專利名稱：基于綠色熒光蛋白檢測細(xì)胞凋亡的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測細(xì)胞凋亡或檢測細(xì)胞程序性死亡的組合物和方法。
背景技術(shù)：
在本發(fā)明公開的內(nèi)容中，不同的文獻(xiàn)通過第一作者和日期，在括號內(nèi)的，專利號或文獻(xiàn)號被引用。完整的文獻(xiàn)引用被提供在本申請的末尾用于參考。這些文獻(xiàn)的內(nèi)容通過引用被合并到本申請中用來更全面的描述本申請的相關(guān)技術(shù)。
細(xì)胞凋亡，也稱為細(xì)胞程序死亡(“PCD”)，是在維持生物體的正常生理功能中起重要作用的非常重要的細(xì)胞過程[1，2]。例如，當(dāng)DNA在細(xì)胞中被損傷且不能被修復(fù)時，細(xì)胞將進(jìn)入細(xì)胞凋亡來避免在組織中形成畸形變態(tài)。此外，細(xì)胞凋亡過程被用于胸腺中來去除自我反應(yīng)的T細(xì)胞從而來避免自身免疫。細(xì)胞凋亡必需被精確地調(diào)控來維持我們機(jī)體的正常功能。例如激活細(xì)胞凋亡的失敗可引起癌癥或自身免疫病[3]。另一方面，細(xì)胞凋亡的激活過度可導(dǎo)致有機(jī)體的巨大的損傷；其可導(dǎo)致很多的神經(jīng)變性疾病例如亨廷頓舞蹈病(Huntington′s disease)和阿耳茨海默氏病(Alzheimer’sdisease)[4，5]。
由于很多重要的疾病，包括癌癥，AIDS，自身免疫疾病以及神經(jīng)變性疾病與細(xì)胞凋亡的不足或過度有關(guān)，能夠啟動或阻止細(xì)胞凋亡的藥物在治療很多的疾病中均是非常有用的。因此，在分子基礎(chǔ)上研究細(xì)胞凋亡的過程是非常有意義的。指示細(xì)胞凋亡過程的信號途徑是非常復(fù)雜的[6-8]。很多外部信號可以引發(fā)細(xì)胞凋亡的開始，包括UV照射，“死亡區(qū)域”通過TNF(腫瘤壞死因子)受體的激活，激素(例如，腎上腺皮質(zhì)激素)治療或化學(xué)療法藥物(例如，喜樹堿)[6-9]。同樣作為內(nèi)部信號，已知細(xì)胞凋亡是細(xì)胞內(nèi)事件程序性級聯(lián)的結(jié)果，其主要激活一類稱為半胱天冬酶(caspases)的半胱氨酸蛋白酶[7，10]。半胱天冬酶是死亡蛋白酶且彼此之間是異體同型的。它們在進(jìn)化中是高度保守的且被發(fā)現(xiàn)可存在于從人到昆蟲，線蟲和水螅中[23-25]。在人體超過一打的半胱天冬酶已被鑒定，其中的三分之二被確信在細(xì)胞凋亡中行使功能[25，26]。
所有已知的半胱天冬酶具有一個活性位點(diǎn)半胱氨酸且在Asp-Xxx鍵處裂解底物。每一種半胱天冬酶的顯著的特性通過裂解位點(diǎn)的4個殘基氨基末端被檢測[27]。半胱天冬酶被依據(jù)底物特異性，序列同源性以及結(jié)構(gòu)相似性的程度被分成亞族。綜述細(xì)胞凋亡的生物化學(xué)和半胱天冬酶的作用參見Hengartner，M.(2000)自然(Nature)407770-776。
目前，存在很多技術(shù)可以檢測細(xì)胞凋亡在不同階段的作用。例如，細(xì)胞凋亡的終止階段可通過細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化被測定(例如存在凋亡體(apoptotic bodies))。在此之前，細(xì)胞凋亡可通過利用凝膠分析或TUNEL技術(shù)的DNA斷裂來被檢測[11]。細(xì)胞凋亡的早期階段可通過Annexin V-FITC標(biāo)記的蛋白[12]檢測PS(磷脂酰絲氨酸)在膜中的轉(zhuǎn)移來測定，或通過檢測半胱天冬酶-3利用熒光染料連接到底物肽上的激活來測定[13]。然而所有的這些技術(shù)具有特定的局限性，例如凝膠分析僅被用于細(xì)胞的提取物，而不能用于單個細(xì)胞或完整的細(xì)胞。TUNEL方法僅僅可被應(yīng)用于固定化細(xì)胞，而不是活的細(xì)胞。Annexin V僅僅檢測外細(xì)胞表面而不是細(xì)胞內(nèi)的情況。利用連接熒光染料肽的半胱天冬酶探針也具有其自己的局限性。首先，此探針不能穿透細(xì)胞膜，典型的其用于測定細(xì)胞提取物。其不能夠進(jìn)行體內(nèi)測定。其次，半胱天冬酶裂解產(chǎn)生的熒光變化主要包括染料發(fā)射譜的遷移而不是熒光的全部破壞。其敏感性是有限的。因此，需要一種有效和精確的組合物和方法來檢測程序性細(xì)胞死亡。本發(fā)明滿足了這種需求并同時提供了相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明也提供了實(shí)現(xiàn)可更好理解細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制的研究以及有助于發(fā)現(xiàn)和改進(jìn)新藥來克服很多重要疾病的工具。

發(fā)明內(nèi)容
目前，人們強(qiáng)烈地需要改進(jìn)有效的方法來檢測活細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡過程的激活。本發(fā)明的檢測方法基于的事實(shí)是程序性細(xì)胞死亡涉及一系列胞內(nèi)稱為“半胱天冬酶”的細(xì)胞內(nèi)蛋白酶，這些半胱天冬酶的底物通常共享稱為“底物序列”的共有序列識別和裂解氨基酸序列。通過遺傳工程技術(shù)，分子探針被制備來通過插入編碼底物序列的基因到連接兩種不同顏色的熒光蛋白分子且顯示熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)特性的連接頭上測定半胱天冬酶活性。當(dāng)此改造的基因在細(xì)胞中表達(dá)時，其基因產(chǎn)物(例如探針的蛋白)是特異性半胱天冬酶的底物且在激活的基礎(chǔ)上被半胱天冬酶裂解。在細(xì)胞裂解之后，探針的FRET特性被破壞。因此，半胱天冬酶的激活通過調(diào)控?zé)晒馓结樀臒晒馓匦缘淖兓粰z測。
與傳統(tǒng)的檢測細(xì)胞凋亡的技術(shù)不同，本發(fā)明提供了一種高度敏感性但簡單的早期檢測細(xì)胞凋亡的方法。本發(fā)明分子探針的改進(jìn)利用三種不同的技術(shù)，其中的一些僅最近才被利用。其為(1)GFP技術(shù)的改進(jìn)，(2)半胱天冬酶家族的已知底物序列，以及(3)FRET(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)方法。
本發(fā)明提供了一種用于檢測蛋白酶和半胱天冬酶激活的細(xì)胞凋亡的熒光蛋白構(gòu)建體。構(gòu)建體含有一個供體熒光蛋白，一個受體熒光蛋白，和一個在受體和供體之間的連接肽。連接肽含有半胱天冬酶的底物序列。本發(fā)明也提供了編碼熒光蛋白構(gòu)建體的核酸，含有核酸的表達(dá)載體以及含有這些核酸的基因傳遞載體。
這些組合物在檢測半胱天冬酶和蛋白酶激活的細(xì)胞凋亡地方法中是有用的，通過在適于刺激供體熒光蛋白的條件下培養(yǎng)含有上述核酸和/或蛋白的宿主細(xì)胞樣本并檢測樣本中的熒光特性，其中存在細(xì)胞凋亡的樣本細(xì)胞在供體蛋白和受體蛋白之間產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移的程度的變化。


圖1顯示了inter-GFP(“GFP”)探針設(shè)計(jì)的原理。此探針通過一個含有半胱天冬酶的底物序列的短肽(在此稱為“傳感蛋白”)連接一個藍(lán)綠色的綠色熒光蛋白分子(CFP)與黃色GFP分子(YFP)來構(gòu)建。當(dāng)這兩種GFP分子被連接在一起時，熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象就發(fā)生了。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞凋亡時，激活的半胱天冬酶裂解了連接兩個GFP分子的底物肽(例如“傳感蛋白”)。當(dāng)兩種GFP分離時，就沒有FRET發(fā)生了。
圖2顯示了純化的重組FRET探針的SDS-PAGE分析。多組氨酸標(biāo)記FRET融合蛋白在細(xì)菌中表達(dá)并通過Ni-NTA柱純化。每一含有大約5.2μg蛋白的樣本被通過12％SDS-PAGE凝膠電泳分析，然后用考馬斯藍(lán)染色。
圖3A和圖3B顯示半胱天冬酶-3裂解的Western印跡分析。純化的FRET探針與半胱天冬酶-3一起在反應(yīng)緩沖液中于37℃溫育1-2小時。反應(yīng)混合物用SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)到硝化纖維膜上。蛋白條帶然后用抗-GFP抗體(Clontech)探針檢測。CHO(AC-DEVD-CHO)，是半胱天冬酶-3特異性抑制劑。
圖4A～圖4C顯示了半胱天冬酶-3處理改變了傳感蛋白A和B的發(fā)射譜。通過分光熒光計(jì)(SPEX 1681)掃描譜分析測定每一探針的熒光發(fā)射譜。用于激發(fā)探針中CFP的波長為433nm。-cpp32在反應(yīng)中沒有半胱天冬酶-3。+cpp32半胱天冬酶-3被加到反應(yīng)中。
圖5顯示了劑量依賴性的半胱天冬酶-3裂解試驗(yàn)。相同量的純化的傳感蛋白A和傳感蛋白B蛋白與從0.3125ng到1.28μg范圍的不同量的半胱天冬酶-3溫育1小時。在反應(yīng)的終止處通過分光熒光計(jì)測定每一樣本的YFP和CFP的發(fā)射譜。每一樣本的發(fā)射比率(YFP/CFP)依據(jù)沒有半胱天冬酶-3的空白對照的比率被標(biāo)準(zhǔn)化。
圖6顯示了UV處理的HeLa細(xì)胞的傳感蛋白A的圖像分析。表達(dá)傳感蛋白A和CFP-YFP融和蛋白的HeLa細(xì)胞被通過UV照射5分鐘誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。當(dāng)探針在440nm激活時，相同細(xì)胞的在UV處理前(A，C)和處理后(B，D)的CFP(480±15nm)和YFP(535±12.5nm)的熒光強(qiáng)度通過冷卻的CCD成像系統(tǒng)記錄。YFP/CFP的代表性的比率的圖像顯示在此。顯著的FRET減少僅在表達(dá)傳感蛋白A的兩個細(xì)胞的B區(qū)觀察到，而沒出現(xiàn)在表達(dá)對照融和蛋白的細(xì)胞的D區(qū)中。
圖7是在細(xì)胞凋亡的過程中FRET變化的統(tǒng)計(jì)分析。圖像被記錄在圖6中。YFP和CFP的熒光強(qiáng)度被從每一個圖像測定。來自13個表達(dá)傳感蛋白A的細(xì)胞和9個表達(dá)CFP-YFP融和蛋白的細(xì)胞的UV照射前和照射后的YFP/CFP的平均值被圖示在此。在表達(dá)傳感蛋白A的apoptotic細(xì)胞中通過FRET探針檢測發(fā)現(xiàn)有4倍的減少而在表達(dá)CFP-YFP融和基因的對照細(xì)胞中沒有發(fā)現(xiàn)。
圖8是Western印跡的結(jié)果，其表明純化的傳感蛋白C8和C8A蛋白(210nM)能夠被兩種不同的濃度(86nM和216nM)的半胱天冬酶-8裂解。YFP的位置和多組氨酸標(biāo)記的CFP用箭頭表示。
圖9是劑量依賴性半胱天冬酶-8裂解實(shí)驗(yàn)。固定量的純化傳感蛋白C8和C8A蛋白(22.45nM)與不同量的半胱天冬酶-8一起溫育1小時。每一樣本的發(fā)射譜在反應(yīng)終止時用分光熒光計(jì)測定(激發(fā)波長433nm)。發(fā)射比率(YFP526nm/CFP480nm)依據(jù)沒用半胱天冬酶-8處理的對照樣本的值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的實(shí)施，除非另有說明，利用常規(guī)的分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))，微生物學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)，生物化學(xué)和免疫學(xué)的技術(shù)，其是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。這些技術(shù)具體的被闡述在文獻(xiàn)中。這些方法被描述在下列文獻(xiàn)中。參見，例如，Sambrook等，分子克隆(MOLECULAR CLONING)實(shí)驗(yàn)室手冊，第二版(1989)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等eds.(1987))；叢書METHODS IN ENZYMOLOGY(學(xué)院出版社，Inc.)；PCRA PRACTICAL APPROACH(M.MacPherson等，IRL Press at Oxford University Press(1991))；PCR 2APRACTICAL APPROACH(M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor eds.(1995))；ANITBODIES，實(shí)驗(yàn)室手冊(Harlow和Lane eds.(1988))；和ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney ed.(1987))。
定義在此處所用的特定的術(shù)語具有下面所定義的含義。
在本說明書中，單數(shù)形式″a″，″an″和″the″包括復(fù)數(shù)含義除非上下文清楚地顯示其它的含義。例如，術(shù)語“一種細(xì)胞”包括多種細(xì)胞，包括其混合物。
此處所用的術(shù)語“包含”是指組合物和方法包含所列舉的基本要素，而不包括其它的。當(dāng)“基本上含有”被用于定義組合物和方法時，將排除組合的任意基本含義的其它要素。因此，在此定義的一種組合物基本上含有要素將不排除來自分離和純化方法的痕量污染物以及藥理上可接受的載體，例如磷酸鹽緩沖液，防腐劑等等?！昂小币馕杜懦喾N其它成分的痕量元素以及用于實(shí)施本發(fā)明組合物的基本的方法。通過這些術(shù)語限定的實(shí)施方案在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
術(shù)語“多核苷酸”和“核酸”可選擇的指任意長度核苷酸的聚合的形式。聚核苷酸可包含脫氧核糖核苷酸，核糖核苷酸，和/或其類似物。核苷酸可具有任意三維結(jié)構(gòu)，以及可執(zhí)行任意已知或未知的功能。術(shù)語“多核苷酸”包括，例如，單，雙鏈和三螺旋分子，基因或基因片段，外顯子，內(nèi)含子，mRNA，tRNA，rRNA，核酶，cDNA，重組多核苷酸，分支多核苷酸，質(zhì)粒，載體，分離的任意序列的DNA，分離的任意序列的RNA，核酸探針，以及引物。核酸分子也可包括修飾的核酸分子。
被用于其用作廣泛的含義的術(shù)語“肽”是指兩或更多亞單位氨基酸，氨基酸類似物，或擬肽(peptidomimetics)的復(fù)合物。亞單位可被肽鍵連接。在另一個實(shí)施方案中，亞單位可被其它的鍵連接，例如，酯，醚等。此處所用的術(shù)語“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括，甘氨酸和D或L光學(xué)異構(gòu)體二者，和氨基酸類似物和擬肽(peptidomimetics)。三或更多氨基酸的肽如果肽鏈很短通常被稱為寡肽。如果肽鏈?zhǔn)情L的，肽通常被稱為多肽或蛋白。
術(shù)語“遺傳修飾”是指含有和/或表達(dá)一個外源基因或核酸序列其依次修飾細(xì)胞或其子代的基因型或表現(xiàn)型。換句話說，其指細(xì)胞內(nèi)源核苷酸的任意增加，刪除或破壞。
此處所用的“表達(dá)”是指多核苷酸被轉(zhuǎn)錄成mRNA并被翻譯為肽，多肽，或蛋白質(zhì)的過程。如果多核苷酸來自基因組DNA，表達(dá)可包括mRNA的剪接，如果適當(dāng)?shù)恼婧怂拗鞅贿x擇。表達(dá)所需的調(diào)控元件包括啟動子序列來結(jié)合RNA聚合酶以及轉(zhuǎn)錄啟動序列來用于核糖體結(jié)合。例如，一個細(xì)菌表達(dá)載體包括一個啟動子例如lac啟動子來用于轉(zhuǎn)錄啟動Shine-Dalgarno序列以及啟動密碼子AUG(Sambrook等(1989)見上文)。類似的，一個真核表達(dá)載體包括RNA聚合酶II的異源或同源啟動子，一個下游的多腺苷酸信號，啟動密碼子AUG和分離核糖體的終止密碼子。此種載體可通過商業(yè)途徑獲得或通過本領(lǐng)域公知的序列來合成，例如，下面所述的常規(guī)的用于構(gòu)建載體的方法。
“啟動子”是DNA分子上的一個RNA聚合酶結(jié)合和啟動轉(zhuǎn)錄的區(qū)域。啟動子的核苷酸序列決定結(jié)合于其上的酶的特性和RNA合成的速率。在本發(fā)明中，術(shù)語“啟動子”是指多核苷酸其不僅包括RNA聚合酶接合位點(diǎn)而且包括所有其它鄰近的與調(diào)控轉(zhuǎn)錄啟動例如阻遏或誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的因子相互作用的序列元件。因此，此處所定義的“啟動子”，是一個多核苷酸其包含所有的以相同于染色體中的天然元件的方式調(diào)控基因表達(dá)所需要的序列信息。
“在轉(zhuǎn)錄調(diào)控下”是本領(lǐng)域共知的術(shù)語，其表明多核苷酸序列通常為DNA序列的轉(zhuǎn)錄，依賴于其被可操作的連接于有助于啟動的元件或啟動子轉(zhuǎn)錄?！翱刹僮鞯剡B接于”是指元件中的排列為允許其行使功能的方式。
術(shù)語“表達(dá)構(gòu)建”是指一個含有啟動子元件的多核苷酸可操作地連接于一個基因。表達(dá)構(gòu)建可通過多種方式，例如子基因傳遞載體中或被插入到細(xì)胞的染色體中。此術(shù)語也指通過任意方法包括但不限于重組DNA技術(shù)，同源重組，基因或啟動子元件的靶插入或基因或啟動子元件的隨機(jī)插入產(chǎn)生的啟動子-基因融合。
“基因傳遞載體”被定義為可以攜帶被插入的多核苷酸到宿主中的任意分子?；騻鬟f載體的例子為脂質(zhì)體，生物相容的聚合物，包括天然的聚合物和合成的聚合物；脂蛋白；多肽；多糖；脂多糖；人工的病毒外殼；金屬粒子；和細(xì)菌，病毒，例如桿狀病毒，腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒，噬菌體，質(zhì)粒，真菌載體和其它的本領(lǐng)域所用的典型的重組載體，其已被描述用于在各種真核和原核宿主中的表達(dá)，以及可被用于基因治療和簡單蛋白表達(dá)。
“基因傳遞”，“基因轉(zhuǎn)移”等類似術(shù)語是指外源多核苷酸(有時是指“轉(zhuǎn)基因”)到宿主細(xì)胞中的導(dǎo)入，其與所用的導(dǎo)入方法無關(guān)。此方法包括各種已知的技術(shù)例如載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(通過例如，病毒感染/轉(zhuǎn)染，或各種其它的基于蛋白或基于脂類的基因傳遞的復(fù)合方法)以及促進(jìn)“裸”多核苷酸傳遞的技術(shù)(例如，電穿孔，“基因槍”傳遞和不同的其它用于多核苷酸導(dǎo)入的技術(shù))。導(dǎo)入的多核苷酸可以穩(wěn)定的或短暫的維持在宿主細(xì)胞內(nèi)。穩(wěn)定的維持典型地要求導(dǎo)入的多核苷酸含有一個復(fù)制區(qū)域其與宿主細(xì)胞相容或被整合到宿主細(xì)胞的復(fù)制子中例如非染色體復(fù)制子(例如，質(zhì)粒)或核的或線粒體染色體。如本領(lǐng)域和此處所述的，已知大量的載體能夠介導(dǎo)基因傳遞到哺乳動物細(xì)胞中。
“病毒載體”被定義為重組產(chǎn)生的含有通過體內(nèi)，來自體內(nèi)(ex vivo)或體外被傳遞到宿主細(xì)胞中的多核苷酸的病毒或病毒粒子。病毒載體的例子包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺病毒載體，腺伴隨病毒載體及其類似物。其中的基因轉(zhuǎn)移被介導(dǎo)通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，含有逆轉(zhuǎn)錄基因組或其部分的多核苷酸的載體構(gòu)建體，和一個轉(zhuǎn)基因。此處的“逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移”或“逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)”具有相同的含義其是指通過利用病毒進(jìn)入細(xì)胞并整合其染色體組到宿主染色體組的能力將基因或核酸序列穩(wěn)定的轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中的過程。病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞通過其正常的感染機(jī)制或被修飾結(jié)合不同的細(xì)胞受體或配體來進(jìn)入細(xì)胞。此處所用的逆轉(zhuǎn)錄病毒是指能夠通過病毒或類病毒侵入機(jī)制導(dǎo)入外源核酸到細(xì)胞中的病毒粒子。
逆轉(zhuǎn)錄病毒以RNA的形式攜帶其遺傳信息，RNA被逆轉(zhuǎn)錄成為DNA的形式整合到被感染細(xì)胞的基因組DNA中。被整合的DNA形式被稱為原病毒。
一方面，其中的基因轉(zhuǎn)移被DNA病毒載體，例如腺病毒(Ad)或腺伴隨病毒(AAV)，載體構(gòu)建體，是指含有病毒基因組或其部分的多核苷酸，和轉(zhuǎn)基因介質(zhì)。腺病毒(Ads)是具有相關(guān)的特征，同源性的病毒組，包括超過50個血清型。參見，WO 95/27071。Ads較容易的生長且不需要整合到宿主細(xì)胞基因組中。重組體來源于Ad的載體，尤其是這些減少重組可能性和野生型病毒的產(chǎn)生的載體已被構(gòu)建。參見WO 95/00655和WO 95/11984。野生型AAV具有高度的整合到宿主細(xì)胞基因組中的感染性和特異性。參見Hermonat和Muzyczka(1984)Proc.Nati.Acad.Sci.USA 816466-6470以及Lebkowski等(1988)分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)83988-3996。
含有一個啟動子和一個被可操作地連接于多核苷酸的克隆位點(diǎn)的載體是本領(lǐng)域公知的。此載體能夠在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄RNA，且可從例如Stratagene(La Jolla，CA)和Promega Biotech(Madison，WI)購買到。為了優(yōu)化表達(dá)和/或體外轉(zhuǎn)錄，其可能有必要去除、增加或改變5′和/或3′的克隆的未翻譯部分來除去額外的、可能的不適當(dāng)?shù)目蛇x擇的啟動密碼子或其它的在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平作用于或減少表達(dá)的序列。可選擇的，共有核糖體結(jié)合位點(diǎn)可被插入在起始密碼子的5’末端來增強(qiáng)表達(dá)。
基因傳遞載體也包括一些非病毒載體，包括DNA/脂質(zhì)體復(fù)合體，以及靶向病毒蛋白-DNA復(fù)合物。含有靶向抗體或其片段的脂質(zhì)體可被用于本發(fā)明的方法中。為了增強(qiáng)傳遞到細(xì)胞，本發(fā)明的核酸或蛋白可被結(jié)合于抗體或結(jié)合細(xì)胞表面抗原的抗體結(jié)合片段，例如，TCR，CD3或CD4。
此處所用的“報道基因”是一個編碼被可被檢測和測數(shù)的細(xì)胞所表達(dá)的蛋白的多核苷酸。因此，測定的報道分子的表達(dá)水平是使報道基因的表達(dá)的啟動子元件的激活水平的指標(biāo)。
“雜交”是指一個反應(yīng)，其中的一或多個多核苷酸反應(yīng)來形成復(fù)合體其通過核苷酸殘基之間的氫鍵被穩(wěn)定化。氫鍵可通過Watson-Crick堿基配對，Hoogotein結(jié)合，或以任意的其它序列特異性方式來產(chǎn)生。復(fù)合體可包括兩條鏈形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)，三或更多鏈形成的復(fù)合鏈結(jié)構(gòu)，一個單鏈自我雜交鏈，或這些的任意組合。雜交反應(yīng)可在更廣的方法中構(gòu)成為一個步驟，例如，PCR反應(yīng)的啟動，或多核苷酸被核酶的酶解。
嚴(yán)格雜交條件的例子包括大約25℃到37℃的溫育溫度；大約6×SSC到大約10×SSC的雜交緩沖液濃度。大約0％到25％的甲酰胺濃度；以及大約6×SSC的洗滌液。溫和的雜交條件包括大約40℃到50℃的溫育溫度；大約9×SSC到2×SSC的緩沖液濃度；大約30％到50％的甲酰胺濃度；以及5×SSC到大約2×SSC的洗滌濃度。高度嚴(yán)格的雜交條件包括大約55℃到68℃的溫育溫度；大約1×SSC到0.1×SSC的緩沖液濃度；大約55％到75％的甲酰胺濃度；以及1×SSC到大約0.1×SSC的洗滌濃度，或去離子水。通常雜交時間為5分鐘到24小時，用一個、兩個或更多的洗滌步驟，以及溫育時間為大約1，2，或15分鐘。SSC是0.15M NaCl和15mM檸檬酸鹽緩沖液。可以理解，使用其它緩沖體系的SSC的等價物可被使用。
多核苷酸或多核苷酸區(qū)域(或多肽或多肽區(qū)域)與另一個序列具有特定(例如，80％，85％，90％，或95％)的“序列同一性”是指，當(dāng)比對時，比較的兩個序列的相同堿基(氨基酸)的百分比。此比對和百分比同源性或序列同一性可通過本領(lǐng)域已知的軟件來測定，例如這些描述在CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY(F.M.Ausubel等，eds.，1987)增刊30，7.7.18部分，表7.7.1。優(yōu)選的用于多核苷酸和多肽序列比對來測定百分比同源性的程序是CLUSTALW，使用缺省的參數(shù)。此程序可獲自萬維網(wǎng)的很多站點(diǎn)例如位于圣路易斯(Saint Louis)的華盛頓大學(xué)的生物計(jì)算學(xué)院的網(wǎng)站，MO(www.ibc.wustl.edu/msa/clustal.html)，德克薩斯州休斯敦醫(yī)學(xué)Baylor學(xué)院的人類基因組測序中心(Human GenomeSequencing Center)，(dot.imgen.bcm.tmc.edu9331/multi-align/multi-align.html)以及法國巴黎的巴斯德研究院(bioweb.pasteur.fr/seqanal/Interfaces/clustalw-simple.html)。
多核苷酸的“生物學(xué)等價物”被通過序列比對程序在缺省參數(shù)下測定的具有至少75％，或至少80％，或至少90％，或至少95％序列同一性，糾正序列數(shù)據(jù)的二義性以及在不改變功能的核苷酸序列中改變被表征的?！吧飳W(xué)等價物”多核苷酸也可通過在溫和或嚴(yán)格條件下雜交被分離。除了序列相似性或與參照的多核苷酸雜交之外，生物學(xué)等價物多核苷酸與參照的多核苷酸具有相同或相似的生物學(xué)功能。
各種軟件程序是本領(lǐng)域可獲得的，其用來鑒定生物學(xué)等價物多核苷酸而不需要大量的試驗(yàn)。這些程序的非限制性的例子為BLAST家族程序包括BLASTN，BLASTP，BLASTX，TBLASTN，以及TBLASTX(BLAST可獲自萬維網(wǎng)http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，F(xiàn)astA，Compare，DotPlot，BestFit，GAP，F(xiàn)rameAlign，ClustalW，以及PileUp。這些程序可以是從市場上獲得的綜合的序列分析程序軟件包例如GCG Inc.的Wisconsin軟件包。其它的類似分析和比對程序可從不同的供應(yīng)商購買例如DNA Star′s MegAlign，或GeneJockey比對程序。可選擇的，序列分析和比對程序可通過萬維網(wǎng)來使用，例如在www.sdsc.edu/ResTools/cmshp.html的CMSMolecular Biology Resource。任意的含有與基因或其片段相應(yīng)的DNA或蛋白序列的序列數(shù)據(jù)庫可以被使用來用于序列分析。通常使用的數(shù)據(jù)庫包括但不限于GenBank，EMBL，DDBJ，PDB，SWISS-PROT，EST，STS，GSS，和HTGS。序列相似性可以通過比對靶序列和DNA序列數(shù)據(jù)庫來辨別。可選擇的，靶序列可被轉(zhuǎn)換為六個閱讀框；所有可能的閱讀框的預(yù)知肽序列然后被與儲存在蛋白數(shù)據(jù)庫中的各個序列比較例如利用BLASIX程序。
用于檢測同源性程度的上述比對程序的一或多個參數(shù)在本領(lǐng)域是確定的。其包括但不限于p值，百分比序列同一性和百分比序列相似性。p值是比對偶然產(chǎn)生的概率。對一個單一的比對來說，p值可通過Karlin等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872246被計(jì)算。對于多重比對來說，p值可通過利用啟發(fā)式方法例如BLAST中的一個程序被計(jì)算。百分序列同一性通過在查詢的序列和已知序列最佳比對時的核苷酸或氨基酸匹配的數(shù)目的比被定義。百分序列相似性通過與百分同一性相同的方式來計(jì)算除了一種計(jì)分的氨基酸，當(dāng)計(jì)算百分相似性時其是不同的但是相似的。
“體內(nèi)”基因傳遞，基因轉(zhuǎn)移，基因治療等術(shù)語是指含有外源多核苷酸的載體直接導(dǎo)入到生物體體內(nèi)，例如人類或非人哺乳動物，由此外源多核苷酸被體內(nèi)導(dǎo)入到此生物體的細(xì)胞中。
術(shù)語“分離的”是指分離自組分，細(xì)胞以及其它的方式，其中的多核苷酸，肽，多肽，蛋白，抗體，或其片段，通常是天然產(chǎn)生的。例如，對于多核苷酸而言，分離的多核苷酸是分離自與染色體正常相連的5′和3′序列。對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的是，非天然產(chǎn)生的多核苷酸，肽，多肽，蛋白，抗體，或其片段，不需要“分離”來區(qū)別其與天然產(chǎn)生的相應(yīng)物。此外，“濃縮的”，“單獨(dú)的”，“稀釋的”多核苷酸，肽，多肽，蛋白，抗體，或其片段被區(qū)別于天然產(chǎn)生的對應(yīng)物，其每體積分子的濃度或數(shù)量與其天然產(chǎn)生的對應(yīng)物相比大于“濃縮的”或小于“單獨(dú)的”。多核苷酸，肽，多肽，蛋白，抗體，或其片段其在基本序列上區(qū)別于天然產(chǎn)生的對應(yīng)物，或通過其糖基化形式，不需要其是存在于分離的形式由于其通過基本序列或可選擇的，通過另外的特征例如糖基化形式被區(qū)別于其天然產(chǎn)生的對應(yīng)物。盡管沒有詳述本發(fā)明在此公開的每一內(nèi)容，可以理解所有用于描述下文公開的組合物和適當(dāng)條件的上述實(shí)施方案，被本發(fā)明所提供。因此，非天然產(chǎn)生的多核苷酸被提供作為來自分離的天然產(chǎn)生的多核苷酸的單獨(dú)的實(shí)施方案。在細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生的蛋白被提供作為來自分離自真核細(xì)胞的天然產(chǎn)生的蛋白的獨(dú)立的實(shí)施方案，其中的細(xì)胞是自然產(chǎn)生的。
“宿主細(xì)胞”，或“基因修飾細(xì)胞”趨向于包括任意單獨(dú)的細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物，其可是載體或是載體的受體或包含外源核酸分子，多核苷酸和/或蛋白。其也包括單細(xì)胞的子代，且子代由于自然，偶然的，或定向的突變可能不是與起始的親代細(xì)胞完全相同(在形態(tài)學(xué)或基因組或總DNA補(bǔ)體上)。細(xì)胞可以是原核的或真核的，且包括但不限于細(xì)菌細(xì)胞，酵母細(xì)胞，動物細(xì)胞，以及哺乳動物細(xì)胞，例如鼠科動物，鼠，猿或人類的。
“受試者”是脊椎動物，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選為人類。哺乳動物包括，但不限于，鼠科動物，猿，人類，農(nóng)田動物，戶外動物，和寵物。
“對照”是在實(shí)驗(yàn)中用于比較的目的的可選擇的受試者或樣本。對照可以為“陽性的”或“陰性的”。例如，當(dāng)實(shí)驗(yàn)的目的是檢測基因的改變的表達(dá)水平與癌癥的特定表型的關(guān)系時，通常優(yōu)選使用一個陽性對照(攜帶此種變化并顯示該疾病的綜合癥狀的特性的受試者或來自受試者的樣本)，和一個陰性對照(缺少改變的表達(dá)和該病的臨床癥狀的受試者或來自受試者的樣本)。
術(shù)語“培養(yǎng)”是指細(xì)胞或生物體在不同類型培養(yǎng)基上或其中的體外繁殖?？梢岳斫庠谂囵B(yǎng)基上生長的細(xì)胞子代可能與親代細(xì)胞不完全相同(形態(tài)學(xué)，遺傳學(xué)，或表型)?！胺糯蟆笔侵讣?xì)胞的任意增殖或分裂。
“組合物”是指活性因子和其它化合物或組合物，惰性(例如，可檢測的試劑或標(biāo)記)或活性劑，例如助劑的組合。
“藥物組合物”是指包括活性劑與載體，惰性劑或活性劑的組合產(chǎn)生適于體體，外內(nèi)或來自體內(nèi)的診斷或治療用途的組合物。
此處所用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”包含任意的標(biāo)準(zhǔn)的藥物載體，例如磷酸緩沖鹽溶液，水，和乳液例如油/水或水/油乳液，以及各種類型的潤濕劑。此組合物也可包含穩(wěn)定劑和防腐劑。例如，載體，穩(wěn)定劑和助劑，參見Martin REMINGTON′S PHARM.SCI，15th Ed.(Mack Pubi.Co.，Easton(1975))。
“有效量”是指產(chǎn)生有益作用的或所期望的結(jié)果的充分的量。有效的量可以一或多種給藥方式應(yīng)用方法或劑量被給藥。
綠色熒光蛋白(GFP)是一種非常有用的蛋白，其在過去幾年的細(xì)胞和分子生物學(xué)的研究中有非常大的應(yīng)用。GFP最初由Shimomura等人在1962年發(fā)現(xiàn)在水母Aequorea victoria中[14]且其基因被Prasher等人在1992年克隆和測序[15]。GFP分子含有通過設(shè)計(jì)三種氨基酸的氧依賴性環(huán)化反應(yīng)產(chǎn)生的熒光團(tuán)[16]。最近，人們發(fā)現(xiàn)GFP基因可在大量的細(xì)胞中表達(dá)來產(chǎn)生內(nèi)源的熒光蛋白，而不需要外源的底物或輔酶[16-18]。利用這種內(nèi)源熒光特性，GFP已成為用于研究基因表達(dá)的調(diào)控的強(qiáng)有力的工具。其也被用作融合標(biāo)記來監(jiān)視蛋白定位和在活細(xì)胞中的運(yùn)動[16-18]。
本發(fā)明提供了基于GFP的分子探針，其對蛋白酶是更具體的，不同點(diǎn)的半胱天冬酶是敏感的。每種半胱天冬酶具有獨(dú)特的識別和裂解的氨基酸序列(例如，“底物序列”)[19]。例如，半胱天冬酶-3的底物序列是DEVD(Asp-Glu-Val-Asp)。表1列舉了幾種半胱天冬酶及其底物序列。
表1蛋白酶別名 識別/裂解序列蛋白質(zhì)底物半胱天冬酶-1 ICE Try-Val-Ala-Aap(YVAD)Pro-IL-1β半胱天冬酶-2 ICH-1/Nedd2 Asp-Glu-His-Asp(DEHD)PARP半胱天冬酶-3 CPP32/Yama/apopainAsp-Glu-Val-Asp(DEVD)PARP，DNA-PK，SREBP1，2，rho-G半胱天冬酶-4 TX/ICH-2./ICEre1-II Trp/Leu-Glu-His-Asp(W/LEHD)半胱天冬酶-5 TY/ICEre1-III Trp/Leu-Glu-His-Asp(W/LEHD)半胱天冬酶-6 Mch2 Val-Glu-His-Asp(VEHD)Lamin A半胱天冬酶-7 Mch3/ICE-LAP3/CMH-1 Asp-Glu-Val-Asp(DEVD)PARP，pro-半胱天冬酶6，SREBP1，2半胱天冬酶-8 MACH/FLICE/Mch5 Leu-Glu-Thr-Asp(LETD)PARP半胱天冬酶-9 ICE-LAP6/Mch6 Leu-Glu-His-Asp(LEHD)PARP半胱天冬酶-10 FLICE2/Mch4半胱天冬酶-11 ICH-3半胱天冬酶-12 DRONC半胱天冬酶-13 ERICE半胱天冬酶-14 MICE Asp-Glu-Val-Asp(DEVD)PARP聚(ADP-核糖)聚合酶參考Cryns V.和Yuan J.Genes Dev11，1551-1570，1998。Cohen G.M.Biochem J.326(Ptl)，1-16，1997.Negata S.Cell88，355-365，1997。Thomberry NA.等J.Biol Chem272，17907-17911，1997.
為了開發(fā)有實(shí)用用途的探針來檢測半胱天冬酶在活細(xì)胞中的活性一些技術(shù)問題被解決和克服，例如(1)作為供體和受體的GFP的最匹配對的篩選；(2)優(yōu)化連接頭的設(shè)計(jì)使得FRET的影響在連接頭被半胱天冬酶裂解之前最大化；和(3)優(yōu)化連接頭設(shè)計(jì)使得底物序列在連接頭處較容易地被半胱天冬酶作用。
本發(fā)明的一個方面是熒光蛋白構(gòu)建體用來檢測蛋白酶或半胱天冬酶激活細(xì)胞凋亡或細(xì)胞程序死亡，其中的構(gòu)建體含有1)一個供體熒光蛋白；2)一個受體熒光蛋白；以及3)一個含有蛋白酶或半胱天冬酶底物序列的肽連接頭。該連接頭位于連接供體熒光蛋白和受體熒光蛋白之間。此處的術(shù)語“半胱天冬酶激活的細(xì)胞程序死亡或細(xì)胞凋亡”是指細(xì)胞凋亡和細(xì)胞程序死亡由一系列的在凋亡(apoptotic)細(xì)胞中被特異性激活的半胱氨酸蛋白酶所引起。構(gòu)建體特定的適于檢測蛋白酶或鑒定在表1中的細(xì)胞凋亡激活的半胱天冬酶，上面的或選自含有半胱天冬酶-3，半胱天冬酶-6，半胱天冬酶-8，半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-12組的半胱天冬酶。酶的底物序列是本領(lǐng)域公知的，參見例如上文表1。
在另一方面，至少一個供體或受體是分離自生物體。在另一個方面，至少一個供體熒光蛋白或受體熒光蛋白是Aequorea-相關(guān)的熒光蛋白或其突變體或變體。可選擇的，供體熒光蛋白或受體熒光蛋白二者均是Aequorea-相關(guān)的熒光蛋白或其突變體或變體。Aequorea-相關(guān)蛋白和其功能性變體是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知的且是商業(yè)可獲得的。參見，例如美國專利第5,981,200號以及其中引用的參考文獻(xiàn)。盡管始終沒有清楚的闡述，至少供體和/或熒光蛋白可為野生型，突變體或其生物學(xué)等價物是人們趨于理解的。生物學(xué)等價物可通過基于同源比較的測序或通過在前面所述的溫和或嚴(yán)格條件下雜交來被檢測。
兩種GFP分子可具有不同的“顏色”(熒光特性)使得第一GFP(供體)的發(fā)射譜與第二GFP(受體)的吸收譜重疊。由于這兩種GFP分子被連接在一起，“熒光共振能量”(FRET)現(xiàn)象就發(fā)生了[20]。也就是說，當(dāng)供體分子被適當(dāng)波長的光激發(fā)時，能量被轉(zhuǎn)移到受體分子且其將發(fā)射熒光。在一方面，F(xiàn)RET現(xiàn)象對于檢測半胱天冬酶的激活是有用的且當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞凋亡時，半胱天冬酶被激活。當(dāng)兩個GFP分子分離時，沒有FRET發(fā)生。因此，當(dāng)供體分子被激發(fā)時沒有從受體的光的發(fā)射。這種熒光特性的改變可通過不同的光學(xué)裝置被檢測(例如，熒光顯微鏡或分光熒光計(jì))。申請人測定到下面的GFP顏色對特別適于本發(fā)明BFP-GFP(藍(lán)色-綠色)；CFP-GFP(青色-綠色)；BFP-YFP(藍(lán)色-黃色)；以及YFP-CFP(黃色-青色)。
特定設(shè)計(jì)的探針含有兩個GFP分子連接在一起通過含有半胱天冬酶的底物或裂解序列的短肽(參見圖1)。肽連接頭優(yōu)選在4到30個氨基酸之間，或在6到30之間，或8到30之間，或8到20之間，或16到30之間，或16到20之間。在一個情況下連接頭是16個氨基酸或更長。在另一個方面，連接頭側(cè)接于一個兩個甘氨酸對，例如，GXXXXG或GGXXXXGG。在一個選擇性的實(shí)施方案中，肽連接頭超過50％的含有一或多的選自包括甘氨酸，絲氨酸和蘇氨酸的組的氨基酸。
本發(fā)明也提供了一個編碼熒光蛋白構(gòu)建體的核酸和含有一或多個這些核酸的表達(dá)構(gòu)建體。這些可進(jìn)一步包含在基因傳遞載體中。蛋白構(gòu)建體，核酸，表達(dá)構(gòu)建體和本發(fā)明基因傳遞載體可在載體例如藥學(xué)可接受的載體中，或在宿主細(xì)胞中以分離的形式提供。宿主細(xì)胞，依次的，可以分離的形式提供，或可選擇的，與載體例如藥學(xué)上可接受的載體結(jié)合的形式提供。
本發(fā)明的核酸分子可通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(“PCR”)(Perkin-Elmer)被分離或復(fù)制。例如，序列可通過PCR(Perkin-Elmer)化學(xué)合成，其與寡核苷酸的合成結(jié)合，使得DNA序列容易的復(fù)制。PCR技術(shù)是美國專利第4,683,195號，第4,800,159號，第4,754,065號和第4,683,202號的主旨且描述于PCRTHE POLVMERASECHAIN REATION Mullis等eds，Birkhauser出版社，波士頓(1994)在此引用作為參考?？蛇x擇的，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可使用此處所提供的序列和商業(yè)可獲得的DNA合成儀來復(fù)制DNA。相應(yīng)的，本發(fā)明也提供了獲得本發(fā)明多核苷酸的方法通過提供多核苷酸，核苷酸，適當(dāng)?shù)囊锓肿?，化學(xué)物質(zhì)例如酶的線性序列和用于其復(fù)制和化學(xué)復(fù)制或在正確方向連接核苷酸來獲得多核苷酸的操作規(guī)程。在一個獨(dú)立的實(shí)施方案中，這些多核苷酸被進(jìn)一步的分離。進(jìn)一步的，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可插入核酸到合適的復(fù)制載體中并插入載體到合適的宿主細(xì)胞中用于復(fù)制和擴(kuò)增。如此擴(kuò)增的DNA可通過本領(lǐng)域公知的方法自細(xì)胞分離。獲得核酸分子的方法以及所獲的核酸分子也被提供。
RNA可通過利用分離的DNA并可操作地連接其到適于宿主細(xì)胞的調(diào)控區(qū)并將其插入到宿主細(xì)胞中獲得。DNA可通過任意合適的方法被插入，例如通過利用適宜的插入載體或通過電穿孔。當(dāng)細(xì)胞復(fù)制物和DNA被轉(zhuǎn)錄為RNA時；RNA也可通過本領(lǐng)域公知的方法被分離，例如，上文的Sambrook等人所描述的(1989)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了可操作地連接于RNA轉(zhuǎn)錄的啟動子的核酸分子，以及其它的用于復(fù)制和/或DNA或RNA的短暫或穩(wěn)定表達(dá)的調(diào)控序列。在特定的實(shí)施方案中，細(xì)胞特異性啟動子被用于插入的核酸分子的細(xì)胞特異性表達(dá)。含有一個啟動子或一個啟動子/增強(qiáng)子，帶有終止密碼子和選擇性標(biāo)記，以及可操作的連接于啟動子的DNA片段可被插入的克隆位點(diǎn)的載體是本領(lǐng)域公知的和商業(yè)可獲得的。常規(guī)的方法學(xué)和克隆策略，參見GENE EXPRESSIONTECHNOLOGY，Goeddel ed.，Academic press，Inc.(1991)引用在此作為參考以及VECTORSESSENTIAL DATA Series，Gacesa和Ramji，eds.，John Wiley & Sons，N.Y.(1994)，其包含圖，功能特性，商品供應(yīng)商以及不同合適的載體的GenEMBL注冊號。優(yōu)選的，這些載體能夠在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄RNA。
如上所述，本發(fā)明的核酸分子可操作地連接于RNA轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)型或非誘導(dǎo)型的啟動子。這些核酸分子對于熒光蛋白和多肽的重組制備或作為診斷用途的載體是有用的。相應(yīng)的，本發(fā)明也提供了一種被插入上述核酸分子的載體(插入，復(fù)制或表達(dá)載體)，例如病毒載體，例如噬菌體，棒狀病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，或粘粒，或質(zhì)粒，YACS，酵母和其它重組的載體。核酸分子通過本領(lǐng)域公知的方法被插入到載體基因組中。例如，插入子和在載體DNA可均被暴露于限制性酶來在兩個分子上產(chǎn)生互補(bǔ)末端然后通過連接酶被結(jié)合在一起?？蛇x擇的，合成的核酸連接頭可被結(jié)合于對應(yīng)載體DNA限制性位點(diǎn)的插入DNA，其然后用識別特定核苷酸序列的限制性酶降解。此外，含有終止密碼子和合適的限制性位點(diǎn)的寡核苷酸可被結(jié)合用于插入到含有例如一些或所有的下列元件的載體中一個選擇性標(biāo)記基因，例如新霉素基因用于哺乳動物中的穩(wěn)定性或短暫轉(zhuǎn)染子篩選；來自人巨細(xì)胞病毒(CMV)的立即早期基因的用于轉(zhuǎn)錄的高水平表達(dá)的增強(qiáng)子/啟動子序列；用于mRNA穩(wěn)定性的SV40的轉(zhuǎn)錄終止和RNA加工信號；SV40多型瘤復(fù)制起點(diǎn)和用于正確的游離基因復(fù)制的ColE1；多向復(fù)合的克隆位點(diǎn)；以及用于正義和反義RNA體外轉(zhuǎn)錄T7和SP6 RNA啟動子。
本發(fā)明的載體構(gòu)建體的另一個實(shí)施例是包括啟動子例如lac啟動子且用于轉(zhuǎn)錄啟動，Shine-Dalgarno序列和起始密碼子AUG的細(xì)菌表達(dá)載體(Sambrook等(1998)見上文)。類似的，一個真核表達(dá)載體是含有異源或同源用于RNA聚合酶II的啟動子，一個下游的多腺苷化信號，起始密碼子AUG，和一個用于分離核糖體的終止信號。此載體可通過商業(yè)獲得或通過此處所述的序列來合成。當(dāng)一個核酸被插入到合適的宿主細(xì)胞中時，例如，原核或真核細(xì)胞以及宿主細(xì)胞復(fù)制物，蛋白可被重組制備。合適的宿主細(xì)胞將依賴于載體且可包括哺乳動物細(xì)胞，動物細(xì)胞，人細(xì)胞，猿細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，酵母細(xì)胞，以及通過公知方法構(gòu)建的細(xì)菌細(xì)胞。參見Sambrook等(1989)，見上文。除了利用病毒載體插入外源核酸到細(xì)胞中，核酸可通過本領(lǐng)域公知的方法被插入到宿主細(xì)胞中，所述方法例如細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化；利用磷酸鈣沉淀轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞；或DEAE-葡萄聚糖；電穿孔；或微注射。此方法參見Sambrook等(1989)，見上文。因此，本發(fā)明也提供一種含有編碼熒光構(gòu)建體的核酸分子的宿主細(xì)胞，例如，一種哺乳動物細(xì)胞，動物細(xì)胞(鼠或小鼠)，人細(xì)胞，或細(xì)菌細(xì)胞。
本發(fā)明也提供了一種方法來檢測半胱天冬酶激活的細(xì)胞程序性死亡，通過在激發(fā)供體熒光蛋白的條件下培養(yǎng)含有本發(fā)明宿主細(xì)胞的樣本并檢測樣本中的熒光特性，其中半胱天冬酶激活的細(xì)胞程序性死亡在樣本細(xì)胞中存在的情況下產(chǎn)生在供體蛋白和受體蛋白之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移的程度變化。檢測的方法可被用于定量測定熒光能量轉(zhuǎn)移程度的變化。
在另一方面，人們可以利用下述方法來檢測是否試劑修飾了樣本中細(xì)胞程序性死亡激活的半胱天冬酶，通過用試劑接觸樣本然后在適于供體熒光蛋白激發(fā)的條件下培養(yǎng)并檢測樣本的熒光特性，其中試劑的活性通過熒光特性在試劑的存在和不存在的情況下的程度的變化被檢測。此處的術(shù)語“試劑”包括但不限于小分子化合物，蛋白，核酸，核酶，以及反義核酸分子。試劑可擴(kuò)大細(xì)胞凋亡或下調(diào)控細(xì)胞凋亡。兩種下調(diào)控半胱天冬酶激活的細(xì)胞凋亡的試劑的例子是(AC-DEVD-CHO)。方法可進(jìn)一步被修改通過提供含有本發(fā)明宿主細(xì)胞的第二樣本，在適于激發(fā)供體熒光蛋白的條件下培養(yǎng)細(xì)胞并比較兩個樣本中熒光共振能量轉(zhuǎn)移的程度。
本發(fā)明也提供了用于實(shí)施上述方法的試劑盒，其中試劑盒含有核酸及其使用的說明。
試驗(yàn)實(shí)施例1盡管特定的實(shí)施例描述了半胱天冬酶-特異性探針的構(gòu)建，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說很顯然任意的蛋白酶及其底物可在所提供方法中被取代。相應(yīng)的，下面的實(shí)施例旨在闡述，而不是限制本發(fā)明。
FRET探針的構(gòu)建含有CFP-YFP融合基因的哺乳動物構(gòu)建體通過下述來產(chǎn)生首先，EYFP從pEYFP-C1通過PCR擴(kuò)增，其利用含有EcoRI位點(diǎn)的5`引物KL-3(5`-CCG GAA TTC ATG GTG AGC AAG GGC GAGG)，以及帶有BamHI位點(diǎn)的3`引物KL-5(5`-CCG GAA TTC TATGGT GAG CAA GGG CGA GG)。其次，PCR產(chǎn)物從載體pECFP-C1(Clontech)的EcoRI和BamHI位點(diǎn)之間的CFP基因下游克隆。連接CFP和YFP的連接頭的氨基酸序列是SGLRSRAQASNS。
第一FRET探針(傳感蛋白A)通過用含有半胱天冬酶-3識別基序的GGDEVDGG替換CFP-YFP融合基因連接頭區(qū)域的氨基酸RAQA。編碼此多肽的雙鏈DNA利用寡KL-6(5′-GGA AGA TCTGGA GGC GAC GAG GTG GAT GGA GGC TCG AAT TCT CGG-3′)作為模板和寡KL-8(5′-CCG AGA ATT-3′)作為引物進(jìn)行引物延伸來被合成。然后DNA被克隆到BglII和EcoRI位點(diǎn)之間的CFP-YFP探針的連接頭區(qū)。CFP和YFP之間的傳感蛋白A的連接區(qū)由16個氨基酸組成且其序列是SGLRSGGDEVDGGSNS。
第二FRET探針(傳感蛋白B)通過用GGSGGDEVDGGSGG替換CFP-YFP探針的連接頭中的氨基酸RAQA來制備。插入的雙鏈DNA通過利用寡KL-7(5′-GGA AGA TCT GGA GGC AGC GGA GGCGAC GAG GTG GAT GGA GGC AGC GGA GGC TCG AAT TCTCGG-3′)作為模板并用寡KL-8作為引物來產(chǎn)生。因此，傳感蛋白B在兩種GFP之間具有較長的連接頭(22個氨基酸)并且其氨基酸序列為SGLRSGGSGGDEVDGGSGGSNS。
細(xì)菌版的FRET探針通過克隆來自哺乳動物構(gòu)建體的CFP-YFP融合基因到載體pRSET-B(Invitrogen)的NcoI和鈍末端HindIII位點(diǎn)之間。所有的融合蛋白在其N末端含有聚組氨酸標(biāo)記。
構(gòu)建的FRET探針可被半胱天冬酶-3裂解為了檢測是否這些FRET探針對半胱天冬酶-3裂解敏感，純化的蛋白與半胱天冬酶-3一起被溫育然后進(jìn)行Western印跡分析?？贵w購自Clontech。圖3A顯示了半胱天冬酶-3可以裂解幾乎所有的傳感蛋白A和傳感蛋白B蛋白，而在相同的條件下CFP-YFP融合蛋白沒有被觀察到裂解。在半胱天冬酶-3抑制劑(AC-DEVD-CHO)存在的條件下，沒有FRET探針(傳感蛋白A)被裂解，此表明裂解是半胱天冬酶-3特異性的(圖3B)。
光學(xué)測定證明了FRET作用結(jié)果的變化對應(yīng)于半胱天冬酶-3活性
FRET探針中熒光能量從CYP到Y(jié)FP的轉(zhuǎn)移通過分光熒光計(jì)被測量。當(dāng)每一探針中的CFP被激發(fā)時，激發(fā)的波長為433nm，來自FRET探針的非常弱的發(fā)射光在已知的CFP的發(fā)射波長處(480nm)檢測。相反，顯著量的發(fā)射的熒光在峰值在526nm的YFP的發(fā)射波長處被檢測到(圖4A～圖4C)。此結(jié)果表明有效的能量轉(zhuǎn)移發(fā)生在CFP的供體分子和YFP的受體分子之間。其然后被測定是否FRET作用是對半胱天冬酶裂解敏感的。FRET探針被用半胱天冬酶-3測定并用分光熒光計(jì)分析。發(fā)現(xiàn)半胱天冬酶-3處理完全改變了傳感蛋白A和B的發(fā)射波長，產(chǎn)生了YFP的發(fā)射峰的較大的減少以及CFP發(fā)射峰的顯著的增加(圖4A～圖4C)。作為對照，從缺少底物序列的CFP-YFP融合蛋白的發(fā)射譜沒有發(fā)現(xiàn)變化(圖4A)。相似于圖4A～圖4C的圖譜，測定半胱天冬酶處理前和處理后所有三種FRET探針的YFP(526nm)/CFP(480nm)的發(fā)射比率。此YFP/CFP比率被用于定量測定FRET的作用效果。我們發(fā)現(xiàn)，在用半胱天冬酶-3溫育傳感蛋白A或傳感蛋白B后，YFP/CFP的發(fā)射比率減少4-5倍，傳感蛋白A從3.02減少到0.59且傳感蛋白B從2.76減少到0.59。
比較傳感蛋白A和傳感蛋白B的靈敏度為了比較傳感蛋白A和傳感蛋白B對半胱天冬酶-3活性的靈敏度，劑量依賴性的半胱天冬酶-3裂解方法被實(shí)施。在此試驗(yàn)中，1.28μg量的純化傳感蛋白A或傳感蛋白B被與從0.3125ng到1.28μg范圍的不同量的半胱天冬酶-3溫育1小時。每一樣本的YFP和CFP的發(fā)射譜在反應(yīng)終止時用分光熒光計(jì)進(jìn)行測定。每一半胱天冬酶反應(yīng)的發(fā)射比率(YFP/CFP)用在反應(yīng)中沒有半胱天冬酶-3的空白對照的發(fā)射比率進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。結(jié)果顯示于圖5中。人們發(fā)現(xiàn)兩種FRET探針均對半胱天冬酶-3高度敏感，盡管傳感蛋白A看上去比傳感蛋白B稍微地更敏感。
使用FET探針來檢測細(xì)胞凋亡期間的活細(xì)胞中的半胱天冬酶-3活性為了檢測是否此FRET探針可被用于檢測活細(xì)胞中的半胱天冬酶活性，傳感蛋白A于HeLa細(xì)胞中表達(dá)并通過冷卻的CCD成像系統(tǒng)測定探針在單細(xì)胞中的FRET作用。獲自CFP和YFP的發(fā)射波長的細(xì)胞在UV處理前和處理后的熒光影像被記錄。計(jì)算機(jī)軟件(Metamorph，Universal Imaging)被用于產(chǎn)生每一細(xì)胞在不同處理中的YFP/CFP的比率圖像。圖6中A顯示了在UV照射前表達(dá)傳感蛋白A的兩種HeLa細(xì)胞。在UV處理3小時后，這些細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞凋亡。這些細(xì)胞的YFP/CFP比率圖像的敏感性被發(fā)現(xiàn)突然降低(圖6中B)。類似的試驗(yàn)在表達(dá)缺乏DEVD序列的CFP/YFP探針的HeLa細(xì)胞中進(jìn)行，在UV處理的前后沒有觀察到比率圖像的顯著的變化(圖6中C和D)。計(jì)算13個表達(dá)傳感蛋白A的細(xì)胞凋亡細(xì)胞的平均YFP/CFP發(fā)射比率的變化，發(fā)現(xiàn)在UV處理后幾乎4倍的減少(圖7)。在另一方面，在9個表達(dá)CFP/YFP構(gòu)建體的對照細(xì)胞中沒有發(fā)射比率的顯著的減少(圖7)。
這些結(jié)果表明FRET探針是一種靈敏的工具，其可檢測內(nèi)源半胱天冬酶-3在細(xì)胞凋亡過程中的活細(xì)胞中的激活。最近，傳感蛋白A被用于研究UV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中的活HeLa細(xì)胞的半胱天冬酶-3激活的動力學(xué)。我們發(fā)現(xiàn)，利用此種FRET探針，半胱天冬酶-3激活在任意的可視的細(xì)胞形態(tài)變化之前被清楚地檢測到。此結(jié)果證明了FRET是用于細(xì)胞凋亡過程的早期檢測的強(qiáng)有力的工具。
可以理解當(dāng)本發(fā)明利用上述的實(shí)施方案來協(xié)助描述時，前面的說明和下面的實(shí)施例旨在闡述而并非限定本發(fā)明的范圍。本發(fā)明范圍內(nèi)的其它方面，優(yōu)點(diǎn)和修改對于本發(fā)明的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
試驗(yàn)實(shí)施例2半胱天冬酶-8特異性探針的制備1.半胱天冬酶-探針的結(jié)構(gòu)和化學(xué)特征除了上述的半胱天冬酶-3特異性探針，傳感蛋白A和傳感蛋白B以外，我們改進(jìn)了其它的FRET探針用于檢測細(xì)胞凋亡過程中的半胱天冬酶-8活性。這些探針與傳感蛋白A有類似的設(shè)計(jì)，其通過含有半胱天冬酶-8特異性裂解序列IETD(Ile-Glu-Thr-Asp)的肽連接頭融合YFP基因與CFP基因。為了檢測IETD位點(diǎn)增加探針對半胱天冬酶-8的裂解效率的可能性，我們導(dǎo)入單和雙IETD位點(diǎn)到傳感蛋白中。也即，傳感蛋白C8具有一個IETD位點(diǎn)，而傳感蛋白C8A具有兩個IETD位點(diǎn)，如下所示傳感蛋白C8His(6x)-CFP-S-G-L-R-S-G-G-I-E-T-D-G-G-S-N-S-YFP傳感蛋白C8AHis(6x)-CFP-S-G-L-R-S-G-G-I-E-T-D-G-G-I-E-T-D-S-N-S-YFP多組氨酸標(biāo)記的傳感蛋白C8蛋白被在細(xì)胞中表達(dá)并利用Ni-NTA親和柱純化。純化的傳感蛋白C8蛋白與半胱天冬酶-8酶一起溫育并進(jìn)行SDS-PAGE和通過抗組氨酸抗體進(jìn)行Western印跡分析。結(jié)果被顯示于圖8中。在應(yīng)用半胱天冬酶-8之前。傳感蛋白C8和傳感蛋白C8A為單鏈，其帶有大約63kDa的分子量，其接近所期望的CFP和YFP融合蛋白的分子量(見圖8的條帶1和2)。在半胱天冬酶-8被加入到反應(yīng)中之后，兩個傳感蛋白被裂解為兩個與抗-GFP作用的帶。上面的條帶具有His-CFP的大約33kDa的期望的分子量且顯示出有與抗-組氨酸抗體的反應(yīng)。這些結(jié)果表明傳感蛋白C8和C8A能夠被半胱天冬酶-8裂解來釋放CFP和YFP分子。
為了比較兩個C8探針之間的裂解的效率，相同量的傳感蛋白C8蛋白(120nM)被與不同量的半胱天冬酶-8酶一起溫育，反應(yīng)混合物通過Western印跡試驗(yàn)分析。顯示在圖8中的結(jié)果表明與傳感蛋白C8相比，傳感蛋白C8A蛋白被半胱天冬酶-8裂解為較大的片段(參見圖8，條帶3-6)。條帶5和6中的蛋白的強(qiáng)度分析表明95％的傳感蛋白C8A蛋白在用半胱天冬酶-8(216nM)溫育一小時后被裂解(條帶6)。而僅有58％的傳感蛋白C8蛋白在相同條件下被裂解(條帶5)。此結(jié)果表明傳感蛋白C8A中雙IETD的存在通過半胱天冬酶-8顯著的增加其裂解的敏感性。
2.光學(xué)檢測表明傳感蛋白C8A是一種用于檢測半胱天冬酶-8活性的更敏感的探針為了檢測傳感蛋白C8A中的CFP和YFP之間是否具有能量轉(zhuǎn)移，我們利用分光熒光計(jì)檢測了純化的傳感蛋白蛋白的發(fā)射譜。當(dāng)傳感蛋白C8蛋白在CFP的發(fā)射波長處(433nm)被激發(fā)時，在YFP的發(fā)射波長(526nm)處比在CFP的發(fā)射波長(480nm)處檢測到更多的熒光，此清楚的表明具有FRET作用。能量轉(zhuǎn)移的效率通過兩種半胱天冬酶-8傳感蛋白的YFP(526nm)/CFP(480nm)的發(fā)射比率被計(jì)算。測定傳感蛋白C8和C8A的FRET比率分別為2.82和2.54。
為了比較不同傳感蛋白對半胱天冬酶-8的敏感性，我們進(jìn)行了一系列的劑量依賴性的半胱天冬酶裂解試驗(yàn)，相同量(22.45nM)的傳感蛋白C8和C8A蛋白與不同量的半胱天冬酶-8酶溫育一個小時。然后，我們用CFP的激發(fā)波長(433nm)的光來激發(fā)反應(yīng)產(chǎn)物，并通過光學(xué)熒光計(jì)測定其發(fā)射譜。結(jié)果顯示在圖9中，其中YFP(526nm)/CFP(480nm)的發(fā)射比率以相對于半胱天冬酶的濃度被繪制。發(fā)射比率(YFP/CFP)被標(biāo)準(zhǔn)化來區(qū)別于未裂解傳感蛋白蛋白的發(fā)射比率。我們觀察到需要大約0.71nM的半胱天冬酶-8來減少傳感蛋白C8A的50％的FRET作用，而需要5倍的更多的半胱天冬酶-8(3.4nM)來產(chǎn)生傳感蛋白C8的相同F(xiàn)RET減少量。這些結(jié)果表明含有雙IETD位點(diǎn)的傳感蛋白C8A比僅含有單個IETD位點(diǎn)的傳感蛋白C8對半胱天冬酶-8裂解更敏感。
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權(quán)利要求
1.一種用于檢測在細(xì)胞凋亡中半胱天冬酶或蛋白酶激活的熒光蛋白構(gòu)建體，含有a.一個供體熒光蛋白；b.一個受體熒光蛋白；以及c.一個含有半胱天冬酶或蛋白酶的底物序列的連接供體熒光蛋白和受體熒光蛋白的肽連接頭。
2.如權(quán)利要求1所述的熒光蛋白構(gòu)建體，其中至少一個供體熒光蛋白或受體熒光蛋白含有Aequorea-相關(guān)的熒光蛋白。
3.如權(quán)利要求1所述的熒光蛋白構(gòu)建體，其中供體熒光蛋白和受體熒光蛋白均是Aequorea-相關(guān)的熒光蛋白。
4.如權(quán)利要求3所述的熒光蛋白構(gòu)建體，其中供體熒光蛋白和受體熒光蛋白均是綠色熒光蛋白。
5.如權(quán)利要求4所述的熒光蛋白構(gòu)建體，其中供體熒光蛋白和受體熒光蛋白選自含有BFP-GFP；CFP-GFP；BFP-YFP和YFP-CFP的供體和受體熒光蛋白對。
6.如權(quán)利要求1所述的熒光蛋白構(gòu)建體，其中至少一個供體熒光蛋白或受體熒光蛋白含有分離自生物有機(jī)體的熒光蛋白。
7.如權(quán)利要求1所述的熒光蛋白構(gòu)建體，其中的肽連接頭含有一個選自半胱天冬酶-3，半胱天冬酶-6，半胱天冬酶-8，半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-12的半胱天冬酶的裂解位點(diǎn)的裂解識別位點(diǎn)。
8.如權(quán)利要求1所述的熒光蛋白構(gòu)建體，其中的肽連接頭實(shí)質(zhì)上含有具有4至30個氨基酸的多肽。
9.如權(quán)利要求1所述的熒光蛋白構(gòu)建體，其中的肽連接頭側(cè)接于甘氨酸氨基酸。
10.如權(quán)利要求1所述的熒光蛋白構(gòu)建體，其中連接供體熒光蛋白和受體熒光蛋白的肽連接頭含有兩個或更多的半胱天冬酶或蛋白酶的底物序列。
11.編碼如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述蛋白構(gòu)建體的核酸。
12.含有如權(quán)利要求11所述核酸的表達(dá)構(gòu)建體。
13.含有如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述蛋白構(gòu)建體的分離的宿主細(xì)胞。
14.含有如權(quán)利要求11所述核酸的分離的宿主細(xì)胞。
15.含有如權(quán)利要求12所述表達(dá)構(gòu)建體的分離的宿主細(xì)胞。
16.含有如權(quán)利要求11所述核酸的基因傳遞載體。
17.一種用于檢測在細(xì)胞凋亡中半胱天冬酶激活的方法，包括在適于供體熒光蛋白激發(fā)的條件下培養(yǎng)含有如權(quán)利要求1所述的蛋白構(gòu)建體或編碼如權(quán)利要求1所述的蛋白構(gòu)建體的核酸的宿主細(xì)胞并檢測樣本中的熒光特性，其中半胱天冬酶激活的細(xì)胞凋亡或細(xì)胞程序性死亡在樣本細(xì)胞中的存在導(dǎo)致供體蛋白和受體蛋白之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移的程度的變化。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，進(jìn)一步包括對熒光能量轉(zhuǎn)移程度變化的定量測定。
19.一種檢測在細(xì)胞凋亡中某種試劑是否改變了宿主中半胱天冬酶或蛋白酶激活的方法，包括用試劑接觸含有如權(quán)利要求1所述的蛋白構(gòu)建體或編碼蛋白構(gòu)建體的核酸的宿主細(xì)胞，并在適于供體熒光蛋白激發(fā)的條件下培養(yǎng)該細(xì)胞，及檢測樣本熒光特性，其中試劑的活性通過在試劑的存在或不存在時的熒光特性的變化而檢測。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述試劑選自小分子化合物，蛋白，核酸，核酶，反義核酸以及來自傳統(tǒng)中藥的分離的化合物及其化學(xué)衍生物。
21.如權(quán)利要求19所述的方法，進(jìn)一步包括提供宿主細(xì)胞的第二樣本并在適于供體熒光蛋白激發(fā)的條件下培養(yǎng)第二樣本，并比較兩個樣本中熒光共振能量轉(zhuǎn)移的程度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于綠色熒光蛋白檢測細(xì)胞凋亡的方法。提供一種熒光蛋白構(gòu)建體來用于檢測在細(xì)胞凋亡中蛋白酶或半胱天冬酶的激活。該構(gòu)建體含有一個供體熒光蛋白；一個受體熒光蛋白；以及一個連接頭肽，其中的連接頭肽含有半胱天冬酶的底物序列。連接頭肽位于供體和受體蛋白之間。本發(fā)明還提供了該編碼熒光蛋白構(gòu)建物的核酸，含有該核酸的表達(dá)構(gòu)建體以及含有這些核酸的基因傳遞載體。所述方法通過在適于供體熒光蛋白激發(fā)的條件下培養(yǎng)含有上述核酸和/或蛋白的宿主細(xì)胞的樣本并檢測樣本中的熒光特性，其中細(xì)胞程序性死亡在樣本細(xì)胞中的存在導(dǎo)致供體蛋白和受體蛋白之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移的程度的變化。
文檔編號C12Q1/37GK1396265SQ0212042
公開日2003年2月12日 申請日期2002年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月24日
發(fā)明者張東才, 羅茜 申請人:香港科技大學(xué)