專利名稱：以蛋白質(zhì)分泌功能為靶的抗耐藥性化合物篩選方法
技術領域：
本發(fā)明涉及抗耐藥性化合物的篩選方法。
背景技術：
30年代和40年代末期，磺胺類藥物和青霉素類藥物分別開始用來殺滅病源細菌，雖然同抗生素問世以前相比，細菌性疾病的發(fā)病率和死亡率已經(jīng)大幅度下降，但由于大量使用抗生素造成的強大選擇性壓力以及迅速的適應和進化使得抗藥性機制在普通病源菌中廣泛傳播。即使在發(fā)達的美國，每年仍有成千上萬的人死于該病，在發(fā)展中國家情況更為嚴重。對有些耐藥性細菌，只有很少種類的藥物，甚至根本就沒有藥物供醫(yī)生選擇。
目前廣泛用于臨床的抗生素是以不同的細胞學過程為攻擊靶點的。氨基糖苷類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素抑制蛋白質(zhì)的合成，β-內(nèi)酰胺類、糖肽類抗生素抑制細胞壁的合成，喹諾酮類抑制DNA超螺旋化，磺胺類藥物抑制葉酸的合成。細菌細胞中的抗生素作用靶點應具備的條件是關系著細菌細胞的生死存亡，在細菌細胞內(nèi)分布廣泛且高度保守而在人體細胞中不存在。換言之，只有那些與致病行為相關的功能才適合作為理想的新抗生素的作用靶點。CHINESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY2000年載文中詳細闡明了橫跨細胞膜的蛋白質(zhì)的分泌過程將是最具潛力的新抗的作用靶點，蛋白質(zhì)的分泌功能可使一些用于構建細胞外膜，菌毛或鞭毛的蛋白質(zhì)以及毒素、酶蛋白等分泌到細胞外。細菌蛋白質(zhì)分泌功能減弱或受阻，勢必會造成其生長受到抑制，失去毒力以及其破壞抗生素的酶蛋白分泌減弱或受阻失去耐藥性。需要指出，在各種耐藥性生物化學機理中，“耐藥菌產(chǎn)生分解或鈍化抗生素的酶”機理是最清楚、最普遍的。作為一種抗耐藥性化合物，蛋白質(zhì)分泌減量劑可同相應抗生素混合用于殺滅那些因產(chǎn)生并分泌出分解鈍化抗生素的酶蛋白而產(chǎn)生耐藥性的病源菌。但至今尚無公開發(fā)表的具體篩選方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種以蛋白質(zhì)分泌功能為靶的抗耐藥性化合物篩選方法。
為達到以上目的，本發(fā)明采用產(chǎn)生抗生素分解或鈍化酶的耐藥菌作指示菌，首先在含指示菌和對該指示菌臨界生長濃度抗生素的瓊脂培養(yǎng)基平板上篩選出蛋白質(zhì)分泌減量劑和抗生素分解或鈍化酶抑制劑；然后在含有抗生素、抗生素分解或鈍化酶和對抗生素敏感的同種指示菌瓊脂培養(yǎng)基平板上檢測出抗生素分解或鈍化酶的抑制劑，從而獲得蛋白質(zhì)分泌減量劑。具體步驟如下(一)、初篩1、選擇合適的初篩指示菌及其培養(yǎng)基指示菌選擇的標準是該菌能產(chǎn)生并分泌抗生素分解或鈍化酶的菌株，由于目前急需對付革蘭氏陽性病源菌的藥物，所以用革蘭氏陽性菌作指示菌來建立的篩選方法會是很有用的，所用的菌株必須是背景清楚，操作方便。并選擇適合該種指示菌生長的培養(yǎng)基。2、測定抗生素對指示菌的臨界生長濃度，即在此抗生素濃度下指示菌剛好能生長，高于此抗生素濃度指示菌生長受到抑制。3、篩選平板與對照平板將選定的指示菌和足夠的但需在其臨界生長濃度以下的抗生素與瓊脂培養(yǎng)基混合后，制成篩選平板；對照平板中不含抗生素。4、篩選同時用無菌濾紙圈浸取液體樣品或用無菌牙簽直接挑取少量固體樣品置于篩選平板和對照平板，每一平板上可放置多個樣品，在一定溫度下培養(yǎng)一定時間后，觀察平板上生長抑制圈的出現(xiàn)。5、篩選結果的判斷和處理凡在篩選平板上出現(xiàn)生長抑制透明圈而在對照平板上不出現(xiàn)生長抑制透明圈的樣品被認為含蛋白質(zhì)分泌減量劑或抗生素分解或鈍化酶抑制劑進入復篩。
(二)、復篩1、選擇合適的復篩指示菌及其培養(yǎng)基復篩指示菌選擇的標準必須是與初篩指示菌同種并且是抗生素敏感菌。培養(yǎng)基同初篩指示菌培養(yǎng)基。2、復篩平板與對照平板的制備將復篩指示菌、適量抗生素、適量抗生素分解或鈍化酶與瓊脂培養(yǎng)基混合后，制成復選平板。對照平板中不加抗生素。3、復篩試驗同時用無菌濾紙圈浸取液體樣品或用無菌牙簽直接挑取少量固體樣品置于復篩平板和對照平板，每一平板上可放置多個樣品，在一定溫度下培養(yǎng)一定時間后，觀察平板上生長抑制圈的出現(xiàn)。4、篩選結果的判斷和處理凡在復篩平板上出現(xiàn)生長抑制透明圈而在對照平板上不出現(xiàn)生長抑制透明圈的樣品被認為含抗生素分解或鈍化酶抑制劑；在復篩平板和對照平板上都不出現(xiàn)生長抑制透明圈的樣品被認為含蛋白質(zhì)分泌減量劑。
本發(fā)明的優(yōu)點在于1、可廣泛用于從微生物發(fā)酵液、中草藥和海洋生物萃取物以及化學合成物中篩選抗耐藥性化合物；2、篩選出的蛋白質(zhì)分泌減量劑是一種以蛋白質(zhì)分泌功能為靶的抗耐藥性化合物，可同多種抗生素混合廣泛用于殺滅多種因產(chǎn)生并分泌分解鈍化抗生素的酶蛋白而引起耐藥性的病源菌，對開發(fā)克服微生物耐藥性的藥物具有重大意義；3、操作方便快捷，可同時處理多個樣品，進行大樣本量篩選；4、本方法設計嚴密、合理、結果可靠。
具體實施例方式初篩材料和方法指示菌Bacillus cereus CCRC11267.β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生菌。斜面菌種培養(yǎng)基組成Peptone 5g，Beef extract 3g，NaCl 5g，MnSO4·H2O5mg，Agar 15～20g，DH2O 1000ml，pH7.0～7.2. 115℃30分鐘殺滅。篩選培養(yǎng)基組成同斜面菌種培養(yǎng)基，裝量100ml/250ml三角瓶，115℃，30分殺滅。茄子瓶培養(yǎng)基組成酪蛋白水解物10g，酵母膏3g，牛肉膏1.5g，葡萄糖1g，瓊脂15～20g，DH2O 1000ml，pH7.0～7.2，115℃，30分殺滅。指示菌懸液的制備在茄子瓶中裝60ml茄子瓶培養(yǎng)基，115℃，30分鐘殺滅，擺成斜面，涼至室溫后接種CCRC11267斜面菌種。30℃培養(yǎng)7天至孢子完全成形。用30ml無菌生理鹽水洗下細胞，置65℃水浴30分鐘殺死營養(yǎng)細胞。用無菌生理鹽水離心洗滌細胞三次。將全部細胞用30ml無菌生理鹽水懸浮，再次65℃水浴30分鐘殺死營養(yǎng)細胞。1ml/1.5ml離心管分裝并置4℃冰箱保藏備用。篩選平板(Test plate)的制備向48℃水浴中盛有100ml篩選培養(yǎng)基的250ml三角瓶中加入稀釋10倍的CCRC11267指示菌懸液0.5ml，搖勻，再加入0.5--1.0ml青霉素鈉母液(10mg/ml)，搖勻，使成50--100μg青霉素鈉/ml培養(yǎng)基。用開口吸管制備15ml培養(yǎng)基/9cm培養(yǎng)皿篩選平板。對照平板的制備與篩選平板相同，只是培養(yǎng)基中不含青霉素。篩選方法對于液體樣品，如微生物發(fā)酵液，中草藥抽提物等，用無菌五層直徑6mm新華一號濾紙片蘸取樣品置篩選平板(Test Plate)和對照平板(Control plate)；對于固體樣品，則用無菌牙簽粘少許置篩選平板(Test Plate)和對照平板(Control plate)。每個平板放置16個樣品和1個在濃度為10μg～50μg/ml的青霉素酶抑制劑棒酸或舒巴坦溶液中浸過的濾紙片代作陽性對照物。置30℃培養(yǎng)12--20小時，觀察平板上生長抑制圈的出現(xiàn)。篩選結果的判斷和處理凡在篩選平板(Test plate)上引起生長抑制(出現(xiàn)生長抑制透明圈)而在對照平板(Control plate)上不引起生長抑制(不出現(xiàn)生長抑制透明圈)的樣品被認為含蛋白質(zhì)分泌減量劑或β--內(nèi)酰胺酶抑制劑移交復篩程序。復篩材料和方法青霉素酶溶液的制備按[中華人民共和國藥典，北京化學工業(yè)出版社，1995.附錄74.]進行，其活力測定按[Methods in Enzymology，Vol.XL III，Antibiotics，1975.p75～76.]進行，并換算成Levy單位表示。指示菌Bacillus cereus AS1.1686。青霉素超敏感菌株。斜面菌種培養(yǎng)基組成、茄子瓶培養(yǎng)基組成和指示菌懸液的制備同初篩。復篩培養(yǎng)基組成同初篩。100ml培養(yǎng)基/250ml三角瓶。115℃殺滅30分鐘。復篩平板的制備向48℃水浴中每100ml復篩培地/250ml三角瓶中加入青霉素酶500Levy單位，青霉素鉀1000μg，稀釋10倍的指示菌懸液0.5ml，搖勻，按15ml/III 制成復篩平板。對照平板的制備與復篩平板相同，只是培養(yǎng)基中不含青霉素。復篩方法在復篩平板制備后的2小時之內(nèi)，將含有樣品的濾紙片或用無菌牙簽粘少許固體樣品同時放在復篩平板和對照平板上。每個平板放置16個樣品和1個在濃度為10μg～50μg/ml的青霉素酶抑制劑棒酸或舒巴坦溶液中浸過的濾紙片作對照物。置30℃培養(yǎng)12--20小時。觀察生長抑制現(xiàn)象。結果判斷在復篩平板上引起生長抑制圈出現(xiàn)，在對照平板不引起生長抑制圈出現(xiàn)的樣品為青霉素酶抑制劑；在復篩平板和對照平板上都不引起生長抑制圈出現(xiàn)的樣品為蛋白分泌減量劑。結果利用以蛋白質(zhì)分泌功能為靶的抗耐藥性化合物篩選方法，從分離自西南各種不同生態(tài)環(huán)境并保存于本實驗室的各種微生物純培養(yǎng)菌種發(fā)酵制成2692個樣品和本所植化室送檢的108個中草藥成份樣品，總共2800個樣品中篩選獲得17個蛋白質(zhì)分泌減量劑---抗耐藥性陽性樣品(放線菌樣品11個，絲狀真菌樣品6個)。用購自華西醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科新近分離自臨床的多種抗生素耐藥菌對上述17個抗耐藥性陽性樣品活性進行確證，結果均顯示出對多種抗生素耐藥菌的抗耐藥性。如我們篩選的+號陽性樣品可以分別同青霉素氯霉素，卡那霉素，四環(huán)素，慶大霉素，紅霉素等六種抗生素混合用于殺滅對上述六種抗生素具有耐藥性的金黃色葡萄球菌和芽孢桿菌。
權利要求
1.一種以蛋白質(zhì)分泌功能為靶的抗耐藥性化合物篩選方法，其特征是采用產(chǎn)生抗生素分解或鈍化酶的耐藥菌作指示菌，首先在含指示菌和對該指示菌臨界生長濃度抗生素的瓊脂培養(yǎng)基平板上篩選出蛋白質(zhì)分泌減量劑和抗生素分解或鈍化酶抑制劑；然后在含有抗生素、抗生素分解或鈍化酶和對抗生素敏感的同種指示菌瓊脂培養(yǎng)基平板上檢測出抗生素分解或鈍化酶的抑制劑，從而獲得蛋白質(zhì)分泌減量劑。
2.根據(jù)權利要求1所述的以蛋白質(zhì)分泌功能為靶的抗耐藥性化合物篩選方法，其特征是指示菌的臨界生長濃度，即通過試驗確定出指示菌的臨界生長濃度。
3.根據(jù)權利要求1所述的以蛋白質(zhì)分泌功能為靶的抗耐藥性化合物篩選方法，其特征是采用選定的指示菌和其臨界生長濃度的抗生素、培養(yǎng)基混合，定量置于培養(yǎng)皿制備篩選平板；控制平板的制備方法與篩選平板相同，但培養(yǎng)基中不含抗生素。
4.根據(jù)權利要求1所述的以蛋白質(zhì)分泌功能為靶的抗耐藥性化合物篩選方法，其特征是篩選結果的判斷和處理是在篩選平板和控制平板上都能出現(xiàn)生長抑制透明圈的樣品被作為具有抗生作用記錄在案，但不參與復篩；凡在篩選平板上出現(xiàn)生長抑制透明圈而在控制平板上不出現(xiàn)生長抑制透明圈的樣品被認為含蛋白質(zhì)分泌減量劑或抗生素分解酶抑制劑進入復篩程序。
5.根據(jù)權利要求1所述的以蛋白質(zhì)分泌功能為靶的抗耐藥性化合物篩選方法，其特征是復篩指示菌選擇的標準必須是與初篩指示菌同種并且是抗生素敏感菌。
6.根據(jù)權利要求1所述的以蛋白質(zhì)分泌功能為靶的抗耐藥性化合物篩選方法，其特征是復篩指示菌、適量抗生素、適量抗生素分解或鈍化酶與瓊脂培養(yǎng)基混合后，制成復選平板；對照平板中不加抗生素。
7.根據(jù)權利要求1所述的以蛋白質(zhì)分泌功能為靶的抗耐藥性化合物篩選方法，其特征是凡在復篩平板上出現(xiàn)生長抑制透明圈而在對照平板上不出現(xiàn)生長抑制透明圈的樣品被認為含抗生素分解或鈍化酶抑制劑；在復篩平板和對照平板上都不出現(xiàn)生長抑制透明圈的樣品被認為含蛋白質(zhì)分泌減量劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以蛋白質(zhì)分泌功能為靶的抗耐藥性化合物篩選方法。針對目前臨床上急需克服各種耐藥菌的藥物，本發(fā)明采用產(chǎn)生抗生素分解或鈍化酶的耐藥菌作指示菌，首先在含指示菌和對該指示菌臨界生長濃度抗生素的瓊脂培養(yǎng)基平板上篩選出蛋白質(zhì)分泌減量劑和抗生素分解或鈍化酶抑制劑；然后在含有抗生素、抗生素分解或鈍化酶和對抗生素敏感的同種指示菌瓊脂培養(yǎng)基平板上檢測出抗生素分解或鈍化酶的抑制劑，從而獲得蛋白質(zhì)分泌減量劑。蛋白質(zhì)分泌減量劑可同多種抗生素混合用于殺滅多種抗生素耐藥菌。本發(fā)明可用于從化學合成物庫、天然產(chǎn)物庫(微生物發(fā)酵物、中草藥和海洋生物提取物)中篩選蛋白質(zhì)分泌減量劑，具有操作簡便、樣品用量小和篩選通量高等優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/18GK1412319SQ01128969
公開日2003年4月23日 申請日期2001年10月18日 優(yōu)先權日2001年10月18日
發(fā)明者官家發(fā), 范成英, 廖連華 申請人:中國科學院成都生物研究所