹽養(yǎng)分。因此，根的發(fā)育對(duì)于農(nóng)作物的產(chǎn)量起著至關(guān)重要的作用。水稻的根系，可根據(jù)它們發(fā)生的位置和發(fā)育階段分為兩類(lèi)，一類(lèi)是胚生根，一類(lèi)是胚后發(fā)育的根。胚生根由胚根萌發(fā)后發(fā)育而來(lái)，它有兩種形式，一條初生根和幾條種子根。胚后發(fā)育的根，也有兩種類(lèi)型，一類(lèi)是從植株莖節(jié)產(chǎn)生的不定根，另一類(lèi)是在所有類(lèi)型根上，都產(chǎn)生的側(cè)生根。
在模式植物擬南芥中，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多參與生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因，調(diào)控著根的發(fā)育。例如受生長(zhǎng)素快速誘導(dǎo)的AUX/IAA基因的成員，包括XHY2/IAA3，SLR1/IAA14，IAA28，MSG2/IAA19，如果發(fā)生突變都會(huì)導(dǎo)致側(cè)生根減少或沒(méi)有(Reed2001，Trends Plant Sci.6，420-425)。相反有些基因如AUX1，TIR1或者M(jìn)AC1超表達(dá)，則會(huì)促進(jìn)側(cè)生根的形成(Marchant et al.，2002，Plant Cell.14，589-597.；Gray et al.，1999，Genes Dev.13，1678-1691；Xie et al.，2000，Genes Dev.14，3024-3036)。植物生長(zhǎng)素(吲哚乙酸，IAA)在根發(fā)育多個(gè)方面起著重要作用，它們包括抑制初生根的伸長(zhǎng)，促進(jìn)不定根，側(cè)根和根毛的形成，維持根尖細(xì)胞分化狀態(tài)。作為一個(gè)重要的調(diào)節(jié)激素，生長(zhǎng)素調(diào)控著細(xì)胞分裂、細(xì)胞擴(kuò)展及其細(xì)胞的分化。這就決定生長(zhǎng)素影響植物發(fā)育是多方面的，它決定著下胚軸和莖端的伸長(zhǎng)，介導(dǎo)著根和莖的向地性，維持著頂端優(yōu)勢(shì)，并且促進(jìn)維管束的形成(Hobbie，1998，Plant Physiol.Biochem.36，91-102)。
很多受生長(zhǎng)素調(diào)控的基因的啟動(dòng)子序列中都有一段共同序列—生長(zhǎng)素反應(yīng)元件AuRE(Auxin Response Element)5’-TGTCTC-3’，這個(gè)序列被證實(shí)是生長(zhǎng)素反應(yīng)因子ARF(auxin response factor)結(jié)合所必需的(Guilfoyle et al.，1998，PlantPhysiol.118，341-347；Liu et al.，1994，Plant Cell.6，645-57；Ulmasov etal.，1999，Plant J 19，309-319)。幼葉原基、幼葉和根尖分生組織可能是生長(zhǎng)素合成的部位。幼葉合成的生長(zhǎng)素，可以向下極性運(yùn)送到根；而根尖產(chǎn)生的生長(zhǎng)素，它可以在根尖皮層里向上運(yùn)輸。這種極性運(yùn)輸可以引起細(xì)胞間的生長(zhǎng)素濃度的梯度，而極有可能這個(gè)濃度梯度決定了胚胎細(xì)胞分化形態(tài)、維管束的分化、根尖分生組織形態(tài)建立等。最近的研究也表明，生長(zhǎng)素不僅可以誘導(dǎo)生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中正調(diào)控蛋白的表達(dá)，同時(shí)也可以誘導(dǎo)生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)調(diào)控蛋白，如AUX/IAA家族蛋白，而AUX/IAA家族蛋白又會(huì)被生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的SCFTIR1蛋白降解復(fù)合體所降解(del Pozo and Estelle，1999，Trends Plant Sci.4，107-112；Gray et al.，2001，Narure.414，271-276)。這樣，植物通過(guò)一個(gè)精巧的反饋抑制與解抑制系統(tǒng)來(lái)精細(xì)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素的調(diào)控作用。生長(zhǎng)素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在雙子葉和單子葉植物中具有較高的保守性。首先在水稻中發(fā)現(xiàn)了11個(gè)基因，編碼的蛋白序列和擬南芥的ARF蛋白有同源性(Sato et al.，2001，Genes Genet.Syst.76，373-80)。而且在水稻中分離的OsIAA1基因，作為一個(gè)單子葉AUX/IAA基因家族的成員，被證實(shí)它可以被生長(zhǎng)素和光線所誘導(dǎo)(Thakur et al.，2001，DNA Res 8，193-203)。與雙子葉植物相比，單子葉植物根發(fā)育調(diào)控機(jī)理的研究相對(duì)滯后。只有在玉米中發(fā)現(xiàn)的幾個(gè)與根發(fā)育相關(guān)的突變體可供研究rtcs，完全不產(chǎn)生不定根；rt1，只形成很少或沒(méi)有冠狀根和支持根；asr1，種子根形成缺陷；slr1和slr2，只形成很短的側(cè)生根(Hetz et al.，1996，Plant J.10，845-857)，但遺憾的是這些突變體相對(duì)應(yīng)的基因并沒(méi)有克隆出來(lái)。而在水稻中，和根發(fā)育相關(guān)的基因研究則更少，現(xiàn)在只證實(shí)了水淹和乙烯處理能誘導(dǎo)不定根的形成(Suge，1985，Plant Cell Physiol.26，607-614；Bleecker et al.，1987，Plant Physiol.84，395-398)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供控制植物根系發(fā)育基因的啟動(dòng)子。
本發(fā)明的發(fā)明人采用反向遺傳學(xué)的方法，分離克隆了水稻中與擬南芥AtFPF1(flowering promoting factor 1)基因(Kania et al.，1997 Plant Cell.9，1327-1338)同源的OsRAA1(Oryza sativa Root Architecture Associated 1)基因，并初步研究了它在植物發(fā)育中的功能。它的啟動(dòng)子序列是基于數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的EST(expressionsequence tag)和基因組序列來(lái)獲得的。
本發(fā)明提供的控制植物根系發(fā)育基因的啟動(dòng)子，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。
序列表中序列1的DNA是水稻OsRAA1的啟動(dòng)子，由1987個(gè)堿基組成。
含有本發(fā)明啟動(dòng)子的表達(dá)載體、細(xì)胞系均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明啟動(dòng)子的發(fā)現(xiàn)和其功能的闡明，在植物特別是水稻育種中具有重要的意義。


圖1為從水稻基因組DNA擴(kuò)增OsRAA1啟動(dòng)子的電泳圖譜。
圖2為本發(fā)明啟動(dòng)子序列的赤霉素和生長(zhǎng)素順式調(diào)控反應(yīng)元件分析。
圖3為轉(zhuǎn)化水稻OsRAA1基因的啟動(dòng)子融合GUS基因的植物表達(dá)載體的圖譜。
圖4為表達(dá)載體的酶切鑒定譜帶。
圖5為OsRAA1∷GUS基因在轉(zhuǎn)基因水稻中的GUS活性染色。
圖6為生長(zhǎng)素誘導(dǎo)OsRAA1的表達(dá)。
具體實(shí)施例方式
在下述實(shí)施例中，所用的水稻品種為中花10號(hào)(Oryza sativa L.cv Zhonghua 10)和中花11號(hào)(Oryza sativa L.cv Zhonghua 11)。
實(shí)施例1、水稻OsRAA1基因啟動(dòng)子序列的分離1、啟動(dòng)子引物設(shè)計(jì)選取ORF前1987bp作為目標(biāo)序列，依據(jù)PAC(AP002525)序列設(shè)計(jì)了5’端引物5’-TGCAGGA TCCATA GAT TTG TCA AGA AAA CAT TTC GA-3’(下劃線序列為BamH I位點(diǎn))。同時(shí)考慮到需要把它和植物表達(dá)雙元載體pCAMBIA1301的報(bào)告基因GUS相連，而在pCAMBIA1301的報(bào)告基因GUS起始密碼子上有一個(gè)Nco I(CCATGG)位點(diǎn)，因此在目標(biāo)基因的起始密碼子上，也修飾為Nco I(CCATGG)位點(diǎn)，3’端引物為5’-CCTG CCATGG CTT AGA TCT CTC TCA AAC TC-3’。
2、PCR擴(kuò)增OsRAA1基因的啟動(dòng)子序列常規(guī)方法分離水稻基因組DNA，引物如前設(shè)計(jì)，反應(yīng)程序是97℃ 5min，1 cycle，加Taq酶；94℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 3min，30 cycles；72℃ 7min，1 cycle。
用日本晴基因組DNA作為模板，得到了需要的目標(biāo)條帶，如圖1所示，圖中M3λDNA用Hind III和EcoR I消化的產(chǎn)物；LP單正向(forward)引物擴(kuò)增產(chǎn)物；DP雙引物擴(kuò)增產(chǎn)物；RP單反向(reverse)引物擴(kuò)增產(chǎn)物。圖中顯示雙引物擴(kuò)增產(chǎn)物中有一個(gè)特異的2.0kb的片段。測(cè)序結(jié)果得到的啟動(dòng)子序列1987bp，為序列表中序列1的DNA序列。
在所得到的啟動(dòng)子序列里含有大量的嘧啶盒，至少三個(gè)GARE，兩個(gè)TATCCA盒，及生長(zhǎng)素反應(yīng)元件TGTCTC，其分布如圖2所示，其中B是在啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)定位赤霉素反應(yīng)元件的3個(gè)組分，嘧啶盒，TAACAAA和TATCCA盒，(用DNAMAN軟件處理)。C是在啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)定位生長(zhǎng)素反應(yīng)元件的核心序列TGTCTC(箭頭所示為潛在的反應(yīng)元件)，這些反應(yīng)元件的核心序列處于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游約150bp的位置。這些保守序列的存在可能暗示這個(gè)基因受赤霉素和生長(zhǎng)素的調(diào)控。
實(shí)施例2、水稻OsRAA1基因啟動(dòng)子融合GUS基因的植物表達(dá)載體的構(gòu)建將經(jīng)測(cè)序鑒定的2.0kb PCR片斷，用BamH I和Nco I消化；同時(shí)用BamH I和NcoI酶切去pCAMBIA1301質(zhì)粒中GUS基因前的CaM35S啟動(dòng)子，連上消化好的2.0kbPCR片斷，即完成了OsRAA1Pro∷GUS (pCAMBIAI301)植物表達(dá)載體，其基因結(jié)構(gòu)圖譜如圖3所示。圖4是三個(gè)表達(dá)載體的酶切鑒定，其中帶1是Marker；帶2是轉(zhuǎn)化水稻的OsRAA1正義基因植物表達(dá)載體用Kpn I和Sac I進(jìn)行酶切的鑒定圖譜(切出了360bp的目標(biāo)條帶)；帶3是轉(zhuǎn)化水稻的OsRAA1反義基因植物表達(dá)載體用BamH I和Kpn I進(jìn)行酶切的鑒定圖譜(切出了360bp的目標(biāo)條帶)；帶4是轉(zhuǎn)化水稻OsRAA1基因的啟動(dòng)子融合GUS基因的植物表達(dá)載體用BamH I和Nco I進(jìn)行酶切鑒定圖譜(切出2kb的目標(biāo)條帶)，從圖中可以看出，GUS基因已置于OsRAA1基因的啟動(dòng)子后。
實(shí)施例3、植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植株的組織化學(xué)分析鑒定用OsRAA1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的β-葡糖醛酸苷酶報(bào)告基因(GUS)植物轉(zhuǎn)化載體，利用農(nóng)桿菌侵染的方法轉(zhuǎn)化水稻，并用GUS原位組織化學(xué)活性分析進(jìn)行檢測(cè)。方法是將經(jīng)根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生的抗性愈傷組織及轉(zhuǎn)化植株的葉片和根段分別放到GUS染色液(100mmol/L NaPO4(pH7.0)；0.1％Triton X-100；10mmol/L EDTA；0.5mmol/L亞鐵氰化鉀；0.5mmol/L鐵氰化鉀；1mg/mL X-Gluc)中，抽氣幾分鐘，然后置于37℃溫育過(guò)夜，觀察藍(lán)色反應(yīng)。染色后的組織用70％乙醇脫色。結(jié)果如圖5所示，圖中，A，初生根分支區(qū)的X-gluc染色，表明不僅在側(cè)根而且在它們的原基組織都有很強(qiáng)信號(hào)(箭頭所示)；B，初生根根尖的染色，表明在根尖的分生和伸長(zhǎng)區(qū)都有GUS活性信號(hào)，特別是根的中柱有很強(qiáng)信號(hào)；C，受粉前的成熟小花，表明內(nèi)外稃也有GUS活性，特別是維管束更強(qiáng)一些；D，幼苗的染色，在幼葉的某些部分存在一些信號(hào)，但是不穩(wěn)定和無(wú)規(guī)則性，可能是由于轉(zhuǎn)GUS基因的滲漏表達(dá)造成的；E，染色后的花器官，雄蕊成熟后，花柱和花絲的連接部分也有穩(wěn)定的很強(qiáng)信號(hào)(箭頭所示)。
從OsRAA1的表達(dá)模式可以看出OsRAA1總是存在于快速生長(zhǎng)的細(xì)胞內(nèi)，如，側(cè)根原基，側(cè)根和不定根中柱。對(duì)于這些組織的細(xì)胞快速分裂和伸長(zhǎng)，生長(zhǎng)素起到重要作用。
實(shí)施例4、OsRAA1Pro∷GUS轉(zhuǎn)基因水稻的NAA處理及GUS活性的組織化學(xué)染色OsRAA1Pro∷GUS轉(zhuǎn)基因水稻T1代種子，在溫室生長(zhǎng)兩個(gè)月后，從土壤中小心拔出，洗去土壤，在1/2MS無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中培養(yǎng)3天，然后將水稻轉(zhuǎn)移到含有2.5μM NAA的1/2MS無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中。選取兩種新生的不定根(直徑約1mm和0.5mm)作為染色對(duì)象。在不同的時(shí)間段(0，1，2，4小時(shí))分別剪取根尖，進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色。結(jié)果如圖6所示，其中A，水稻幼根的RNA Northern雜交顯示OsRAA1的轉(zhuǎn)錄受生長(zhǎng)素的誘導(dǎo)(用10nM IAA分別處理野生型幼苗0，1/4，1/2，1，2，4，8hours)，對(duì)照為EB染色的rRNA。B，OsRAA1∷GUS轉(zhuǎn)基因水稻的根用NAA(2.5μM)處理不同時(shí)間(0，1，2，4hours)的GUS染色結(jié)果。C-E，野生型水稻在1/2MS培養(yǎng)基(含有1μM NAA或沒(méi)有NAA)生長(zhǎng)14天的表型，C，顯示1μM NAA的處理強(qiáng)烈抑制植株根系的生長(zhǎng)，右邊兩株為NAA處理植株，左邊為未處理植株；D，未處理的植株根基部的情況；E，用1μM NAA處理的植株根基部的情況，箭頭所示為螺旋的初生根。從圖中可以得出，在NAA誘導(dǎo)一小時(shí)的根尖有最強(qiáng)的信號(hào)。
序列表<160>1<210>1<211>1987<212>DNA<213>稻屬水稻(Oryza sativa L.)<400>1tggccattaa caaataaaca aaaataaaca tatccataga tttgtcaaga aaacatttcg 60atcatataca ccatgatata tattgtaggt gctagttatc caacaatatt atgattttaa 120gcattgcgat aattttaaaa agctggtgat tatgtttatt taacttagaa cttgtggtat 180atttatgtgt gatttgtcac aacacggaac cactgtactg aggattttaa aacagtacta 240tgttcggccg gtaccttttg cacaaacaag cagtggcgcc cgaaagcata tatatgatgg 300atgtttaggt taagtcattg gaacctttct attgattaat cggttgattg aggagcaaga 360ttaacgccaa cttttagcat atatatatcg gccagacaaa tttgaaaagt aaacttttaa 420ctctgaaaaa catttcttaa ttatggggcg ttcatttttc tgccgtacaa cacaaccaaa 480acaggcctcg attaaacaaa tgtgtgccaa attttaggga cagacgtgca ccaatattat 540cacaaaggga acgaacacaa taaccaaatt aatgcgccat tgcgtgcgca ctatgggaat 600aattttgtta catatatata taaatagatg tggtattcta agataaacca aaatcttttt 660aaattttctg cagaagatgc tagcttgagc ttgtcaatca atatagctag agctataaaa 720attaaagaaa aaaattatgt cctgccgtac acaaaatata tacttgacaa tgagctagga 780gaatcggttt tgttcctgat aaaaggtgat cttagctctg tcgatcggcc agaattcact 840ttcactagaa aaaaaaaatt gttcgaaaag agatgggcat gcacgtacag ctgaaattct 900cttgtgtgat ggctaagtaa agtagtaaac tatgggaagt gaatcatatt cccttctttg 960ataaatagac cccttttgtt ttcgagaaaa gaaagtaggt aggattcctc gcacagcatc1020acaagttatt ttcgttacca tatgaaaatt cttatctatc tatatatcaa tccattgtga1080aatcaattag ctttatggga tatataacac taatttatca ttgtggtcca agtaagatgc1140atggatatta ggatttaacc gattaatcat gcattttata tacacaaccc atatggtttt1200tatctctctt tttctacgcg tcatggtcac acgataacat gtgttgataa tcgagaaccc1260ttgatgtcat gcatgcatgt atatatttca atcgactttg gtttgtccca aaaattagag1320aataaatact agtttatttt tcttcttttt agagattgta cgatcactag ctagctaggt1380atagctagct gacggatttt tccaattagg tatatatcca tgcacacaca ccgatctttt1440cattcattct tttctttctt ttcacagata tattccaggt agcttatcaa gcacataatg1500ttggaaaatt aaacaaggaa tccttaacta acaaatgaaa cacggggagg gaggaagaga1560gggggcagag ctagagagct agctagctat tgctacagca catcttcgat atcatgacct1620aacctaacta cgaccccacg tatactcgat actaaactac tatagacgaa cgaacgatcg1680ttcgttcgtt tcgcatatat ctataaatcc tttatgatat cgatatctct atttcttagt1740atatctaata gcatagtagt aggttagtat atctgctata gctagctagc agtacatgca1800tgcatgcaca catgtacata ctaccatatc tctgtcttgt ctccctttca catgtcacct1860ctgacccaca aacaaaccct ttccaagctc ctaacactag ctttaccttc ttcttcctcc1920tcctctgtat atatacaccc cctcacctcc ctatcttgca cccatccatc cacccatagc1980tatctct 198權(quán)利要求
1.控制植物根系發(fā)育基因的啟動(dòng)子，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子，其特征在于它具有序列表中序列1的DNA序列。
3.含有權(quán)利要求1所述啟動(dòng)子的表達(dá)載體。
4.含有權(quán)利要求1所述啟動(dòng)子的細(xì)胞系。
5.權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子在植物育種中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為水稻。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了控制植物根系發(fā)育基因的啟動(dòng)子及其應(yīng)用，其目的是提供控制植物根系發(fā)育基因的啟動(dòng)子。本發(fā)明提供的控制植物根系發(fā)育基因的啟動(dòng)子，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。含有本發(fā)明啟動(dòng)子的表達(dá)載體、細(xì)胞系均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明啟動(dòng)子的發(fā)現(xiàn)和其功能的闡明，在植物特別是水稻育種中具有重要的意義。
文檔編號(hào)C12N5/04GK1483822SQ0213075
公開(kāi)日2004年3月24日 申請(qǐng)日期2002年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月20日
發(fā)明者種康, 葛磊, 陳惠 , 趙原, 徐云遠(yuǎn), 許明麗, 許智宏, 譚克輝, 種 康 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院植物研究所