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整聯(lián)蛋白靶向化合物的制作方法

文檔序號:889056閱讀:852來源:國知局
專利名稱:整聯(lián)蛋白靶向化合物的制作方法
背景技術
本發(fā)明涉及整聯(lián)蛋白靶向化合物和制備及使用所述化合物的方法。有效的化學治療劑的用途因主要涉及藥物的毒性已受到某些明顯的限制。治療所需的藥物劑量經(jīng)常使患者易于受到潛在的致命感染、心臟毒性和其它的副作用。對癌生物學的不斷的深入的理解已導致更特異性的“靶向療法”。在染病細胞(例如腫瘤細胞)表面上表達的抗原形成“單克隆抗體導向藥物傳遞”途徑的基礎。然而,不幸地是,腫瘤抗原由于藥物抗性經(jīng)常向下調(diào)節(jié)這限制了“單克隆抗體導向藥物傳遞”途徑的有效性。另一方面,在腫瘤內(nèi)皮細胞表面上表達的靶向分子易于接近在血液中循環(huán)的靶向分子。另外,與腫瘤細胞相反,腫瘤內(nèi)皮細胞遺傳穩(wěn)定并且由于藥物抗性不可能向下調(diào)節(jié)。因此,在腫瘤內(nèi)皮細胞表面上表達的分子似乎為“導向藥物傳遞”的合適的受體。
本發(fā)明通過提供靶向表達整聯(lián)蛋白的細胞的新化合物解決本領域的問題。這樣的化合物在癌癥和其它的疾病中具有診斷和治療用途。
本發(fā)明簡述本發(fā)明涉及含至少一個通過接頭(linker)共價連接于至少一個功能成分的整聯(lián)蛋白靶向成分的靶向化合物,其中所述整聯(lián)蛋白靶向成分選自下面的一組,包括(a)RGD肽模擬物,和(b)非-RGD肽、肽模擬物、或者有機分子整聯(lián)蛋白激動劑或者拮抗劑。
在某些實施方案中,整聯(lián)蛋白靶向成分對整聯(lián)蛋白例如αvβ3或者αvβ5是特異性的。優(yōu)選的RGD肽模擬物的核心結構被公開用于具體的靶向化合物實施方案。
本發(fā)明的整聯(lián)蛋白靶向化合物具有超過所述成分自身的多種益處。例如,功能成分一般可以延長較小體積的靶向成分在體內(nèi)的半衰期。通過加入由功能成分例如抗體提供的效應分子功能,也可以改善整聯(lián)蛋白靶向成分的生物學效價或者其它的生物學特性。另外,整聯(lián)蛋白靶向成分,通過連接于功能成分提供的其增加的體積,可以促使靶向制劑在新的載荷量下功能化。
也提供產(chǎn)生本發(fā)明的整聯(lián)蛋白靶向化合物的方法。在一個實施方案中,制備整聯(lián)蛋白靶向成分-接頭化合物,該化合物包含整聯(lián)蛋白靶向成分和包括與功能成分的易于反應的部分共價反應的反應基團的接頭。在另一種方法中,制備功能成分-接頭化合物,該化合物包括功能成分和與整聯(lián)蛋白靶向成分的易于反應的部分共價反應的反應基團的接頭。在另一種方法中,靶向成分和功能成分連接于一個含反應基團的接頭或者具有易敏部分的接頭,以便當兩個接頭共價結合時形成靶向化合物。
另外提供用于使整聯(lián)蛋白靶向成分共價連接于功能成分的整聯(lián)蛋白靶向成分-接頭化合物和功能成分-接頭化合物。在某些實施方案中,接頭包括用于共價連接于其它成分的反應基團。在某些實施方案中,接頭反應基團為酮、二酮、β-內(nèi)酰胺、琥珀酰亞胺活性酯、鹵代酮、內(nèi)酯、酸酐、環(huán)氧化物、醛或者馬來酰亞胺。整聯(lián)蛋白靶向成分-接頭化合物和功能成分-接頭化合物的各種化學特征被描述。在一個實施方案中,接頭具有通式X-Y-Z,其中X為含C、H、N、O、P、S、Si、F、Cl、Br和I中的任一種的原子或其鹽的線性或者分支連接鏈,并且包含介于2-100單元之間的重復的醚單元;Y為任選的且為單一的或者稠合的5或者6元高-(homo-)或者雜碳環(huán)的飽和或不飽和的定位于Z的1-20個原子的環(huán);且Z為使一個或者更多個靶向制劑共價連接于易敏部分例如反應性氨基酸側鏈的反應基團。當在靶向化合物中包含多個成分時,靶向成分或者功能成分可以連接于X或者Y或連接于X和Y。
另外也提供使功能成分傳遞至與整聯(lián)蛋白相關的細胞、單個組織的方法。方法包括給予個體本發(fā)明的整聯(lián)蛋白靶向化合物。在本發(fā)明的某些實施方案中,功能成分為包括功能成分的治療劑。
另外提供治療或者預防與個體內(nèi)與整聯(lián)蛋白有關的疾病或病癥的方法。方法包括給予個體治療有效量的本發(fā)明整聯(lián)蛋白靶向化合物,它包括為治療劑的功能成分。疾病或病癥對治療劑是易敏的,以有效減少或者預防與疾病或病癥有關的癥狀。在方法的某些實施方案中,疾病或病癥包括在新生血管形成、骨代謝、炎癥或者細胞生長中的缺陷。
本發(fā)明另外提供藥用組合物或者藥物,它們包含本發(fā)明的整聯(lián)蛋白靶向化合物和藥學上可接受的載體。
圖的簡述

圖1顯示小圖A-E為RGD肽模擬物而小圖F為RGD肽的示例性的整聯(lián)蛋白靶向制劑。核心結構來源如下美國專利6335330號(小圖A)、美國專利5693636號(小圖B)、美國專利6040311號(小圖C)和美國專利6001117號(小圖E)。
圖2為顯示與靶向制劑有關的通用接頭設計(小圖A)和具體實施方案(小圖B;SCS-873)。
圖3顯示具有分支接頭和兩個相同靶向制劑的靶向制劑-接頭化合物的實施方案的通用圖式(小圖A)以及小圖B(整聯(lián)蛋白靶向制劑二酮接頭;化合物26)和小圖C(整聯(lián)蛋白靶向制劑二酮接頭;化合物27)的具體實施方案。分支點為接頭的連接鏈部分。
圖4顯示具有分支接頭和兩個不同靶向制劑的靶向制劑-接頭化合物的實施方案的通用圖式(小圖A)以及小圖B(整聯(lián)蛋白靶向和葉酸靶向制劑二酮接頭;化合物28)的具體實施方案。分支點為接頭的連接鏈部分。T1為整聯(lián)蛋白靶向成分,而T2為葉酸受體靶向成分。
圖5顯示具有分支接頭和兩個不同靶向制劑的靶向制劑-接頭化合物的實施方案的的通用圖式(小圖A)以及小圖B(整聯(lián)蛋白靶向制劑二酮接頭;化合物29)的具體實施方案。分支點為接頭的識別基團部分。
圖6顯示接頭反應基團的結構。結構A-C與反應親核基團(例如賴氨酸或者半胱氨酸側鏈)在抗體結合位點形成可逆共價鍵(結構A可以形成不可逆共價鍵X為N且如果R1和R3形成環(huán)狀結構的一部分)。R1和R2和R3在結構A-C中表示取代基,所述取代基可以為C、H、N、O、P、S、Si、鹵素(F、Cl、Br、I)或其鹽。X為N、C、Si或者任何其它的雜原子。這些取代基也可以包括基團例如烷基、鏈烯基、炔基、氧代烷基、氧代鏈烯基、氧代炔基、氨基烷基、氨基鏈烯基、氨基炔基、磺基烷基、磺基鏈烯基或磺基炔基、磷酸烷基、磷酸鏈烯基、磷酸炔基。如在結構B和C中所圖示說明的,R2和R3可以為環(huán)狀,而X可以為雜原子。結構D-G與反應親核基團(例如賴氨酸或者半胱氨酸側鏈)在抗體的結合位點形成不可逆共價鍵。在這些結構中,R1和R2表示C、O、N、鹵化物和離去基團例如甲磺?;蚣妆交酋;?。
圖7顯示適于用抗體的活性氨基酸側鏈反應修飾的各種親電試劑。關鍵(A)?;?內(nèi)酰胺;(B)簡單二酮;(C)琥珀酰亞胺活性酯;(D)馬來酰亞胺;(E)具有接頭的鹵代乙酰胺;(F)鹵代酮;(G)環(huán)己基二酮;及(H)醛。R指可以包含靶向制劑、接頭或者抗體的其它的結構,而X指鹵素。
圖8顯示接頭識別基團(Y)的結構,位于反應基團部分與接頭的連接鏈部分之間。小圖A顯示接頭中識別基團Y的關系(參見圖2)。小圖B-D顯示Y至Z的距離,環(huán)上的取代基和環(huán)成員原子。
圖9顯示接頭連接鏈(X)的結構,如在小圖A中所示,其一端直接連接于靶向制劑(參見圖2)。取代基R2-R4可為C、H、N、O、P、S、Si、鹵素(F、Cl、Br、I)或其鹽,并且可以包括基團例如烷基、鏈烯基、炔基、氧代烷基、氧代鏈烯基、氧代炔基、氨基烷基、氨基鏈烯基、氨基炔基、磺基烷基、磺基鏈烯基、磺基炔基、磷酸烷基、磷酸鏈烯基、磷酸炔基以及碳環(huán)或者雜環(huán)單或者稠和的飽和或者不飽和環(huán)結構。在結構B和C中的連接鏈,n、r或者m為1-100。在結構D和E中,n為1、2、4或者更優(yōu)選為3。
圖10顯示流程1,用于SCS-873的胺前體、靶向制劑3或者SCS-胺的合成流程,關鍵(a)BBr3,CH2Cl2,-20℃,2h;(b)DMF,室溫-80℃,3h;(c)BnCOCl,飽和NaHCO3水溶液,乙醚;(d)TBDPSiCl,咪唑,DMF,16h;(e)Pd(OAc)2,(o-tol)3P,i-Pr2EtN,CH3CH2CN,回流,3h;(f)20%(w/w)Pd-C(10%),H2,EtOH-AcOH(1∶1),36h;(g)TBAF,THF,室溫,1h;(h)DEAD,PPh3,THF-苯(3∶1),16h;(i)20%(w/w)Pd-C(10%),環(huán)己烯-i-PrOH(1∶1),90℃,12h;(j)i.2NNaOH水溶液,MeOH-THF(1∶1),16h,ii.TFAA,苯甲醚,CH2Cl2,0℃,2h。
圖11顯示流程2,一條用于制備化合物4的合成流程(R=丁氧基羧基氨基己?;?衍生物)。關鍵(a)DMF,室溫;(b)EDC,HOBT,DMF;(c)0.01M在DMSO中,130℃;(d)TFAA,苯甲醚,二氯甲烷;(e)DMF;(f)EDC,HOBT,DMF;(g)(i)步驟d,(ii)2M NaOH,MeOH-THF(1∶1)。
圖12顯示流程3,用于制備化合物SCS-873和SCS-1655的合成流程。
圖13顯示流程4,用于制備化合物SCS-864和SCS-789的合成流程,關鍵(a)Et3N,DMF,室溫,16小時。
圖14顯示兩個靶向成分借以連接到一個單一接頭上的實施方案。T1為整聯(lián)蛋白靶向成分和T2為生物素(化合物30)。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供用于呈遞給具體的整聯(lián)蛋白靶例如細胞或者組織的整聯(lián)蛋白靶向化合物。靶向成分啟動以使化合物定位于靶向部位。整聯(lián)蛋白靶向化合物含至少兩種成分靶向成分和功能成分。成分被啟動性連接,以使每一成分保留它的活性。通常,靶向成分一般通過配體/受體關系特異性結合于整聯(lián)蛋白靶。這樣的配體/受體關系是本領域熟知的。整聯(lián)蛋白靶優(yōu)選處于靶細胞或者靶組織的表面。整聯(lián)蛋白靶也可以與具體的疾病例如病理疾病有關。
優(yōu)選的靶向成分靶向于一種或者更多種整聯(lián)蛋白。靶向成分可以為整聯(lián)蛋白的激動劑或者拮抗劑或者沒有任何生物學活性結合。在一個實施方案中,整聯(lián)蛋白為αvβ3或者αvβ5。整聯(lián)蛋白為雜化二聚體跨膜糖蛋白復合物,它在細胞粘附事件和信號傳導過程中起作用。整聯(lián)蛋白αvβ3在多種細胞上表達并且已顯示介導幾種生物學有關的過程,包括使破骨細胞粘附于骨基質(zhì)、血管平滑肌細胞遷移和血管生成。整聯(lián)蛋白αvβ3拮抗劑可用于治療幾種人的疾病,包括參與新生血管形成的疾病例如類風濕性關節(jié)炎、癌癥眼部疾病等。
本發(fā)明的整聯(lián)蛋白靶向化合物的整聯(lián)蛋白靶向成分可以為約5000道爾頓或者更小的小分子有機化合物,例如藥物或者藥劑,它們是整聯(lián)蛋白拮抗劑或者激動劑。整聯(lián)蛋白激動劑或者拮抗劑也可以為蛋白質(zhì)、肽、肽模擬物、糖蛋白、蛋白聚糖、類脂、磷脂、脂多糖、糖脂、核酸、蛋白聚糖、碳水化合物等。術語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”可以相互交替使用,表示氨基酸殘基的聚合體。這些術語應用于氨基酸聚合體,其中一種或者更多種氨基酸殘基是相應的天然來源的氨基酸的合成化學類似物(例如,對甲基酪氨酸、對氯-苯丙氨酸(phenylanine)等)、以及天然來源的氨基酸聚合體。氨基酸可以以L或者D構型存在,只要保持肽的結合功能。肽可以具有可變化的長度,但一般長度介于4-200個氨基酸之間。肽可以是環(huán)狀,肽內(nèi)部在兩個非-相鄰氨基酸之間具有分子內(nèi)鍵,例如主鏈-主鏈、側鏈-主鏈和側鏈-側鏈環(huán)合。通過本領域熟知的方法可以制備環(huán)肽。參見美國專利第6013625號。
整聯(lián)蛋白靶向成分不為抗體,盡管靶向化合物可以包括作為功能成分的抗體并且這樣的抗體可以具有靶向能力。如果這樣的抗體具有整聯(lián)蛋白靶向能力,那么靶向化合物應包括整聯(lián)蛋白特異性的非-抗體成分。
如在此使用的,“Arg-Gly-Asp肽”或者“RGD肽”打算指具有一種或者更多種含Arg-Gly-Asp序列的肽,此序列可以作為“Arg-Gly-Asp受體家族”例如整聯(lián)蛋白的受體結合位點起作用。包括α和β亞基的整聯(lián)蛋白包括各種類型,包括α1β1、α2β1、α3β1、α4β1、α5β1、α6β1、α7β1、α8β1、α9β1、α1β1、α6β4、α4β7、αDβ2、αDβ2、αLβ2、αMβ2、αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、αxβ2、αIIbβ3、αIELbβ7等。序列RGD以幾種基質(zhì)蛋白質(zhì)存在并且為細胞通過整聯(lián)蛋白結合于基質(zhì)的靶。血小板含大量的蛋白GP IIb/IIIa的RGD-細胞表面受體,其通過與其它的血小板和損傷血管的內(nèi)皮細胞表面相互作用,對冠狀動脈血栓形成的發(fā)展負主要責任。術語RGD肽也包括具有為RGD肽的功能等價物(例如RLD或者KGD)的氨基酸的肽,前提是它們與相同的RGD受體相互作用。采用自動肽合成儀,例如由Applied Biosystems公司(Foster City,California)制造的那些自動肽合成儀,通過本領域熟知的方法可以從氨基酸合成含RGD序列的肽。
在其它的實施方案中,本發(fā)明的靶向化合物的整聯(lián)蛋白靶向成分可以為非-RGD肽激動劑或者拮抗劑或其肽模擬物。如在此使用的,“非-RGD肽”指為結合其配體(例如纖連蛋白、玻連蛋白、層粘連蛋白、膠原蛋白等),但涉及RGD結合位點的整聯(lián)蛋白的拮抗劑或者激動劑的肽。這樣的非-RGD整聯(lián)蛋白靶向化合物對αvβ3(參見例如美國專利第5767071號和5780426號)以及對其它的整聯(lián)蛋白例如α4β1(VLA-4)、α4β7(參見例如美國專利第6365619號;Chang等,Bioorganic&Medicinal Chem Lett,12159-163(2002);Lin等,Bioorganic&Medicinal Chem Lett,12133-136(2002))等是已知的。
在一個實施方案中,整聯(lián)蛋白靶向成分為肽模擬物激動劑或者拮抗劑,其優(yōu)選為RGD肽或者非-RGD肽的肽模擬物激動劑或者拮抗劑。如在此使用的,術語“肽模擬物”為含有能夠模似或者拮抗天然母體肽的生物學作用的非-肽結構元件的化合物。RGD肽的肽模擬物為保留RGD氨基酸序列的類似肽鏈藥效團的有機分子,但在結合位點序列中缺乏氨基酸或者肽鍵。同樣地,非-RGD肽的肽模擬物為保留類似肽鏈藥效團的非-RGD結合位點序列的有機分子,但在結合位點序列中缺乏氨基酸或者肽鍵。“藥效團”為特殊的三維排列的官能團,其需要化合物產(chǎn)生特殊的應答或者具有所需的活性。術語“RGD肽模擬物”意指包括含由有機/非-肽結構承載的RGD藥效團的分子的化合物。應該理解,RGD肽模擬物(或者非-RGD肽模擬物)可以為更大分子的一部分,其本身包括通過肽鍵連接的常規(guī)或者修飾的氨基酸。
RGD肽模擬物是本領域熟知的,并已按整聯(lián)蛋白例如GPIIb/IIIa、αvβ3和αvβ5描述(參見例如Miller等,J.Med.Chem.2000,4322-26和國際專利申請書WO 0110867、WO 9915178、WO9915170、WO 9815278、WO 9814192、WO 0035887、WO 9906049、WO 9724119和WO 9600730;也參見Kumar等,Cancer Res.612232-2238(2000))。許多這樣的化合物對一種以上的整聯(lián)蛋白是特異性的。RGD肽模擬物一般基于核心或者模板(也稱作“纖連蛋白受體拮抗劑模板”),它通過核心一端的酸性基團和另一端的堿性基團的間隔基連接。酸性基團通常為羧酸官能團而堿性基團一般為含N部分例如脒或者胍。通常,核心結構加入酸性部分與堿性氮部分之間的一種剛性間距的形式,并且含一種或者更多種環(huán)狀結構(例如,吡啶、吲唑等)或者酰胺鍵,以用于這一目的。對纖連蛋白受體拮抗劑,RGD肽模擬物的酸性基團與堿性基團的氮之間通常存在約12-15個,更優(yōu)選13或者14個,插入的共價鍵存在(借助最短的分子內(nèi)途徑)。對玻連蛋白受體拮抗劑而言,酸性部分與堿性部分之間插入的共價鍵數(shù)目通常更少,為2-5個,優(yōu)選3或者4個。可以選擇具體的核心以得到纖連蛋白拮抗劑模板的酸性部分與吡啶的氮原子之間的合適的間距。通常,纖連蛋白拮抗劑在酸性部分(例如放出質(zhì)子或者接受電子對的原子)與堿性部分(例如接受質(zhì)子或者給予電子對)之間應具有約16埃(1.6nm)的分子內(nèi)距離,而玻連蛋白拮抗劑在酸性與堿性中心之間應具有約14埃(1.4nm)的分子內(nèi)距離。在美國專利第6159964號中可以發(fā)現(xiàn)自纖連蛋白受體模擬物轉變?yōu)槔w連蛋白受體模擬物的另外的描述。
肽模擬物RGD核心可以包括含0-6個雙鍵和含0-6個選自N、O和S的雜原子的5-11元芳族或者非芳族單-或者多環(huán)系統(tǒng)。環(huán)系統(tǒng)可為未取代的或者可以在碳或者氮原子上被取代。具有用于玻連蛋白結合的合適的取代基的優(yōu)選核心結構包括單環(huán)和雙環(huán)基團,例如在WO 98/14192中描述的苯并氮雜、在U.S.6239168號中描述的苯并二氮雜和在U.S.6008213中描述的稠合三環(huán)。
美國專利號6159964含該文件的表1中的參考文獻的廣泛條目,其公開了RGD肽模擬物核心結構(稱作纖維蛋白原模板),后者可以用于制備RGD肽模擬物。優(yōu)選的玻連蛋白RGD和纖連蛋白RGD肽模擬物在以下美國專利號中公開6,335,330;5,977,101;6,088,213;6,069,158;6,191,304;6,239,138;6,159,964;6,117,910;6,117,866;6,008,214;6,127,359;5,939,412;5,693,636;6,403,578;6,387,895;6,268,378;6,218,387;6,207,663;6,011,045;5,990,145;6,399,620;6,322,770;6,017,925;5,981,546;5,952,341;6,413,955;6,340,679;6313,119;6,268,378;6,211,184;6,066,648;5,843,906;6,251,944;5,952,381;5,852,210;5,811,441;6,114,328;5,849,736;5,446,056;5,756,441;6,028,087;6,037,343;5,795,893;5,726,192;5,741,804;5,470,849;6,319,937;6,172,256;5,773,644;6,028,223;6,232,308;6,322,770;5,760,028。
示例性的RGD肽模擬物整聯(lián)蛋白靶向制劑以下表示為化合物1、2和3,并且可以用于制備本發(fā)明的整聯(lián)蛋白靶向化合物。在這三個化合物中,接頭如對七元環(huán)的氮指明的那樣連接。其它的RGD肽模擬物整聯(lián)蛋白靶向制劑包括化合物31,其中P和L為碳或者氮。接頭可以為R1或者R2,而R3基團包括堿基例如-NH基團。在某些實施方案中,R3基團如在結構1、2或者3中所示。在某些實施方案中,R3基團包括雜環(huán)基,例如苯并咪唑、咪唑、吡啶基等。在某些這樣的實施方案中,R3為烷氧基,例如丙氧基等,其由被烷基氨基例如甲基氨基等取代的雜烴基(heterocarbyl)取代,而在其它的實施方案中,R3為烷氧基,例如丙氧基等,由雜環(huán)基氨基取代,例如由吡啶基氨基等例如2-吡啶基氨基取代。在其它的實施方案中,R3為式-C(=O)Rb的基團,其中Rb選自-N(烷基)-烷基-雜環(huán)基,例如-N(Me)-CH2-苯并咪唑基等。
在圖1中顯示了其它的示例性整聯(lián)蛋白肽模擬物靶向制劑和肽靶向制劑。接頭可為R1、R2、R3中的任一個,其中R4可以是接頭或者可水解基團,例如烷基、鏈烯基、炔基、氧代烷基、氧代鏈烯基、氧代炔基、氨基烷基、氨基鏈烯基、氨基炔基、磺基烷基、磺基鏈烯基或磺基炔基、磷酸烷基、磷酸鏈烯基、磷酸炔基等。本領域技術人員應易于意識到其它的整聯(lián)蛋白激動劑和拮抗劑模擬物(mimetics)也可以用于本發(fā)明的靶向化合物。
本發(fā)明的靶向化合物可含一個以上的靶向成分。在這樣的實施方案中,靶向成分之一靶向如上公開的整聯(lián)蛋白。第二個靶向成分可靶向另一個實體。示例性的這樣的實體為趨化因子受體例如CCR5、白細胞介素或者細胞因子受體、維生素受體例如葉酸受體、癌癥標記物例如前列腺特異性抗原、癌胚抗原、HER-2、病毒標記物例如HIV gp41、或者肽激素受體。線性或者分支接頭可以用于制備雙重制劑靶向化合物。在圖3-5中顯示示例性的分支接頭設計。
以下顯示一個這樣的示例性雙重靶向化合物(化合物32),其中化合物靶向整聯(lián)蛋白和葉酸受體。在圖14中顯示另一個使用單一線性接頭并靶向整聯(lián)蛋白及抗生物素蛋白的雙重靶向化合物(化合物30)?;衔?0具有比在其它的實施例中更短的接頭,它具有幾種用途。例如,化合物30可與可檢測的標記的抗生物素蛋白或者鏈霉抗生物素蛋白一起用于受試細胞以表達與T1反應的整聯(lián)蛋白靶。在另一個實施方案中,化合物30可以與用合適的治療劑或者造影劑標記的抗生物素蛋白或者鏈霉抗生物素蛋白一起體內(nèi)給予。
如在此描述的,靶向成分連接于功能成分,其中它可以具有一種或者更多種生物活性,每一活性特征在于可檢測對細胞、器官或者有機體的功能的生物作用。然而,靶向化合物可以為沒有生物學活性的純結合的化合物。在靶向化合物具有功能活性的這一情況下,化合物應包括區(qū)別于靶向成分的功能成分。
靶向化合物的功能成分可以為對與整聯(lián)蛋白有關的細胞或者組織具有所需的生物學活性的任何結構。在某些實施方案中,功能成分不是含或者不含相關金屬離子例如放射金屬離子的金屬螯合結構。在某些實施方案中,功能成分不是類脂。功能成分可以包括本領域熟知的許多生物學活性結構中的任何一種。適于作為靶向化合物的功能成分的生物制劑包括(但不限于)小分子藥物(約5000道爾頓或者更小的藥用有機化合物)、有機分子、蛋白質(zhì)、肽、肽模擬物、糖蛋白、蛋白聚糖、類脂、磷脂、脂多糖、糖脂、核酸、蛋白聚糖、碳水化合物等。在某些實施方案中,生物制劑功能成分可以為抗腫瘤劑、抗微生物劑、激素、效應分子等。合適的功能成分包括熟知的治療化合物例如抗腫瘤劑,包括紫杉醇、柔紅霉素、多柔比星、去甲柔紅霉素、4’-表阿霉素、4-去甲氧基道諾霉素、11-脫氧柔紅霉素、13-脫氧柔紅霉素、阿霉素-14-苯甲酸酯、阿霉素-14-辛酸酯、阿霉素-14-萘乙酸酯、長春堿、長春新堿、絲裂霉素C、N-甲基絲裂霉素C、博來霉素A2、二脫氮雜四氫葉酸、氨基喋呤、甲氨喋呤、秋水仙素和順鉑等。合適的抗微生物劑功能成分包括氨基糖苷,包括慶大霉素、抗病毒化合物例如利福平、3’-疊氮基-3’-脫氧胸苷(AZT)和阿昔洛韋、抗真菌藥例如唑系包括氟康唑、多烯類大環(huán)內(nèi)酯類例如兩性霉素B和克念菌素、抗寄生蟲化合物例如銻劑等。合適的激素功能成分可包括毒素例如白喉毒素、細胞因子例如CSF、GSF、GMCSF、TNF、促紅細胞生成素、免疫調(diào)節(jié)劑或者細胞因子例如干擾素或者白介素、神經(jīng)肽、生殖激素例如HGH、FSH或者LH、甲狀腺激素、神經(jīng)遞質(zhì)例如乙酰膽堿、激素受體例如雌激素受體。合適的功能成分也包括非甾體抗炎藥,例如吲哚美辛、乙酰水楊酸、布洛芬、舒林酸、吡羅昔康和萘普生及麻醉藥或者鎮(zhèn)痛藥。在某些實施方案中,功能成分不為放射性同位素。
功能成分可以為天然來源或者合成的并且在其天然狀態(tài)下可以是生物學活性的,它們可以在例如靶細胞的表面上起作用或者可被轉運到靶細胞中以便在細胞內(nèi)起作用。
功能成分也可以為在此使用的“抗體”,包括免疫球蛋白,它們?yōu)锽細胞及其變體以及T細胞受體(TcR)的產(chǎn)物,TcR為T細胞及其變體的產(chǎn)物。免疫球蛋白為含一種或者更多種基本上由免疫球蛋白κ、λ、α、γ、δ、ε、μ和恒定區(qū)基因以及無數(shù)免疫球蛋白可變區(qū)基因編碼的多肽的蛋白。輕鏈分類為κ或者λ。重鏈歸為γ、μ、α、δ或者ε類,后者依次分別定義為免疫球蛋白種類,IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。重鏈的亞類也是已知的。例如,人體內(nèi)的IgG重鏈可以為IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亞類的任一種。
已知典型的免疫球蛋白結構單位包含四聚體。每一四聚體由兩個相同對的多肽鏈組成,每對具有一個“輕鏈”(約25kD)和一個“重鏈”(約50-70kD)。每一鏈的N-末端限定約100-110個或者更多個主要擔負抗原識別的氨基酸的可變區(qū),術語可變輕鏈(VL)和可變重鏈(VH)分別指這些輕鏈和重鏈。
抗體作為全長完整抗體存在或者作為許多由多種肽酶或者化學物消化產(chǎn)生的充分鑒定的片段存在。因此,例如,胃蛋白酶在鉸鏈區(qū)的二硫鍵下消化抗體以產(chǎn)生F(ab’)2,一種Fab二聚體,其本身為通過二硫鍵連接于VH-CH1的輕鏈。在溫和的條件下可以還原F(ab’)2以斷裂鉸鏈區(qū)的二硫鍵由此將F(ab’)2二聚體轉變?yōu)镕ab’單體。Fab’單體基本為帶有鉸鏈區(qū)部分的Fab片段(參見,F(xiàn)undamentalImmunology,W.E.Paul編輯,Raven Press,N.Y.(1993),用于更詳細地描述其它抗體片段)。雖然按照完整抗體消化定義各種抗體片段,本領域技術人員仍應意識到可以經(jīng)化學重新合成或者采用重組DNA方法學合成各種抗體片段的任一種。因此,如在此使用的術語抗體也包括由整個抗體修飾或重新合成產(chǎn)生的抗體片段或者通過采用重組DNA方法學得到的抗體和片段。
T細胞受體(TcR)為由α或β鏈組成或(在少數(shù)T細胞上)由γ或者δ鏈組成的二硫鍵合的雜化二聚體(heterodimer)。兩條鏈一般以裝配抗體鉸鏈區(qū)的氨基酸的較短延伸的序列段(stretch)恰好在T細胞質(zhì)膜的外面被二硫鍵合。每一TcR鏈由一個抗體樣可變區(qū)(Vα或Vβ)和一個恒定區(qū)(Cα或Cβ)組成。全長TcR具有約95kDa的分子量,帶有在35-47kDa之間變化的各條鏈。受體的部分也包括在TCR含義中,例如采用本領域熟知的方法可生產(chǎn)的作為可溶性蛋白的這一受體的可變區(qū)。例如,美國專利6080840號描述了通過把TcR的細胞內(nèi)結構域剪接至Thy-1的糖基磷脂酰肌醇(GPI)膜錨序列制備的可溶性T細胞受體(TcR)。在CD3不存在下,這個分子表達在細胞表面上并且能夠通過用磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(PI-PLC)從膜中被剪切?;救缭诿绹鴮@?216132號所述,通過使TcR可變區(qū)與抗體重鏈CH2或CH3結構域偶合,或者通過Schusta等Nature Biotech.18,754-759(2000)或者Holler等Proc.Natl.Acad.Sci(USA)975387-5392(2000)描述的可溶性TcR單鏈,也可以制備可溶性TcR。TcR“抗體”作為可溶性產(chǎn)物可以代替用于制備本發(fā)明化合物的抗體。采用以上對抗體討論的相同的方法,根據(jù)CDR區(qū)和其它的構架殘基可以鑒定TcR的結合位點。
重組抗體可以為常規(guī)全長抗體,自蛋白水解消化的已知抗體片段、獨特的抗體片段例如Fv或者單鏈Fv(scFv),缺失結構域的抗體等。片段可以包含結構域或者伴有盡可能少的一個或者幾個氨基酸缺失或者突變的多肽,而更廣泛的缺失是可能的,例如缺失一個或者幾個結構域。
Fv抗體為大約50Kd大小并且包含輕鏈和重鏈的可變區(qū)。單鏈Fv(“scFv”)多肽為共價連接的VH∷VL雜化二聚體,它可以自包括VH-和VL-編碼的序列在內(nèi)的核酸或者直接加入或者通過肽編碼的接頭連接而表達。參見Huston等(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 855879-5883。使天然聚集的但自抗體V區(qū)化學分離的輕和重多肽鏈轉變?yōu)檎郫B為三維結構的scFv分子的各種結構基本上與抗原-結合位點的結構類似。參見美國專利第5091513、5132405和4956778號。
為抗體的示例性功能成分為一個識別和結合靶向成分的靶的物質(zhì)。當靶為整聯(lián)蛋白時,示例性的和優(yōu)選的此類抗體為LM609并且其人源化形式已知為Vitaxin(參見例如公開WO 89/05155和WO01/30393)。
另一類可以摻入本發(fā)明的靶向化合物的抗體為在結合位點帶有活性氨基酸側鏈的抗體。結合位點指抗體分子參與抗原結合的部分。抗原結合位點由重(“H”)和輕(“L”)鏈的N-末端可變(“V”)區(qū)的氨基酸殘基形成。抗體可變區(qū)含三個稱作“高變區(qū)”或者稱作“互補性決定區(qū)”(CDRs)的高度趨異性序列段,它們在稱為“構架區(qū)”(“FRs”)的更保守的側翼區(qū)的序列段之間插入。在抗體分子中,輕鏈的三個高變區(qū)(LCDR1、LCDR2和LCDR3)和重鏈的三個高變區(qū)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)在三維空間彼此相對排列以形成抗原結合表面或者袋(pocket)。因此,抗體結合位點表示組成抗體CDRs的氨基酸和組成結合位點袋的任何構架殘基。
采用本領域熟知的方法,可測定在組成結合位點的具體抗體中氨基酸殘基的同一性。例如,抗體CDRs可被鑒定為最初由Kabat等(參見,“免疫學問題的蛋白質(zhì)序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)”,E.Kabat,U.S.Department of Health andHuman Services;Johnson,G and Wu,TT(2001),Kabat數(shù)據(jù)庫及其應用未來方向(Kabat Database and its applicationsfuture directiohs).Nucleic Acids Research,29205-206;http://immuno.bme.nwa.edu)限定的高變區(qū)。也可以把CDRs的位置鑒定為最初由Chothia和其它人描述的結構環(huán)狀(loop)結構(參見Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196,901(1987),Chothia等,Nature 342,877(1989),和Tramontano等,J.Mol.Biol.215,175(1990))。其它的方法包括“AbM定義”,該方法為Kabat和Chothia之間的折衷辦法并且采用Oxford Molecular’sAbM抗體建模軟件(now Accelrys)或者由Macallum等(“抗體抗原相互作用接觸分析和結合位點拓撲學(Antibody-antigen interactionscontact analysis and binding site topography)”,J Mol Biol.1996 Oct 11;262(5)732-45)描述的衍化。以下圖表基于多種已知的定義鑒定CDRs。
LoopKabat AbMChothia接觸---------------- ------------- -----------------------L1 L24--L34 L24--L34 L24--L34 L30--L36L2 L50--L56 L50--L56 L50--L56 L46--L55L3 L89--L97 L89--L97 L89--L97 L89--L96H1 H31--H35B H26--H35B H26--H32..34 H30--H35B(Kabat編號)H1 H31--H35 H26--H35 H26--H32 H30--H35(Chothia編號)H2 H50--H65 H50--H58 H52--H56 H47--H58H3 H95--H102 H95--H102 H95--H102 H93--H101一般指南如下,借此人們可以鑒定僅來自序列的抗體中的CDRsLCDR1起始-約殘基24。
之前的殘基總是Cys。
之后的殘基總是Trp。通常TRP之后跟隨TYR-GLN,但是也可以后接LEU-GLN、PHE-GLN,或者TYR-LEU。
長度為10-17個殘基。
LCDR2起始-L1末端之后16個殘基。
之前的序列一般為ILE-TYR,但是也可以為VAL-TYR、ILE-LYS,或者ILE-PHE。
長度一般為7個殘基。
LCDR3起始為L2末端之后33個殘基。
之前的殘基為Cys。
之后的序列為PHE-GLY-X-GLY。
長度一般為7-11個殘基。
HCDR1起始-在約殘基26(CYS之后4個殘基)[Chothia/AbM定義]隨后Kabat定義起始5個殘基。
之前的序列為CYS-X-X-X。
之后的殘基為TRP,一般之后為VAL,但之后也可以為ILE或者ALA。
長度為在AbM定義下的10-12個殘基,而Chothia定義排除最后4個殘基。
HCDR2起始-以CDR-H1的Kabat/AbM定義的末端之后的15個殘基。
之前的序列一般為LEU-GLU-TRP-ILE-GLY(SEQ ID NO1)但許多變異是可能的。
之后的序列為LYS/ARG-LEU/ILE/VAL/PHE/THR/ALA-THR/SER/ILE/ALA。
長度為在Kabat定義下的16-19個殘基(較早時候AbM定義末端7個殘基)。
HCDR3起始-CDR-H2末端之后的33個殘基(CYS后的兩個殘基)。
之前的序列為CYS-X-X(一般為CYS-ALA-ARG)。
之后的序列為TRP-GLY-X-GLY,長度為3-25個殘基。
采用本領域熟知的方法例如分子模造(modeling)和X-射線結晶圖形學,可以測定具體抗體中的氨基酸殘基的同一性,這些殘基在CDRs外部,盡管如此,卻通過具有為結合位點的襯部分的側鏈組成結合位點的的部分(即,可獲得通過結合位點的連接)。參見例如Riechmann等,(1988)Nature,332323-327。醛縮酶抗體小鼠mAb 38C2(其具有接近但處于HCDR3外部的活性賴氨酸)為這樣抗體的實例。
例如,當殘基由存在于首先被鑒定以制備抗體的淋巴細胞中的核苷酸編碼時,抗體結合位點的反應性殘基與抗體可以為天然相關的?;蛘撸ㄟ^故意突變可以產(chǎn)生氨基酸殘基,以編碼特定的殘基(參見例如Meares等的WO 01/22922)。在另一種方法中,氨基酸殘基或者其活性元素(例如親核氨基或者巰基)可以連接在抗體結合位點中的氨基酸殘基。因此,在此使用的“通過在抗體結合位點中的氨基酸殘基”出現(xiàn)的與抗體的共價連接意指可以直接對抗體結合位點的氨基酸殘基進行連接或者間接通過連接抗體結合位點的氨基酸殘基的側鏈的化學部分進行連接。
為蛋白的功能成分可以通過蛋白中的反應性側鏈連接于靶向成分。反應性側鏈可以存在或者通過突變產(chǎn)生。賴氨酸中的反應性側鏈(ε氨基)可以共價連接于包括以下的接頭酮、二酮、β-內(nèi)酰胺、活性酯鹵代酮、內(nèi)酯、酸酐、馬來酰亞胺、環(huán)氧化物、醛、脒、胍、亞胺、烯胺、磷酸酯、膦酸酯、環(huán)氧化物、氮丙啶、硫代環(huán)氧化物、掩蔽或者保護的二酮(例如縮酮)、內(nèi)酰胺、鹵代酮、醛等。這樣的活性賴氨酸側鏈存在于醛縮酶抗體結合位點,例如小鼠單克隆抗體mAb38C2及其它像催化抗體以及此類抗體的合適的人源化和嵌合形式(versions)。小鼠mAb 38C2為由反應性免疫作用和機械模擬天然醛縮酶產(chǎn)生的一類新的催化抗體的原型(Barbas等,Science 278,2085-2092,1997)。通過活性賴氨酸,使用天然醛縮酶的烯胺機制,這些抗體催化羥醛和逆羥醛(retro-aldol)反應(Wagner等,Science 270,1797-1800,1995;Barbas等,Science 278,2085-2092;Zhong等,Angew.Chem.Int.第38版,3738-3741,1999;Karlstrom等,2000,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,973878-3883)。除它們在合成有機化學(例如Hoffmann.等,1998,J.Am.Chem.Soc.120,2768-2779;Sinha等,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95,14603-14608)中的多用途和效力以外,醛縮酶抗體已作為一種抗癌策略用于在體外和體內(nèi)激活喜樹堿、多柔比星和依托泊苷前藥(Shabat等,1999,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96,6925-6930,和2001,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98,7528-7533)。
催化抗體為這樣的功能成分抗體,包括醛縮酶抗體、β-內(nèi)酰胺酶抗體、酯酶抗體、酰胺酶抗體等的優(yōu)選來源。在一種方法中,用具有一個或者更多個C=O基團的接頭衍生靶向成分,優(yōu)選如醛縮酶抗體的構型。合適的此類接頭可以包括酮、二酮、β-內(nèi)酰胺、琥珀酰亞胺、鹵代酮、內(nèi)酯、酸酐、馬來酰亞胺、α-鹵代乙酰胺、環(huán)己基二酮基等(參見以上)。這樣的接頭化合物的實例示于圖2-5中。
在另一個實例中,功能成分的活性氨基酸例如抗體可以為活性半胱氨酸、絲氨酸或者酪氨酸殘基。對半胱氨酸,得到的抗體可以與含馬來酰亞胺的成分或者其它的硫醇反應基團例如碘代乙酰胺、芳基鹵化物、二巰基等形成共價鍵。如由Janda等,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)912532-2536,(1994)描述的,在硫代酯酶催化抗體中可以發(fā)現(xiàn)活性半胱氨酸。對其它的酯酶抗體,參見Wirsching等,Science 2701775-82(1995)。通過本領域熟知的方法,可以制備含活性氨基酸的功能成分,包括使氨基酸殘基突變以對活性氨基酸編碼或者使含反應基團的氨基酸側鏈經(jīng)化學衍生化。
靶向化合物的成分優(yōu)選被共價連接并且優(yōu)選與接頭或者分支接頭連接。在某些實施方案中,當抗體為功能成分時,靶向成分通過使用接頭可以共價連接于抗體結合位點。可以選擇合適的接頭以提供靶向成分與功能成分之間的足夠的距離,以使靶向成分能夠結合于它的靶向分子。當需要連接于抗體結合位點時,可以選擇合適的接頭以提供靶向成分與抗體結合位點之間的足夠的距離,以使靶向成分能夠結合于它的靶向分子。這個距離依幾個因素而定,包括例如抗體結合位點的最外面與結合位點的反應性側鏈之間的距離、靶向制劑的性質(zhì)。一般地,接頭長度應為約5-10埃(0.5-1nm)之間,10埃(1.0nm)或10埃以上為更優(yōu)選,如果氨基酸側鏈非常鄰近結合位點的最外面部分和/或靶向成分包括可以作為接頭的一部分起作用的區(qū)段,則長度約3埃(0.3nm)的更短的接頭可以是足夠的。
根據(jù)線性原子的數(shù)目也可以觀察接頭的長度(通過采用最短的途徑計算環(huán)狀部分例如芳族環(huán)等)。在這種測量下的接頭長度一般為約10-200個原子并且更通常為約30個或30個以上的原子,盡管2個或者更多個原子的較短的接頭可以是足夠的,如果活性氨基酸側鏈非常鄰近抗體結合位點的最外面部分的話。通常,帶有至少約9個原子的線性序列段的接頭是足夠的。以上用于連接抗體結合位點的接頭長度一般應用于使整聯(lián)蛋白靶向成分連接于非抗體功能成分。
其它的接頭方面的考慮包括接頭對生成的靶向化合物的以下物理或者藥動學性質(zhì)的作用例如溶解度、親脂性、親水性、疏水性、穩(wěn)定性(或多或少的穩(wěn)定性以及可計劃的降解作用)、剛性、柔性、免疫原性、結合的調(diào)節(jié)、與靶向制劑的化學適配性、摻入膠束或者脂質(zhì)體的能力等。在RGD肽模擬物靶向成分的情況下,接頭可以連接于分子核心與堿性或酸性基團之間的間隔基?;蛘呓宇^可以與核心本身相連接。
在某些實施方案中,接頭包括來自C、H、N、O、P、S、Si、鹵素(F、Cl、Br、I)的任何原子或其鹽。接頭也可以包括基團例如烷基、鏈烯基、炔基、氧代烷基、氧代鏈烯基、氧代炔基、氨基烷基、氨基鏈烯基、氨基炔基、磺基烷基、磺基鏈烯基或磺基炔基、磷酸烷基、磷酸鏈烯基、磷酸炔基以及碳環(huán)或者雜環(huán)單或者稠和的飽和或者不飽和環(huán)結構。以上基團和環(huán)的組合也可以存在于本發(fā)明的靶向化合物的接頭中。
用于本發(fā)明靶向化合物的線性接頭的實施方案的一般性設計示于圖2中。接頭包括三個結構域,認為從靶向制劑(T)起始,為連接鏈(X)、識別基團(Y)和活性基團(Z)。整聯(lián)蛋白靶向制劑-接頭化合物SCS-873示于圖2中,其接頭部分X、Y和Z被鑒定。在某些實施方案中,可以不需要識別基團。
接頭反應基團Z可以包括一個或者更多種C=O,基團被排布以形成二酮、?;?內(nèi)酰胺、活性酯、鹵代酮、環(huán)己基二酮、醛或者馬來酰亞胺。其它基團可包括內(nèi)酯、酸酐、α-鹵代乙酰胺和環(huán)氧化物??晒矁r結合于功能成分或者整聯(lián)蛋白靶向成分的活性親核基團(例如賴氨酸或者半胱氨酸側鏈)的示例性接頭親電反應基團包括酰基β-內(nèi)酰胺、簡單二酮、琥珀酰亞胺活性酯、馬來酰亞胺、帶有接頭的鹵代乙酰胺,鹵代酮、環(huán)己基二酮、醛、脒、胍、亞胺、烯胺、磷酸酯、膦酸酯、環(huán)氧化物、氮丙啶、硫代環(huán)氧化物、磺酸酯、掩蔽或者保護的二酮(例如縮酮)、內(nèi)酰胺等,掩蔽的C=O基團例如亞胺、縮酮、縮醛和任何其它已知的親電基。優(yōu)選接頭反應基團包括一種或者更多種C=O,基團被排布以形成酰基β-內(nèi)酰胺、簡單二酮、琥珀酰亞胺活性酯、馬來酰亞胺、帶有接頭的鹵代乙酰胺、鹵代酮、環(huán)己基二酮或者醛。
與功能成分或者整聯(lián)蛋白靶向成分的活性賴氨酸或半胱氨酸形成可逆共價鍵的接頭二酮反應基團示于圖6中。在結構A-C中的R1和R2和R3表示取代基,它們可以為C、H、N、O、P、S、Si、鹵素(F、Cl、Br、I)或其鹽。這些取代基也可以包括基團例如烷基、鏈烯基、炔基、氧代烷基、氧代鏈烯基、氧代炔基、氨基烷基、氨基鏈烯基、氨基炔基、磺基烷基、磺基鏈烯基或磺基炔基、磷酸烷基、磷酸鏈烯基、磷酸炔基。R2和R3可以為如在結構B和C中舉例說明的環(huán),而X可為雜原子。其它的二酮接頭反應基團作為結構B和G示于圖7中。圖7也包括其它優(yōu)選的接頭反應基團的結構。
在某些實施方案中,接頭可包括與抗體結合位點形成不可逆共價鍵的反應基團。如在圖6中的結構D-G所示,示例性的此類反應基團用于使靶向成分-接頭不可逆地連接于功能成分中的活性親核基團(例如賴氨酸或者半胱氨酸側鏈)(反之亦然)。形成不可逆共價鍵的其它的二酮接頭反應基團如結構A、C和D示于圖7中。
接頭可以任選含例如示于圖2中的位于接頭的反應基團部分與連接鏈部分之間的識別基團Y。并不希望受到任何理論的束縛,如果存在,識別基團可以起作用以合適地使反應基團定位于這樣的抗體結合位點的結合位點,以使其可與活性氨基酸側鏈反應。圖8顯示各種示例性的帶有一個或者更多個含5或者6個原子的高或者雜環(huán)結構的識別基團。更大的環(huán)結構也是可能的。
通用的接頭設計(圖2)的連接鏈X部分的各種實施方案示于圖9中。如顯示的那樣,連接鏈的長度可以隨可能的直鏈和分支鏈結構顯著性變化。
用于本發(fā)明的靶向化合物和用于制備靶向制劑-接頭化合物或者功能成分-接頭化合物的優(yōu)選接頭為具有如下所示的結構33的帶有1,3-二酮反應基團的接頭,其中n為1-100或者更多且優(yōu)選為1、2或者4,更優(yōu)選為3。在某些實施方案中,接頭為重復的聚合物例如聚乙二醇。
能夠選擇可在靶向成分中插入的接頭反應基團或者類似的此類反應基團用于與具體的功能成分鍵合。例如,經(jīng)醛縮酶抗體修飾的化學部分可以為酮、二酮、β-內(nèi)酰胺、活性酯鹵代酮、內(nèi)酯、酸酐、馬來酰亞胺、α-鹵代乙酰胺、環(huán)己基二酮、環(huán)氧化物、醛、脒、胍、亞胺、烯胺、磷酸酯、膦酸酯、環(huán)氧化物、氮丙啶、硫代環(huán)氧化物、掩蔽或者保護的二酮(例如縮酮)、內(nèi)酰胺、鹵代酮、醛等。1,3-二酮構型例如在化合物SCS-873(參見如下)或者SCS-864(參見如下)中顯示的二酮,作為經(jīng)醛縮酶抗體修飾的底物是特別優(yōu)選的。
適用于經(jīng)功能成分或者整聯(lián)蛋白靶向成分的反應性巰基共價修飾的接頭反應基團化學部分可為二硫化物、芳基鹵化物、馬來酰亞胺、α-鹵代乙酰胺、異氰酸酯、環(huán)氧化物、硫代酯、活性酯、脒、胍、亞胺、烯胺、磷酸酯、膦酸酯、環(huán)氧化物、氮丙啶、硫代環(huán)氧化物、掩蔽或者保護的二酮(例如縮酮)、內(nèi)酰胺、鹵代酮、醛等。本領域技術人員應該容易地意識到,在蛋白功能成分中的活性氨基酸側鏈可具有與靶向成分或其接頭上親核基團反應的親電基團,而在其它的實施方案中,蛋白功能基團的氨基酸側鏈中的活性親核基團與靶向成分或接頭上的親電基團反應。因此,蛋白成分側鏈可被親電試劑取代(例如圖6和7)并且這個基團可用于與靶向成分或其接頭上的親核基團(例如NH2)反應。在這個實施方案中,功能和靶向成分各自具有在每一端帶有合適的活性部分的部分接頭,以使部分接頭的兩端能形成全長接頭,由此建立完全的靶向化合物。
通過幾種方法可制備整聯(lián)蛋白靶向化合物。在一種方法中,用接頭可合成靶向成分-接頭化合物,所述接頭包括被設計用于與功能成分上的易于反應的部分共價反應的一種或者更多種反應基團。在一個優(yōu)選實施方案中,合適的活性部分可為氨基酸的側鏈。然后,在這樣的條件下,成分-接頭化合物和功能成分結合,其中接頭反應基團與功能成分形成共價鍵。在此使用的涉及化學部分的術語“易敏的(容易的)”,表示化學部分應與適配的反應基團共價結合。因此,親電基團易于與親核基團共價結合,反之亦然。
在另一種方法中,通過合成含功能成分和接頭的功能成分-接頭化合物,其中接頭包括一種或者更多種設計用于與靶向成分的易敏化學部分發(fā)生共價反應的反應基團,可以實現(xiàn)連接。靶向成分可需要被修飾以提供用于與接頭反應基團反應的合適的活性部分。在其中接頭反應基團共價連接于靶向成分的條件下,可使功能成分-接頭和靶向成分結合。
形成本發(fā)明靶向化合物的另一種方法采用雙重接頭設計。在一個實施方案中,合成靶向成分-接頭化合物,該化合物包含靶向成分和帶有反應基團的接頭。也可合成功能成分-接頭化合物,它含功能成分和接頭,后者帶有易于與第一步驟的成分-接頭的反應基團反應的化學部分。然后,在接頭共價結合,形成靶向化合物的條件下,這兩個含接頭的化合物結合。
在另一個實施方案中,合成功能成分-接頭化合物,其包含功能成分和帶有反應基團的接頭。也可制備靶向成分-接頭化合物,它含所述成分和接頭,后者帶有易于與第一步驟的抗體-接頭的反應基團反應的化學部分。然后,在接頭共價結合,形成靶向化合物的條件下,這兩個含接頭的化合物結合。
本領域熟知的各種方法可用于使接頭與靶向制劑或者抗體結合位點連接??蓞⑴c連接的示例性功能基團包括例如酯、酰胺、醚、磷酸酯、氨基、酮基、脒、胍、亞胺、烯胺、磷酸酯、膦酸酯、環(huán)氧化物、氮丙啶、硫代環(huán)氧化物、掩蔽或者保護的二酮(例如縮酮)、內(nèi)酰胺、鹵代酮、醛、硫代氨基甲酸酯、硫代酰胺、硫代酯、硫化物、二硫化物、磷酰胺、磺酰胺、脲、硫脲、氨基甲酸酯、碳酸酯、羥基酰胺等。
采用在一定的條件下不穩(wěn)定的接頭部分,可將功能成分連接于靶向成分。不穩(wěn)定鍵可以處于功能成分與接頭之間,靶向成分與接頭之間,或者處于接頭內(nèi),或者它們的組合。例如,當經(jīng)歷一定的pH時,接頭可以是不穩(wěn)定的。接頭也可為具體酶例如存在于體液中的酶的底物。因此,不穩(wěn)定接頭的具體設計可用于指導生物藥物功能成分在它到達其預定的靶時釋放。不穩(wěn)定接頭可以為可逆共價鍵。這樣的接頭可以為酸不穩(wěn)定接頭,例如有利于不同細胞內(nèi)室的酸性環(huán)境的順式-烏頭酸接頭,例如在受體介導的胞吞和溶酶體期間遇到的核內(nèi)體。參見Shen等,Biochem.Biophys.Res.Commun.(1981)1021048-1054;Yang等,J.Natl.Canc.Inst.(1988)801154-1159。在其它的實施方案中,肽間隔基臂用作接頭,以便通過肽酶例如溶酶體肽酶作用可釋放功能成分。參見例如Trouet等,Proc.Natl.Acad.Sci.(1982)79,626-629。以下顯示的(化合物34)是示例性的本發(fā)明靶向化合物,其中靶向部分為整聯(lián)蛋白拮抗劑且功能成分為前吡咯啉基(propyrrolino)多柔比星(R=肽)并且它們兩個通過pH敏感不穩(wěn)定接頭連接。
不穩(wěn)定接頭包括可逆共價鍵、pH敏感鍵(酸或堿敏感)、酶敏感鍵、降解敏感接頭、光敏感鍵等以及它們的組合。這些特征也是可被認為是不穩(wěn)定接頭類型的前藥的特征。先前已設計各種不穩(wěn)定的接頭。例如,如在美國專利第5498729號中描述的,采用具有經(jīng)水解緩慢降解的羧酸的化合物可以形成前藥。
關于這一點,功能成分可以為“前藥”,意思是功能成分在治療中是基本無活性的,但在某些修飾下變得有活性。采用本發(fā)明的抗體靶向化合物,前藥可在細胞表面或者細胞內(nèi)傳遞,在那兒它可變得有活性。在前藥方法中,自前藥的組織特異性激活可以得到位點特異性藥物傳遞,這是經(jīng)酶對組織獨特的代謝或者在更高的濃度(與其它的組織相比較)下呈現(xiàn)的結果;因此,它更有效地激活前藥。
如先前描述的,通過裂解光敏感接頭或者經(jīng)激活光敏感酶(酰基酶水解),光動力學治療可被用來激活前藥(參見美國專利第5114851和5218137號)。光動力學治療也可以用于在不需要藥物活性的部位(例如在非-靶向組織)使藥物迅速失活。共價修飾藥物以形成前藥的各種方法是本領域熟知的。
制備本發(fā)明的化合物需要簡單選擇具有預先選擇的活性的結構。在一個實施方案中,功能成分為治療制劑例如藥物。可使用任何合適的藥物。選擇治療制劑依所需的活性和本發(fā)明化合物的靶而定。當靶為整聯(lián)蛋白時,優(yōu)選的治療劑為具有直接對抗整聯(lián)蛋白的生物學活性的藥物。例如,在卡波西肉瘤(一種與癌病變的血管形成有關的癌癥)的情況下技術人員可選擇各種藥物的任一種,例如,在這一疾病中被證實療效的三種藥物紫杉醇、多柔比星和依托泊苷。一種多柔比星的衍生物、2-吡咯啉基多柔比星,比多柔比星本身的效果強500-1000倍并且它已在其它的藥物靶向策略中得到廣泛研究(最新綜述參見Schally和Nagy,Eur.J.Endocrinology 141,1-14,1999)。含整聯(lián)蛋白靶向成分的化合物與這些化合物中的任一種可用于治療卡波西肉瘤的異常血管形成。在實施例中描述了用整聯(lián)蛋白靶向成分SCS-873合成這些化合物。
本發(fā)明的整聯(lián)蛋白靶向化合物具有許多種用途。在一種方法中,通過給予靶向化合物,功能成分可以傳遞至與個體的細胞、組織或者流體大分子有關的整聯(lián)蛋白。在一個優(yōu)選方法中,功能成分為治療劑。
本發(fā)明的整聯(lián)蛋白靶向化合物對治療與整聯(lián)蛋白表達有關的病理學疾病具有特殊的用途。因此,提供治療或者預防個體體內(nèi)疾病或病癥的方法,其中所述疾病或病癥涉及整聯(lián)蛋白,所述方法包括給予個體治療有效量的含對疾病或病癥有效的治療成分的本發(fā)明靶向化合物。在一個這樣的實施方案中,病癥為癌癥。整聯(lián)蛋白表達在癌癥中的關系是本領域熟知的(參見例如美國專利第5753230和5766591號)。
本發(fā)明的整聯(lián)蛋白靶向化合物可以用于治療與為靶向的整聯(lián)蛋白有關的任何疾病或病癥。例如,已知破骨細胞上的玻連蛋白受體抑制破骨細胞的骨吸收。因此,通過給予本發(fā)明玻連蛋白靶向化合物,可以治療其中骨重吸收與病理學例如骨質(zhì)疏松癥和骨關節(jié)炎有關的疾病或病癥?;蛘?,通過增加由破骨細胞釋放的骨鈣蛋白,帶有合適的功能成分的玻連蛋白靶向化合物可被用于刺激骨形成。增加的骨生成在其中礦物化骨質(zhì)缺乏或者骨重新再造被需求,例如骨折愈合和預防骨折的疾病狀態(tài)中具有明顯的效益。導致骨結構丟失的疾病和代謝紊亂也從這樣的治療中受益。例如,甲狀旁腺機能亢進、培吉利氏病、妊娠高鈣血癥、骨轉移產(chǎn)生的溶骨病變、由于固定術或性激素缺乏引起的骨丟失、貝賽特氏癥、骨軟化、骨肥厚和骨硬化癥,可以從給予本發(fā)明的化合物中受益。
本發(fā)明的整聯(lián)蛋白靶向化合物也可以用于治療任何炎性疾病,例如類風濕性關節(jié)炎和牛皮癬,及心血管疾病,例如動脈粥樣硬化和再狹窄,它們涉及表達玻連蛋白的細胞。因此,其包含合適的功能成分的本發(fā)明的玻連蛋白靶向化合物可用于治療這些疾病。這一方法也應用于治療或者預防其它的疾病,包括(但不限于)血栓栓塞疾病、哮喘、變應性反應、成人呼吸窘迫綜合征、移植物抗宿主病、器官移植排斥、膿毒性休克、濕疹、接觸性皮炎、炎性腸道疾病和其它的自身免疫疾病。本發(fā)明的化合物也可以用于傷口愈合。
本發(fā)明的整聯(lián)蛋白靶向化合物還發(fā)現(xiàn)在治療血管生成疾病中具有用途。這樣的疾病包括異常新血管生成,其中新生血管生長是與疾病有關的病理學的原因或者歸因于它。在這樣情況下,抑制血管生成將減少疾病的有害作用。本發(fā)明化合物的其它治療靶為其特征在于新血管生成的眼疾病。這樣的眼疾病包括角膜新生血管疾病,例如角膜移植、皰疹性角膜炎、梅毒性角膜炎、翼狀胬肉和與隱性眼鏡使用有關的新血管角膜瘢。另外的眼科疾病包括老年性斑退化、先兆性眼組織胞漿菌病、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜變性、新生血管性青光眼等。
當需要新血管生長以支撐有害組織的生長時,抑制血管形成將減少血液供應于該組織,因而有助于基于血液供給需要的組織重量的減少。癌癥為這樣一個實例,其中持續(xù)需要新血管形成以使腫瘤生長并促使腫瘤轉移。因此,本發(fā)明的整聯(lián)蛋白靶向化合物可抑制腫瘤組織血管形成,由此預防腫瘤轉移和腫瘤生長。
除了治療應用以外,本發(fā)明的整聯(lián)蛋白靶向化合物也可以用于細胞或者組織例如本領域熟知的腫瘤細胞成像。因此,提供在個體體內(nèi)使細胞或者組織成像的方法,其中所述細胞或者組織表達整聯(lián)蛋白靶向分子,所述方法包括給予個體有效量的連接于合適的放射性同位素或者可檢測的標記物的整聯(lián)蛋白靶向化合物。放射性同位素或者標記物可以連接于靶向成分或者功能成分。
本發(fā)明的整聯(lián)蛋白靶向化合物可作為藥用組合物給予,其中本發(fā)明化合物與藥學上可接受的載體一起配制。因此,本發(fā)明化合物可以用于藥物的制備。本發(fā)明化合物的藥用組合物可以配制為非腸道給藥的溶液或者凍干粉末。通過加入合適的稀釋劑或者其它的藥學上可接受的載體,可以臨用前將粉末重新構成。粉劑也可以以干燥形式噴霧。液體制劑可以為緩沖、等滲水溶液。合適的稀釋劑的實例為正常的等滲鹽水,標準的5%葡萄糖水溶液或者緩沖的乙酸鈉或乙酸銨溶液。這樣的制劑特別適用于非腸道給藥,但也可用于口服給藥或者包含在用于吹入或吸入的計量吸入器或者噴霧器中。它可以需要加入賦形劑例如聚乙烯吡咯烷酮、明膠、羥基纖維素、阿拉伯膠、聚乙二醇、甘露糖醇、氯化鈉或者枸櫞酸鈉。
或者,整聯(lián)蛋白靶向化合物可以被裝膠囊、壓片或者制備成乳劑或者糖漿劑,以用于口服給藥??梢约尤胨帉W上可接受的固體或者液體載體以增強或者穩(wěn)定組合物,或者便利于組合物的制備。固體載體包括淀粉、乳糖、硫酸鈣二水合物、白土、硬脂酸鎂或者硬脂酸、滑石粉、果膠、阿拉伯膠、瓊脂或者明膠。液體載體包括糖漿、花生油、橄欖油、鹽水和水。載體也可以包括緩釋材料例如單硬脂酸甘油酯或者二硬脂酸甘油酯,單獨或與石蠟一起使用。固體載體的量可變化但優(yōu)選應介于每劑量單位約20mg-1g之間。按照常規(guī)藥學技術,包括研磨、混合、制粒和壓制,可制備藥用制劑,必要時,用于片劑形式、或者研磨、混合和填充硬明膠膠囊形式。當使用液體載體時,制劑應為糖漿、酏劑、乳劑或者含水或非水混懸劑的形式。對直腸給藥,本發(fā)明化合物可以與賦形劑例如可可脂、甘油、明膠或者聚乙二醇組合并模壓成栓劑。
本發(fā)明的整聯(lián)蛋白靶向化合物可以被配制包括其它的醫(yī)學上有用的藥物或者生物制劑。化合物也可以與用于本發(fā)明化合物涉及的疾病或病癥的其它藥物或者生物制劑聯(lián)合給予(參見美國專利第6413955號,活性成分用于骨質(zhì)疏松癥)。
如在此使用的術語“有效量”指足以提供高的足以在其接受者中產(chǎn)生有益作用的濃度的劑量。對任何具體的患者,具體的治療有效劑量水平應依各種因素而定,包括受治療的疾病、疾病的嚴重性、具體化合物的活性、給藥途徑、化合物的清除率、治療持續(xù)時間、用于與化合物聯(lián)合或者共同給予的藥物、患者的年齡、體重、性別、飲食和一般健康狀況和在醫(yī)學領域和科學領域中熟知的因素。重視各種通常的考慮以確定“治療有效量”是本領域技術人員已知的并在例如Gilman等,Goodman和Gilman’sThe Pharmacological Bases ofTherapeutics,第8版,Pergamon Press,1990;和Remington’sPharmaceutical Sciences,第17版,Mack Publishing公司,Easton,Pa.,1990中被描述。劑量水平一般處于約0.001至最多可達100mg/kg/天范圍內(nèi);通常使用約0.05至最多可達10mg/kg/天范圍內(nèi)的水平?;衔锟梢越?jīng)非腸道例如血管內(nèi)、靜脈、動脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下等給予。也可以經(jīng)口、鼻、直腸、經(jīng)皮或者通過氣溶膠吸入給藥。組合物可以作為大劑量或者緩慢輸入給予。
將靶向化合物給予具免疫能力的個體可以導致對化合物產(chǎn)生抗體。這樣的抗體可以涉及靶向成分、功能成分或者與化合物有關的任何其它的實體。通過本領域熟知的方法,例如通過將基于長鏈聚乙二醇(PEG)序列段等連接于化合物的一種或者更多種成分,可以加強這樣的化合物的免疫原性。已知長鏈PEG和其它的聚合物對它們具有掩蔽外源性抗原決定部位的能力,導致起外源性抗原決定部位作用的治療蛋白的免疫原性減少(Katre等,1990,J.Immunol.144,209-213;Francis等,1998,Int.J.Hematol.68,1-18)。值得注意的是,PEG在本發(fā)明的靶向化合物中可用作接頭,因此提供接頭功能并減少免疫原性?;蛘?,或者另外,個體可被給予免疫抑制藥物例如環(huán)孢菌素A、抗-CD3抗體等,以減少對靶向化合物將產(chǎn)生的免疫應答的可能性。
在某些實施方案中,RGD和非-RGD肽模擬物或者非-RGD肽拮抗劑或者激動劑可用于靶向脂質(zhì)體。這通過使這樣的靶向成分化學連接于能夠使靶向成分與脂質(zhì)體的類脂發(fā)生關聯(lián)的類脂部分來實現(xiàn)。通過靶向成分的幫助,那么用合適的藥物包囊化的脂質(zhì)體可在體內(nèi)更有效地靶向靶標。例如,用含多柔比星(DoxilTM)的空間定位的穩(wěn)定密封的(stealth)脂質(zhì)體治療卡波西肉瘤是已被批準的最有效的KS療法之一。這種脂質(zhì)體制劑提供超過單獨給予多柔比星的幾個優(yōu)點。除了由脂質(zhì)體制劑提供的減少心臟毒性、嘔吐、脫發(fā)、周圍神經(jīng)病變和粘膜炎以外,由于粒子大小和增強的可滲透性和滯留現(xiàn)象(Matsumura等,Cancer Res.46,6387-6392,1986)的結果(進一步得益于延長的藥物血清半衰期),DoxilTM對被動靶向腫瘤具有內(nèi)在的能力。
在此公開的活性靶向可以增大DoxilTM的被動靶向能力,因而更有效地使脂質(zhì)體的細胞毒載藥量傳遞至KS腫瘤及其血管。這樣的DoxilTM活性靶向同樣應減少臨床應答需要的劑量,從而限制非特異毒性。如先前描述的(參見例如Allen等,Adv.Drug.Deliv Rev.21,117-133),可以實現(xiàn)靶向脂質(zhì)體的給予。本發(fā)明的靶向化合物可以與其它的化合物或者療法例如放射性治療聯(lián)合使用。
應該容易地意識到,本發(fā)明的化合物不僅在人體醫(yī)學治療和診斷中而且在體外診斷、獸醫(yī)學、農(nóng)業(yè)、環(huán)境和其他的學科中發(fā)現(xiàn)有用途。通過以下實施例描述本發(fā)明的多用性,實施例闡述本發(fā)明的優(yōu)選實施方案,但不以任何方式限制權利要求或者說明書。
實施例1含共價連接于醛縮酶單克隆抗體38C2結合位點的RGD肽模擬物靶向制劑的抗體靶向化合物基于RGD肽模擬物的二酮接頭衍生物與小鼠mAb 38C2的活性賴氨酸之間的可逆共價鍵的形成,可形成整聯(lián)蛋白靶向化合物。小鼠mAb 38C2為由反應性免疫作用和機械模擬天然醛縮酶產(chǎn)生的一類新的催化抗體的原型(Barbas等,Science 278,2085-2092,1997)。采用天然醛縮酶的烯胺機制,通過活性賴氨酸,這些抗體催化羥醛和逆羥醛反應(Wagner等,Science 270,1797-1800,1995;Barbas等,Science278,2085-2092,1997;Zhong等,Angew.Chem.Int.Ed.38,3738-3741,1999)。除它們在合成有機化學中的多用性和有效性以外,醛縮酶抗體作為抗癌策略已被用于喜樹堿、多柔比星和依托泊苷前藥體內(nèi)外的活化(Shabat等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96,6925-6930,1999;Shabat等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98,7528-7533,2001)。這些抗體的另外的特征,即它們共價結合二酮的能力,在很大程度上仍未被探索。
所采用的RGD肽模擬物(參見化合物1)對人整聯(lián)蛋白具有特異性,在0.9nM下對αvβ3和在0.6nM下對αvβ5具有高的結合親合性(通過最小aIIbb3結合呈現(xiàn)的特異性)(Miller等,同上)。如在實施例3中描述的,制備化合物1的二酮接頭修飾的形式,命名為SCS-873。SCS-873如下顯示帶有分別鑒定的靶向成分和接頭。
靶向藥物 具有1,3二酮基團的接頭SCS873對αvβ3或者αvβ5結合具有已知活性的肽模擬物RGD拮抗劑是合乎需要的,因為這些化合物中的某些化合物結合小鼠和人整聯(lián)蛋白。這樣的種類交叉反應性提供人體試驗前的動物血管形成模型的臨床前體內(nèi)研究。另外,靶向化合物可以用于治療與αvβ3整聯(lián)蛋白有關的卡波西肉瘤。
通過以下方法,將SCS-873連接于抗體38C2將在磷酸緩沖鹽水(10mg/ml)中的1毫升抗體38C2加入到12微升的SCS-873的10mg/mL儲備液中并臨用前在室溫下把生成的混合物維持2小時。
評價SCS-873和38C2的混合物與SLK細胞的結合。SCS-873有效介導38C2的細胞表面結合。在SCS-873不存在下,未檢測到38C2的結合。對照實驗證實需要接頭的二酮部分使SCS-873與38C2結合。已測定SCS-873可保留整聯(lián)蛋白靶向成分的整聯(lián)蛋白特異性,即未檢測出在ELISA上對aIIbb3的結合,而對αvβ3和αvβ3的結合很強。對獨立的腹膜內(nèi)和靜脈注射由SCS-873和38C2制備的靶向化合物與每一成分單獨注射進入小鼠體內(nèi)進行比較,證實了體內(nèi)整聯(lián)蛋白的靶向性。在這些實驗中,通過結合38C2,SCS-873的血清半衰期延長2個數(shù)量級以上。未結合于抗體的游離SCS-873僅有數(shù)分鐘的血清半衰期,而幾天后還可從采自眼血中的血清樣品中檢測出抗體和小分子的結合。
實施例2帶有蛋白質(zhì)功能成分的整聯(lián)蛋白靶向整聯(lián)蛋白靶向成分可以共價連接于功能成分例如蛋白質(zhì),以使通道效應物通過這些蛋白質(zhì)引發(fā)起作用。通過賴氨酸活性的N-羥基琥珀酰亞胺或者半胱氨酸活性的馬來酰亞胺官能團可以實現(xiàn)這樣的連接。
例如,整聯(lián)蛋白靶向化合物綴合于IgM抗體誘導補體介導的細胞毒性;與IL-2的綴合導致細胞介導的細胞毒性。用整聯(lián)蛋白靶向化合物可修飾各種抗體以增加它們的選擇性,這些抗體中和參與腫瘤血管形成的生長因子。例如,如果與整聯(lián)蛋白靶向化合物綴合,中和VEGF的單克隆抗體為高度選擇性的。考慮到這些綴合物潛在的免疫原性,可以在蛋白質(zhì)-活性和整聯(lián)蛋白靶向官能團之間引入基于長鏈聚乙二醇(PEG)的序列段。已知長鏈PEG和其它的聚合物對它們掩蔽外部抗原決定部位的能力,導致呈現(xiàn)外部抗原決定部位的治療蛋白的免疫原性減少(Katre等,1990,J.Immunol.144,209-213;Francis等,1998,Int.J.Hematol.68,1-18)。
實施例3靶向成分-接頭分子的合成如在圖10(流程1)和圖11(流程2)中分別顯示的那樣,合成如化合物15和4所示的整聯(lián)蛋白靶向成分。把帶有二酮反應部分的接頭加入到這些如流程3(圖12)所示的靶向分子中,以形成靶向化合物-接頭分子SCS-873和SCS-1655。自化合物14開始以三個步驟實現(xiàn)SCS-873的合成。如在流程1中所示的,在Et3N存在下,使化合物14轉變?yōu)?5并使粗產(chǎn)物與二酮化合物23的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)-酯在CH3CN-DMF中反應。經(jīng)硅膠(CH2Cl2-MeOH,9∶1)純化得到純的SCS-873。
以五個步驟(流程2和3)自14合成化合物SCS-1655。在化合物14上使BOC基團脫保護,隨后與二價接頭24的NHS酯反應得到化合物25,使化合物25脫保護且如上與23反應得到SCS-1655。
在流程4(圖13)中顯示整聯(lián)蛋白靶向成分-接頭分子SCS-864和SCS-789的合成。以一個步驟自化合物4(圖13,流程4)分別合成SCS-864和SCS-789。用合適的活化NHS-酯實現(xiàn)化合物4的連接。帶有分別鑒定的靶向成分和接頭的SCS-864如下所示。
靶向藥物具有1,3二酮基團的接頭SCS864實施例4帶有作為功能成分的紫杉醇的整聯(lián)蛋白靶向化合物的合成自如前描述制備的紫杉醇-琥珀酸酯開始合成紫杉醇-SCS-873(Deutsch等,J.Med.Chem.32,788-792,1989)。用DMF中的PyBOP活化羧基,直接偶合SCS-胺(Huang等,Chemistry&Biology.7,453-461,2000)得到紫杉醇-SCS-873。這個衍生物與先前描述的5-羥色胺拮抗劑肽靶向紫杉醇衍生物類似(Huang等,Chemistry&Biology.7,453-461,2000),證實了良好的活性和靶向性,因此證實該藥的基于琥珀酸酯接頭策略。其它人描述了采用2’-氨基甲酸酯替代基于琥珀酸酯接頭的紫杉醇前藥(de Groot等,J.Medicinal.Chem.43,3093-3102,2000)獲得成功。因而紫杉醇-SCS-873比紫杉醇本身更具有溶解性,而紫杉醇具有不良的溶解度。紫杉醇-SCS-873的結構如下所示。
紫杉醇-SCS-873
實施例5帶有作為功能成分的多柔比星或者2-吡咯啉基多柔比星的整聯(lián)蛋白靶向化合物的合成采用與對黃體化激素釋放激素和生長抑素綴合物的多柔比星衍生物描述的類似的合成流程,制備多柔比星-SCS-873(Nagy等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93,7269-7273,1996;Nagy等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95,1794-1799,1998)。如Nagy等所述制備N-Fmoc-DOX-14-O-半戊二酸酯(Proc.Natl.Acad.Sci.93,2464-2469,1996),接著用在DMF中的PyBOP活化,隨后加入SCS-胺,除去Fmoc保護基,得到多柔比星-SCS-873。多柔比星-SCS-873的結構如下所示。
如對LH-RH-2-吡咯啉基多柔比星綴合物描述的(Nagy等,Proc.Natl.Acad.Sci.93,2464-2469,1996),通過與4-碘代丁醛反應,自多柔比星-SCS-873可以制備2-吡咯啉基多柔比星-SCS-873。各種其他的合成方法也是可以利用的。LH-RH-2-吡咯啉基多柔比星的已證實的活性和類似設計的多柔比星綴合物支持我們的整聯(lián)蛋白靶向衍生物的設計(參見例如Schally和Nagy,Eur.J.Endocrinology 141,1-14,1999和在此關于綜述肽靶向制劑綴合物的參考文獻)。2-吡咯啉基多柔比星-SCS-873的結構如下所示。
實施例6帶有作為功能成分的依托泊苷的整聯(lián)蛋白靶向化合物的合成自最近對結構類似的經(jīng)催化抗體活化的依托泊苷前藥描述的對硝基苯基碳酸酯制備依托泊苷-SCS-873(Shabat等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98,7528-7533,2001)。通過內(nèi)源性細胞酶以及通過催化抗體易于催化逆-Michael步驟(Shabat等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96,6925-6930,1999)。依托泊苷-SCS-873的設計基于通過逆-Michael反應,隨后經(jīng)自發(fā)的脫羧和提供活性依托泊苷的內(nèi)酰胺化反應,內(nèi)源性酶或者一般性酸堿的活化。依托泊苷-SCS-873的結構如下所示。
依托泊苷-SCS-873實施例7用于脂質(zhì)體靶向的整聯(lián)蛋白靶向化合物的制備含DoxilTM的脂質(zhì)體與所描述的本發(fā)明的靶向化合物相關。靶向成分連接于馬來酰亞胺末端的PEG2000-DSPE(MAL-PEG2000-DSPE)。MAL-PEG2000-DSPE可以從市場上通過Shearwater Polymers公司得到。硫醇末端的靶向分子連接于馬來酰亞胺部分是自發(fā)的。然后以簡單的溫育步驟把PEG-類脂衍生物轉變?yōu)閹в锌珊雎运幬镄孤┑腄oxilTM脂質(zhì)體。
通過生物素標記的MAL-PEG2000-DSPE及用FITC-標記的鏈霉抗生物素染色,經(jīng)FACS分析研究脂質(zhì)體對細胞的靶向結合。各種對照組細胞系也被研究以評價非特異性結合。如(Moase等,2001)描述的,采用三種KS細胞系,用多種不同的靶向分子填充脂質(zhì)體進行細胞毒性測定。為研究這個方法在SLK動物模型上的效果,細胞植入后及腫瘤已建立(200mm3)后將動物治療1天。初步研究單次給藥方案以評價靶向DoxilTM對未靶向DoxilTM的相對效果。藥物劑量在0.5mg/kg-5mg/kg(i.v.)范圍內(nèi)。用空白處理其它的對照組,但靶向脂質(zhì)體以多相脂質(zhì)體本身對疾病的作用評價。緩沖對照組也被包括在內(nèi)。在多項治療研究中,藥物以14天間隔基注射。如以上描述的那樣評價全身毒性。
應該注意到,DoxilTM也被批準用于治療頑固性卵巢癌。一項關于自發(fā)展的卵巢癌建立的25種永久性人細胞系的最近的研究證實,所有的細胞系對整聯(lián)蛋白表達均呈陽性(Bruning等,Hum.Gene Ther.12,391-399,2001)。這個結果提示,腫瘤及其支撐的血管兩者的靶向也在治療卵巢癌中具有用途。最近的研究表明,αvβ3可在轉移人頸腫瘤組織中高度表達(Chattopadhyay已Chatterjee,J.Exp.Clin.Cancer Res.20,269-275,2001),提示在此公開的基于DoxilTM的策略在治療宮頸癌中具有用途。其它的聚合脂質(zhì)體裝配(assemblies)例如那些在Bruehl等(Biochemistry,405964-5971,2001)中描述的那些也被采用。
因此,參照以上描述的代表性實施方案,本發(fā)明已被廣泛公開和闡述。本領域技術人員應意識到對本發(fā)明可以做各種改進而不背離其精神和范圍。所有的公開、專利申請書和授權的專利在此通過引用結合到本文中,如同每一各自的公開、專利申請書和授權的專利被特別和各自指明通過引用全部結合到本文中一樣。但排除通過引用結合到本文中所包含的與本公開相抵觸的定義。在此顯示的所有結構被構思以提供所有的對映體和互變異構體。
權利要求
1.一種整聯(lián)蛋白靶向化合物,它包含至少一種共價連接于線性或分支接頭的整聯(lián)蛋白靶向成分,所述接頭共價連接于至少一種功能成分,其中所述整聯(lián)蛋白靶向成分選自(a)RGD肽模擬物,和(b)非-RGD肽、肽模擬物或有機分子整聯(lián)蛋白激動劑或者拮抗劑。
2.權利要求1的靶向化合物,其中所述整聯(lián)蛋白靶向成分為RGD肽模擬物。
3.權利要求1的靶向化合物,其中所述整聯(lián)蛋白靶向成分為非-RGD肽。
4.權利要求1的靶向化合物,其中所述整聯(lián)蛋白靶向成分為有機分子整聯(lián)蛋白激動劑或者拮抗劑。
5.權利要求1的靶向化合物,其中所述整聯(lián)蛋白靶向成分為非-RGD肽模擬物。
6.權利要求1的靶向化合物,其中所述整聯(lián)蛋白靶向α1β1、α2β1、α3β1、α4β1、α5β1、α6β1、α7β1、α8β1、α9β1、α1β1、α6β4、α4β7、αDβ2、αDβ2、αLβ2、αMβ2、αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、αxβ2、αIIbβ3或αIELbβ7。
7.權利要求1的靶向化合物,其中所述至少一種功能成分為治療劑。
8.權利要求7的靶向化合物,其中所述治療劑選自紫杉醇、多柔比星、2-吡咯啉基多柔比星和依托泊苷。
9.權利要求1的靶向化合物,其中所述至少一種功能成分為抗體。
10.權利要求9的靶向化合物,其中所述抗體是全長的。
11.權利要求9的靶向化合物,其中所述抗體為全長抗體的片段。
12.權利要求11的靶向化合物,其中所述全長抗體的片段為Fab、Fab’F(ab’)2、Fv或者sFv。
13.權利要求9的靶向化合物,其中所述抗體為人抗體、人源化抗體或者嵌合人抗體。
14.權利要求9的靶向化合物,其中至少一種整聯(lián)蛋白靶向成分通過接頭被共價連接于抗體結合位點。
15.權利要求9的靶向化合物,其中所述抗體為催化抗體。
16.權利要求15的靶向化合物,其中所述催化抗體選自醛縮酶抗體、β-內(nèi)酰胺酶抗體和酯酶抗體或酰胺酶抗體。
17.權利要求1的靶向化合物,其中所述整聯(lián)蛋白靶向成分連接于兩種或更多種功能成分。
18.權利要求17的靶向化合物,其中所述兩種或更多種功能成分中至少一種為抗體。
19.權利要求18的靶向化合物,其中所述兩種或更多種功能成分中所述至少一種為治療劑。
20.權利要求1的靶向化合物,其中所述整聯(lián)蛋白靶向成分包含兩種或更多種靶向成分。
21.權利要求1的靶向化合物或其鹽,其中所述接頭包含5-100個選自C、H、N、O、P、S、Si、F、Cl、Br和I的原子之間的線性序列段。
22.權利要求1的靶向化合物,其中所述接頭包含一種或更多種選自以下的基團烷基、鏈烯基、炔基、氧代烷基、氧代鏈烯基、氧代炔基、氨基烷基、氨基鏈烯基、氨基炔基、磺基烷基、磺基鏈烯基、磺基炔基、磷酸烷基、磷酸鏈烯基和磷酸炔基。
23.權利要求1的靶向化合物,其中所述接頭包含2-100個重復的醚單元。
24.權利要求1的靶向化合物,其中所述接頭包含下式的雜烴基結構 其中R2-R4為C、H、N、O、P、S、Si、鹵素(F、Cl、Br、I)或其鹽;n為1-100;和m為1-100。
25.權利要求1的靶向化合物,其中所述接頭包含一種或更多種環(huán)結構。
26.權利要求25的靶向化合物,其中所述一種或更多種環(huán)結構包括一種或更多種下式的六元環(huán) 其中A、Z、Y、X或W獨立為C或N。
27.權利要求25的靶向化合物,其中所述一種或更多種環(huán)結構包括一種或更多種下式的五元環(huán) 其中A、Z、Y或X獨立為C、O、N或S。
28.權利要求1的靶向化合物,其中所述整聯(lián)蛋白靶向成分為如以下化合物1、2或3所示的RGD肽模擬物。
29.權利要求1的靶向化合物,其中所述靶向成分與所述接頭之間或者所述接頭與所述功能成分之間或者兩者皆有的所述共價鍵是不可逆的。
30.權利要求1的靶向化合物,其中所述靶向成分與所述接頭之間或者所述接頭與所述功能成分之間或者兩者皆有的所述共價鍵是可逆的。
31.權利要求1的靶向化合物,其中所述靶向成分與所述接頭之間或者所述接頭與所述功能成分之間或者兩者皆有的所述共價鍵是不穩(wěn)定的。
32.權利要求31的靶向化合物,其中所述不穩(wěn)定的鍵是pH敏感的鍵,為酶的底物或者易于經(jīng)輻射降解。
33.一種制備整聯(lián)蛋白靶向化合物的方法,該方法包括將至少一種整聯(lián)蛋白靶向成分通過線性或分支接頭共價連接于至少一種功能成分,其中所述整聯(lián)蛋白靶向成分選自(a)RGD肽模擬物,和(b)非-RGD肽、肽模擬物或者有機分子整聯(lián)蛋白激動劑或者拮抗劑。
34.權利要求33的方法,其中所述至少一種靶向成分以這樣的方式連接于所述至少一種功能成分,以保留靶向成分的結合功能和功能成分的生物學活性。
35.權利要求33的方法,其中所述連接通過制備包含所述至少一種整聯(lián)蛋白靶向成分和接頭的整聯(lián)蛋白靶向成分-接頭化合物來實現(xiàn),所述接頭包含用于與功能成分反應的反應基團,并且所述接頭的所述反應基團共價連接于功能成分。
36.權利要求33的方法,其中所述連接通過制備包含功能成分和接頭的功能成分-接頭化合物來實現(xiàn),所述接頭包含用于使所述至少一種整聯(lián)蛋白靶向成分反應的反應基團,并且所述接頭的反應基團共價連接于所述至少一種整聯(lián)蛋白靶向成分。
37.權利要求33的方法,其中所述連接通過以下方法實現(xiàn)(a)制備包含整聯(lián)蛋白靶向成分和接頭的整聯(lián)蛋白靶向成分-接頭化合物,所述接頭包含反應基團;和(b)制備包含功能化合物和接頭的功能成分-接頭,所述接頭包含易于與步驟(a)的反應基團反應的化學部分;或者(c)制備包含功能成分和包含反應基團的接頭的功能成分-接頭化合物;和(d)制備包含整聯(lián)蛋白靶向成分和接頭的整聯(lián)蛋白靶向成分-接頭化合物,所述接頭包含易于與步驟(c)的所述反應基團反應的化學部分;和(e)通過所述反應性和易敏基團,使步驟(a)和(b)或步驟(c)和(d)的接頭共價連接在一起以形成整聯(lián)蛋白靶向化合物。
38.一種通過權利要求37的方法生產(chǎn)的整聯(lián)蛋白靶向化合物。
39.一種用于將整聯(lián)蛋白靶向成分共價連接于功能成分、下式的所述接頭的整聯(lián)蛋白靶向成分-接頭化合物或功能成分-接頭化合物,所述接頭具有式X-Y-Z,其中X為包含C、H、N、O、P、S、Si、F、Cl、Br和I中任何一種的原子或其鹽的線性或分支連接鏈,Y,如果存在,為單或稠合5或6元高-或雜碳環(huán)飽和或不飽和環(huán);和Z為酮、二酮、β-內(nèi)酰胺、活性酯、鹵代酮、內(nèi)酯、酸酐、環(huán)氧化物、醛、馬來酰亞胺二硫化物或者芳基鹵化物;和其中Z為用于將所述成分之一共價連接于活性氨基酸或所述成分的其它成分中的其它易敏部分的反應基團,所述靶向成分或功能成分被連接于X或Y(如果存在)或者X和Y兩者(如果Y存在)。
40.權利要求39的整聯(lián)蛋白靶向成分-接頭化合物或功能成分-接頭化合物,其中所述成分以保持結合靶子和顯示功能活性的能力的方式連接。
41.權利要求39的整聯(lián)蛋白靶向成分-接頭化合物或功能成分-接頭化合物,其中X包含5-200個原子之間的線性序列段。
42.權利要求39的整聯(lián)蛋白靶向成分-接頭化合物或功能成分-接頭化合物,其中X為下式的雜烴基結構 其中R2-R4為C、H、N、O、P、S、Si、鹵素(F、Cl、Br、I)或其鹽;n為1-100;和m為1-100。
43.權利要求39的整聯(lián)蛋白靶向成分-接頭化合物或功能成分-接頭化合物,其中Y為下式的六元環(huán) 其中A、Z、Y、X或W獨立為C或N。
44.權利要求39的整聯(lián)蛋白靶向成分-接頭化合物或功能成分-接頭化合物,其中Y為下式的五元環(huán) 其中A、Z、Y或X獨立為C、O、N或S。
45.權利要求39的整聯(lián)蛋白靶向成分-接頭化合物或功能成分-接頭化合物,其中所述接頭通過加入一種或更多種連接鏈被分支,所述接頭包含一種以上的識別基團,所述接頭包含一種以上的反應基團,或其組合。
46.權利要求39的整聯(lián)蛋白靶向成分-接頭化合物或功能成分-接頭化合物,其中所述接頭具有以下結構,其中n為1-100。
47.一種用于將整聯(lián)蛋白靶向成分共價連接于功能成分、下式的所述接頭的整聯(lián)蛋白靶向成分-接頭化合物或功能成分-接頭化合物,所述接頭具有式X-Y-Z其中X為包含C、H、N、O、P、S、Si、F、Cl、Br和I中任何一種的原子或其鹽的線性或分支連接鏈,并且包含0-100之間的重復醚單元;Y為單或稠合5或6元高-或雜碳環(huán)的飽和或不飽和的定位于1-20個原子的Z的環(huán);和Z為用于將所述成分之一共價連接于活性氨基酸或所述成分的其它成分中的其它易敏部分的反應基團,所述靶向成分或功能成分連接于X或Y。
48.權利要求47的整聯(lián)蛋白靶向成分-接頭化合物或功能成分-接頭化合物,其中所述制劑以保持結合靶子和呈現(xiàn)生物學活性的能力的方式連接。
49.權利要求47的整聯(lián)蛋白靶向成分-接頭化合物或功能成分-接頭化合物,其中Z選自酮、二酮、β-內(nèi)酰胺、活性酯、鹵代酮、內(nèi)酯、酸酐、環(huán)氧化物、醛、馬來酰亞胺、二硫化物和芳基鹵化物。
50.權利要求47的整聯(lián)蛋白靶向成分-接頭化合物或功能成分-接頭化合物,其中X包含10-200原子之間的線性序列段。
51.權利要求47的整聯(lián)蛋白靶向成分-接頭化合物或功能成分-接頭化合物,其中X為下式的雜烴基 其中R2-R4為C、H、N、O、P、S、Si、鹵素(F、Cl、Br、I)或其鹽;n為1-100;和m為1-100。
52.權利要求47的整聯(lián)蛋白靶向成分-接頭化合物或功能成分-接頭化合物,其中Y為下式的六元環(huán) 其中A、Z、Y、X或W獨立為C或N。
53.權利要求47的整聯(lián)蛋白靶向成分-接頭化合物或功能成分-接頭化合物,其中Y為下式的五元環(huán) 其中A、Z、Y或X獨立為C、O、N或S。
54.權利要求47的整聯(lián)蛋白靶向成分-接頭化合物或功能成分-接頭化合物,其中所述接頭包含一種以上的連接鏈、一種以上的識別基團或一種以上的反應基團,或其組合。
55.一種將功能成分傳遞至個體的表達整聯(lián)蛋白的細胞或組織的方法,所述方法包括給予個體權利要求1的靶向化合物。
56.權利要求55的方法,其中所述功能成分為治療劑。
57.一種將功能成分傳遞至個體的表達整聯(lián)蛋白的細胞或組織的方法,所述方法包括給予個體權利要求38的靶向化合物。
58.權利要求57的方法,其中所述功能成分為治療劑。
59.一種在個體中治療或預防涉及整聯(lián)蛋白的疾病或癥狀的方法,所述方法包括給予個體治療有效量的權利要求7的靶向化合物,其中所述治療成分減輕與所述疾病或癥狀相關的癥狀。
60.權利要求59的方法,其中所述疾病或癥狀涉及血管生成、骨代謝、炎癥或細胞生長的缺陷。
61.權利要求59的方法,其中所述疾病或癥狀為癌癥。
62.一種藥用制劑,它包含權利要求1的靶向化合物和藥學上可接受的載體。
63.一種藥用制劑,它包含權利要求38的靶向化合物和藥學上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含連接于功能成分例如治療劑或抗體的整聯(lián)蛋白靶向成分的整聯(lián)蛋白靶向化合物。多種整聯(lián)蛋白靶向化合物的結構被提供。另外提供使用整聯(lián)蛋白靶向化合物將功能成分傳遞至與個體的細胞或組織有關的整聯(lián)蛋白的方法。也提供使用整聯(lián)蛋白靶向化合物在個體中治療或預防涉及整聯(lián)蛋白的疾病或癥狀的方法。
文檔編號A61P35/00GK1606566SQ02825588
公開日2005年4月13日 申請日期2002年10月22日 優(yōu)先權日2001年10月22日
發(fā)明者C·F·巴巴斯, C·拉德爾, S·C·辛哈 申請人:斯克里普斯研究學院
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