專(zhuān)利名稱(chēng)：一種建立人/山羊造血干細(xì)胞異種移植模型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種建立造血干細(xì)胞異種移植模型的方法。
人類(lèi)和哺乳動(dòng)物的HSC移植實(shí)驗(yàn)表明，只有在宿主處于免疫耐受或免疫屏障尚未被激活時(shí)，移植方能成功。在胎兒發(fā)育的早期，免疫器官尚未發(fā)育成熟，處于免疫幼稚期，故是HSC移植的合適受體。Zanjani等成功地將從人胎肝分離的HSC移植于胎綿羊，獲得人HSC在綿羊體內(nèi)長(zhǎng)期存活。
本發(fā)明從人臍血分離獲得人HSC，注射到胎山羊體內(nèi)，成功地建立了人/山羊造血干細(xì)胞異種移植模型。在實(shí)驗(yàn)組的50頭移植山羊中，35頭山羊移植成功，并顯示人HSC擴(kuò)增至1000-10000倍，更有意義的是，移植于山羊體內(nèi)的人造血細(xì)胞已穩(wěn)定保持其表型達(dá)10個(gè)月以上，并處于不完全分化狀態(tài)。而對(duì)照組40頭非移植山羊的血液中卻沒(méi)有人造血干細(xì)胞所特有的CD34+細(xì)胞，兩者之間的差異極顯著[P＜0.01]。本發(fā)明方法技術(shù)方案及步驟如下1、移植模型構(gòu)建的基本路線(xiàn)首先收集新鮮人臍血，然后分離出人HSC，將分離的HSC移植入胎山羊腹腔中。整個(gè)過(guò)程在8-16小時(shí)內(nèi)完成。待胎羊分娩后3個(gè)月、6個(gè)月、10個(gè)月分別抽取靜脈血進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證山羊體內(nèi)是否嵌合有人HSC及其含量和分化程度。
2、移植模型構(gòu)建的具體步驟(1)獲得新鮮的人臍血。
(2)所得人新鮮臍血首先用NycoPrepTM(1.077g/mL，Nycomed Pharma AS，Oslo，Norway)梯度離心分離臍血中單個(gè)核細(xì)胞，然后用“人原始祖細(xì)胞富集雞尾酒”(Human PrimitiveProgenitor Enrichment Cocktail，Stemcell Technologies，Vancouver，Canada)試劑盒進(jìn)一步分離獲得人HSC(CD34+CD38-Lin-細(xì)胞)。
(3)將分離獲得的人HSC移植于胎山羊，胎齡為55-65天。術(shù)前母山羊需禁食24小時(shí)，然后肌肉注射麻醉劑“846”(0.01mL/kg，中國(guó)軍需大學(xué)產(chǎn)品)，剖腹暴露子宮后，通過(guò)子宮壁直接向胎羊腹腔內(nèi)注射人HSC，注射劑量為每頭HSC1-5×105。關(guān)閉母體腹腔后，靜脈推注“清醒劑”(中國(guó)軍需大學(xué)產(chǎn)品)促使山羊恢復(fù)知覺(jué)。
3、檢測(cè)構(gòu)建模型在50頭移植的胎山羊中活產(chǎn)39頭。待胎羊分娩后3個(gè)月、6個(gè)月、10個(gè)月分別抽取靜脈血進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定山羊體內(nèi)是否成功移植入人HSC即是否嵌合有人HSC，并檢測(cè)山羊體內(nèi)人HSC的量及其HSC的分化程度。
(1)進(jìn)行FACS分析在鑒定人/山羊造血干細(xì)胞移植模型的體內(nèi)是否嵌入人的HSC以前，比較分析正常山羊和人兩者的細(xì)胞對(duì)鼠抗人單抗結(jié)合能力的差異，以找出對(duì)人細(xì)胞特異而對(duì)山羊細(xì)胞不特異的鼠抗人單抗用于人/山羊模型的FACS比較分析。
本發(fā)明采用材料來(lái)源PE(phycoerythrin)和FITC共價(jià)標(biāo)記的鼠抗人CD抗原，GPA和HLA抗原的單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)B.D.公司，流式細(xì)胞儀為美國(guó)B.D.公司產(chǎn)品。本發(fā)明中FACS的分析步驟按美國(guó)B.D.公司的操作指南進(jìn)行，通過(guò)鼠抗人單抗對(duì)正常山羊和人兩者之間的細(xì)胞結(jié)合能力的比較分析。
FACS測(cè)定方法如下每組單抗10μL加入50μL山羊全血標(biāo)本，徹底混勻后在室溫下孵育30分鐘，然后加入1mL1×FACSTM裂解液(B.D.公司，San Jose，CA，USA)，混勻，室溫下15分鐘后用含有0.5％牛血清白蛋白(BSA)和0.1％疊氮鈉的PBS洗滌二次，再離心1,500rpm孵育15分鐘，丟棄上清液，取1-2×105細(xì)胞進(jìn)行單抗的染色后在室溫下進(jìn)行細(xì)胞流式儀分析。本發(fā)明分析結(jié)果顯示出特異于CD3，CD4，CD5，CD7，CD8，CD10，CD13，CD14，CD15，CD19，CD20，CD22，CD33，CD34，CD38，CD42a，CD45，CD56，CD62和CD71的鼠抗人單抗對(duì)山羊細(xì)胞不敏感，在此基礎(chǔ)上，常規(guī)選擇CD20/CD7；GPA/CD45；D34/CD15；CD14/38(PE/FITC標(biāo)記)以及CD3，CD4，CD8，CD56等單抗進(jìn)行FACS測(cè)定。
(2)DNA分析①抽提DNA；②設(shè)計(jì)PCR引物通過(guò)Genbank分別查詢(xún)?nèi)薈D34、血型糖蛋白A(Glycophorin A，Gly A)和SRY基因的序列，與山羊的序列進(jìn)行同源性比對(duì)，選取非同源的部分設(shè)計(jì)引物；表1為具體引物表.
③檢測(cè)引物特異性將合成的各對(duì)引物分別擴(kuò)增人基因組，檢測(cè)DNA和對(duì)照組羊DNA的特異性；④PCR檢測(cè)人/山羊造血干細(xì)胞嵌合模型的巢式CD34基因的PCR擴(kuò)增將抽提的DNA作為模板，以HCl/HC作第一次擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃×5′→(94℃×1′→61℃×45′′→72×1′)×15cycles→72℃×10′，擴(kuò)增體積為15μL。取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物再以HC2/HC3作第二次擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃×5′→(94℃×1′→61C×45′′→72℃×1′)×28cycles→72℃×10′，擴(kuò)增體積為25μL。其中陽(yáng)性的可擴(kuò)增出437bp的特異性條帶。
Gly A基因的PGR擴(kuò)增將抽提的DNA作為模板，以GA2/GA3作第一次擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃×5′→(94℃×1′→61℃×45′′→72℃×1′)×15cycles→72℃×10′，擴(kuò)增體積為15μL。取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物再以GA1/GA4作第二次擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃×5′→(94℃×1′→61℃×45′′→72℃×1′)×28cycles→72℃×10′，擴(kuò)增體積為25μL。其中陽(yáng)性的可擴(kuò)增出479bp的特異性條帶。
SRY基因的PCR擴(kuò)增將抽提的DNA作為模板，以HS1/HS4作第一次擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃×5′→(94℃×1′→56℃×45′′→72℃×1′)×15cycles→72℃×10′，擴(kuò)增體積為15μL。取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物再以HS2/HS3作第二次擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃×5′→(94℃×1′→58℃×45′′→72℃×1′)×28cycles→72℃×10′，擴(kuò)增體積為25μL。陽(yáng)性的可擴(kuò)增出302bp的特異性條帶。
⑤檢測(cè)PCR-Sothern blot將擴(kuò)增CD34基因得到的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，用從人DNA上擴(kuò)增到的437bp片段作為探針進(jìn)行雜交。
⑥RT-PCR檢測(cè)人/山羊造血干細(xì)胞嵌合模型抽提總RNA使用QIAGEN公司的QIAampRNA Blood Kit從羊外周血中抽提總RNA。將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA使用BRL公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
PCR擴(kuò)增CD34基因、Gly A基因以逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA為模板，具體擴(kuò)增過(guò)程同上。
⑦對(duì)移植流產(chǎn)的胎羊進(jìn)行組織學(xué)和免疫組織化學(xué)檢查。
⑧對(duì)被移植胎羊的母體血液行血液學(xué)檢查。四、本發(fā)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下1、人臍血HSC移植于50頭胎山羊后，其中11頭因手術(shù)創(chuàng)傷或急性免疫反應(yīng)等原因而流產(chǎn)，其它39頭胎羊妊娠至足月后分娩，經(jīng)FACS和DNA分析，證實(shí)35頭存在人造血細(xì)胞的鑲嵌，并穩(wěn)定地持續(xù)至出生后10個(gè)月以后而無(wú)免疫排斥反應(yīng)。表2為人HSC宮內(nèi)移植于胎羊后的結(jié)果。
FACS分析結(jié)果顯示，35頭人干/祖細(xì)胞移植存活的山羊血液中均有人CD34+細(xì)胞(2.58±0.54％)，而40頭非移植對(duì)照山羊的血液中卻沒(méi)有人CD34+細(xì)胞，兩者之間存在極顯著的差異(P＜0.01)，不同移植羊個(gè)體間人CD34+細(xì)胞的數(shù)量具有差異，但與受體山羊的性別和母羊的年齡無(wú)關(guān)。此外，移植存活羊的血液中還存在表達(dá)CD14，CD20和GPA等的陽(yáng)性細(xì)胞，但未檢測(cè)出表達(dá)CD3，CD4，CD8和CD56的細(xì)胞。
2、山羊血液中人造血細(xì)胞各亞群的頻率(％)以平均值±SE表示。移植存活組和對(duì)照組之間具有顯著差異{P＜0.01}。表3為移植組和對(duì)照組山羊FACS分析的結(jié)果。
胎羊出生后，在不同時(shí)期通過(guò)FACS動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)其體內(nèi)人造血細(xì)胞的存在狀況，結(jié)果表明，人造血細(xì)胞在山羊體內(nèi)能較穩(wěn)定地表達(dá)多種表面抗原，其數(shù)量也保持到出生后10個(gè)月以上。
3、引物特異性的檢測(cè)結(jié)果人基因組DNA中均可擴(kuò)增出CD34、GPA和SRY三種基因中特定的條帶，羊基因組DNA中沒(méi)有擴(kuò)出相應(yīng)的條帶，本發(fā)明證合成的引物特異性較好，可用于隨后的分子檢測(cè)。
4、人/山羊造血干細(xì)胞嵌合模型的巢式PCR檢測(cè)結(jié)果CD34基因的PCR擴(kuò)增圖2的結(jié)果證實(shí)有8個(gè)從小羊外周血中提取的DNA中可擴(kuò)增出437bp的特異性片段，證明其外周血中存在人HSC。
GPA基因的PCR擴(kuò)增圖3的結(jié)果可以看出1-8為陽(yáng)性。共有8只小羊外周血DNA中可擴(kuò)增出人GPA基因。
SRY基因的PCR擴(kuò)增圖4的結(jié)果可以看出2、3、5、8、10為陽(yáng)性，移植于這幾只小羊體內(nèi)的HSC均來(lái)自于男性，結(jié)果與實(shí)際情況相符。
5、人/山羊造血干細(xì)胞嵌合模型的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果CD34基因的RT-PCR擴(kuò)增從圖5可以看出1、2、4、5、6、7、8為陽(yáng)性。共有1只羊外周血中有人CD34基因的表達(dá)。
GPA基因的RT-PCR擴(kuò)增從圖6可以看出1-8均為陽(yáng)性。共有1只羊外周血中有人GPA基因的表達(dá)。
6、PCR-Sothern blot雜交證實(shí)以上PCR結(jié)果。
7、移植流產(chǎn)的胎羊進(jìn)行了組織學(xué)和免疫組織化學(xué)的檢查顯示不僅血管內(nèi)含有人造血干細(xì)胞而且部分臟器組織內(nèi)，特別在肝臟組織內(nèi)有較大量人的肝細(xì)胞的聚集。
8、移植胎羊的母體血液檢查中發(fā)現(xiàn)人的造血干細(xì)胞。
本發(fā)明結(jié)果顯示，從人臍血分離獲得的HSC也能成功地移植于山羊體內(nèi)，其技術(shù)方案、檢測(cè)完整性及良好的結(jié)果國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。如根據(jù)每頭移植存活的山羊體內(nèi)人造血細(xì)胞占山羊外周血單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)(1011-1012)的1-3％計(jì)算，那么人HSC在山羊體內(nèi)已擴(kuò)增至103-104倍，換言之，如將1×105的人HSC移植于山羊，將有108-109的人造血細(xì)胞循環(huán)于山羊體內(nèi)，因此本發(fā)明所建立的人/山羊HSC移植模型可為貯存和擴(kuò)增人造血干/祖細(xì)胞提供潛在的活體倉(cāng)庫(kù)，可成為人造血干/祖細(xì)胞一種方便的來(lái)源。
本發(fā)明結(jié)果進(jìn)一步支持以下觀(guān)點(diǎn)妊娠早期的胎兒因處于免疫反應(yīng)幼稚期，因而是HSC移植的理想受體。它的獨(dú)到之處在于正常HSC能移植成功并長(zhǎng)期存活，而毋需進(jìn)行造血組織的摧毀和免疫抑制治療。本發(fā)明的人/山羊HSC移植模型為通過(guò)宮內(nèi)HSC移植途徑來(lái)治療疾病提供了理論和技術(shù)依據(jù)。
研究結(jié)果清楚表明，自胎山羊腹腔內(nèi)注射了人造血干細(xì)胞后，人造血干細(xì)胞不僅存在于胎羊的血液中，并顯示人的組織細(xì)胞存在于胎羊相應(yīng)組織中，如胎山羊肝臟中存在人的肝細(xì)胞。表1；實(shí)驗(yàn)中所用PCR引物一覽表

表2.人臍血HSC宮內(nèi)移植于胎山羊的結(jié)果

表3.FACS分析人造血干/祖細(xì)胞移植山羊后的結(jié)果



圖1為FACS分析移植山羊血液中含有人CD34和GPA抗原的造血細(xì)胞。其中N非移植山羊；T移植山羊圖2為羊外周血DNA中人CD34基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果其中M100bp DNA ladder；1-9實(shí)驗(yàn)羊外周血DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果；10空白對(duì)照11對(duì)照羊外周血DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果(陰性對(duì)照)；12人外周血DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果(陽(yáng)性對(duì)照)。
圖3為應(yīng)用PCR檢測(cè)移植山羊血中人GPA DNA片段，2％瓊脂糖凝膠電泳，其中M100bp梯度分子質(zhì)量標(biāo)記1-1111頭移植山羊，具有特異于人GPA基因的479bp擴(kuò)增片段，12陰性對(duì)照，13空白對(duì)照，14陽(yáng)性對(duì)照(人DNA)。
圖4為羊外周血DNA中人SRY基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果其中M100bp DNA ladder；1-11實(shí)驗(yàn)羊外周血DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果；12男人外周血DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果(陽(yáng)性對(duì)照)；13對(duì)照羊外周血DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果(陰性對(duì)照)。
圖5應(yīng)用PCR檢測(cè)移植山羊血中人CD34 DNA片段，2％瓊脂糖凝膠電泳，其中M100bp梯度分子質(zhì)量標(biāo)記1-66頭移植山羊，具有特異于人CD34基因的437bp擴(kuò)增片段7陰性對(duì)照(非移植山羊)8空白對(duì)照9陽(yáng)性對(duì)照(人DNA)圖6為羊外周血總RNA中Gly A基因的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果其中M100bp DNA ladder；1-8實(shí)驗(yàn)羊外周血總RNA的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果；9對(duì)照羊外周血總RNA的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果(陰性對(duì)照)；10人外周血總RNA的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果(陽(yáng)性對(duì)照)；11空白對(duì)照；圖7為PCR-Southern檢測(cè)移植山羊的人CD34基因，擴(kuò)增的CD34 DNA片段轉(zhuǎn)移至S & S尼龍膜上，然后與(α-32P)dCTP標(biāo)記的人CD34基因探針雜交并行放射自顯影，1，2，4，5，7，8，9移植山羊，顯示陽(yáng)性雜交帶3，6母羊，無(wú)雜交帶 10陰性對(duì)照(非移植山羊)11空白對(duì)照 12陽(yáng)性對(duì)照(人DNA)圖8為應(yīng)用FACS動(dòng)態(tài)分析移植山羊(#3)出生后不同時(shí)期人造血細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)比較出生后3個(gè)月至10個(gè)月，CD34，CD20，CD14，CD7，CD38，CD15，CD45和GPA的頻率幾乎相似。
權(quán)利要求
1.一種建立人/山羊造血干細(xì)胞異種移植模型的方法，其特征在于首先收集新鮮人臍血，然后分離人造血干細(xì)胞HSC后，將其移植入胎山羊腹腔中，抽取分娩后胎山羊靜脈血檢測(cè)后，得體內(nèi)嵌合有人HSC其含量擴(kuò)增至1000-10000倍，穩(wěn)定保持其表型10個(gè)月以上，處于不完全分化狀態(tài)的人/山羊造血干細(xì)胞異種移植模型。
2.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于從收集人臍血到移植人HSC入胎山羊腹腔中的整個(gè)過(guò)程在8-16小時(shí)內(nèi)完成。
3.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的靜脈血檢測(cè)是胎羊分娩后3個(gè)月、6個(gè)月、10個(gè)月分別抽取。
4.一種權(quán)利要求1所述的方法，其步驟如下1)分離新鮮人臍血其中單個(gè)核細(xì)胞和離心分離獲得人HSC；2)將分離獲得的人HSC移植于胎山羊，檢測(cè)構(gòu)建模型山羊體內(nèi)人HSC的量及其HSC的分化程度，包括FACS分析、DNA分析及對(duì)移植流產(chǎn)的胎羊的組織學(xué)和免疫組織化學(xué)檢查和對(duì)被移植胎羊的母體血液學(xué)檢查。
5.按權(quán)利要求4所述的方法，其中DNA分析包括抽提DNA、設(shè)計(jì)PCR引物、檢測(cè)引物特異性、和PCR檢測(cè)人/山羊造血干細(xì)胞嵌合模型的巢式及RT-PCR檢測(cè)人/山羊造血干細(xì)胞嵌合模型。
全文摘要
本發(fā)明屬生物細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種建立造血干細(xì)胞異種移植模型的方法。本發(fā)明從人臍血分離獲得人HSC,移植入胎山羊體內(nèi),建立了人/山羊造血干細(xì)胞異種移植模型,實(shí)驗(yàn)證實(shí)移植山羊靜脈血中,顯示人HSC擴(kuò)增至1000－10000倍,穩(wěn)定保持人HSC表型達(dá)10個(gè)月以上,并處于不完全分化狀態(tài)。本發(fā)明所建立的移植模型可為貯存和擴(kuò)增人造血干/祖細(xì)胞提供潛在的活體倉(cāng)庫(kù),可成為人造血干/祖細(xì)胞方便來(lái)源,為通過(guò)宮內(nèi)HSC移植途徑治療疾病提供了理論和技術(shù)依據(jù)。
文檔編號(hào)C12N5/00GK1353994SQ0113223
公開(kāi)日2002年6月19日 申請(qǐng)日期2001年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月19日
發(fā)明者曾凡一, 黃淑幀, 曾溢滔 申請(qǐng)人:上海凡華生物技術(shù)有限公司