專利名稱：一種對(duì)丙肝、乙肝、愛滋和梅毒病毒進(jìn)行共檢的基因芯片及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬免疫學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體地是一種應(yīng)用基因芯片技術(shù)對(duì)丙肝、乙肝、愛滋和梅毒病毒進(jìn)行共檢的方法。
背景技術(shù)：
乙肝、丙肝、愛滋和梅毒(HBV、HCV、HIV和TP)是常見的傳染病，這四種傳染病的病原體有的是DNA病毒，有的是RNA病毒。
乙肝病毒血清方法證實(shí)由四種重要的亞型(adr，adw，ayr，ayw)，決定這四種亞型的病毒基因基礎(chǔ)是由于其S基因是乙肝病毒基因中變異率發(fā)生最高的基因區(qū)，所以亞型又派生出許多亞亞型。丙肝病毒是一種很小的RNA病毒，它包含一個(gè)長(zhǎng)度為10,000個(gè)核苷酸的單向的正向的RNA分子?；蚪M含有一個(gè)據(jù)信可被轉(zhuǎn)化成單個(gè)的，大聚合蛋白并隨后進(jìn)行處理的單個(gè)的長(zhǎng)的開放閱讀框。這個(gè)開放閱讀框始于一個(gè)非轉(zhuǎn)化區(qū)域(UTR)之后的核苷酸343(采用原型病毒編號(hào)系統(tǒng))。5′UTR序列是相對(duì)不變的，并且在病毒的復(fù)制和調(diào)節(jié)方面是很重要的。編碼區(qū)域的5′端也是不變的。人類免疫缺陷病毒(HIV)是獲得型人類免疫缺陷綜合癥(AIDS)和相關(guān)失調(diào)的致病劑。HIV是逆轉(zhuǎn)錄病毒家族的一種RNA病毒，并表現(xiàn)出所有逆轉(zhuǎn)錄病毒的5′LTR-gag-pol-env-LTR3′結(jié)構(gòu)。HIV通過復(fù)制從細(xì)胞中芽生和損壞細(xì)胞膜，殺傷它感染的細(xì)胞。
目前檢測(cè)丙肝、乙肝、愛滋和梅毒病毒的方法主要是多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)，將丙肝、乙肝、愛滋和梅毒病毒的核酸擴(kuò)增后進(jìn)行核酸堿基的序列分析，檢測(cè)病毒的堿基序列以獲得其變異結(jié)果。這種方法雖比較精確，但較繁瑣，分析成本高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在提供一種簡(jiǎn)便易行的丙肝、乙肝、愛滋、梅毒共檢方法。
本發(fā)明的目的是以下述方式實(shí)現(xiàn)的在丙肝、乙肝、愛滋和梅毒的每一種病原體中選擇其保守區(qū)域，并在該區(qū)域設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)奶结樅鸵铮贿M(jìn)而采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄌ崛颖局械牟≡w核酸(RNA or DNA)、擴(kuò)增、雜交、掃描、分析，得出結(jié)論。


下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。
圖1是本發(fā)明芯片的具體點(diǎn)樣方法。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1樣本處理，擴(kuò)增、標(biāo)記及雜交樣本處理●HBV血清100+300Solution D 冰浴10mins +200苯酚氯仿(堿性)13000rpm，10min 取上清，加2倍體積的無(wú)水乙醇、2ul tRNA(5mg/ml)和1/10體積的NaAc -20℃放置30min13000rpm，15min 去上清，沉淀加400ul75％乙醇洗滌2遍，晾干；●HCV方法與HBV相同，只是苯酚氯仿要用酸性的；也可采用煮沸法；●HIV先HCV的抽提方法，其他方法有待進(jìn)一步查證；●TP先采用煮沸法，再用堿裂解法。擴(kuò)增、標(biāo)記①HCV和HIV分別進(jìn)行RT和NEST-PCR；②HBV一次PCR擴(kuò)增；③TPNEST-PCR，嘗試一次PCR。
雜交取標(biāo)記產(chǎn)物7.5ul，加入雜交液7.5ul，混勻，94℃變性3min，48℃雜交30min，用2×SSC+0.2％SDS 42℃洗滌15min，用2×SSC洗滌10min；避光晾干。
掃描、結(jié)果分析和得出結(jié)論
將雜交好的芯片在掃描儀中掃描，根據(jù)圖象分析，得到結(jié)論。
實(shí)施例2芯片的制備點(diǎn)樣液的制備將合成的帶氨基修飾的Oligo干粉用TE溶解成100uM的原液，原液再用TE稀釋成20uM，臨點(diǎn)樣前用spotting solution對(duì)半稀釋成10uM。
點(diǎn)樣將制備的點(diǎn)樣液，加入96孔板中，按圖1用GMS417點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣點(diǎn)樣后處理點(diǎn)樣完成后，水合30min，用0.2％SDS洗滌2min，重復(fù)一次，再用水洗滌2min，重復(fù)一次，晾干，點(diǎn)樣區(qū)用NaBH4封閉5min，用0.2％SDS洗滌1min，重復(fù)兩次，用水沖洗干凈，晾干，4℃保存。
掃描后結(jié)果判斷根據(jù)各個(gè)病原體所對(duì)應(yīng)的特異性探針條帶的熒光信號(hào)即可得出結(jié)論。
權(quán)利要求
1.一種乙肝、丙肝、愛滋、梅毒病毒基因共檢芯片，其特征在于可在體外同時(shí)檢測(cè)人血清中乙肝、丙肝、愛滋和梅毒四種病毒DNA或RNA，從而可以在診斷乙肝、內(nèi)肝、愛滋和梅毒中應(yīng)用。
2.一種權(quán)利要求1中提到的共檢芯片，其特征在于a) 所述的作為檢測(cè)芯片載體的是玻片；b) 玻片上點(diǎn)有HBV特征基因片斷、HCV特征基因片斷、HIV特征基因片斷、TP特征基因片斷、乙肝陽(yáng)性植物內(nèi)參照基因、丙肝陽(yáng)性植物內(nèi)參照基因、愛滋陽(yáng)性植物內(nèi)參照基因、梅毒陽(yáng)性植物內(nèi)參照基因、陰性植物內(nèi)參照基因、空白參照樣品。
3.一種制備權(quán)利要求2所述的檢測(cè)芯片的方法，包括HBV、HCV、HIV、TP特征基因的制備、轉(zhuǎn)化、測(cè)序驗(yàn)證，靶基因的制備純化、步驟，點(diǎn)樣，其特征在于a)HBV特征基因、HCV特征基因、HIV特征基因、TP特征基因是直接取自病人的血清抽提物，cDNA是通過RT-PCR和nest-PCR方法獲得的；b)含有經(jīng)過測(cè)序驗(yàn)證的HBV特征基因、HCV特征基因、HIV特征基因、TP特征基因和5個(gè)植物基因片斷的質(zhì)粒作為PCR擴(kuò)增的模板，經(jīng)過兩次擴(kuò)增后，純化PCR產(chǎn)物，得到樣品；c)將樣品按照點(diǎn)樣矩陣的要求點(diǎn)于玻片上，干燥后，去除背景干擾。
4.一種利用如權(quán)力要求1所述的乙肝、丙肝、愛滋、梅毒病毒基因共檢芯片檢測(cè)待檢測(cè)樣本中乙肝、丙肝、愛滋、梅毒病毒的方法，包括從待檢測(cè)樣本中抽提核酸，反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，標(biāo)記熒光，雜交，檢測(cè)，分析，其特征在于(1)利用HBV核酸抽提液、HCV核酸抽提液、HIV核酸抽提液和TP核酸抽提液從待測(cè)樣本中分別抽提乙肝、丙肝、愛滋和梅毒病毒核酸；(2)利用反轉(zhuǎn)錄試劑進(jìn)行RT-PCR；(3)利用標(biāo)記試劑和熒光標(biāo)記混合物對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記；(4)利用雜交試劑將探針和檢測(cè)芯片進(jìn)行雜交；(5)將雜交后的檢測(cè)芯片進(jìn)行掃描；(6)利用軟件分析雜交結(jié)果，得出診斷結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的一種乙肝、丙肝、愛滋、梅毒病毒基因檢測(cè)方法和共檢芯片，其檢測(cè)方法是應(yīng)用基因芯片技術(shù)鑒定乙肝、丙肝、愛滋、梅毒病毒基因。該共檢芯片能方便快捷地對(duì)四種病毒基因同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，便于臨床診斷和治療引導(dǎo)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1405322SQ0112643
公開日2003年3月26日 申請(qǐng)日期2001年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月9日
發(fā)明者吳海, 肖學(xué)葵, 孫曉豐, 陳秋雯, 華兵 申請(qǐng)人:上海博華基因芯片技術(shù)有限公司