專利名稱：抗人端粒重復(fù)序列結(jié)合因子(trf1的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種抗人端粒重復(fù)序列結(jié)合因子單克隆抗體的制備，尤其是涉及抗人端粒重復(fù)序列結(jié)合因子(TRF133-277)單克隆抗體的制備及應(yīng)用。
當(dāng)正常人體細(xì)胞的端粒縮短至一定程度時，啟動停止細(xì)胞分裂的信號。正常人的細(xì)胞開始衰老死亡，稱之為第一死亡期(M1)或危險期(crisis)。而另一些組織細(xì)胞由于癌基因、抑癌基因p53和Rb的突變等能逃逸M1期，獲得一定的額外增殖能力，進(jìn)入第二死亡期(M2)。此時端粒酶仍為陰性，端粒進(jìn)一步縮短。大部分細(xì)胞壽命達(dá)到極限而死亡，而生存下來的細(xì)胞具有無限增殖的能力，端粒酶檢測陽性，成為永生化細(xì)胞。
研究表明，端粒序列的復(fù)制依賴與一種特殊的DNA聚合酶即端粒酶(telomerase)的作用。該酶是由RNA和蛋白質(zhì)組成的一種核糖核蛋白復(fù)合物(RNP)。目前研究普遍認(rèn)為通常DNA復(fù)制后，起始復(fù)制的RNA引物被降解，引物段留下的空缺有上游引物延伸合成的DNA序列填補(bǔ)替代。但與模板3’端配對的引物降解后，則沒有上游引物延伸序列填補(bǔ)。因此，DNA每復(fù)制一次，其子鏈即縮短一次。經(jīng)若干次分裂周期后，當(dāng)染色體端?？s短至臨界長度時，細(xì)胞即進(jìn)入“程序性死亡”。但癌細(xì)胞則是在某些機(jī)制的作用下啟動端粒酶表達(dá)而使染色體端粒穩(wěn)定地維持在一定長度，從而使癌細(xì)胞得以持續(xù)增殖、轉(zhuǎn)移并獲得永生化。
研究表明有超過85％的惡性腫瘤，其端粒酶活性高于正常組織，而且增高的程度與疾病預(yù)后有關(guān)。目前，人們已克隆的人端粒酶基因組密碼，主要有人端粒酶RNA部分(telomerase RNA component hTR)、人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerasereverse transcriptase hTERT)及端粒酶相關(guān)結(jié)合蛋白(telomerase-associatedprotein TEP1)。1995年Chong首次在Science雜志報道了人端粒重復(fù)序列結(jié)合因子(Telomere Repeat Binding Factor hTRF)，并克隆了cDNA序列。迄今為止，人們已發(fā)現(xiàn)的端粒重復(fù)序列結(jié)合因子有TRF1、TRF2、tankyrase、PinX等，它們與細(xì)胞周期、細(xì)胞惡變、衰老等有關(guān)?，F(xiàn)已明確hTRF1全長為439個氨基酸，羧基端與Myb原癌基因DNA結(jié)合區(qū)同源，具有HTH(helix-turn-helix)結(jié)構(gòu)，稱Myb區(qū)。蛋白質(zhì)的中間約包含200個氨基酸，比較保守，稱TRF特異保守區(qū)。TRF1蛋白可特異地結(jié)合于端粒TTAGGG重復(fù)片斷。近年來，國外對TRF的結(jié)構(gòu)和及相關(guān)基因進(jìn)行了大量的研究，現(xiàn)一般認(rèn)為TRF1通過抑制端粒酶活性而起負(fù)調(diào)控作用。在體外實(shí)驗(yàn)中，Elizabeth等發(fā)現(xiàn)TRF1蛋白也參與了端粒長度的調(diào)節(jié)，它通過與DNA雙鏈的結(jié)合而阻斷了端粒C末端的合成，從而起到使端粒逐漸縮短，維持正常的細(xì)胞周期的作用。有研究表明，在急性白血病中TRF1和TRF2 mRNA的表達(dá)明顯低于正常細(xì)胞。對HL-60細(xì)胞株應(yīng)用腫瘤壞死因子471和全反式維甲酸促其分化，隨著細(xì)胞分化，端粒酶活性明顯降低，TRF1和TRF2mRNA的表達(dá)增加。2000年，Aragona等應(yīng)用TRF1多克隆抗體對消化道腫瘤進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TRF1的表達(dá)在惡性腫瘤中的表達(dá)明顯低正常、炎癥組織及良性腫瘤；次年，Aragona等對顱腦腫瘤進(jìn)行了檢測，也得到了相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
但迄今為止，對抗TRF1單克隆抗體的研究國內(nèi)外均未見報道。同時，對TRF1蛋白表達(dá)也僅有少數(shù)的應(yīng)用抗TRF1多克隆抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)定性研究的報道，而無定量檢測的報道。
本發(fā)明目的通過以下方案實(shí)現(xiàn)運(yùn)用雜交瘤技術(shù)，以谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶-端粒重復(fù)序列結(jié)合因子133-277(GST-TRF133-277)融合蛋白為抗原，制備抗人端粒重復(fù)序列結(jié)合因子(TRF133-277)單克隆抗體，并應(yīng)用該單抗作Western-blot及免疫組化對臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測。
本發(fā)明的抗人端粒重復(fù)序列結(jié)合因子(TRF133-277)單克隆抗體的制備主要有以下步驟①以GST-TRF133-277融合蛋白免疫Balb/c小鼠后予細(xì)胞融合，融合時脾細(xì)胞數(shù)量為1.38×108個，骨髓瘤細(xì)胞數(shù)量為3.0×107個。
②細(xì)胞融合后，接種于96孔板，共接種192孔，融合率達(dá)98％。以TRF1蛋白包被作ELISA篩選陽性克隆細(xì)胞，獲得一株雜交瘤細(xì)胞株，部分液氮凍存，部分進(jìn)行有限稀釋克隆化培養(yǎng)，連續(xù)亞克隆3次，第3次亞克隆陽性反應(yīng)率達(dá)100％。此株雜交瘤細(xì)胞液氮凍存一年，復(fù)蘇后仍生長良好，并能持續(xù)穩(wěn)定分泌單克隆抗體。
③誘生腹水，雜交瘤細(xì)胞株(1×104～1×105/只)接種Balb/c小鼠腹腔誘生腹水，約2周后采集腹水，均呈血性。
本發(fā)明的抗人端粒重復(fù)序列結(jié)合因子(TRF133-277)單克隆抗體的一個應(yīng)用是以TRF1單克隆抗體對臨床標(biāo)本作組織免疫印跡法(Western-blot)，設(shè)純化GST蛋白為陰性對照，純化的TRF1為陽性對照，結(jié)果顯示TRF1單克隆抗體對TRF1蛋白具有高度特異性，可用于定量檢測組織細(xì)胞表達(dá)的TRF1蛋白。
本發(fā)明的抗人端粒重復(fù)序列結(jié)合因子單克隆抗體的另一個應(yīng)用是用TRF1單克隆抗體對臨床待檢組織標(biāo)本作免疫組織化學(xué)法，不經(jīng)胰酶及微波修復(fù)，直接進(jìn)行染色(Envision法)，一抗為1∶100稀釋的抗TRF1單克隆抗體，可用于檢測腫瘤細(xì)胞表達(dá)的TRF1蛋白。
圖2為正常及急性白血病骨髓細(xì)胞、腸癌組織及近旁正常組織提取蛋白的Western-blot分析圖。
圖3為組織細(xì)胞免疫組化染色圖。
(2) 細(xì)胞、動物和組織樣本 Balb/c小鼠(雌性，20g，8-12W)購自上海必凱實(shí)驗(yàn)動物中心，SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院傳染病研究所惠贈)，正常及急性白血病骨髓和大腸癌組織取自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院臨床標(biāo)本。
(3) 小鼠免疫、細(xì)胞融合及克隆化培養(yǎng) 以純化的GST-TRF133-277融合蛋白為抗原免疫Balb/c小鼠，時間為第0、28、42天，所用總蛋白量為20-50ug。初次免疫用完全福氏佐劑與抗原1∶1制成乳狀液，皮內(nèi)多點(diǎn)接種Balb/c小鼠；加強(qiáng)免疫用抗原加福氏不完全佐劑皮下多點(diǎn)注射，2周后接種純抗原，共接種3次。末次免疫后3天，無菌取Balb/c小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0在50％聚乙二醇作用下進(jìn)行細(xì)胞融合，融合時脾細(xì)胞數(shù)量為1.38×108個，骨髓瘤細(xì)胞數(shù)量為3.0×107個。細(xì)胞融合后，接種于96孔板，共接種192孔，融合率達(dá)98％。用含20％小牛血清的HAT選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞融合第10天，以純化的TRF1蛋白為抗原，作ELISA間接法檢測培養(yǎng)上清液中的抗體，選取OD值最大的分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)孔，部分液氮凍存，部分予以有限稀釋克隆化培養(yǎng)，直到克隆化細(xì)胞抗體陽性率為100％。
(4) 雜交瘤細(xì)胞染色體檢測 細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)期，棄原培養(yǎng)液，換含秋水仙素至終濃度0.3ug/ml的培養(yǎng)基，經(jīng)低滲處理，加入37℃預(yù)熱的0.075mol/L的KCL溶液，37℃30min后離心收集細(xì)胞，滴片，自然干燥后Giemsa染色，計數(shù)分析。
(5) 誘生腹水 給Balb/c小鼠腹腔注射液體石蠟0.5ml/鼠。1-2周后，將擴(kuò)大培養(yǎng)的陽性雜交瘤細(xì)胞以無血清1640細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，接種到經(jīng)石蠟預(yù)處理過的Balb/c小鼠腹腔(1×104～1×105/只)，1-2周后收集腹水，均呈血水，離心后取上清，凍存于-80℃。
(6) 抗TRF1 單抗腹水效價檢測及亞類鑒定 TRF1重組蛋白(5ug/ml)每孔0.1ml包被酶標(biāo)板作ELISA間接法檢測抗體滴度。一抗為經(jīng)倍比稀釋的腹水，二抗為1∶800稀釋的羊抗鼠IgG/HRP，經(jīng)顯色液顯色，450nm測定光密度?？贵w亞類取雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清以單抗亞類試劑盒確定?？筎RF1單抗效價為1∶3200。TRF1單克隆抗體亞類取雜交瘤細(xì)胞株培養(yǎng)上清確定，屬IgG1亞類。參見

圖1。
實(shí)施例2 組織蛋白提取及免疫印跡法(Western-blot)正常人及急性白血病患者骨髓經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離出單個核細(xì)胞，大腸癌組織及近旁正常組織經(jīng)超聲粉碎離心取上清，測定蛋白濃度。細(xì)胞和組織提取的總蛋白取20ug作10％SDS-PAGE電泳(200V)、電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(100V，1小時)，以含7％脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉后，在制備的抗TRF1單克隆抗體中室溫反應(yīng)30min，4℃過夜，洗膜，在羊抗鼠IgG/HRP中反應(yīng)1小時，TBST洗膜2小時。ECL溫浴1min，X光膠片感光，顯影，定影。并設(shè)純化GST蛋白為陰性對照，純化TRF1蛋白為陽性對照。
結(jié)果顯示上述正常人及白血病骨髓細(xì)胞、大腸癌組織及近旁正常腸粘膜組織樣本均于約60KD處呈一條陽性帶，與陽性對照純化TRF1蛋白處于同一水平，而純化GST樣本孔顯示陰性結(jié)果，表明TRF1單抗僅針對TRF1蛋白，具有高度的特異性，且與其計算分子量基本一致?？捎糜跈z測組織細(xì)胞表達(dá)的TRF1蛋白。參見圖2，其中1純化GST蛋白；2純化TRF1蛋白；3正常腸粘膜組織；4大腸癌組織；5正常人骨髓細(xì)胞；6急性白血病患者骨髓細(xì)胞。
實(shí)施例3 免疫組織化學(xué) 正常及白血病骨髓細(xì)胞、大腸癌組織及近旁正常粘膜組織切片應(yīng)用抗TRF1單克隆抗體作免疫組化染色，不經(jīng)胰酶及微波修復(fù)，直接進(jìn)行染色(Envision法)，一抗為1∶100稀釋的抗TRF1單克隆抗體。
結(jié)果大腸正常粘膜組織上皮細(xì)胞、正常及急性白血病骨髓細(xì)胞、大腸癌組織細(xì)胞的胞漿呈陽性著色，但大腸正常粘膜組織上皮細(xì)胞及正常骨髓細(xì)胞陽性率明顯高于腫瘤組織，部分腫瘤細(xì)胞細(xì)胞漿無著色，細(xì)胞核和組織間質(zhì)呈陰性反應(yīng)。參見圖3。
應(yīng)用抗TRF1單克隆抗體作免疫組化檢測臨床組織樣本，結(jié)果表明TRF1蛋白定位于骨髓造血細(xì)胞及大腸上皮組織的細(xì)胞漿，為細(xì)胞漿蛋白。免疫組化結(jié)果還顯示TRF1蛋白在正常組織與腫瘤組織中均有表達(dá)，但存在明顯差別，正常大腸組織上皮細(xì)胞及正常骨髓細(xì)胞陽性率明顯高于腫瘤組織，這可能與TRF1對端粒酶的負(fù)調(diào)控作用有關(guān)，此結(jié)果與Aragona等報道的應(yīng)用TRF1多抗檢測臨床標(biāo)本的研究結(jié)果相同。
無需進(jìn)一步詳細(xì)闡述，相信采用前面所公開的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可最大限度地應(yīng)用本發(fā)明。因此，前面的優(yōu)選具體實(shí)施方案應(yīng)理解為僅是舉例說明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.抗人端粒重復(fù)序列結(jié)合因子(TRF133-277)單克隆抗體的制備及應(yīng)用，運(yùn)用雜交瘤技術(shù)，以蛋白為抗原，制備單克隆抗體，其特征是以GST-TRF133-277融合蛋白為抗原，制備抗人端粒重復(fù)序列結(jié)合因子(TRF133-277)單克隆抗體，并建立了應(yīng)用該單抗作Western-blot及免疫組化檢測臨床標(biāo)本的方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗人端粒重復(fù)序列結(jié)合因子(TRF133-277)單克隆抗體的制備方法，其特征是由以下步驟實(shí)現(xiàn)①以GST-TRF133-277融合蛋白免疫Balb/c小鼠后予細(xì)胞融合，融合時脾細(xì)胞數(shù)量為1.38×108個，骨髓瘤細(xì)胞數(shù)量為3.0×107個；②細(xì)胞融合后，接種于96孔板，共接種192孔，融合率達(dá)98％。以TRF1蛋白包被作ELISA篩選陽性克隆細(xì)胞，獲得一株雜交瘤細(xì)胞株，部分液氮凍存，部分進(jìn)行有限稀釋克隆化培養(yǎng)，連續(xù)亞克隆3次，第3次亞克隆陽性反應(yīng)率達(dá)100％。此株雜交瘤細(xì)胞液氮凍存一年，復(fù)蘇后仍生長良好，并能持續(xù)穩(wěn)定分泌單克隆抗體；③誘生腹水，雜交瘤細(xì)胞株(1×104～1×105/只)接種Balb/c小鼠腹腔誘生腹水，約2周后采集腹水，均呈血性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗人端粒重復(fù)序列結(jié)合因子(TRF133-277)單克隆抗體的應(yīng)用，其特征是以TRF1單克隆抗體對臨床標(biāo)本作組織免疫印跡法(Western-blot)，以純化GST蛋白為陰性對照，純化的TRF1為陽性對照，結(jié)果顯示TRF1單克隆抗體對TRF1蛋白具有高度特異性，可用于檢測組織細(xì)胞表達(dá)的TRF1蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗人端粒重復(fù)序列結(jié)合因子(TRF133-277)單克隆抗體的應(yīng)用，其特征是應(yīng)用TRF1單克隆抗體，對臨床待檢組織標(biāo)本作免疫組織化學(xué)法檢測，不經(jīng)胰酶及微波修復(fù)，直接進(jìn)行染色(Envision法)，一抗為1∶100稀釋的抗TRF1單克隆抗體，可用于檢測腫瘤細(xì)胞表達(dá)的TRF1蛋白。
全文摘要
一種抗人端粒重復(fù)序列結(jié)合因子(TRF文檔編號C12P21/08GK1464064SQ0211200
公開日2003年12月31日 申請日期2002年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月7日
發(fā)明者黃河, 施繼敏, 陳巧芳 申請人:浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院