專利名稱：一種口蹄疫dna疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，是一種口蹄疫DNA疫苗。
背景技術(shù)：
口蹄疫是一種分布廣、嚴(yán)重危害偶蹄獸，威脅人類健康，對(duì)畜牧業(yè)生產(chǎn)及畜產(chǎn)品貿(mào)易影響極大的疾病，被列為A類烈性傳染病?？谔阋咭呙缡穷A(yù)防口蹄疫的重要手段，目前應(yīng)用的口蹄疫滅活疫苗雖然具有很好的預(yù)防同型口蹄疫感染的效果，但不能有效地預(yù)防多種不同血清型口蹄疫的感染，而且免疫持續(xù)時(shí)間短，導(dǎo)致保護(hù)效果不甚理想。DNA疫苗，是近年興起的新型疫苗，具有抗體效價(jià)維持時(shí)間長(zhǎng)和交叉保護(hù)效果好等優(yōu)點(diǎn)。此外DNA疫苗還具有以下突出優(yōu)點(diǎn)(1)能誘發(fā)體液及細(xì)胞全方位免疫應(yīng)答，起到預(yù)防作用；(2)能將免疫佐劑CpG序列整合入DNA疫苗內(nèi)，提高機(jī)體的免疫應(yīng)答水平而無(wú)需另加佐劑；(3)生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、成本低廉、穩(wěn)定性好且貯運(yùn)方便。
DNA疫苗的作用機(jī)理為將合成的口蹄疫抗原基因重組入真核表達(dá)質(zhì)粒載體，注射于肌肉組織，使其在肌細(xì)胞中表達(dá)口蹄疫抗原表位，經(jīng)過(guò)抗原提呈過(guò)程，可激活體內(nèi)的體液免疫系統(tǒng)和細(xì)胞免疫系統(tǒng)。激活的體液免疫系統(tǒng)可產(chǎn)生特異的抗體，消除游離在血液中的病毒，預(yù)防口蹄疫的入侵；而激活的細(xì)胞免疫系統(tǒng)可產(chǎn)生細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞(CTL)，攻擊已被感染的細(xì)胞，消除隱藏的口蹄疫病毒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明采用O型口蹄疫病毒中和抗原表位基因構(gòu)建口蹄疫DNA疫苗。
口蹄疫病毒的中和抗原表位是刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的重要保護(hù)性抗原成分，位于口蹄疫病毒衣殼。本發(fā)明所采用的是豬特有的O型口蹄疫病毒，將中和表位基因進(jìn)行設(shè)計(jì)并合成，再將其插入真核表達(dá)載體pVAX1，構(gòu)建成口蹄疫DNA疫苗pVAX-SG。
本發(fā)明用以構(gòu)建真核表達(dá)載體的基本骨架為pVAX1(購(gòu)自Invitrogen公司，序列和物理圖譜見(jiàn)該公司的產(chǎn)品目錄)；構(gòu)建過(guò)程以及制備過(guò)程中，質(zhì)粒擴(kuò)增所用的宿主菌為DH5α(購(gòu)自GIBCO公司)；插入的外源基因?yàn)樨i特有的O型口蹄疫病毒衣殼蛋白中和抗原表位基因，其結(jié)構(gòu)描述如下(1)O型口蹄疫的中和抗原表位基因a)序列特征長(zhǎng)度501bp類型核酸鏈數(shù)雙鏈幾何結(jié)構(gòu)線性b)分子類型DNAc)來(lái)源基因合成。
d)序列描述SGATGGTCACCA GTGACTCATT CGGACGTTGC GGTGGAGGTG GCTCTATCCA AAAGGGCGGT GGAGGATCCCGCTTCGAGGG TGGCGGTGGA TCCGGCGAAA CACAGATCCA GAGGCGCCAA CACACGGACG TCTCGTTCATCATGGACAGA TTTGTGAAGG TGACACCGCA AAACCAAATT AACATTTTGG ACCTCATGCA GATTCCATCACACACTGGGG GTGGAGGCTC GAGTAAGTAC TCCGCAGGTG GTATGGGCAG ACGGGGCGAC CTAGAGCCTCTCGCGGCGAG GGTCGCCGCT CAGCTTCCTA CTTCTTTCAA CTTTGGTGCA ATTGGTGGCG GAGGCTCGAGTAGACACAAA CAGAAAATTG TGGCACCGGT GAAACAGACT TTGGGAGGCG GTGGGAGCTC CAGGTACAACAGAAATGCTG TGCCCAACTT GAGAGGTGAC CTTCAGGTGT TGGCTCAAAA GGTGGCACGG ACGCTGCCTGGGAGCTCCTA A口蹄疫的表位基因采用PCR全基因合成的方式進(jìn)行，該方法的大致流程為根據(jù)設(shè)計(jì)的基因序列合成單鏈并設(shè)計(jì)相應(yīng)PCR引物，然后以單鏈DNA為模板，PCR擴(kuò)增相應(yīng)的基因片段，再將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆測(cè)序即可。具體方法及其反應(yīng)體系參見(jiàn)《分子克隆》(科學(xué)出版社，1992年出版)相關(guān)章節(jié)。


圖1含SG抗原基因的質(zhì)粒圖譜圖2DNA疫苗pVAX-SG的構(gòu)建流程3DNA疫苗pVAX-SG在BALB/c小鼠體內(nèi)的表達(dá)量曲線圖4DNA疫苗pVAX-SG誘發(fā)小鼠血清抗體效價(jià)的時(shí)間曲線
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的制備方法及作用進(jìn)行詳細(xì)描述。
一、DNA疫苗pVAX-SG的結(jié)構(gòu)、構(gòu)建及制備本DNA疫苗的結(jié)構(gòu)是以真核表達(dá)載體——PVAX1為骨架的重組質(zhì)粒DNA分子，大體結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。全長(zhǎng)3.5kb(千堿基對(duì))，除含有pMB1 ori質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)、卡那霉素抗性基因Kanamycin等元件外，還包含了一個(gè)完整的真核轉(zhuǎn)錄翻譯單元。真核轉(zhuǎn)錄翻譯單元含有真核轉(zhuǎn)錄翻譯所必需的元件真核巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子Pcmv、相應(yīng)的編碼基因SG及3′端的多聚腺苷酸BGH pA?？傮w上說(shuō)，本疫苗是一個(gè)可在真核細(xì)胞中表達(dá)SG抗原并可激活淋巴細(xì)胞的重組質(zhì)粒DNA。
1、構(gòu)建工程菌DH5α(pVAX-SG)(見(jiàn)圖2)對(duì)O型口蹄疫合成基因SG用EcoR I/Xba I雙酶切，電泳回收519bp的目的片段(含酶切位點(diǎn))。同時(shí)以EcoR I/Xba I雙酶切載體pVAX1，電泳回收載體大片段，將以上兩片段連接成pVAX-SG質(zhì)粒。用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選獲得陽(yáng)性重組子，即獲含有重組質(zhì)粒pVAX-SG的工程菌DH5α(pVAX-SG)。(具體反應(yīng)體系及實(shí)驗(yàn)方案參見(jiàn)前述《分子克隆》相關(guān)內(nèi)容)2、制備DNA疫苗pVAX-SG本發(fā)明DNA疫苗用上述工程菌株DH5α(pVAX-SG)制備。培養(yǎng)擴(kuò)增及精制可通過(guò)常規(guī)的細(xì)菌培養(yǎng)、質(zhì)粒擴(kuò)增和純化方法進(jìn)行(詳見(jiàn)前述《分子克隆》相關(guān)內(nèi)容)。
培養(yǎng)方式一般為液體培養(yǎng)。少量擴(kuò)增時(shí)可用空氣搖床振蕩培養(yǎng)；工業(yè)性生產(chǎn)時(shí)需用細(xì)菌發(fā)酵罐行高密度懸浮通氣培養(yǎng)。對(duì)培養(yǎng)基中的培養(yǎng)源無(wú)特殊的要求，一般用LB液體培養(yǎng)基，如需高密度培養(yǎng)，則可選用2×YT(含1.6％胰蛋白胨、1％酵母提取物和0.5％氯化鈉，pH7.0)或SOC液體培養(yǎng)基(含2％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.05％氯化鈉、20mmol/L葡萄糖、2.5mmol/L KCl、10mmol/L MgCl2、pH7.0)。必要時(shí)也可添加動(dòng)、植、礦物油等作為消泡劑。培養(yǎng)溫度一般為37℃，培養(yǎng)時(shí)間及收集細(xì)菌的時(shí)機(jī)決定于培養(yǎng)基、培養(yǎng)方式以及通氣量條件的設(shè)置。
從擴(kuò)增后的工程菌中分離純化質(zhì)粒DNA，可采用一些常規(guī)的方法。例如可用去垢劑SDS裂解菌體，利用質(zhì)粒DNA和染色體DNA變復(fù)性特征的差異，通過(guò)對(duì)DNA的變性和復(fù)性的處理，將質(zhì)粒DNA和染色體DNA分開(kāi)；再利用質(zhì)粒DNA與雜質(zhì)在溶解度、離子結(jié)合力、吸附親和力等方面的區(qū)別進(jìn)行進(jìn)一步的純化，并去除內(nèi)毒素。具體地說(shuō)，存在于復(fù)性液中的質(zhì)粒DNA經(jīng)過(guò)脫鹽處理后，可用陰離子交換樹(shù)脂(如DEAESepharose)進(jìn)行交換，然后用TE(含10mmol/L Tris和1mmol/L EDTA、pH8.0)緩沖液洗脫，即可制得高純度的質(zhì)粒DNA(具體見(jiàn)實(shí)施例)。經(jīng)PBS稀釋分裝，即可獲得透明澄清的本發(fā)明DNA疫苗純品。本品理化性質(zhì)十分穩(wěn)定，可于常溫下保存與運(yùn)輸，使用前，用注射用水溶解即可。
二、DNA疫苗pVAX-SG的功能檢測(cè)1、本DNA疫苗的體外表達(dá)及檢測(cè)，是將所構(gòu)建的DNA疫苗通過(guò)電穿孔法轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，72小時(shí)后收獲細(xì)胞，以間接ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清及細(xì)胞破碎液中SG抗原的表達(dá)水平，結(jié)果表明有表達(dá)，說(shuō)明本發(fā)明DNA疫苗確可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。(詳見(jiàn)后面的實(shí)驗(yàn)1)2、本DNA疫苗的體內(nèi)表達(dá)及檢測(cè)，是將獲得的DNA疫苗純品免疫小鼠后，用ELISA法檢測(cè)血清中的抗原水平(見(jiàn)圖3)。結(jié)果表明本DNA疫苗免疫動(dòng)物后，可表達(dá)SG抗原。(詳見(jiàn)后面的實(shí)驗(yàn)2)3、本DNA疫苗誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答水平的檢測(cè)，是將獲得的DNA疫苗純品免疫小鼠后，以ELISA法檢測(cè)血清中抗口蹄疫抗體的水平。結(jié)果DNA疫苗組可以在很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持較高水平的抗體效價(jià)，而作為對(duì)照組的滅活疫苗(購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所)抗體效價(jià)自3月起則下降，亞單位疫苗組抗體效價(jià)比DNA疫苗高，但是抗體效價(jià)從3月起即開(kāi)始下降(見(jiàn)圖4)。(詳見(jiàn)后面的實(shí)驗(yàn)3)本發(fā)明能有效地誘發(fā)小鼠的免疫應(yīng)答反應(yīng)，說(shuō)明其對(duì)動(dòng)物的口蹄疫病毒感染有一定免疫保護(hù)作用；且生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，理化性質(zhì)穩(wěn)定、便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸。
使用本發(fā)明的工程菌制備口蹄疫DNA疫苗的實(shí)施例從-80℃冰箱中取出凍存的工程菌株——DH5α(pVAX-SG)，于室溫融化后，用接種環(huán)蘸取少量菌液劃線接種于1.5％的LB瓊脂平板(含卡那霉素50μg/ml)上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜后，取單克隆接種于50ml LB液體培養(yǎng)基(含1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％氯化鈉，卡那霉素50μg/ml，pH7.0)中，37℃振蕩培養(yǎng)40小時(shí)，作為種子液。按1∶20的比例將種子液接種于1升SOC液體培養(yǎng)基中(在前述成分的基礎(chǔ)上，另含卡那霉素50μg/ml)，于37℃劇烈振搖培養(yǎng)25小時(shí)；加氯霉素至終濃度為170μg/ml，于37℃劇烈振搖繼續(xù)培養(yǎng)16小時(shí)。將菌液于4℃以6000rpm離心10分鐘；去上清，將菌體重懸于30ml的堿裂解法的溶液I(含50mmol/L葡萄糖、25mmol/LTris.Cl、10mmol/L EDTA pH8.0)中加溶菌酶40mg，加60ml溶液II(0.2mol/L NaOH和I％SDS)，緩慢顛倒5次混勻，室溫放置5分鐘。加45ml冰預(yù)冷的溶液III(含鉀離子3mol/L、乙酸根5mol/L)，緩慢顛倒數(shù)次混勻，冰浴10分鐘；于4℃以10000r/m離心10分鐘，取上清，過(guò)500ml G25柱除鹽后，上20ml DEAE Sepharose陰離子交換柱，待結(jié)合吸附完畢后，按鹽離子(Cl-)濃度從低到高(0～1mol/L)漸進(jìn)的梯度洗脫法，用10個(gè)柱體積的PBS(pH8.0)和氯化鈉溶液緩慢清洗陰離子交換柱，收集260nm處吸收峰的洗脫液，得到DNA疫苗的粗品。然后進(jìn)一步純化，加2倍體積的無(wú)水乙醇沉淀，12000rpm 4℃離心10分鐘，去上清，用70％的乙醇漂洗涼干后，溶于PBS(pH8.0)溶液中，即得本發(fā)明DNA疫苗的純品；用紫外分光光度法定量后，再按每份200μg/ml分裝制成成品。
本發(fā)明的預(yù)防接種方案是用成品1ml肌肉注射即可，劑量為每頭仔豬200μg。10天后追加免疫一次，即可獲得較強(qiáng)免疫應(yīng)答反應(yīng)。如與亞單位疫苗聯(lián)合治療則效果更佳。
實(shí)驗(yàn)1 DNA疫苗的體外表達(dá)及檢測(cè)用電穿孔的方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入COS7細(xì)胞，穿孔條件為電容960μF，電壓為250V，質(zhì)粒40μg，COS7細(xì)胞濃度為1×107/ml，時(shí)間為16.7 同時(shí)設(shè)空載體pVAX1的對(duì)照，72小時(shí)后收獲細(xì)胞。以間接ELISA法檢測(cè)SG抗原在COS7細(xì)胞上清和細(xì)胞裂解液中的表達(dá)情況，將細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解液分別包被96孔酶聯(lián)板，一抗為小鼠抗口蹄疫血清(以購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所的口蹄疫疫苗按照常規(guī)方法免疫小鼠制得)，二抗為羊抗鼠-HRP(購(gòu)自華美生物工程有限公司)。顯色后，以P/N比值大于1.8為陽(yáng)性，結(jié)果SG抗原在COS7細(xì)胞中得到了表達(dá)，培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解液均為陽(yáng)性。說(shuō)明本DNA疫苗在COS7細(xì)胞中可以表達(dá)。
實(shí)驗(yàn)2 免疫接種后體內(nèi)的抗原水平檢測(cè)試驗(yàn)4～6周齡的雌性BALB/c小鼠40只，隨機(jī)分成4組，每組10只，第1組免疫本發(fā)明DNA疫苗(每只接種200μg)，第2、3組為PBS或pVAX1陰性對(duì)照。將DNA 200μg經(jīng)脛前肌注射給1組小鼠，2組小鼠則接種等體積PBS或pVAX1。于注射當(dāng)日注射前和注射后第2、4、6、8、10天經(jīng)眼眶取血，分離血清后一并檢測(cè)DNA在血清中的表達(dá)情況。
以間接ELISA法檢測(cè)血清中SG的水平，將小鼠血清1∶10稀釋后包被96孔酶聯(lián)板，一抗為豬抗口蹄疫血清(購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所)，二抗為兔抗豬-HRP(購(gòu)自華美生物工程有限公司)。陰性對(duì)照為未注射疫苗的空白小鼠血清。顯色后，以l、2、3組檢測(cè)孔分別與空白小鼠檢測(cè)孔的OD450比值P/N＞1.5為陽(yáng)性。結(jié)果見(jiàn)圖3。
從圖中可以看出，疫苗在小鼠體內(nèi)所檢測(cè)到的抗原水平在第2天最高，以后逐漸下降，到第10天時(shí)，為弱陽(yáng)性。
實(shí)驗(yàn)3 DNA疫苗誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答水平的檢測(cè)為比較DNA疫苗pVAX-SG體液免疫應(yīng)答的維持時(shí)間，將BALB/c小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，第1組為DNA疫苗組，每只小鼠注射pVAX-SG疫苗200μg，第2組為滅活疫苗組(購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所)，每只小鼠皮下注射滅活苗10μl，第3組為亞單位疫苗組，每只小鼠注射蛋白10μg(亞單位疫苗制備方法含融合表達(dá)質(zhì)粒GST-SG的菌種，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后超聲破碎，用GST純化融合蛋白，溶于PBS。)，第4組為PBS對(duì)照組。在注射的當(dāng)天和注射后的兩個(gè)月內(nèi)每2周取血1次，2個(gè)月以后每月取血一次，眼眶取血。觀察至1年。以間接ELISA法檢測(cè)血清中抗口蹄疫的抗體水平，以純化的GST-SG包被酶聯(lián)板，加入待檢的血清后，再加入HRP標(biāo)記的兔抗小鼠IgG二抗(購(gòu)自華美生物工程有限公司)，顯色反應(yīng)后在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度值，以P/N大于2為陽(yáng)性。
結(jié)果DNA疫苗組可以在很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持較高水平的抗體效價(jià)，滅活疫苗抗體效價(jià)自3月起則明顯下降；亞單位疫苗組抗體效價(jià)比DNA疫苗高，但是抗體效價(jià)從3月起即開(kāi)始下降。(見(jiàn)圖4)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以證明，本發(fā)明DNA疫苗pVAX-SG能有效地誘發(fā)小鼠的免疫應(yīng)答反應(yīng)，說(shuō)明其對(duì)動(dòng)物的口蹄疫病毒感染有一定免疫保護(hù)作用；且生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，理化性質(zhì)穩(wěn)定、便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸。
口蹄疫DNA疫苗pVAX-SG的抗原基因SG核苷酸序列如下ATGGTCACCA GTGACTCATT CGGACGTTGC GGTGGAGGTG GCTCTATCCA AAAGGGCGGT GGAGGATCCCGCTTCGAGGG TGGCGGTGGA TCCGGCGAAA CACAGATCCA GAGGCGCCAA CACACGGACG TCTCGTTCATCATGGACAGA TTTGTGAAGG TGACACCGCA AAACCAAATT AACATTTTGG ACCTCATGCA GATTCCATCACACACTGGGG GTGGAGGCTC GAGTAAGTAC TCCGCAGGTG GTATGGGCAG ACGGGGCGAC CTAGAGCCTCTCGCGGCGAG GGTCGCCGCT CAGCTTCCTA CTTCTTTCAA CTTTGGTGCA ATTGGTGGCG GAGGCTCGAGTAGACACAAA CAGAAAATTG TGGCACCGGT GAAACAGACT TTGGGAGGCG GTGGGAGCTC CAGGTACAACAGAAATGCTG TGCCCAACTT GAGAGGTGAC CTTCAGGTGT TGGCTCAAAA GGTGGCACGG ACGCTGCCTGGGAGCTCCTA A
權(quán)利要求
1.一種口蹄疫DNA疫苗，包括真核表達(dá)載體和抗原基因SG，其特征在于所用的抗原基因SG來(lái)源于豬特有的O型口蹄疫病毒，其核苷酸序列如下ATGGTCACCA GTGACTCATT CGGACGTTGC GGTGGAGGTG GCTCTATCCA AAAGGGCGGTGGAGGATCCC GCTTCGAGGG TGGCGGTGGA TCCGGCGAAA CACAGATCCA GAGGCGCCAACACACGGACG TCTCGTTCAT CATGGACAGA TTTGTGAAGG TGACACCGCA AAACCAAATTAACATTTTGG ACCTCATGCA GATTCCATCA CACACTGGGG GTGGAGGCTC GAGTAAGTACTCCGCAGGTG GTATGGGCAG ACGGGGCGAC CTAGAGCCTC TCGCGGCGAG GGTCGCCGCTCAGCTTCCTA CTTCTTTCAA CTTTGGTGCA ATTGGTGGCG GAGGCTCGAG TAGACACAAACAGAAAATTG TGGCACCGGT GAAACAGACT TTGGGAGGCG GTGGGAGCTC CAGGTACAACAGAAATGCTG TGCCCAACTT GAGAGGTGAC CTTCAGGTGT TGGCTCAAAA GGTGGCACGGACGCTGCCTG GGAGCTCCTA A
2.按權(quán)利要求1所述的口蹄疫DNA疫苗，其特征在于所說(shuō)的真核表達(dá)載體為pVAX1。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域,是一種口蹄疫DNA疫苗。它是采用豬特有的O型口蹄疫的合成表位基因SG為抗原基因,以pVAX1為表達(dá)載體構(gòu)建的。SG序列為:ATGGTCACCA GTGACTCATT CGGACGTTGCGGTGGAGGTG GCTCTATCCA AAAGGGCGGTGGAGGATCCC GCTTCGAGGG TGGCGGTGGA TCCGGCGAAACACAGATCCA GAGGCGCCAA CACACGGACG TCTCGTTCATCATGGACAGA TTTGTGAAGG TGACACCGCA AAACCAAATTAACATTTTGG ACCTCATGCA GATTCCATCA CACACTGGGGGTGGAGGCTC GAGTAAGTAC TCCGCAGGTG GTATGGGCAGACGGGGCGAC CTAGAGCCTC TCGCGGCGAG GGTCGCCGCTCAGCTTCCTA CTTCTTTCAA CTTTGGTGCA ATTGGTGGCGGAGGCTCGAG TAGACACAAA CAGAAAATTG TGGCACCGGTGAAACAGACT TTGGGAGGCG GTGGGAGCTC CAGGTACAACAGAAATGCTG TGCCCAACTT GAGAGGTGAC CTTCAGGTGTTGGCTCAAAA GGTGGCACGG ACGCTGCCTG GGAGCTCCTAA
文檔編號(hào)C12N15/79GK1367021SQ01132249
公開(kāi)日2002年9月4日 申請(qǐng)日期2001年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月20日
發(fā)明者孫樹(shù)漢, 張洪英, 郭瀛軍, 陳祖歡 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)