專利名稱：人睪丸泛蛋白相關(guān)基因編碼蛋白特異性抗體及基因芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于人類基因組技術(shù)領(lǐng)域。
本發(fā)明所述睪丸特異表達(dá)的泛蛋白相關(guān)基因(Ubiquitin-like fusingprotein,ULFP)基因是發(fā)明人在南京醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)江蘇省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室用基因芯片方法篩選獲得，首先制備人睪丸功能基因表達(dá)芯片，通過(guò)比較胚胎和成年人睪丸功能基因的表達(dá)，獲得差異表達(dá)克隆，經(jīng)序列測(cè)定證明為全長(zhǎng)cDNA，為3256bp；其開(kāi)放閱讀框架為2184bp，其編碼728個(gè)氨基酸。查閱基因庫(kù)，其編碼氨基酸序列與爪蟾同源性達(dá)95％，但在人類和其它物種中未發(fā)現(xiàn)同源序列。經(jīng)RT-PCR顯示ULFP基因在人睪丸內(nèi)特異表達(dá)，為睪丸功能特異基因，制備成融合蛋白，并用該蛋白免疫家兔，制備成單克隆和多克隆抗體，同時(shí)該基因已用于制備睪丸功能基因表達(dá)芯片。
由于ULFP基因序列在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中尚無(wú)同源序列，本發(fā)明人對(duì)于ULFP基因的結(jié)構(gòu)和功能研究成果全都是開(kāi)創(chuàng)性的。美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)情報(bào)中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)已正式接受ULFP基因?yàn)镚enbank的新成員，該基因的接受號(hào)為AF311324。
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②制備特異性抗體基因編碼蛋白的特異性抗體是研究基因結(jié)構(gòu)和功能的不可缺少的重要工具，ULFP基因編碼蛋白多克隆和單克隆抗體，可用作免疫組織化學(xué)染色、ELISA、免疫電鏡、免疫共沉淀等多種根據(jù)免疫學(xué)原理設(shè)計(jì)的檢測(cè)方法，可用于該基因編碼蛋白在組織細(xì)胞中的定位和定量研究。在各種生物樣本(如血液、精液、尿液等)中的含量變化研究以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究等。因此，該抗體有可能用于制備與ULFP基因表達(dá)異常相關(guān)疾病診斷試劑盒制備，并有可能用于制備抗生育藥物。
③制備基因芯片將功能基因用于制備基因芯片是基因開(kāi)發(fā)研究的一個(gè)重要方面，在疾病診斷和藥物篩選等方面均具有重要意義。本發(fā)明人已將ULFP基因用于睪丸功能基因芯片的制備，在今后睪丸功能研究、睪丸相關(guān)疾病(如男性不育、性功能低下)的診斷及治療和藥物篩選中將發(fā)揮重要作用。本發(fā)明技術(shù)方案1．ULFP基因融合蛋白的制備以ULFP基因開(kāi)放閱讀框的核苷酸序列與質(zhì)粒pDESTTM15制備成GST-ULFP-pDEST15表達(dá)質(zhì)粒，在無(wú)NaCl的LB中30℃培養(yǎng)到0.5 OD600，經(jīng)0.3M NaCl誘導(dǎo)后，超聲粉碎后經(jīng)GST親和層析柱純化，得到純化的GST-ULFP融合蛋白。2．ULFP基因編碼蛋白特異性多克隆抗體取融合蛋白與載體蛋白KLH(Keyhole Limpet Hymocyanin)結(jié)合，經(jīng)透析后再與完全/不完全佐劑(Complete/Incomplete Freund’sAdjuvant)等量混合，免疫新西蘭兔(背部皮下注射)，每隔3～4周激發(fā)注射一次，共三次，于三個(gè)月后取血分離血清。以免疫前動(dòng)物血清作為對(duì)照做ELISA，測(cè)定各免疫兔血清中抗體滴度。篩選高滴度血清，進(jìn)一步用抗原作競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫試驗(yàn)確定抗體的特異性。根據(jù)ELISA結(jié)果確定其用于免疫組織化學(xué)染色的稀釋倍增數(shù)為1∶200～500。3．ULFP基因編碼蛋白特異性單克隆抗體取融合蛋白與載體蛋白KLH(Keyhole Limpet Hymocyanin)結(jié)合，經(jīng)透析后再與完全/不完全佐劑(Complete/Incomplete Freund’sAdjuvant)混合，免疫Balb/C小鼠(腹腔內(nèi)注射)，隔周一次，連續(xù)2-3次，融合前靜脈加強(qiáng)一次，用ELISA方法證實(shí)抗體的產(chǎn)生后，取脾臟分離脾細(xì)胞，然后與骨髓瘤細(xì)胞融合產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞。陽(yáng)性克隆經(jīng)多次亞克隆，直至獲得分泌抗ULFP的單克隆雜交瘤細(xì)胞株。4．ULFP基因用于制備睪丸功能基因表達(dá)芯片(1)以獲取ULFP基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增全長(zhǎng)的ULFP序列，100ul PCR加入80μL異丙醇混勻，-20℃冰箱中放置60分鐘，4℃4000rpm離心30分鐘，。棄去上清，室溫干燥。每孔加10μL變性液，轉(zhuǎn)移至384孔板，4℃保存，用作點(diǎn)膜的樣品。(2)用英國(guó)BioRobotics自動(dòng)點(diǎn)膜儀將標(biāo)本點(diǎn)在8×12cm尼龍膜上，每一標(biāo)本點(diǎn)2個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)的DNA量約幾ng。；陽(yáng)性對(duì)照8個(gè)housekeeping genes (a.ribosomal protein S9；b.Actin gamma；c.glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；d.hypoxanthinephosphoribosyltransferase 1；e.H.sapiens mRNA for 23KD highly basicprotein；f.ubiqnitin C；g.Phospholipase A2；h.ubiquitin carboxyⅠ-ferminal esterase LⅠ)。陰性對(duì)照加λ噬菌體DNA和P-blue質(zhì)粒。(3)將含有該基因的芯片用于ULFP缺失的診斷和藥物篩選33P標(biāo)記抽提待檢標(biāo)本mRNA或DNA，用Random Primer標(biāo)記法標(biāo)記待檢標(biāo)本mRNA或DNA，作為雜交的探針。雜交將點(diǎn)制好的尼龍膜68℃預(yù)雜交3小時(shí)，倒去預(yù)雜交液，加入2ml已高溫變性過(guò)的探針雜交液，68℃雜交約20小時(shí)。將膜置于一個(gè)盛有250ml 2×SSC和0.5％SDS的白瓷盤(pán)內(nèi)，室溫浸泡15分鐘。換新的洗脫液，37℃振蕩l小時(shí)。再換新的洗脫液在65℃時(shí)振蕩1小時(shí)。將尼龍膜轉(zhuǎn)移到一個(gè)盛有250ml蒸餾水的托盤(pán)中，室溫漂洗片刻。雜交爐(68℃)內(nèi)烘干，用磷屏壓片。信號(hào)掃描和分析實(shí)驗(yàn)室使用FIJIFILM公司的FLA-3000信號(hào)記錄儀分析雜交信號(hào)。根據(jù)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱分析影響ULFP蛋白表達(dá)水平或ULFP基因的缺失。
權(quán)利要求
1．一種睪丸功能特異基因(ULFP)克隆制備的融合蛋白，其特征是ULFP基因全部開(kāi)放閱讀框氨基酸，序列為MDNRKEPPFFNDDNMGPFYYRLHFCDTMELFIETLTGTCFELRVSPFETVISVKAKIRRLEGIPICRQHLIWNNMELENDYCLNDYNISEGCTLKLVLAMRGGPINTRRVPTDDPLRKMAEYLDSSRVEVWEKTSCSKQVTFLVYREGDQLNFFPAVDRGDGTLTPLSDSSKKIDFHLHVLRRKGEHRMSGGSMYNSDTDEDEETEPSSSGQQIIENSITMNKMKLLKAKMKNMNLSKKPKKAVKIKPHPPVAPRPSSGSTAPSRHRLLRVLPNIGQSCSPAFGNAYPPEISRNGISSLATQLSAERYISSITGEFLKEDNSWENNTLSHFSSNVKLPPQIPHLELGNDQELADSVLHLGSSLPRQTKHFLGNLPSSNGNIVLPSEECVTEQSLLPKVGSPASFAEGNADEQSSGLEGACKVNLELLLTNADKGLKAPEQHLKHVAGVLNGESVETSVLNYRELSPHKNRLLSPLRCSASMSLHNSLVKPERQSKCFEFGKLQPSSSQSLDVQNITDSSFSRTTCFQGVKVDSLGKRSDVISKVEARDITEMTNKASKEPVGCVNNISFLASLAGSTSRNRLQSTRGAGRLQNSGTGLSTNLQHFQEENFRKSSPQLEHTGVFLSTHGVGMNGNNAAAGKSVGECTTHHLPPVKAPLQTKKKTTNHCFLCGKKTGLASSYECRCGNNFCASHRYAETHGCTYDYKSAGRRYLHEANPVVNAPKLPKI
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述針對(duì)ULFP基因開(kāi)放閱讀框氨基酸序列制備的多克隆抗體，其特征是融合蛋白與完全和不完全佐劑混合后，免疫新西蘭兔制備多克隆抗體。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述針對(duì)ULFP基因開(kāi)放讀框氨基酸序列制備的單克隆抗體，其特征是融合蛋白與完全和不完全佐劑混合，免疫Balb/C小鼠，分離脾臟B淋巴細(xì)胞并和骨髓瘤細(xì)胞融合產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞，進(jìn)一步用亞克隆方法、ELISA和抗體分型方法篩選分泌IgG抗體的單克隆，制備單克隆抗體。
4．根據(jù)權(quán)利要求1所述針對(duì)將ULFP基因開(kāi)放讀框氨基酸序列用于制備睪丸功能基因表達(dá)芯片，其特征是PCR擴(kuò)增ULFP基因cDNA，點(diǎn)于芯片用于芯片制備。
全文摘要
本發(fā)明屬于人類基因組技術(shù)領(lǐng)域,所述的睪丸特異表達(dá)泛蛋白(Ubiquitin－like fusing protein,ULFP)基因全長(zhǎng)cDNA序列為3256bp,其開(kāi)放閱讀框序列為2184bp,其編碼728個(gè)氨基酸,該基因在基因庫(kù)(Genbank)中的編號(hào)為AF311324。本發(fā)明利用ULFP基因克隆制備融合蛋白,并用該蛋白免疫動(dòng)物制備單克隆和多克隆抗體,同時(shí)將基因克隆用于睪丸特異功能基因表達(dá)芯片的制備。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1309136SQ0110825
公開(kāi)日2001年8月22日 申請(qǐng)日期2001年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月28日
發(fā)明者沙家豪, 周作民, 李建民 申請(qǐng)人:南京醫(yī)科大學(xué)