專利名稱：人類g型溶菌酶、其編碼序列、制法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種新的人類鵝型溶菌酶的核酸和氨基酸序列，且提供了將該序列用于自身免疫系統(tǒng)/炎癥、腎臟、腎上腺方面的疾病和腫瘤的診斷、治療及預(yù)防的方法。
溶菌酶是一個(gè)酶家族，能催化細(xì)菌細(xì)胞壁某些粘多糖水解，特別是催化N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之間的β-1，4-糖苷鍵，并能引起細(xì)菌裂解。溶菌酶在多種生物體例如病毒、鳥(niǎo)類以及哺乳動(dòng)物中都存在。在人體中，溶菌酶存在于脾、肺、腎、白細(xì)胞、血漿、唾液、乳汁、眼淚和軟骨中。(Online Mendelian Inheritance in Mn(OMIM)153450 Lysozyme；Weaver，L.H.et al.(1985)J.Mol.Biol.184739-741)。
已知的兩種溶菌酶，雞型(C型)和鵝型(G型)，最初分別是從雞蛋清和鵝蛋清中分離出的。C型與G型溶菌酶有著相似的三維結(jié)構(gòu)，但氨基酸序列不同。(Nakano，T.andGraf，T.(1991)Biochim.Biophys.Acta 1090273-276).在雞中，兩種類型的溶菌酶都存在于中性粒細(xì)胞中，而蛋清中僅存在C型溶菌酶。對(duì)雞中兩種類型的溶菌酶mRNA的表達(dá)譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)C型溶菌酶mRNA既存在于附著的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中，也存在于非附著的早幼粒細(xì)胞和粒細(xì)胞以及骨髓、脾、黏液囊和輸卵管細(xì)胞中。G型溶菌酶mRNA存在于非附著的骨髓和肺細(xì)胞中。從雞中克隆出的G型溶菌酶基因編碼一個(gè)211個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，該蛋白包含一個(gè)公認(rèn)的26氨基酸的N端切割信號(hào)。在雞、黑天鵝、鵝和鴕鳥(niǎo)中發(fā)現(xiàn)了同源的G型溶菌酶。其中保守的殘基包括三個(gè)催化中心殘基Glu99、Asp12和Asp123(以雞G型溶菌酶前體計(jì)數(shù))以及4個(gè)半胱氨酸，這4個(gè)半胱氨酸在黑天鵝G型溶菌酶中形成兩個(gè)雙硫鍵。在兔子中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種同功酶，包括白細(xì)胞型、消化道型，也許還有淋巴上皮細(xì)胞型(OMIM153450，supra；Nakono(1991)supra；and GenBank g 1310929)。編碼類似C型溶菌酶的蛋白的人溶菌酶基因也已被克隆(Yoshimura，K.et al.(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.150794-801)。
溶菌酶與多種疾病有關(guān)。Nakano(supra)認(rèn)為溶菌酶可能在宿主防御系統(tǒng)中起作用。帶有遺傳性溶菌酶缺陷的年長(zhǎng)兔子對(duì)感染的敏感性增加，特別是皮下膿腫的高敏感性(OMIM153450，supra)。人溶菌酶基因突變會(huì)引起遺傳性系統(tǒng)性淀粉樣變。該病是一種罕見(jiàn)的顯性常染色體病，淀粉樣蛋白在內(nèi)臟，包括腎、腎上腺、脾和肝中沉積，該病通常在50歲前致人死命。淀粉樣沉積中包含有氨基酸被替換的溶菌酶。腎臟淀粉樣變是最常見(jiàn)的，也是器官累及中最嚴(yán)重的(Pepys，M.B.et al.(1993)Nature 362553-557；OMIM 105200 Familial Visceral Amyloisosis；Cotran，R.S.et al.(1994)Robbins Pathologic Basis of Disease，W.B.Saunders Company，Philadelphia，Pa.，pp.231-238)。G型溶菌酶在帶v-myb癌基因的L106突變子的成髓細(xì)胞白血病病毒的鳥(niǎo)的早幼粒細(xì)胞中被表達(dá)(Nakano，T.and Graf.T.(1992)Oncogene 7527-534；andNakano(1991)supra.)。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)新的溶菌酶。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種多聚核苷酸，該多聚核苷酸被命名為人LYG2，它編碼人類G型溶菌酶2(已公布的人類G型溶菌酶在本文中被稱作LYG1)。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新的人溶菌酶蛋白LYG2。
本發(fā)明所提供了一種新的人類G型溶菌酶及其編碼多核苷酸，為自身免疫/炎癥性、腎臟、腎上腺相關(guān)的疾病和癌癥的診斷、治療和預(yù)防提供了新的途徑。
本發(fā)明還提供了一種充分純化的變異蛋白，該蛋白與SEQ ID No.1中的氨基酸序列或其片斷的順序有至少90％的同一性。本發(fā)明還提供一種分離純化的多聚核苷酸，該多聚核苷酸編碼含有SEQ ID No.1中的氨基酸序列或其片斷順序的多肽。本發(fā)明還提供一種分離純化的多聚核苷酸變異體，其與編碼含有SEQ ID No.1中的氨基酸序列或其片斷順序的多聚核苷酸有至少70％同一性。
本發(fā)明還提供了一種分離純化的多聚核苷酸，該多聚核苷酸能在嚴(yán)緊條件下與編碼含有SEQ ID No.1中的氨基酸序列或其片斷順序的多肽的多聚核苷酸相雜交，還提供與編碼含有SEQ ID No.1中的氨基酸序列或其片斷順序的多肽的多聚核苷酸相互補(bǔ)的多聚核苷酸。
本發(fā)明還提供一種分離純化的多聚核苷酸，該多聚核苷酸含有SEQ ID No.2中第1-846位或第114-662位的多聚核苷酸序列或其片斷順序。本發(fā)明還提供一種分離純化的多聚核苷酸變異體，其與含有SEQ ID No.2中的多聚核苷酸序列或其片斷順序的多聚核苷酸有至少70％同一性。還提供一種分離純化的與含有SEQ ID No.2中的順序或其片斷順序的多聚核苷酸相互補(bǔ)的多聚核苷酸。
本發(fā)明還提供一種表達(dá)載體，它含有至少一段編碼包含SEQ ID No.1中的氨基酸序列或其片斷的多聚核苷酸。另一方面，此表達(dá)載體包含在宿主細(xì)胞中。
本發(fā)明還提供了一種制備含有SEQ ID No.1中的氨基酸序列或其片斷的多肽的方法。其步驟為(a)在適合含有SEQ ID No.1中的氨基酸序列或其片斷的多肽表達(dá)的環(huán)境中培養(yǎng)宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞含有一個(gè)表達(dá)載體，該表達(dá)載體帶有至少一段編碼含有SEQ ID No.1中的氨基酸序列或其片斷多肽的多聚核苷酸；(b)從宿主培養(yǎng)物中提取此多肽。
本發(fā)明還提供一種藥學(xué)成分，該成分包含了充分純化的多肽，該多肽含有SEQ IDNo.1中的氨基酸序列或其片斷，并與一適合的藥學(xué)載體相連。
本發(fā)明還提供了一種和包含SEQ ID No.1中的氨基酸序列或其片斷的多肽結(jié)合的純化抗體，以及該純化抗體的激動(dòng)劑和純化的拮抗劑。
本發(fā)明還提供了一種治療或預(yù)防自身免疫/炎癥疾病的方法，該方法包括給需要治療的病人以有效劑量的藥學(xué)成分，該成分含帶有SEQ ID No.1中的氨基酸序列或其片斷的純化多肽。
本發(fā)明還提供了一種治療或預(yù)防腎臟疾病的方法，該方法包括給需要治療的病人以有效劑量的藥學(xué)成分，該成分含帶有SEQ ID No.1中的氨基酸序列或其片斷的純化多肽。
本發(fā)明還提供了一種治療或預(yù)防腎上腺疾病的方法，該方法包括給需要治療的病人以有效數(shù)量的藥學(xué)成分，該成分含帶有SEQ ID No.1中的氨基酸序列或其片斷的純化多肽。
本發(fā)明還提供一種治療或預(yù)防癌癥的方法，該方法包括對(duì)有此需要的病人給予有效量的拮抗劑，該拮抗劑可拮抗具有SEQ ID No.1中氨基酸序列或其片斷的多肽。
本發(fā)明還提供了一種在含有核酸的生物樣本中檢測(cè)編碼SEQ ID No.1中氨基酸或其片斷的多聚核苷酸的方法。其步驟是(a)將編碼SEQ ID No.1中氨基酸序列或其片斷的多聚核苷酸與該生物樣本中至少一種核酸雜交，得到一個(gè)雜交復(fù)合物。
(b)檢測(cè)該復(fù)合物，其中該雜交復(fù)合物的存在與該生物樣本中編碼SEQ ID No.1中氨基酸或其片斷的多聚核苷酸的存在密切相關(guān)。另一方面，本方法還包括雜交前對(duì)多聚核苷酸的擴(kuò)增。
定義“LYG2”是指充分純化的LYG2的氨基酸序列或其變異形式，其來(lái)源可以是任何種屬，特別是哺乳類動(dòng)物，包括牛、綿羊、豬、鼠、馬、較佳的是來(lái)源于人的；或是任何方法，可以是天然，合成，半合成或重組來(lái)源。
術(shù)語(yǔ)“激動(dòng)劑”指一個(gè)結(jié)合LYG2后可增強(qiáng)LYG2效果或延長(zhǎng)LYG2有效時(shí)間的分子。激動(dòng)劑可包括蛋白質(zhì)，核酸，碳水化合物或任何其他與LYG2結(jié)合并調(diào)節(jié)其作用的分子。
“等位變異體”是編碼LYG2基因的另一種形式。等位變異體可由核酸順序的至少一個(gè)突變引起，該突變可造成mRNA或多肽的改變，這種改變可能會(huì)也可能不會(huì)引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能的變化。任何一個(gè)特定的天然或重組基因可以沒(méi)有，有一個(gè)或有許多等位形式。
編碼LYG2的“變異”核酸序列包括含有不同核苷酸缺失，插入或替換的核酸順序，這些核酸可以產(chǎn)生一個(gè)與LYG2相同的多核苷酸或帶有至少一個(gè)LYG2功能特征的多肽。此定義還包括了與等位變異體間發(fā)生的一些不恰當(dāng)?shù)幕虿黄谕牡碾s交，這些等位變異體的座位與編碼LYG2的多聚核苷酸的正常染色體座位不同。被編碼的蛋白也可以發(fā)生“變異”，可能含有氨基酸殘基的缺失，插入和替換，還可以引起沉默突變，從而產(chǎn)生與LYG2的功能等同的蛋白質(zhì)。在保留LYG2的生物或免疫活性的前提下，可以基于各殘基極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和雙親性的性質(zhì)對(duì)LYG2的氨基酸進(jìn)行人為的替換。例如，帶負(fù)電的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸，帶正電的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸，具有相似的疏水性的不帶電的極性氨基酸，包括亮氨酸，異亮氨酸和纈氨酸，甘氨酸和丙氨酸，天門(mén)冬酰胺和谷胺酰胺，絲氨酸和蘇氨酸，以及苯丙氨酸和酪氨酸。
術(shù)語(yǔ)“氨基酸”或“氨基酸序列”指一個(gè)寡肽、肽、多肽或蛋白質(zhì)順序，且包括天然及合成分子。本文中，“片段”，“免疫片段”或“抗原片段”指的是較佳的至少10個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的LYG2片斷，或最佳的至少14個(gè)氨基酸。這些片斷有LYG2的一些生物或免疫活性。雖然“氨基酸序列”指天然形成的蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列，“氨基酸序列”以及相似的術(shù)語(yǔ)不應(yīng)局限于本文所述蛋白質(zhì)分子的全長(zhǎng)氨基酸序列。
術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增”指一核酸順序的多份拷貝的制備。擴(kuò)增通常用本領(lǐng)域中所熟知的PCR技術(shù)完成。
術(shù)語(yǔ)“拮抗劑”指的是與LYG2結(jié)合后降低LYG2生物或免疫活性的作用效果或時(shí)間的分子。拮抗劑可包括蛋白，核酸，碳水化合物，抗體或其它任何降低LYG2作用的分子。
術(shù)語(yǔ)“抗體”指能結(jié)合抗原決定簇的完整分子以及片段，如Fab，F(xiàn)(ab′)2及Fv片斷。與LYG2多肽結(jié)合的抗體可用完整的多肽或含有小肽的片斷作為免疫抗原得到。用來(lái)免疫動(dòng)物(如小鼠，大鼠或兔子)的多肽或寡肽可由RNA翻譯或化學(xué)合成得到，且在需要時(shí)可與載體蛋白相聯(lián)。常用的與肽鏈化學(xué)偶聯(lián)的載體包括牛血清白蛋白，甲狀腺球蛋白和匙孔形血藍(lán)蛋白(Keyhole limpet hemocyanin)。偶聯(lián)的蛋白即可用于免疫動(dòng)物。
術(shù)語(yǔ)“抗原決定簇”指與特定抗體接觸的分子的一段(如一個(gè)表位)。當(dāng)一個(gè)蛋白或蛋白片斷被用來(lái)免疫一個(gè)動(dòng)物時(shí)，該蛋白的許多區(qū)域(基于蛋白中的區(qū)域或三維結(jié)構(gòu))可以引起能與抗原決定簇特異結(jié)合的抗體的產(chǎn)生?？乖瓫Q定簇可以與抗原(即引發(fā)免疫應(yīng)答的免疫原)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抗體。
術(shù)語(yǔ)“反義”是指任何一種含有可與一特定核苷酸序列中的“有義”鏈相互補(bǔ)的核苷酸序列的成分。反義分子可由包括合成或轉(zhuǎn)錄的任何方法制備。轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，此互補(bǔ)核苷酸可與細(xì)胞產(chǎn)生的天然順序形成復(fù)式結(jié)構(gòu)，阻礙轉(zhuǎn)錄或翻譯?！柏?fù)”鏈可指反義鏈，“正”鏈可指有義鏈。
術(shù)語(yǔ)“有生物學(xué)活性的”指具有一個(gè)天然分子的結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)或生化功能的蛋白質(zhì)。與此相似，“有免疫活性的”指天然、重組或合成的LYG2或與之有關(guān)的寡肽，它們能在適當(dāng)?shù)膭?dòng)物或細(xì)胞中引發(fā)特定的免疫應(yīng)答并與特定抗體結(jié)合的功能。
術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)”或“互補(bǔ)性”指通過(guò)堿基配對(duì)而形成的多聚核苷酸的天然結(jié)合。例如5′A-G-T3′與互補(bǔ)序列3′T-C-A5′相結(jié)合。兩個(gè)單鏈分子間的“互補(bǔ)性”可以是“部分的”，即僅有一部分核酸可結(jié)合，也可是“完全的”，即兩個(gè)單鏈分子序列完全互補(bǔ)。
“一致序列”指一段核酸順序，該序列可以是為鑒定不確定的堿基而進(jìn)行重復(fù)測(cè)序得到的序列；或者是一段由多個(gè)重疊片斷拼接而成的核酸順序。有些順序?yàn)榱水a(chǎn)生一致序列既被延伸也被拼裝過(guò)。
一個(gè)“缺失”指在一個(gè)氨基酸序列或核苷酸序列中丟失了一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基或核苷酸的變化。
術(shù)語(yǔ)“衍生物”指的是經(jīng)化學(xué)修飾的一個(gè)多肽順序或多核苷酸序列。一個(gè)多聚核苷酸序列的化學(xué)修飾形式包括，烷基化，酰基或氨基基團(tuán)替代等。一個(gè)衍生的多聚核苷酸可編碼一個(gè)多肽，該多肽至少保持有天然分子的一項(xiàng)生物或免疫功能。一個(gè)衍生多肽是經(jīng)糖基化或任何相似過(guò)程作用后，仍保有原多肽的至少一項(xiàng)生物或免疫功能的多肽。
術(shù)語(yǔ)“相似性”指的是互補(bǔ)性的程度，可有部分相似性或完全相似性?！巴恍浴笨梢源妗跋嗨菩浴?。一個(gè)“充分相似”順序指的是一個(gè)部分互補(bǔ)的順序，它可以至少部分抑制一個(gè)相同的順序與靶核酸的雜交。對(duì)完全互補(bǔ)的順序與靶順序的雜交的抑制可通過(guò)在低嚴(yán)緊度的條件下進(jìn)行雜交分析(Southern或Northern雜交等等)來(lái)檢驗(yàn)。一個(gè)充分相似的順序或雜交探針可在嚴(yán)緊度降低的條件下競(jìng)爭(zhēng)并抑制一個(gè)完全相似(相同)的順序與靶順序的雜交。這并不意味著在嚴(yán)緊度降低的條件下允許非特異的結(jié)合發(fā)生，而是在此條件下兩個(gè)順序的結(jié)合要求是特異的(有選擇性的)。檢測(cè)有無(wú)非特異結(jié)合可用另一非互補(bǔ)的(即少于30％相似性或同一性)靶順序來(lái)實(shí)現(xiàn)。如果沒(méi)有非特異結(jié)合，則充分相似的順序或探針不會(huì)和第二個(gè)非互補(bǔ)的靶順序結(jié)合。
“同一性百分比”或“％同一性”指比較兩個(gè)或更多氨基酸序列或核酸順序的序列相同性的百分比。同一性百分比可由電腦測(cè)定，如用PCGENE程序。PCGENE程序可以根據(jù)不同的方法如Clustal方法形成兩個(gè)或以上順序之間的聯(lián)配。Clustal算法通過(guò)比較兩兩序列將序列分成簇。先簇內(nèi)成對(duì)聯(lián)配，再簇間聯(lián)配。如，兩個(gè)氨基酸序列A和B的同一百分比是這樣計(jì)算的將A的序列長(zhǎng)度減去A中未匹配的殘基數(shù)減去B中未匹配的殘基，除以所有A與B中匹配的殘基數(shù)，再乘以100。A和B之間沒(méi)有或有低相似性的間隙序列在計(jì)算同一百分比時(shí)不被包括進(jìn)去。核酸序列之間的同一百分比也可用本領(lǐng)域的其它方法如Jotun Hein方法(見(jiàn)，如，Hein，J.(1990)Methods Enzymol.183626-645.)來(lái)計(jì)算。序列間的相似性也可以用本領(lǐng)域的其它方法如改變雜交條件來(lái)計(jì)算。
“人類人工染色體”(HACs)是含有大約6kb到10Mb的DNA序列的線性微染色體，它含有所有染色體穩(wěn)定的有絲分離及維持所必需要的元件。
“人化抗體”指非抗原結(jié)合部分的氨基酸序列經(jīng)改變而更類似于人類抗體，同時(shí)仍保留有原結(jié)合功能的動(dòng)物抗體。
“雜交”指任何核酸鏈通過(guò)堿基配對(duì)與互補(bǔ)鏈結(jié)合的過(guò)程。
術(shù)語(yǔ)“雜交復(fù)合物”指兩個(gè)核酸序列通過(guò)互補(bǔ)堿基間的氫鍵的形成而產(chǎn)生的復(fù)合物。雜交復(fù)合物可在溶液中形成(如，C0或R0t分析)或者一個(gè)溶液中的核酸序列和一個(gè)固定在固體支持物(如紙，膜，濾膜，芯片，針尖或玻璃片，或其他任何固定了細(xì)胞或核酸的合適的底物)上的核酸序列之間形成。
術(shù)語(yǔ)“插入”或“添加”指對(duì)天然產(chǎn)生的分子的改變，這種改變可在原氨基酸序列或核苷酸序列中添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸。
術(shù)語(yǔ)“免疫應(yīng)答”指與炎癥、創(chuàng)傷、免疫疾病、感染或遺傳性疾病等有關(guān)的情況。這些情況受各種因素的影響，如細(xì)胞因子、趨化因子及其它信號(hào)分子的表達(dá)，它們可影響細(xì)胞和系統(tǒng)的防御體系。
術(shù)語(yǔ)“微矩陣”是指將不同的多聚核苷酸排列在一個(gè)基質(zhì)上如紙、尼龍或其它任何一種膜、濾膜、芯片、玻片或任何其它合適的固體支持物。術(shù)語(yǔ)“元件”或“微矩陣元件”，指的是排列在一個(gè)基質(zhì)表面的可雜交的多聚核苷酸。
術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”指的是LYG2活性的改變。例如，蛋白活性或結(jié)合特征的改變，其它任何生物功能或免疫性質(zhì)的增強(qiáng)或減弱。
術(shù)語(yǔ)“核酸”或“核酸順序”指核苷酸、寡核苷酸、多聚核苷酸及其片斷。它可指基因組來(lái)源的或合成的DNA或RNA，可以是單鏈也可是雙鏈，可以是有義鏈或反義鏈，可以是肽核酸(PNA)，也可是任何DNA樣或RNA樣的物質(zhì)。本文中，“片斷”指翻譯后可產(chǎn)生一段多肽的核酸序列，該多肽應(yīng)保留原有原全長(zhǎng)多肽的某種功能特征如抗原性或某種結(jié)構(gòu)域特征，如ATP結(jié)合位點(diǎn)。
術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”指至少約6-60個(gè)核苷酸，較佳的約15-30個(gè)核苷酸，最佳的約20-25個(gè)核苷酸的核酸順序，這些序列能被用于PCR擴(kuò)增，用于雜交分析或微陣列中。
術(shù)語(yǔ)“肽核甘酸”大體等價(jià)于本領(lǐng)域中一般性地定義的術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增引物”，“引物”，“寡聚體”和“探針”，“肽核酸”(PNA)是指一反義分子或抗基因藥劑，它含有一段寡核苷酸，該寡核苷酸由至少長(zhǎng)約5個(gè)連接在以賴氨酸結(jié)尾的氨基酸殘基組成的肽骨架上的核苷酸組成。末端的賴氨酸使得該組分具有可溶性，肽核酸優(yōu)先與單鏈DNA或RNA互補(bǔ)結(jié)合并終止轉(zhuǎn)錄延伸。(如，見(jiàn)Niclson，P.E.等人，1993，Anticancer DrugDes.853-63)。
術(shù)語(yǔ)“樣品”在這里采用其最廣泛的含義，一個(gè)可能含有編碼LYG2的核苷酸，或其片段，或LYG2本身的生物樣本(可能包括體液，細(xì)胞染色體、細(xì)胞器的提取物，或分離自細(xì)胞的膜)；細(xì)胞，存在于溶液中或結(jié)合于固體支持物上的基因組DNA、RNA或CDNA、組織、組織印跡等等。
術(shù)語(yǔ)“特異結(jié)合”或“特異性結(jié)合”是指蛋白或肽與激動(dòng)劑、抗體或拮抗劑之間的相互作用，這種相互作用依賴于該蛋白特定結(jié)構(gòu)的存在，如抗原決定簇或抗原表位。例如，如果一種抗體對(duì)表位“A”有特異性，則一種含有表位A的多肽的存在，或游離的未被標(biāo)記的A的存在，均會(huì)在一個(gè)包含游離標(biāo)記A和該抗體的反應(yīng)中降低結(jié)合該抗體的標(biāo)記A的量。
術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)緊條件”是指能讓多核苷酸與要求權(quán)利的多核甘酸雜交的條件。嚴(yán)緊條件可由鹽濃度、有機(jī)溶劑濃度(如，甲酰胺，溫度，或其它在本領(lǐng)域中為人熟知的條件來(lái)界定的，尤其是可通過(guò)降低鹽濃度，增加甲酰胺濃度，或提高雜交溫度來(lái)增加嚴(yán)緊性)濃度來(lái)界定。
術(shù)語(yǔ)“基本純的”是指取自天然環(huán)境并被分離的核酸或氨基酸序列，并且至少有60％，較佳的至少75％，最佳地至少90％與天然狀態(tài)下伴隨其的組分分離。
術(shù)語(yǔ)“取代”是指一個(gè)或更多的氨基酸或核苷酸分別被不同的氨基酸或核苷酸替換。
術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”指的是外源DNA進(jìn)入并改變一個(gè)受體細(xì)胞的過(guò)程，依據(jù)本領(lǐng)域中已知的種種方法，轉(zhuǎn)化可以在自然或人工條件下發(fā)生，并可依據(jù)任何已知的方法使外來(lái)核酸序列插入原核或真核宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)化方法要視將被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的類型而定，它可能包括(但不限于)病毒感染、電穿孔、電休克、脂轉(zhuǎn)染法和粒子轟擊。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化的”細(xì)胞包括被穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，在其中，插入的DNA能夠以自主復(fù)制質(zhì)?；蛩拗魅旧w的一部分的形式復(fù)制，也包括被暫時(shí)轉(zhuǎn)化的，在一定時(shí)期內(nèi)表達(dá)插入DNA或RNA的細(xì)胞。
LYG2多肽的“變異形式”指改變了一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基的一個(gè)氨基酸序列。該“變異形式”可具有“保守的”改變，其特征在于替代的氨基酸具有(與被替代者)相似的結(jié)構(gòu)上的或化學(xué)上的性質(zhì)。(例，用異亮氨酸取代亮氨酸)。更為罕見(jiàn)的是，一個(gè)變異形式可能具有“非保守的”改變(如，用色氨酸取代甘氨酸)。類似的次要變異也可能包括氨基酸缺失或插入，或兩者皆有。
術(shù)語(yǔ)“變異形式”，在用于多核苷酸序列時(shí)，包括與LYG2相關(guān)的多核苷酸序列。這個(gè)概念也包含“等同的”(如上定義)、“剪接”“種間”或“多態(tài)”變異形式。一種剪接變異形式可能與參比分子有著顯著的同一性，但由于mRNA加工過(guò)程中外顯子的可變剪接，它通常有更多或更少數(shù)目的多核苷酸。其相應(yīng)的多肽可能會(huì)有額外的功能結(jié)構(gòu)域或結(jié)構(gòu)域的缺失。種間變異形式是那些隨著物種的不同而不同的多核苷酸序列。因而其編碼的多肽相互之間通常會(huì)有顯著氨基酸同一性。一個(gè)多態(tài)變異形式是指在同一不同個(gè)體之間某一特定基因的多核苷酸序列上的變異。多態(tài)變異形式還可能包括“單核苷酸多態(tài)性”(SNP，其中多核苷酸序列僅單個(gè)堿基改變)SNPS的存在或許顯示了，如，某一特定人群，某一疾病狀態(tài)，或某一疾病狀態(tài)的傾向。
在對(duì)本發(fā)明中的蛋白，核苷酸序列和方法進(jìn)行描述前，應(yīng)理解本發(fā)明不限于所描述的特定的方法，操作手冊(cè)，細(xì)胞系，載體和反應(yīng)物，因?yàn)檫@些都是可能改變的。還應(yīng)理解此處所用的術(shù)語(yǔ)僅僅為描述特定的具體情況，而不是為了限制本發(fā)明包括的范圍，本發(fā)明的范圍應(yīng)由附加的權(quán)利要求書(shū)所限制。
必須注意，除非文中清楚地表明為特指，在附帶的權(quán)利要求書(shū)中“一個(gè)”實(shí)際表示的是復(fù)數(shù)。舉例說(shuō)，“一個(gè)宿主細(xì)胞”指的是許多這樣的宿主細(xì)胞，“一個(gè)抗體”指一個(gè)或更多的抗體或本領(lǐng)域人員熟知的其他相應(yīng)物。
除非另有說(shuō)明，此處所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中所理解的意義相同。雖然任何與此處描述的方法或材料相似或相同的方法和材料都可用于檢測(cè)或重復(fù)本發(fā)明，仍有必要描述一下優(yōu)先采用的方法、設(shè)備和材料。此處被引用的文章目的是描述和指出這些文章中報(bào)道的細(xì)胞系，載體和方法，而這些是和本發(fā)明有關(guān)的。
本發(fā)明是基于一種新的人類鵝型溶菌酶(LYG2)及編碼LYG2的多核苷酸的發(fā)現(xiàn)，以及這些成分在診斷、治療或預(yù)防自體免疫/炎癥、腎臟、腎上腺疾病和癌癥方面的應(yīng)用。
在一個(gè)具體實(shí)施例中，本發(fā)明包括一個(gè)含有SEQ ID NO1氨基酸序列的多肽LYG2。LYG2有182個(gè)氨基酸，在殘基T16，S26，T45及T153處有四個(gè)潛在的蛋白激酶C的磷酸化位點(diǎn)。LYG2還有一個(gè)潛在信號(hào)序列(殘基M1到殘基S19左右)。分析顯示，從殘基S4到G174，LYG2與溶菌酶G的特征序列有同源性，LYG2與LYG1有化學(xué)和結(jié)構(gòu)上的相似性，尤其是LYG2與人的鵝型溶菌酶具有31.2％的同一性。LYG2與雞的鵝型溶菌酶都具有四個(gè)在鵝型溶菌酶中保守的半胱氨酸，據(jù)推測(cè)這些半胱氨酸在LYG2的殘基C39，C53，C62和C92處形成二硫鍵。LYG2在D117處含有在鵝型溶菌酶的催化中心保守的天冬氨酸殘基，而在另外兩個(gè)催化中心的殘基位點(diǎn)上有一個(gè)帶電荷的E105殘基和一個(gè)酸性的Q127殘基。
本發(fā)明還包括LYG2的各種變異形式。首選的LYG2變異形式是與LYG2氨基酸序列至少有約80％，更佳地至少約90％，最佳的至少約95％的同一性，并至少包含一個(gè)LYG2功能或結(jié)構(gòu)特征的變異形式。
本發(fā)明還包括編碼LYG2的多核苷酸。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，本發(fā)明包括一個(gè)含有SEQ ID NO2序列的多核苷酸序列，該序列編碼LYG2。
本發(fā)明還包括編碼LYG2的多核苷酸序列的變異形式。特別地，這樣一個(gè)變異多核苷酸與編碼LYG2的多核苷酸序列有至少約70％，更佳地至少約85％，最佳地至少約95％的多核苷酸序列的同一性。本發(fā)明的一個(gè)具體方面包括一個(gè)SEQ ID NO2的變形式，它與SEQID NO.2有著至少約70％，更佳的約85％，最佳地至少約95％的多核苷酸序列同一性。任何一個(gè)上述多核苷酸變異形式均能編碼至少包含一個(gè)LYG2的功能或結(jié)構(gòu)特性的氨基酸序列。
本領(lǐng)域中的技術(shù)人員都知道，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，可能會(huì)產(chǎn)生許多編碼LYG2的多核苷酸序列，其中一些與已知天然存在的基因的多核苷酸序列的相似性都很低，本發(fā)明還包括個(gè)由于選擇了不同密碼子組合而產(chǎn)生的多核苷酸序列的變異形式。這些組合是依照天然存在的LYG2的多核苷酸序列，采用標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)體遺傳密碼而產(chǎn)生的。
LYG2也可由基本不同的核苷酸序列編碼，如編碼序列中包含有非天然存在的密碼子；依照宿主對(duì)特定密碼子的使用頻率，可以選擇密碼子以增加存在于特定原核或真核宿主中肽的表達(dá)速率。其它大范圍更改編碼序列的理由包括產(chǎn)生具有更多合乎需要的性質(zhì)的RNA轉(zhuǎn)錄本，如具有較天然序列產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物有更長(zhǎng)的半衰期。
本發(fā)明還包括編碼LYG2衍生物，或其片段，或其完全通過(guò)合成化學(xué)合成的分段。在合成之后，利用本領(lǐng)域中所熟知的試劑，可以將合成序列插入許多可用的表達(dá)載體和細(xì)胞系統(tǒng)中的任何一個(gè)。而且，可用合成化學(xué)法將突變導(dǎo)入編碼LYG2或其任何一個(gè)片段的序列。
雜交之后的洗滌步驟也可在嚴(yán)緊度上變化。洗滌的嚴(yán)緊條件可由鹽濃度和溫度來(lái)限定。如上，洗滌的嚴(yán)緊度可通過(guò)降低鹽濃度或增高溫度來(lái)提高。例如，洗滌步驟的嚴(yán)緊鹽濃度較佳地不高于30mM NaCl和3mM檸檬酸三鈉，最佳地不高于約15mM NaCl和1.5mM檸檬酸三鈉。洗滌步驟的嚴(yán)緊溫度條件通常至少約25℃，更佳地至少約為42℃，最佳地至少約為68℃。在一個(gè)較佳的實(shí)施例中，可在25℃，30mM NaCl，3mM檸檬酸三鈉和0.1％SDS條件下進(jìn)行洗滌，在一個(gè)更佳的實(shí)施例中，可在42℃，15mM NaCl，1.5mM檸檬酸三鈉和0.1％SDS條件下進(jìn)行洗滌步驟。在一個(gè)最佳的實(shí)施例中，可在68℃，15mM NaCl，1.5mM檸檬酸三鈉和0.1％SDS條件下進(jìn)行洗滌步驟。這些條件的種種有用處的改變?yōu)楸绢I(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員所熟悉。
本領(lǐng)域中，DNA測(cè)序和分析的各種方法為眾人所熟知。這些方法能利用各諸如DNA聚合酸I的Klenow片段，Taq DNA聚合酶或是各種聚合酶和校正外切核酸的組合。較佳地，測(cè)序預(yù)備可由熱循環(huán)控制設(shè)備和儀器自動(dòng)完成，測(cè)序也可自動(dòng)完成，例如使用ABI377測(cè)序系統(tǒng)(PE Biosystems)。序列可由本領(lǐng)域中眾所周知的計(jì)算機(jī)程序和算法來(lái)分析(如PCGENE，Clustal等)。
利用部分核苷酸序列和各種本領(lǐng)域已知的基于PCR的方法來(lái)檢測(cè)上游序列(諸如啟動(dòng)子和調(diào)控元件)可將編碼LYG2的核酸序列進(jìn)一步延伸。例如，利用通用引物和嵌套引物可從克隆在載體上的基因組DNA中擴(kuò)增未知序列(如見(jiàn)Sarkar，G.(1993)PCRMethods Applic，2318-322)。另一種方法，反向PCR利用向不同方向延伸的引物來(lái)從環(huán)狀的模板上擴(kuò)增未知序列。該模板來(lái)源于含有已知基因組座位和周圍序列的限制性片段(如見(jiàn)，Triglia，T.等人(1988)Nucleic Acids Res.168186)，第三種方法是捕獲PCR，它涉及擴(kuò)增人的和酵母的人工染色體中鄰近已知序列的DNA片段(如見(jiàn)，lagerstrom，M.等人(1991)PCR Methods Applic.上111-119)。這種方法可用許多限制性酶消化和連接的手段將一雙鏈核苷酸序列插入未知序列的區(qū)域，再在進(jìn)行PCR。其它可用于獲取未知序列的方法在本領(lǐng)域中已為人們所知。(如見(jiàn)，Parker，J.D.et al.(1991)NaCleic Acids Res.193055-3060)。此外，人們可用PCR和嵌套引物進(jìn)行基因組DNA步移。這個(gè)過(guò)程無(wú)需篩選文庫(kù)并有利于尋找內(nèi)含子/外顯子接頭。對(duì)所有基于PCR的方法而言，引物的設(shè)計(jì)可利用市售軟件，如OLG04.06 Primer AnaLysis Software(National Biosciences Inc.Plymouth，Minn.)或其它合適的程序來(lái)完成，其長(zhǎng)度約為22-30核苷酸，GC比約50％或更高，并可在約68℃-72℃的溫度下與模板進(jìn)行退火反應(yīng)。
當(dāng)篩選全長(zhǎng)cDNA時(shí)，利用已經(jīng)過(guò)大小選擇并含有較大的cDNA的文庫(kù)較佳。當(dāng)用一個(gè)寡聚d(T)文庫(kù)不能獲得全長(zhǎng)cDNA時(shí)，選用隨機(jī)引物文庫(kù)較適合，因?yàn)樗?jīng)常包括含基因的5′區(qū)域的序列，基因組文庫(kù)可用于將序列擴(kuò)延伸至5′端非轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域。
市售毛細(xì)管電泳系統(tǒng)可用于分析或確認(rèn)測(cè)序產(chǎn)物或PCR產(chǎn)物的大小或核苷酸序列。尤其是毛細(xì)管測(cè)序系統(tǒng)，該系統(tǒng)將可流動(dòng)的多聚物用于電泳分離；四種不同的熒光染料以產(chǎn)生核苷酸特異的、由激光激發(fā)的熒光；電荷藕合照相機(jī)裝置用于檢測(cè)熒光發(fā)射的波長(zhǎng)。利用合適的軟件(如GENOTYPER和SEQUENCE NAVIGATOR analysis software(PE Biosystems)可將輸出/光強(qiáng)度轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，而且從上樣到計(jì)算機(jī)分析和顯示電子數(shù)據(jù)的全過(guò)程可由計(jì)算機(jī)控制，毛細(xì)管電泳尤其適用于對(duì)特定樣品中的有限量的cDNA小片段進(jìn)行測(cè)序。
在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，編碼LYG2的多核苷酸序列或其片段可克隆在重組DNA分子，該分子能在合適的宿主細(xì)胞中指導(dǎo)LYG2，或其片段，或其功能等價(jià)物的表達(dá)。由于固有的遺傳密碼的固有簡(jiǎn)并性，可利用其他編碼與LYG2的氨基酸序列大體相同或功能等價(jià)的的DNA序列來(lái)表達(dá)LYG2。
在另一個(gè)實(shí)施例中，利用本領(lǐng)域眾所周知的化學(xué)方法(見(jiàn)，如Caruthers，M.H.等人(1980)Nucl.Acids Symp.Ser(Z)215-223，Hom.T.等人(1980)Nucl.Acids Res.Symp.Ser.225-232)可全部或部分合成編碼LYG2的序列。或者LYG2本身或其片段也可用化學(xué)方法合成。例如，用各種固相技術(shù)(見(jiàn)，如J.Y.Rdearge等人(1995)Science269202-204)可進(jìn)行多肽合成，利用ABI model 43/A肽合成儀(PE Biosystems)可進(jìn)行自動(dòng)合成。此外，在，LYG2或其任何一部分的氨基酸序列都可通過(guò)定向合成和/或與來(lái)自其它蛋白的其任何部分相融合而產(chǎn)生變異多肽。
該肽可由制備型的高效液相色譜來(lái)基本純化。(見(jiàn)，R.M.Chiez和F.Z.Regrier(1990)Methods Enzymol.182392-421)。通過(guò)氨基酸分析或測(cè)序可證實(shí)合成肽的成分(見(jiàn)，如T.Creighton(1984)Proteins，structures and MolecularProperties，WH Freeman and CO.，New York，N.Y.)。
為了表達(dá)具有生物活性的LYG2，將編碼LYG2及其衍生物的核苷酸序列插入到合適的表達(dá)載體中，如，一個(gè)含有能在合適的宿主中對(duì)插入的編碼序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控的必要元件的載體。這些元件包括諸如增強(qiáng)子，組成型和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，載體和編碼LYG2的多核苷酸序列的5′和3′非翻譯區(qū)，這些元件在其調(diào)控能力和特異性上各不相同。特異性的起始信號(hào)可使編碼LYG2的序列進(jìn)行更有效的翻譯。這類信號(hào)包括ATG起始密碼子及其相鄰的序列。如KOZAK序列，倘若編碼LYG2的序列和其起始密碼子及上游調(diào)控序列都插入了適宜的表達(dá)載體，則無(wú)需其它的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)控信號(hào)。然而，如果僅僅是編碼序列，或其一個(gè)片段插入了載體，則包括一個(gè)在框ATG起始密碼子在內(nèi)的外源翻譯，調(diào)控信號(hào)就必需由載體來(lái)提供。外源翻譯元件和起始密碼子可以有不同的來(lái)源——既可以是天然的也可以是合成的。含有適于特定宿主細(xì)胞系統(tǒng)所用的增強(qiáng)子可提高表達(dá)效率。(見(jiàn)，如，D.Scharf等人(1994)Results Probl.Cell Differ.20125-162)。
用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的種種方法，可以來(lái)構(gòu)建包含有編碼LYG2的序列和合適的轉(zhuǎn)錄、翻譯調(diào)控元件的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)及體內(nèi)遺傳重組。(見(jiàn)，如Sambrook等人(1989)，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold spring Llarbor Press，Plainview，N.Y.，第4.8和16-17章，和F.M.Ausbel等人(1995，及定期增刊)Current Protoecols in Molecular Biology，John wiley ofsons，new york，n.y第9.13和16章)可用不同的表達(dá)載體/宿主系統(tǒng)來(lái)包裝并表達(dá)LYG2編碼序列。它們包括(但不限于)微生物，如轉(zhuǎn)化重組噬菌體、質(zhì)?；蛘沉NA表達(dá)載體的細(xì)菌的；轉(zhuǎn)化酵母表達(dá)載體的酵母；用病毒表達(dá)載體(如桿狀病毒)感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞體系；用病毒表達(dá)載體或加括號(hào)細(xì)菌表達(dá)載體(如Ti質(zhì)料或pBR332質(zhì)粒)，(如花椰菜花葉病毒(CaMV)或煙草花葉病毒(TMV))轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞體系；或動(dòng)物細(xì)胞體。本發(fā)明并不被所用的宿主細(xì)胞所限制。
在細(xì)菌體系中依據(jù)編碼LYG2的多核苷酸序列的預(yù)期用途對(duì)克隆和表達(dá)載體可有多種選擇。例如，編碼LYG2的多核苷酸序列的常規(guī)克隆、亞克隆及增殖可以用諸如PBLUESCRIPT噬菌粒(Stratagence)或PSPORT2質(zhì)粒(Life Technologies)等的多功能大腸桿菌載體來(lái)進(jìn)行。由于LYG2編碼序列與載體多克隆位點(diǎn)的連接會(huì)破壞LacZ基因，這使得對(duì)含有重組分子的轉(zhuǎn)化細(xì)菌進(jìn)行比色篩選成為可能。此外，這些載體對(duì)體內(nèi)轉(zhuǎn)錄、雙脫氧測(cè)序，協(xié)同輔助噬菌體進(jìn)行的單鏈拯救，以及在所克隆的序列中造成嵌套缺失很有用處(見(jiàn)，如Van rleeke，G.和S.W.Schuster(1989)J.B.Chem.2645535-5509)。當(dāng)需要大量的LYG2，如，用于產(chǎn)生抗體時(shí)，就要用LYG2定向高水平表達(dá)的載體。例如，可以用含有強(qiáng)誘導(dǎo)型T5或T7噬菌體啟動(dòng)子的載體。
酵母表達(dá)系統(tǒng)可用于生產(chǎn)LYG2。許多含有組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(如α因子，醇氧化酶及PGH)的載體可用于釀酒酵母或pichia Pastors中。此外，這些載體可引導(dǎo)表達(dá)蛋白分泌或滯留于胞內(nèi)，并能夠?qū)⑼鈦?lái)序列整合進(jìn)宿主的基因組以穩(wěn)定增殖。(見(jiàn)，如Ausube，supra；和grant等人(1987)metheds enzymol.153516-554；C.A.Scorer等人(1994)Bio/technology12181-184)。
植物系統(tǒng)也可用于表達(dá)LYG2。LYG2編碼序列的轉(zhuǎn)錄可由病毒啟動(dòng)子，如單獨(dú)使用或與TWV的Ω前導(dǎo)序列聯(lián)合使用的Camv19S和35s啟動(dòng)子(N.Takamatsn(1984)S224838-834，及J.Winter等人(1191)results probl.Cell differ.1785-105)；或者，如RUBISCO的小亞基或熱休克蛋白的啟動(dòng)子等植物啟動(dòng)子(CoruLYG2i，G.et al.(1984)EMBO J.31671-1680；Broglie，R.et al.(1984)Science 224838-843；and Winter，J.et al.(1991)Results Probl.Cell Differ.1785-105.)。這些構(gòu)建物可通過(guò)定向DNA轉(zhuǎn)化或病原體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染而導(dǎo)入植物細(xì)胞。(見(jiàn)，如，S.Hobbs或L.E.Murry在MCGRAW HILL YEARLOOK OF SCIENCE AND Technology(1192)。191-196頁(yè)，Mcgraw hill，New York，N.Y.)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，有多個(gè)基于病毒的表達(dá)系統(tǒng)可用。若用腺病毒作為一個(gè)表達(dá)載體，則可將LYG2編碼序列連接到由晚期啟動(dòng)子和三聯(lián)體前導(dǎo)序列構(gòu)成的腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯復(fù)合體上。在病毒基因組非必需的E1或E3區(qū)的插入可用于獲取在宿主細(xì)胞中表達(dá)LYG2的感染性病毒(見(jiàn)，如J.Logan和T.Shenk(1984)Proc.Natl.Acad.Scio813655-3659)。另外，轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，如勞氏內(nèi)瘤病毒(RSV)增強(qiáng)子，可用于提高在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中的表達(dá)?；赟V40或EBV的載體也可用于高水平蛋白表達(dá)。
人工染色體(HACS)也可用以遞送較質(zhì)粒所能包裝并表達(dá)的DNA片段更大的DNA片段。由常規(guī)的遞送方式(脂質(zhì)體，聚陽(yáng)離子氨基多聚物或囊泡)，可以構(gòu)建并運(yùn)送約6Kb-10Mb的HACs用于治療目的。(見(jiàn)，如J.T.Harringtoo等人(1997)Nat.Genet.15345-355)。
為了在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中長(zhǎng)期產(chǎn)生重組蛋白，首先要使LYG2在細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)。例如，利用含有病毒復(fù)制起點(diǎn)和/或內(nèi)源表達(dá)元件以及位于同一個(gè)載體或不同載體上的選擇性標(biāo)記基因的表達(dá)載體，可將LYG2編碼基因轉(zhuǎn)化進(jìn)入細(xì)胞系。導(dǎo)入載體之后，可讓細(xì)胞在轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基之前先在富集培養(yǎng)基上生長(zhǎng)約1-2天。選擇性標(biāo)記的目的在于賦予對(duì)選擇劑的抗性，且它的存在可讓成功表達(dá)導(dǎo)入序列的細(xì)胞生長(zhǎng)、恢復(fù)。根據(jù)細(xì)胞類型采用合適的組織培養(yǎng)技術(shù)可使穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的抗性克隆增殖。
盡管標(biāo)記基因表達(dá)的存在或不存在暗示了我們感興趣的基因也存在，但該基因的存在與表達(dá)尚需確證。例如，如果LYG2編碼基因插入了標(biāo)記基因序列內(nèi)，則可通過(guò)標(biāo)記基因功能的喪失來(lái)鑒定含有LYG2編碼序列的轉(zhuǎn)化細(xì)胞?；蛘?，將標(biāo)記基因與LYG2編碼序列串聯(lián)放置，并處在單一啟動(dòng)子的控制下，誘導(dǎo)或選擇的作用下標(biāo)記基因的表達(dá)通常也顯示了串聯(lián)基礎(chǔ)的表達(dá)。
一般地，利用各種本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法步驟，可以鑒定含有LYG2編碼核酸序列的和表達(dá)LYG2的宿主細(xì)胞。這些方法步驟包括，但不限于，DNA-DNA或DNA-RNA雜交，PCR擴(kuò)增，以及包括各種基于膜、溶液、芯片對(duì)核酸和蛋白質(zhì)序列進(jìn)行檢測(cè)的方法在內(nèi)的測(cè)定方法。或是利用特異性的多克隆抗體或的單克隆抗體以檢測(cè)和測(cè)量LYG2表達(dá)，這些免疫學(xué)方法在本領(lǐng)域中是已知的。這類技術(shù)的例子包括有酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISAS)，放射免疫測(cè)定(RIAS)，以及熒光激活細(xì)胞分選(FACS)。利用對(duì)LYG2上兩個(gè)相互獨(dú)立的表位有活性的單克隆抗體而進(jìn)行的基于單克隆的雙位點(diǎn)免疫測(cè)定方法當(dāng)為首選，但也可采用競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定法。這些測(cè)定方法和其它測(cè)定方法在本領(lǐng)域中為人所熟知(見(jiàn)，如，R.Hampton等人(1990)serological methods，a laboratory manual，APSPress，stpaul minn.第IV部分；J.Z.coligan等人(1997，及定期增干)CurrentProtocols in ImMmnology，Greene Pub.Associates and wiley-interscience，NewYork，N.Y.；及D.E.maddox等人(1983)J.Exp.med.1581211-1216)大量的標(biāo)記和連接技術(shù)為本領(lǐng)域中的技術(shù)人員所知，這些技術(shù)可用于各種核酸和氨基酸分析。用以產(chǎn)生標(biāo)記雜交探針和PCR探針、以檢測(cè)與編碼LYG2的多核苷酸相關(guān)序列的的方法包括，寡核苷酸標(biāo)記，缺刻平移，末端標(biāo)記或用標(biāo)記的核苷酸進(jìn)行的PCR擴(kuò)增，或者，編碼LYG2的序列或其任何一個(gè)片段都可被克隆進(jìn)載體以產(chǎn)生mRNA探針，這類載體在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，且有市售。通過(guò)添加對(duì)諸如T7、T3或SP6的合適的RNA聚合酶及標(biāo)記的核苷酸，這類載體可用于體內(nèi)合成RNA探針。利用各種市售的試劑盒，如Amersham pharmacia Biotech and proanega(Maddison，wis)提供的試劑盒，可以完成這些流程。合適的報(bào)告分子和標(biāo)記可使檢測(cè)工作易于進(jìn)行，這些分子和標(biāo)記包括放射性同位素，酶、熒光劑，化學(xué)發(fā)光劑或生色劑，也包括底物，輔助因子，抑制劑，磁性顆粒，以及類似物。
轉(zhuǎn)化有編碼LYG2的核苷酸序列的宿主細(xì)胞可在適于蛋白表達(dá)和從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收蛋白的條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白是分泌出去還是停留于細(xì)胞內(nèi)，取決于所用的序列和/或載體。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，含有編碼LYG2的多核苷酸的表達(dá)載體可設(shè)計(jì)成包含信號(hào)序列，該序列指導(dǎo)LYG2分泌通過(guò)原核或真核細(xì)胞膜。
此外，宿主細(xì)胞株的選擇可依據(jù)該細(xì)胞株對(duì)插入序列的表達(dá)的調(diào)控或修飾能力。多肽的這類修飾包括，但不限于乙?；Ⅳ然?、糖基化、磷酸化、脂質(zhì)化，及酰化。蛋白質(zhì)前體的翻譯后加工可以限定蛋白質(zhì)靶向、折疊和/或活性。具有特異的蛋白翻譯后加工能力或機(jī)制的不同宿主細(xì)胞，可以從美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏物(American，TypeCulture Collection)處得到(ATCC，Bathesda，Md)，可以對(duì)這些宿主細(xì)胞加以選擇以確保對(duì)外來(lái)蛋白的正確加工和修飾。
在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，可以將編碼LYG2的天然的、經(jīng)修飾的或重組的核酸序列連接到一個(gè)異源序列上，在任何一個(gè)上述的宿主系統(tǒng)中表達(dá)融合蛋白。例如，含有可被市售抗體識(shí)別的異源成分的嵌合LYG2蛋白能有助于對(duì)肽文庫(kù)的篩選，從而獲得有抑制LYG2活性的抑制劑。異源蛋白成分和多肽組分還可促進(jìn)利用市售親和性基質(zhì)對(duì)融合蛋白的純化。這類組成成分包括，但不限于，谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)，麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)，硫氧還蛋白(Trx)，鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽(CBP)，6-His，F(xiàn)LAG，C-MYC和紅細(xì)胞凝素(HA)。GST、MBP、TRX、CBP和6-His能分別在固定化的谷胱甘肽、麥芽糖、氧化苯胂、鈣調(diào)蛋白樹(shù)脂和金屬螯合樹(shù)脂上純化相應(yīng)的融合蛋白。利用市售的特異識(shí)別這些表位標(biāo)簽的單克隆和多克隆抗體，用FLAG、c-MYE和血凝素(HA)來(lái)免疫親和純化融合蛋白。此外，可以人工構(gòu)造融合蛋白，讓它在LYG2編碼序列和異源蛋白序列之間包含一個(gè)蛋白裂解位點(diǎn)，從而使得LYG2在純化后可與異源成分裂解分開(kāi)。
在本發(fā)明的一個(gè)更為深入的實(shí)施例中，可以完成放射性標(biāo)記的LYG2的體外合成。這些系統(tǒng)偶聯(lián)了T7、T3或SP6啟動(dòng)子的蛋白編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯。翻譯發(fā)生在有放射性標(biāo)記的氨基酸前體，較佳地為Sup35S-甲硫氨的條件下。
LYG2的片段不僅可以由重組產(chǎn)物來(lái)產(chǎn)生，也可以直接用固相合成技術(shù)中的直接肽合成來(lái)產(chǎn)生(見(jiàn)，如，Creighton，supra，pp55-60)。蛋白質(zhì)合成可通過(guò)手工(操作)技術(shù)或自動(dòng)化技術(shù)來(lái)進(jìn)行，例如，使用ABI msdel 43/A肽合成儀(PE Biosystems)可完成蛋白質(zhì)的自動(dòng)合成。可分別合成LYG2的各種片段，然后將它們結(jié)合起來(lái)以產(chǎn)生LYG2的全長(zhǎng)分子。
在LYG2和來(lái)自人的鵝型溶菌酶LYG2之間存在著化學(xué)上和結(jié)構(gòu)上的相似性。此外LYG2在癌性組織、發(fā)炎的組織、腎組織、乳房組織、腎上腺組織、結(jié)腸組織和神經(jīng)組織中有表達(dá)。因而，LYG2主要在自體免疫炎癥、腎臟和腎上腺的疾病及癌癥方面起作用。
因此，在一個(gè)實(shí)施例中，LYG2或其片段或其衍生物可施與受試對(duì)象以治療或預(yù)防自體免疫/炎癥疾病。這類自體免疫/炎癥疾病包括(但不限于)獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)，阿狄森氏病(慢性腎上腺皮質(zhì)機(jī)能減退癥)，成人呼吸障礙綜合癥、過(guò)敏、關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊椎炎、淀粉狀蛋白病、貧血、哮喘、動(dòng)脈粥樣硬化，自體免疫溶血性貧血，自體免疫性甲狀腺炎、腳氣、膽囊炎、接觸性皮炎、局限性回腸炎、過(guò)敏性皮炎，支氣管炎、糖尿、肺氣腫，階段性淋巴球減少癥及淋巴肉芽腫，骨髓成紅細(xì)胞增多癥，紅斑、萎縮性胃炎、血管球性腎炎，肺出血腎炎綜合癥、痛風(fēng)、突眼性甲狀腺腫、橋本甲狀腺炎、嗜酸細(xì)胞綜合癥，急性腸炎、硬化癥、重癥肌無(wú)力、心肌炎或心包炎、骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、胰腺性，多神經(jīng)炎，牛皮癬，賴特綜合癥，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，硬皮病，斯耶格倫綜合癥，系統(tǒng)性過(guò)敏，系統(tǒng)性狼瘡、系統(tǒng)性硬化，血小板減少性紫癜，潰瘍性大腸性，葡萄膜炎，成人早老癥，并發(fā)性癌癥，血滲析及體外循環(huán)，病毒性的、細(xì)菌性、真菌生的、寄生蟲(chóng)性的、原生動(dòng)物性的及腸道寄生蟲(chóng)性的感染和外傷。
在另一個(gè)實(shí)施例中，可將能表達(dá)LYG2或其片段或其衍生物的載體施與受試對(duì)象以治療或預(yù)防自體免疫/炎癥的疾病，這些病包括(但不限于)上述的那些疾病。
在再一個(gè)的實(shí)施例中，可將一含有基本純的LYG2的藥物成分連同一個(gè)合適的藥物載體一起施與受試對(duì)象來(lái)治療或預(yù)防自體免疫/炎癥的疾病，這些包括(但不限于)上述的那些疾病。
在又一個(gè)實(shí)施例中，可將調(diào)節(jié)LYG2活性的激動(dòng)劑施與受試對(duì)象以治療或預(yù)防自體免疫/炎癥的疾病，它們包括(但不限于)以上列舉出的疾病。
因此，在另一個(gè)實(shí)施例中，LYG2或其片段或其衍生物可被施與受試對(duì)象以治療或預(yù)防腎臟疾病。這類腎臟疾病包括(但不限于)腎臟淀粉樣變性病，腎型高血壓；醛甾酮多過(guò)多癥；阿狄森氏??；腎衰竭；血管球性腎炎；慢性血管球性腎炎；腎囊病變及發(fā)育畸形，如多囊病，腎發(fā)育異常以及皮質(zhì)或髓質(zhì)囊，遺傳性腎發(fā)育不良癥(PRD)，如陷性的和常染色體占優(yōu)勢(shì)的PRO髓質(zhì)囊性病；腎臟海綿體樣髓質(zhì)及管裝發(fā)育異常；Alprot氏綜合癥；影響腎臟生理功能的非腎臟癌癥，如支氣管瘤，或腦基部瘤；多種骨髓瘤；腎臟腺癌；轉(zhuǎn)移性腎癌；由消化、注射、吸入或吸收任何藥劑、化學(xué)試劑或生物試劑，如重金屬、任何抗生素、鎮(zhèn)痛藥、溶劑、草酸中誘發(fā)劑、抗癌藥、除草劑、殺蟲(chóng)劑、植物性和生物性的因素或抗癲閑藥引起的對(duì)腎臟有害的疾病。
在另一個(gè)實(shí)施例中，可將能表達(dá)LYG2或其片段或衍生物的載體施與受試對(duì)象以治療或預(yù)防腎臟疾病，這些疾病包括(但不限于)上述的那些疾病。
在再一個(gè)實(shí)施例中，可將含有基本純LYG2的藥物成分連同一個(gè)合適的藥物載體一起施與受試對(duì)象以用來(lái)治療或預(yù)防腎臟疾病，它們包括(但不限于)上面所提供的疾病。
在又一個(gè)實(shí)施例中，可將調(diào)節(jié)LYG2活性的激動(dòng)劑施與受試對(duì)象以治療或預(yù)防腎臟疾病，它們包括(但不限于)以上列舉的疾病。
因此，在另一個(gè)實(shí)施例中，LYG2或其片段或其衍生物可被施與受試對(duì)象以治療或預(yù)防腎上腺疾病。此類腎上腺疾病包括(但不限于)腎上腺皮質(zhì)的增生、癌或腺瘤，堿中毒相關(guān)的高血壓，淀粉樣變性病，血鉀過(guò)少，庫(kù)欣病，liddle氏綜合癥以及Arnold-Healy-Gorden綜合癥，嗜鉻細(xì)胞瘤，以及阿狄森氏病。
在另一個(gè)實(shí)施例中，可將能表達(dá)LYG2或其片段或其衍生物的載體施與受試對(duì)象以治療或預(yù)防腎上腺疾病，它們包括(但不限于)上述的疾病。
在再一個(gè)實(shí)施例中，可將一個(gè)含基本LYG2的藥物成分連同一個(gè)合適的藥物載體一起施與受試對(duì)象來(lái)治療或預(yù)防腎上腺疾病，它們包括(但不限于)以上提供的疾病。
在又一個(gè)實(shí)施例中，可將調(diào)節(jié)LYG2活性的激動(dòng)劑施與受試對(duì)象來(lái)治療或預(yù)防腎上腺疾病，它們包括(但不限于)以上所列出的疾病。
在再一個(gè)實(shí)施例中，可將LYG2的拮抗劑施與受試對(duì)象以治療或預(yù)防癌癥。這樣的癌癥包括(但不限于)腺瘤，白血病，淋巴瘤，黑素瘤，骨髓瘤，肉瘤，畸胎瘤，且尤其包括腎上腺癌，膀胱癌，骨癌，骨髓癌，腦癌，乳腺癌，子宮頸癌，膽囊癌，神經(jīng)中樞癌，胃腸道癌，心臟癌，腎臟癌，肝癌，肺癌，肌癌，卵巢癌，胰腺癌，甲狀旁腺癌，陰莖癌，前列腺癌，唾液腺癌，皮膚癌，脾癌，睪丸癌，胸腺癌，甲狀腺癌以及子宮癌。一方面，特異性結(jié)合LYG2的抗體可以作為拮抗劑而被直接利用或是作為將藥劑帶入表達(dá)LYG2的細(xì)胞或組織的靶向機(jī)制或送遞機(jī)制而被間接利用。
在一個(gè)附加的實(shí)施例中，可將一個(gè)表達(dá)LYG2編碼多核苷酸的互補(bǔ)鏈的載體施與受試對(duì)象，為了治療或預(yù)防癌癥，這類癌癥包括(但不限于)上述的的癌癥。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明中的任何一個(gè)蛋白、拮抗劑、抗體、激動(dòng)劑、互補(bǔ)序列或載體都可結(jié)合其他合適的治療藥劑一起施用。依照常規(guī)的藥物學(xué)原理，本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員就能完成用于復(fù)合療法的合適藥劑的選擇。不同治療藥劑的復(fù)合可以協(xié)同作用而影響上述各種疾病的治療和預(yù)防。通過(guò)這種途徑，人們用更少劑量的各種藥物就能達(dá)到治療功效，因而也降低了不利副作用的可能性。
運(yùn)用本領(lǐng)域中通常已知的方法就可產(chǎn)生LYG2的拮抗劑。特別地，純化的LYG2可以用來(lái)產(chǎn)生抗體，或是用來(lái)篩查藥劑庫(kù)以鑒定特異性結(jié)合LYG2的藥劑。針對(duì)LYG2的抗體還可利用本領(lǐng)域中為人熟知的方法來(lái)產(chǎn)生。這類抗體包括(但不限于)多克隆抗體；單克隆抗體，嵌合抗體和單鏈抗體，F(xiàn)ab片段，以及由Fab表達(dá)文庫(kù)產(chǎn)生的片段。中和抗體(如抑制二聚體形成的中和抗體)，尤為適用于治療。
為產(chǎn)生多克隆抗體，可注射LYG2或其任何具有免疫原性的片段或寡肽來(lái)免疫各種宿主，它們包括山羊、兔、大鼠、小鼠，人及其它宿主。對(duì)于涉及產(chǎn)生單克隆抗體的下游應(yīng)用而言，大鼠和小鼠是首選的宿主。為增強(qiáng)免疫應(yīng)答，根據(jù)宿主的不同可選用各種佐劑。這樣的佐劑包括(但不限于)Freund′s佐劑；礦物凝膠，如氫氧化鋁；表面活性物質(zhì)，如溶血卵磷酯；聚陽(yáng)離子；油乳劑；匙孔戚血藍(lán)蛋白(KLH)；以及二硝基苯酸。在用于人的佐劑中，B CG(卡介菌)尤為適宜。(關(guān)于對(duì)抗體產(chǎn)生和分析方法的評(píng)論，可見(jiàn)，如，E.Harlew和D.Lare(1988)AntibodiesA Laboratory Manual，cold springhartor Laboratore，cold spring harbor，N.Y.)。
較佳地，用于誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)LYG2的抗體的寡肽、肽或片段具有一個(gè)至少約由5個(gè)氨基酸構(gòu)成的氨基酸序列，更佳地，至少約由14個(gè)氨基酸構(gòu)成。較佳地，這些寡肽或其片段與天然蛋白的部分氨基酸序列是同一的，并且包含了一天然存在的小分子的完整的氨基酸序列。短的LYG2氨基酸片段可以與另一蛋白如KLH的短氨基酸片段融合，從而可以用于產(chǎn)生針對(duì)嵌合分子的抗體。
制備LYG2的單克隆抗體，可利用培養(yǎng)連續(xù)傳代細(xì)胞株以產(chǎn)生抗體分子的技術(shù)。這些技術(shù)包括(但不限于)雜交瘤技術(shù)，人類B細(xì)胞雜交瘤持術(shù)，以及EBV雜交瘤技術(shù)。(見(jiàn)，G.Koller等人(1975)Nature256495-497；D.Kozbor等人(1985)J.Immunol.Methodsgl31-42；R.J.cote等人(1983)proc.Natl.Acad.Sci.802026-2030；以及S.p.cole等人(1984)Mol.Cell Biol.62109-120)。
此外，可利用已開(kāi)發(fā)的用于產(chǎn)生“嵌合抗體”的各種技術(shù)，如將小鼠抗體基因剪接到人的抗體基因上以獲取具有合適的抗原特異性和生物活性的分子。(見(jiàn)，M.s.newberger等人(1984)nature312604-608和S.Takeda等人(1985)Nature314452-454；以及S.l.Morridon等人(1984)proc.Natl.acad.Scil816851-6855)?；蛘?，利用本領(lǐng)域中已知的方法，可以利用上述用以產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)來(lái)產(chǎn)生LYG2特異性的單鏈抗體。通過(guò)免疫球蛋白文庫(kù)的鏈隨機(jī)組合改組，可以產(chǎn)生具有相關(guān)特異性而又不同的獨(dú)特型抗體(見(jiàn)，如D.R.Burton(1991)proc，nal.acad.sci.8810134-10137)。
可以在體內(nèi)淋巴細(xì)胞群中誘導(dǎo)抗體的生成?；蛘?，如同文獻(xiàn)中所揭示的那樣，通過(guò)篩選免疫球蛋白文庫(kù)或系列高特異性結(jié)合的試劑來(lái)產(chǎn)生抗體。(見(jiàn)，R.Orlandi等人(1989)proc，nal.acad.sci.883833-3837；以及G.Winter等(1991)nature349293-299)也可產(chǎn)生含有LYG2特異性結(jié)合經(jīng)點(diǎn)的抗體片段。這類片段包括(但不限于)；用胃蛋白酶消化抗體分子而產(chǎn)生的F(ab)′2片段，以及還原F(ab)′2片段的二硫橋而產(chǎn)生的Fab片段?；蛘?，構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(kù)以便快速而簡(jiǎn)單地鑒定帶有所預(yù)期的特異性的單克隆Fab片段。(見(jiàn)W.D.Huse等人(1989)science2461275-1281)。
許多免疫測(cè)定法可以用于抗體篩選，以便鑒定出兼有所期望的特異性和最小交叉反應(yīng)性的抗體。本領(lǐng)域中有許多已知的免疫測(cè)定方案。這些方案利用單克隆抗體或多克隆抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合或免疫放射分析。通常包括對(duì)LYG2與其特異性抗體形成的復(fù)合物的測(cè)量，利用對(duì)2個(gè)相互不干擾的LYG2抗原表位具有反應(yīng)性的單克隆抗體進(jìn)行的基于單克隆、雙位點(diǎn)的免疫分析法則更佳，但競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分析法也可以應(yīng)用。
通過(guò)估計(jì)這些多抗的滴度和親合度可以進(jìn)一步確定它們的質(zhì)量及對(duì)某種下游應(yīng)用的適合度。例如，一種多克隆抗體制備物至少應(yīng)含1-2mg特異性抗體/ml，且最好為5-10mg/ml，才適用于需要進(jìn)行LYG2-抗體復(fù)合物沉淀反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)操作。測(cè)定抗體特異性、滴度、親合度的方法，以及在各種應(yīng)用中抗體性質(zhì)和用途的說(shuō)明介紹通常是易得到的(參見(jiàn)e.g.catty，supra and doligan et al.supra)。
在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，編碼LYG2的多核苷酸，或其片段，或其互補(bǔ)序列可被用于治療。一方面，編碼LYG2的多核苷酸的互補(bǔ)序列可用于阻礙mRNA轉(zhuǎn)錄。一定條件下，細(xì)胞可被編碼G OLY的多核苷酸的互補(bǔ)序列所轉(zhuǎn)化。因此，互補(bǔ)分子或互補(bǔ)片段可用于調(diào)節(jié)LYG2活性，或調(diào)節(jié)基因功能?，F(xiàn)在在本領(lǐng)域中這種技術(shù)是很普遍的，寡聚核苷酸或大片段或它們的反義序列可通過(guò)LYG2編碼序列上的編碼區(qū)或控制區(qū)上的各種位點(diǎn)來(lái)設(shè)計(jì)。
各種源于逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、皰疹病毒、痘病毒或各種細(xì)菌質(zhì)粒的表達(dá)載體可用于將核苷酸序列轉(zhuǎn)入目的器官、目的組織或細(xì)胞群中。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各項(xiàng)技術(shù)可用于構(gòu)建載體，以表達(dá)LYG2編碼序列的互補(bǔ)序列(見(jiàn)，e.g.，sambrook supra，andAusubel，supra)。
通過(guò)用可高水平表達(dá)多核苷酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞或組織，編碼LYG2的基因或其片段可被關(guān)閉。這一類構(gòu)建物可用于介導(dǎo)非翻譯序列或反義序列進(jìn)入細(xì)胞。即使在與DNA缺乏整合性的情況下，這一類載體可以繼續(xù)轉(zhuǎn)錄RNA分子直至內(nèi)源核酸酶使它們失活。在不能復(fù)制載體的情況下，瞬時(shí)表達(dá)可持續(xù)一個(gè)月或更長(zhǎng)，如在載體系統(tǒng)具有合適的復(fù)制因子的情況下，持續(xù)時(shí)間可進(jìn)一步延長(zhǎng)。
如上所述，通過(guò)對(duì)LYG2編碼基因的控制區(qū)、5′區(qū)或調(diào)控區(qū)的互補(bǔ)序列或反義分子(DNA，RNA或PNA)進(jìn)行設(shè)計(jì)，可以對(duì)表達(dá)基因進(jìn)行修飾。來(lái)源于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)處的寡核苷酸，例如來(lái)源于-10到+10區(qū)的寡核苷酸是優(yōu)先的選擇。類似地抑制作用可通過(guò)三螺旋堿基配對(duì)法產(chǎn)生。由于它使雙螺旋鏈不能充分解鏈，從而抑制了DNA與多聚酶、轉(zhuǎn)錄因子或調(diào)控分子的結(jié)合，故非常有用，近來(lái)利用三為螺旋DNA的療法已在文獻(xiàn)中有所闡述(見(jiàn)e.g.，gee，j.e.等(1994)in Huber，B.E.and B.I.carr，holecnlar andImmunologic Aproaches，F(xiàn)utura Publishing Co.，Mt.Kisco，N.T.，PP163-177)。通過(guò)設(shè)計(jì)互補(bǔ)序列或反義分子可以阻礙mRNA結(jié)合于核糖體而抑制mRNA的翻譯。
核酶，是具有酶活性的RNA分子，也可用于催化RNA特異切割位點(diǎn)的裂解。核酶反應(yīng)的機(jī)制涉及到核酶分子與互補(bǔ)靶RNA的特異性結(jié)合，隨之是靶RNA的裂解。例如，人工合成的錘型花式的核酶分子可特異性并有效地催化LYG2編碼序列的裂解。靶RNA上任何潛在的的特異性核酶作用位點(diǎn)可由掃描靶分子初步檢測(cè)出，這些位點(diǎn)包括以下一些序列GUA、GUU和GUC。與靶RNA中核酶作用位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的短RNA序列(15～20bp)一旦被撿出，就應(yīng)對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行估測(cè)，因?yàn)槟承┒?jí)結(jié)構(gòu)會(huì)使得寡核苷酸無(wú)法被操作。侯選目標(biāo)的適合性也可通過(guò)RNA酶保護(hù)分析法測(cè)試其與互補(bǔ)寡核苷酸的雜交難易來(lái)確定。
本發(fā)明中的互補(bǔ)核糖核酸分子及核酶可通過(guò)本領(lǐng)域中任何已知的合成核酸分子的方法來(lái)制備。這些技術(shù)中包括化學(xué)合成法，如固相亞磷酰胺固相合成法。此外，RNA分子可由LYG2的編碼序列的體外轉(zhuǎn)錄或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生。這些DNA序列可克隆至一大類具有T7或sp6RNA多聚酶啟動(dòng)子等合適啟動(dòng)子的載體中?；蛘?，也可將組成型或誘導(dǎo)型地合成互補(bǔ)RNA的cDNA構(gòu)建物導(dǎo)入細(xì)胞株、細(xì)胞或組織中。
RNA分子可加以修飾以增進(jìn)其在胞內(nèi)的穩(wěn)定性和半衰期。可能的修飾形式包括(但不限于)在分子的5′和、或3′末端加上側(cè)翼序列，或用硫代磷酯鍵或2′0-甲基鍵代替分子主鏈間的磷酸二酯鍵連接。這些修飾形式同樣適用于PNAs的制備并可被擴(kuò)展到其它核苷酸分子中，包括非普通堿基如肌苷、也包括酰基化、甲基化、硫化或其它類似修飾形式的胸腺嘧啶、胞嘧喧、鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤及尿嘧啶。這些修飾形式不易為內(nèi)源核酸內(nèi)切酶識(shí)別。
有許多方法可制備導(dǎo)入細(xì)胞或組織的載體，并同樣適于體內(nèi)和體外療法。對(duì)于exvivo療法，載體先導(dǎo)入從病人身上取出的干細(xì)胞中，再克隆增殖細(xì)胞，通過(guò)自體移植又轉(zhuǎn)回原病人中。
上述方法可通過(guò)轉(zhuǎn)染、淋巴注射、或聚陽(yáng)離子氨基聚合物等方式達(dá)到導(dǎo)入載體的目的(Goldamn.C.K.et al.1997.Nature Biotechnology 15462-466)?？捎糜谛枰睡煼ǖ娜魏螌?duì)象，包括哺乳動(dòng)物如狗、貓、牛、羊、兔、猴，最佳的是人類。
在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，涉及到藥物組分或無(wú)菌組分與可載藥的載體相配合的使用以達(dá)到上述治療效果的問(wèn)題。這些藥物組份包括LYG2，LYG2的抗體以及LYG2的模擬物、興奮劑、拮抗劑、抑制劑，這些組份可被單獨(dú)使用或至少與一種其它藥劑配合使用。如一種穩(wěn)定的可用于任何無(wú)菌的、可在生物體內(nèi)存在的包括(但不限于)鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖水，的復(fù)合物。這些組份可單獨(dú)施用于病人，或與其它藥劑藥物及激素配合使用。
本發(fā)明中的藥物組份可通過(guò)任何途徑施用。包括(但不限于)口服、靜脈注射、肌注、動(dòng)脈注射、骨髓注射、皮下注射或腹膜注射方式。
除了活性組份以外，這些藥物成份還包括合適的含激發(fā)劑和輔劑的可承載藥物的載體，它有助于將活性復(fù)合物轉(zhuǎn)為可使用的藥物成份。更進(jìn)一步的生成和使用技術(shù)細(xì)節(jié)參見(jiàn)最新版的remington′s pharmacentical silences lmaack publishing.Co.，Easton，pa.。
供口服的藥物成份可用本領(lǐng)域中為普通技術(shù)人員所知的適合口服的各種藥劑載體承載。這些藥物成份以藥片、藥丸、糖丸、膠囊、流質(zhì)、懸浮劑等形式供病人吸收。
制備供口服的藥物時(shí)，可將活性成份與固體固型劑混合研磨成顆粒狀混合物，再制成藥片或糖丸核心，并可以加上適當(dāng)?shù)妮o劑。合適的固型劑包括糖和蛋白類填充劑，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖酶，從玉米、麥、米、土豆或其它植物中提取的淀粉，纖維素如甲基化纖維素或-纖維或甲基鈉纖維素，樹(shù)膠以及蛋白如明膠、膠原。需要的話，還可加上分散劑和促溶劑，如瓊脂、藻酸及其鹽，如固體藻酸鹽。
糖丸核心必須與合適的包衣結(jié)合，如飽合糖溶液，(也可含阿拉伯樹(shù)膠，聚乙烯毗略烷酮，聚乙烯二醇和/或二氧化鈦)及合適的有機(jī)溶劑或混合溶劑，可在藥片或色素以區(qū)分產(chǎn)品或標(biāo)明活性成份的數(shù)量，如劑型等。
可口服的藥物制成品包括由明膠制成的契合型膠囊和由明膠及葡萄糖酶、山梨糖酶三類色衣制成的軟的、密封的膠囊。契合型膠囊除含有活性成份外，還含有填充型和結(jié)合(如乳糖或淀粉)、潤(rùn)滑劑(如talcum粉或硬脂酸鎂)，此外還有穩(wěn)定劑。在軟膠囊中，活性成份溶解或懸浮在合適的液體中。如油脂，液體或聚乙烯二醇液體，它們中可加入穩(wěn)定劑。
注射用藥物劑型可以是水溶液配方的，更佳地是生理兼容性緩沖液如Hanks溶液或生理鹽水。注射劑可含有可增加懸浮液粘度的物質(zhì)如羧甲基鈉纖維素，山梨糖醇或右旋糖苷，此外，活性復(fù)合物懸浮液亦可制成油脂型的懸浮注射劑。合適的親脂性溶劑或媒介物包括脂肪，(如芝麻油)，或合成脂肪酸酯，(如乙基油酸鹽)，三甘油酯，或脂質(zhì)體。非脂質(zhì)聚陽(yáng)離子氨基高聚物亦可用作媒介物。此外，懸浮液也可含適用的穩(wěn)定劑或增加復(fù)合物溶解性的藥劑，以制備高濃度的溶液。
用于局部或鼻部給藥的配方中，含有本領(lǐng)域中通常所知的可透過(guò)特殊障礙的滲透劑。
本發(fā)明中的藥劑成份可通過(guò)本領(lǐng)域中的已知的方式生產(chǎn)如常規(guī)的混合、溶解、顆粒、制丸、研粉、乳化、封裝或凍干過(guò)程。
這些藥物成份能與多種酸結(jié)合形成鹽，并以鹽的形式保存。這些酸包括(并不限于)鹽酸、硫酸、醋酸、乳酸、酒石酸、蘋(píng)果酸及琥珀酸。鹽較之相應(yīng)的基本成分而言更易溶解于水溶液或其它質(zhì)子溶劑中。在其它例子中，更佳的制成品是凍干粉形式的，可包括以下部分或全部成份，1mm-50mm的組氨酸，0.1％到0.2％蔗糖，2％gc 7％的甘露醇，PH范圍為4.5到5.5，將它們?cè)谑褂们芭c緩沖液混合。
在另一實(shí)施例中，與LYG2特異性結(jié)合的抗體可用表達(dá)于以LYG2為特征的疾病的診斷，或用于對(duì)給予LYG2或LYG2的激活劑，拮抗劑或抑制劑治療的病人的監(jiān)控分析。用于診斷目的的抗體可用以上描述相同方式制備。對(duì)LYG2的診斷分析包括利用該抗體及標(biāo)記檢測(cè)人體液細(xì)胞或組織抽提物中的LYG2。該抗體可以經(jīng)或未經(jīng)修飾，亦可將其與報(bào)告分子共價(jià)或非共價(jià)連接而標(biāo)記。本領(lǐng)域中有許多報(bào)告分子可以利用，其中幾個(gè)上文已提及。
許多本領(lǐng)域普通技術(shù)員所掌握的方案可用來(lái)測(cè)量LYG2，包括ELISA，RIA，及FACS等，它們?yōu)樵\斷LYG2表達(dá)水平的改變或異常變化提供了基礎(chǔ)。正常的或標(biāo)準(zhǔn)的LYG2表達(dá)值可由下述過(guò)程確定將正常實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)象(最好是人)的體液或細(xì)胞提取物，在適合復(fù)合物形成的條件下與LYG2抗體結(jié)合。標(biāo)準(zhǔn)的復(fù)合物含量可通過(guò)各種方法定量測(cè)定，更佳的是光學(xué)測(cè)量方式。將LYG2在實(shí)驗(yàn)對(duì)象、對(duì)照和活體組織的病變樣品中表達(dá)的測(cè)量值與標(biāo)準(zhǔn)值比較，兩者間的差異可用于確定疾病診斷的參數(shù)。
在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，編碼LYG2的多核苷酸可用于診斷目的，此類多核苷酸包括寡聚核苷酸序列，互補(bǔ)RNA、DNA分子及PNA分子，這些多核苷酸可用于檢測(cè)及定量測(cè)定活體組織中的基因表達(dá)，其中，LYG2表達(dá)可能與疾病相關(guān)。診斷分析可用于測(cè)定LYG2表達(dá)的喪失、存在及過(guò)量情況，并用來(lái)監(jiān)測(cè)治療間期LYG2的調(diào)整水平。
該探針宜包含SEQ ID No.2中10-846個(gè)連續(xù)核苷酸構(gòu)成的序列或其互補(bǔ)鏈序列。探針可用于相關(guān)序列的檢測(cè)，該探針與任何LYG2編碼序列最好能有至少50％的序列同一性，本發(fā)明的雜交探針可以是DNA或RNA。
制備編碼LYG2的DNA的特異性探針的方法有將編碼LYG2或LYG2衍生物的多核苷酸克隆到制備mRNA探針的載體中，這些載體是本領(lǐng)域中已知的，市售的，并可用于通過(guò)添加合適的RNA多聚酶及合適的標(biāo)記核苷酸的方式離體合成RNA探針。雜交探針可為各種報(bào)告基因所標(biāo)記，如放射性核苷，如32P或35S，及酶標(biāo)，如通過(guò)親合素/生物素偶聯(lián)系統(tǒng)與探針偶聯(lián)的堿性磷酸酶，以及其它類似方法。
編碼LYG2的多核苷酸可用于與LYG2表達(dá)相關(guān)的疾病的診斷。這些疾病包括(但不限于)自身免疫病/炎性病，如獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)，Addison′s病，成人呼吸困難綜合癥、過(guò)敏、關(guān)節(jié)僵硬性脊椎炎、淀粉樣病變、貧血、哮喘、動(dòng)脈粥樣硬化、自身免疫溶血性貧血、自身免疫性甲狀腺炎、腳氣、膽囊炎、接觸性皮炎，Crohn′s病，過(guò)敏性皮炎、支氣管炎、糖尿病，肺氣腫階段性淋巴球減少癥及淋巴肉芽腫，骨髓成紅血細(xì)胞增多型、紅斑、萎縮性胃炎、血管球性腎炎、Goodpasture′s綜合癥、痛風(fēng)、Grave′s病、急性腸炎、硬化癥、嚴(yán)重肌力癥、心肌炎、心包炎、骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、胰腺炎、多神經(jīng)炎、牛皮癬、Reiter′s綜合癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮病、siogren′s綜合癥、系統(tǒng)性多種過(guò)敏，系統(tǒng)性狼瘡、系統(tǒng)性硬化、血小板減少性此癜、潰性大腸炎；葡萄膜炎；werner綜合癥、并發(fā)性癌癥、血滲析及體外循環(huán)、濾過(guò)性毒菌的、細(xì)菌性的、真菌性的、寄生性的、原生動(dòng)物的及腸道寄生蟲(chóng)的感染、外傷；腎病如腎臟淀粉樣性病、高血壓；醛甾酮過(guò)多癥；addison′s病，腎衰竭；血管球性腎炎、慢性血管球性腎炎、腎囊的病變及發(fā)育畸形如多囊病，腎發(fā)育異常，及皮質(zhì)式髓質(zhì)囊；遺傳性的腎發(fā)育不良癥(PRD)如隱性和常染色體占優(yōu)勢(shì)的PRD髓質(zhì)囊性病，腎臟海綿體樣髓質(zhì)及管狀發(fā)育異常；Alprot′s綜合癥；影響腎生理功能的非腎臟癌癥，如支管痛或腦基部瘤；多種骨髓瘤；胰癌；志移性腎癌；由消化、注射、吸入或吸收任何藥劑、化學(xué)試劑或生物試劑如重金屬、任何抗生素；鎮(zhèn)痛藥、溶劑、抗癌藥、除草劑、殺蟲(chóng)劑、植物性的和生物性的及某些對(duì)胃有害的疾病，腎上腺疾病如增生、癌、或腺瘤與堿中毒有關(guān)的高血壓，淀粉樣變性病、胰癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、肉瘤、畸胎瘤，以及特別地，腎上腺癌、膀胱癌、骨癌、骨髓癌、腦癌、乳房癌、子宮頸癌、膽囊、神經(jīng)中樞癌、胃腸道癌、心癌、腎癌、肝癌、肺癌、肌癌、卵巢癌、胰腺癌、副甲狀腺癌、陰莖癌、前列腺癌、唾腺癌、皮膚癌、脾癌、睪丸癌、胸腺癌、甲狀腺癌及子宮癌。編碼LYG2多核苷酸序列可用于Southern或Northern分析，或其它基于膜技術(shù)的分析，用于PCR技術(shù)；量桿、針尖及ELISA類分析；以及用于病人體液或組織的微矩陣分析以檢測(cè)LYG2表達(dá)的變化。這些定性或定量分析方法都是本領(lǐng)域中熟知的。
編碼LYG2的核苷酸序列可用常規(guī)方法標(biāo)記，然后在適合雜交復(fù)合物形成的條件下加入到病人的體液或組織樣品中。經(jīng)過(guò)溫浴后，洗滌樣品，定量測(cè)量信號(hào)值并與標(biāo)準(zhǔn)值比較，如果病人樣品中的信號(hào)值與對(duì)照組相比有明顯改變，則編碼LYG2的核苷酸水平的改變表明相關(guān)病變的存在。這些分析在動(dòng)物研究及臨床實(shí)驗(yàn)中，可用于評(píng)價(jià)某一特定療法的功效。也可用于監(jiān)測(cè)某一病例的治療過(guò)程。
為了提供與LYG2表達(dá)相關(guān)的病變的診斷基礎(chǔ)，必須確定正常的或標(biāo)準(zhǔn)的LYG2表達(dá)的分布圖，這可以通過(guò)以下方面獲得將來(lái)自動(dòng)物或人的正常對(duì)象個(gè)體中提取的體液或細(xì)胞抽提物，在適合雜交或擴(kuò)增的條件下，與編碼LYG2的序列或其片段混合。通過(guò)比較此正常對(duì)象的值與另一實(shí)驗(yàn)中由定量的基本純的多核苷酸得出的值，就可得出標(biāo)準(zhǔn)的雜交的數(shù)量值，通過(guò)此方式得出的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)值可與從具有病變癥狀的病人提出的樣品的值比較，偏離的大小就可用來(lái)確定是否存在病變。
一旦確定了病變的存在并開(kāi)始實(shí)施治療方案后，可定期重復(fù)進(jìn)行雜交分析以確定病人中的表達(dá)水平是否開(kāi)始接近正常個(gè)體中觀測(cè)到的水平，連續(xù)的分析結(jié)果可用來(lái)顯示一段時(shí)間的治療功效，從幾天到數(shù)月。
根據(jù)LYG2編碼序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸的其它診斷用途涉及PCR的使用，這些寡聚物可由化學(xué)合成，酶切產(chǎn)生，或體外生成，寡聚物最好含有LYG2編碼序列的片段，或含有與其互補(bǔ)的片段，將它們?cè)趦?yōu)化的條件下應(yīng)用可以鑒定特定的基因或狀況，寡聚物也可在低嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下用以檢測(cè)或定量測(cè)量相近的DNA或RNA序列。
可用來(lái)定量分析LYG2表達(dá)的方法包括放射性標(biāo)記或生物素化核苷酸，對(duì)照核酸共擴(kuò)增，以及基于標(biāo)準(zhǔn)曲線的推導(dǎo)(見(jiàn)e.g.melby，d.c.et al.(1993)J.Imaunol.Methods 159235-244；及Duplaa，C.et al.(1993)Anal.BiocheM 212224-236)，多個(gè)樣品定量分析可通過(guò)類似ELISA的分析來(lái)快速得到結(jié)果。該方法中，寡聚物被稀釋到不同濃度，以分光光度法量熱法就可快速定量。
在另一實(shí)施例中，從以上的描述的多聚核苷酸序列獲得的寡核苷酸或其全長(zhǎng)片段可作微矩陣的對(duì)象，微矩陣列可用于同時(shí)檢測(cè)大量基因的表達(dá)水平，并可檢測(cè)出基因變異、突變及多態(tài)現(xiàn)象。這些信息可用于推斷基因功能，理解疾病產(chǎn)生的基因基礎(chǔ)，診斷疾病，并可改進(jìn)及監(jiān)測(cè)藥劑的活性。
微排列方法可通過(guò)本領(lǐng)域中已知方式去準(zhǔn)備，應(yīng)用及分析(見(jiàn)e.g.Brennan，T.M.et al.(1995)U.S.Pat.no.5,474,796；Schena，M.et al(1996)Proc.Natl，AcadSci，9310614-10619)PCT appvication wo95/35505，Heller，R.A.et al.(1997)Prol.Natl.Acad.Sci.942510-2155；and Heller，M.J.et al.(1197)U.S Pat No.5,605,622)。
在本發(fā)明另一實(shí)施例中，編碼LYG2的核酸序列可用于生成對(duì)天然基因組序列定位有用的探針，該序列可被定位于某一染色體，染色體某一特殊區(qū)域，或人工染色體構(gòu)建物，如人類人工染色體(HALs)，酵母人工染色體(YACs)，細(xì)菌人工染色體(BALs)，細(xì)菌PI構(gòu)建物，或單一染色體的cDNA文庫(kù)(見(jiàn)e.g.Price，L，M.(1993)Blood Rev.7127-134；及Trask，B.J.(1191)Trends Genet.7149-154)。
熒光原位雜交技術(shù)可與其它物理制圖譜技術(shù)及基因圖譜數(shù)據(jù)結(jié)合(見(jiàn)e.g.Heinz-Ulrich等(1995)in Meyers，R.A.led)Molecular Biology and Biotechnology，VCHPublishers New York，N.T，PP965-968)。在各類科學(xué)手冊(cè)或OMIM站點(diǎn)上可查到基因圖譜數(shù)據(jù)的例子，LYG2編碼基因在物理圖譜上的位置與某特殊疾病或某一疾病易感性的關(guān)系可用于確定與此疾病關(guān)聯(lián)的DNA的位置，本發(fā)明的核苷酸序列可用于檢測(cè)正常者、攜帶者及發(fā)病者之間基因序列的不同。
在染色體原位雜交制備物和制物理圖譜技術(shù)方面，如采用確定染色體標(biāo)記的連索分析，可用于進(jìn)一步擴(kuò)展基因圖譜。通常，即使在位于人類第幾條染色體或長(zhǎng)短臂不知的情況下，某一基因在另一哺乳動(dòng)物(如鼠)染色體上的布局可以提供相關(guān)標(biāo)記的信息。新的序列可通過(guò)物理圖譜定位于染色體上。這為利用定位克隆或其它找基因技術(shù)的尋找疾病基因的工作者提供了有用的信息，一旦疾病或綜合癥通過(guò)基因連鎖被初步定位于某一基因組區(qū)域，如ataxia-telangiectasia定位11922-23，任何位于這一區(qū)域的序列就可能是與疾病相關(guān)聯(lián)基因，或調(diào)控基因，可作進(jìn)一步研究(見(jiàn)e.g.，Gatti，R.A等(1988)Nature336577-580)本發(fā)明的核苷酸序列也可用于檢測(cè)在正常的，攜帶者或發(fā)病者中基于易位、插入而帶來(lái)的染色體位置的差異。
在本發(fā)明另一實(shí)施例，LYG2的催化片段或免疫原性片段，或寡肽可用于篩選復(fù)合物文庫(kù)(通過(guò)各種藥物篩選技術(shù))。在該方法中用到的片段可以是溶于液相的，可定位于固相支持物上，位于細(xì)胞表面的，或定位于胞內(nèi)的。LYG2與被測(cè)試藥物間連接復(fù)合物的形成是可被測(cè)量的。
另一種藥物篩選技術(shù)為鑒別與感興趣的蛋白有結(jié)合性的復(fù)合物提供了高效篩選方式(見(jiàn)e.g.Geysen等(1984)PCT application WO84103564)。這類技術(shù)中，少量的許多不同的測(cè)試復(fù)合物被合成于固體物質(zhì)表面，如塑料針或其它表面，這些測(cè)試物可與LYG2或其片段反應(yīng)，反應(yīng)后經(jīng)洗滌，被結(jié)合的LYG2就可通過(guò)本領(lǐng)域已知技術(shù)測(cè)出，純化的LYG2也可直接包裹于盤(pán)上，以用于前述的藥物篩選技術(shù)中。另外，非中和性抗體可用于結(jié)合肽并將其固定于固相支持物上。
在另一實(shí)施例中，可以采用競(jìng)爭(zhēng)性藥物篩選分析。此法利用可與LYG2特異性結(jié)合的中和抗體，與待測(cè)復(fù)合物競(jìng)爭(zhēng)同LYG2的結(jié)合。在此方法中，抗體可用于檢測(cè)任何具有一個(gè)或多個(gè)LYG2的抗原決簇的肽段。
在另一實(shí)施例中，編碼LYG2的核苷酸序列用于已發(fā)展的任何分子生物學(xué)技術(shù)中，只要該新技術(shù)基于已知核苷酸的性質(zhì)，這些特性包括(但不限于)基因編碼三聯(lián)體及堿基特異性配對(duì)。
本發(fā)明的人LYG2核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常，通過(guò)先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過(guò)化學(xué)合成來(lái)編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中的各種DNA分子(如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過(guò)化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
此外，由于本發(fā)明的人LYG2具有源自人的天然氨基酸序列，因此，與來(lái)源于其他物種的同族蛋白相比，預(yù)計(jì)在施用于人時(shí)將具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人體內(nèi)的免疫原性更低或沒(méi)有)。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring HarborLaboratoryPress，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1 人LYG2基因的cDNA序列的克隆和測(cè)定1)數(shù)據(jù)庫(kù)的篩選以LYG1基因的cDNA序列為出發(fā)序列，檢索GenBank人EST數(shù)據(jù)庫(kù)，得到同源的EST。以得到的EST為探針再一次檢索EST數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得與之部分重疊并向5′或3′延伸的EST序列。將這些新獲得的EST與探針序列聯(lián)配成一重疊群。以此重疊群的5′和3′末端再檢索EST數(shù)據(jù)庫(kù)，并重復(fù)以上步驟，直到獲得一條無(wú)法再延伸的EST重疊群為止。
2)引物擴(kuò)增基于上述得到的EST重疊群的序列，設(shè)計(jì)引物。以人睪丸λgt10cDNA文庫(kù)(購(gòu)自Clontech公司)為模板，用一對(duì)寡核苷酸為引物——A15′-GTAAGGTTGCAAACAAGGTCCTG-3′(SEQ ID NO.3)為正向引物，寡核苷酸B15′-TCACACTGGTCTTCAGTGGTCTC-3′(SEQ ID NO.4)為反向引物，進(jìn)行PCR。PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、70℃1分鐘和72℃1分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測(cè)得到的PCR片段為846bp的目的片段。
3)PCR產(chǎn)物的測(cè)序?qū)⑷缟汐@得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEM-T載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質(zhì)粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)對(duì)插入片段進(jìn)行定向系列缺失，然后用PCR對(duì)缺失子進(jìn)行快速鑒定及排序。用SequiTherm EXCEL？DNA測(cè)序試劑盒(Epicentre Technologies)對(duì)依次截短的缺失子進(jìn)行測(cè)序，最后用電腦軟件拼接順序，獲得全長(zhǎng)cDNA序列，共846bp，詳細(xì)序列見(jiàn)SEQ IDNO.2，其中開(kāi)放讀框位于114-662位核苷酸。
根據(jù)得到的全長(zhǎng)cDNA序列推導(dǎo)出人LYG2的氨基酸序列共182個(gè)氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見(jiàn)SEQ ID NO.1。
實(shí)施例2 同源比較用本發(fā)明的人LYG2的全長(zhǎng)cDNA序列及其編碼蛋白，在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫(kù)及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+Swiss Prot+Spupdate+PIR數(shù)據(jù)庫(kù)中，用BLAST算法進(jìn)行核酸和蛋白同源檢索。采用BLAST的計(jì)算機(jī)技術(shù)被用于在數(shù)據(jù)庫(kù)(如Genbank)中搜索相同的或相關(guān)的分子。這種分析比基于多種膜雜交的方式迅速得多。此外，計(jì)算機(jī)搜索的敏感度也可以調(diào)整。檢索結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的人LYG2與G型溶菌酶家族成員顯示了較高的同源性。它與人中已發(fā)現(xiàn)的G型溶菌酶LYG1在核酸水平上的同一性達(dá)到了約46％，在蛋白水平上則達(dá)到了約31％。此外，本發(fā)明的LYG2與來(lái)自黑天鵝、鴕鳥(niǎo)和雞的G型溶菌酶(sp|P00717、sp|P00718和sp|P00719)在蛋白水平上的同一性分別達(dá)到了39％、40％和36％，因此這表明本發(fā)明的人LYG2也屬于LYG基因家族，具有相同或相似類似的功能。
實(shí)施例3 Northern分析Northern分析是一項(xiàng)用于檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)。它包括將標(biāo)記的核苷酸序列與含有從特定細(xì)胞或組織中抽提的RNA的膜雜交。
Northern結(jié)果顯示，LYG2在各組織中廣譜表達(dá)但表達(dá)量都較低，其中在腦及睪丸中的表達(dá)量稍高。
實(shí)施例4 標(biāo)記和運(yùn)用雜交探針根據(jù)SEQ ID NO2設(shè)計(jì)的雜交探針可用于搜索其cDNA序列、基因組序列及mRNA序列。雖然本方法是針對(duì)標(biāo)記這23個(gè)左右寡聚核苷酸設(shè)計(jì)的，但是從本質(zhì)上來(lái)說(shuō)，它也可應(yīng)用于更長(zhǎng)的核苷酸序列。寡聚核苷酸探針設(shè)計(jì)時(shí)使用了一些軟件，如PCGENE等。標(biāo)記時(shí)采用了50pmol的游離核苷酸、250mCi的γ-32p標(biāo)記的三磷酸腺苷及T4多核苷酸激酶的體系。標(biāo)記好的寡聚核苷酸過(guò)G-25葡聚糖層析柱加以純化(AmershamPharmacia Biotech)。把純化后的探針固定在雜交膜上，洗膜，使背景降至7-10cpm，備用。
用Ase I，Bgl II，Eco RI，Pst I，Xbal，or Pvu II(NEN Life Science Products)等內(nèi)切酶酶切人類基因組序列。每份酶切產(chǎn)物都在0.7％的瓊脂糖凝膠中電泳，然后轉(zhuǎn)移到尼龍膜上進(jìn)行雜交反應(yīng)。反應(yīng)需要在40℃中進(jìn)行16個(gè)小時(shí)。在室溫下逐漸增加檸檬酸鈉達(dá)0.1x和十二烷基磺酸鈉的濃度達(dá)0.5x以去掉非特異性的信號(hào)。經(jīng)X光膠片(Eastman Kodak，Rochester，N.Y.)曝光若干小時(shí)后，雜交結(jié)果就清晰可見(jiàn)了。
實(shí)施例5.MicroarraysMicroarrays，又稱DNA芯片。芯片可通過(guò)使用一系列化學(xué)方法及噴墨技術(shù)把樣品固定在底物上得到。常用的方法有射線、化學(xué)、熱力學(xué)、機(jī)械方法等，形成的元件有點(diǎn)狀、條形等等。一塊典型的芯片通常含有一定數(shù)量的元件，可通過(guò)手工或用適當(dāng)?shù)膬x器設(shè)備制備。雜交反應(yīng)后，洗去未結(jié)合的探針，然后用掃描儀來(lái)檢測(cè)發(fā)生雜交反應(yīng)的元件及反應(yīng)的程度。探針與每一個(gè)芯片元件的互補(bǔ)性和結(jié)合量都可通過(guò)對(duì)掃描出的圖像的分析來(lái)判斷。
全長(zhǎng)cDNA、EST、或基因片段都可以作為固定于底物上的樣品。適合于雜交的片段可通過(guò)用一些著名的生物軟件(如LASERGENE SOFTWARE(DNASTAR)，來(lái)選擇。這些全長(zhǎng)cDNA、EST、與本發(fā)明的核酸序列相關(guān)的片斷、或與這項(xiàng)發(fā)明有關(guān)的cDNA庫(kù)中隨機(jī)選出的片段被有序的排列于玻璃等載體上。cDNA固著于玻片的方法是紫外線交聯(lián)、熱學(xué)、化學(xué)處理、干燥(Schena，M.et al.(1995)Science 270467-470；and Shalon，D.et al.(1996)Genome Res.6639-645.)等。將探針用熒光標(biāo)記后，再與固著地反應(yīng)元件雜交。雜交的結(jié)果用前述方法分析。
實(shí)施例6.互補(bǔ)多核苷酸片段LYG2的互補(bǔ)序列或互補(bǔ)片段可用于檢測(cè)、降低或抑制天然LYG2的表達(dá)。實(shí)例4中提到的寡聚核苷酸為15-30個(gè)堿基對(duì)，原則上說(shuō)該方法亦可用于更小或更大的核苷酸片斷。LYG2互補(bǔ)寡聚核苷酸及編碼序列可用軟件OLIGO 4.06輔助設(shè)計(jì)。在LYG2的5′端設(shè)計(jì)特異性互補(bǔ)片段可以阻止啟動(dòng)子與LYG2相結(jié)合從而抑制轉(zhuǎn)錄，設(shè)計(jì)互補(bǔ)多核苷酸片段也可以阻礙其與核糖體亞基與LYG2的編碼轉(zhuǎn)錄本結(jié)合從而阻止蛋白翻譯。
實(shí)施例7.LYG2的表達(dá)LYG2的表達(dá)和純化建立在使用細(xì)菌或病毒表達(dá)體系的基礎(chǔ)上。
在細(xì)菌中，LYG2的cDNA首先被連接到含有抗菌素抗性及可誘導(dǎo)的高效啟動(dòng)子的載體上，這樣的啟動(dòng)子至少包括trp-lac(tac)融合啟動(dòng)子、連有l(wèi)ac操縱子調(diào)節(jié)單元的T5或T7噬菌體啟動(dòng)子等。把重組載體轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中去，如BL23(DE3)等，具有抗菌素抗性的細(xì)菌會(huì)在IPTG的誘導(dǎo)下表達(dá)LYG2。在真核細(xì)胞中，LYG2與AcMNPV(一種重組病毒)形成的重組子，感染昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞而表達(dá)的。桿狀病毒的多角體蛋白基因通過(guò)同源重組或細(xì)菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座作用而被LYG2的cDNA序列替代，替代后的病毒仍保持著感染性并且多角蛋白基因的強(qiáng)啟動(dòng)子使LYG2基因的轉(zhuǎn)錄能高效進(jìn)行。在此過(guò)程中，細(xì)菌或病毒的易傳染性及重組體啟動(dòng)子的強(qiáng)大功能保證了LYG2的高表達(dá)量。重組子的桿狀病毒大多用于感染昆蟲(chóng)Sf9細(xì)胞，如果把該桿狀病毒的遺傳特性進(jìn)行某些修飾，還可用于感染人類的肝(實(shí)質(zhì))細(xì)胞(Engelhard，E.K.et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA913224-3227；Sandig，V.et al.(1996)Hum.Gene Ther.71937-1945.)。
純化時(shí)，LYG2通常是與GST或多肽標(biāo)簽(如FLAG，6-His等)結(jié)合形成融和蛋白進(jìn)行的，這樣可快速、簡(jiǎn)便、高特異性的把重組融合蛋白從細(xì)菌裂解液中提取純化出來(lái)。GST是一個(gè)從日本血吸蟲(chóng)中提取出來(lái)的分子量約為26kDa的酶，在固化的谷胱苷肽存在的情況下可用于提取融合蛋白而保證不破壞其活性及抗原性(Amersham PharmaciaBiotech)。融合蛋白抽提出來(lái)后可按常規(guī)的操作手冊(cè)把GST與LYG2在特定位點(diǎn)分開(kāi)。FLAG是一個(gè)由8個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，可以通過(guò)利用市售的抗FLAG的單抗或多抗抗體與FLAG之間的特異性免疫親合力來(lái)純化融合蛋白(Eastman Kodak)。6-His是含有6個(gè)連續(xù)組氨酸的多肽，利用它能特異附著到金屬螯合樹(shù)脂上的特性來(lái)提取融合蛋白。關(guān)于蛋白表達(dá)和純化方法可見(jiàn)目前市售的操作手冊(cè)(John Wiley&Sons，New York，N.Y.，ch 10，16)。用以上方法純化獲得的LYG2可直接用于活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例8.活性驗(yàn)證LYG2的蛋白活性可通過(guò)檢測(cè)其裂解微球菌細(xì)胞的能力來(lái)驗(yàn)證(Enzymatic Assay ofLysozyme 1，Sigma Aldrich，St.Louis Mo.)。在25℃下把適量微球菌凍干粉懸浮在66mM，pH6.24的磷酸鉀緩沖液(緩沖液A)中，濃度保持在0.015％左右。把2.5ml上述懸浮液移入比色皿，保持25℃恒溫，永恒溫分光光度計(jì)測(cè)定其在450nm的吸光率，直到其恒定在0.6-0.7之間，用2.5ml的緩沖液A作為空白對(duì)照。在含有微球菌的比色皿中加入0.1ml的LYG2溶液(用冷的緩沖液A配制)，在作對(duì)照的比色皿中加入0.1ml的緩沖液A，立即顛倒混勻，連續(xù)測(cè)定5分鐘內(nèi)在450nm處的吸光率。細(xì)菌裂解時(shí)溶液變清，因此其在450nm的吸光率也隨之下降。樣品管中溶液在450nm的吸光率下降的速率與LYG2原溶液的濃度成一定比率。
實(shí)施例9.功能測(cè)試檢測(cè)LYG2的功能需將其轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中并大量表達(dá)。先把cDNA連到含有強(qiáng)啟動(dòng)子的哺乳動(dòng)物載體上，如包含細(xì)胞巨化病毒啟動(dòng)子的PCMV SPORT(Lifetechnology)，PCR3.1(Invitrogen，Carlsbad，Calif.)等。利用脂質(zhì)體或電轉(zhuǎn)化的方法把5-10ng重組載體轉(zhuǎn)染某種人體細(xì)胞系，最佳選擇為內(nèi)皮細(xì)胞或造血干細(xì)胞，同時(shí)將1-2ng含標(biāo)記蛋白編碼序列的質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。使用標(biāo)記蛋白可區(qū)分已被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與未被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，這樣的蛋白包括GFP，CD64，GFP-CD64融合蛋白等。
流式細(xì)胞儀FEM(Flow cytometry)是一種以激光為基礎(chǔ)能自動(dòng)檢測(cè)細(xì)胞性狀的技術(shù)，也可以知道重組載體上的cDNA是否表達(dá)。它能夠檢測(cè)出表達(dá)GFP或CD64-GFP的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，也能檢測(cè)出細(xì)胞的性狀，如凋亡狀態(tài)。它也能夠通過(guò)檢測(cè)熒光分子的數(shù)量及熒光強(qiáng)度來(lái)檢測(cè)發(fā)生于細(xì)胞死亡前或伴隨細(xì)胞死亡的細(xì)胞變化。這些變化包括用碘化丙V染DNA的方法來(lái)測(cè)定核DNA含量；通過(guò)直線光和直側(cè)光的方法測(cè)定細(xì)胞和顆粒大小的改變；通過(guò)測(cè)量5′-脫氧溴脲苷的吸收來(lái)推測(cè)DNA合成是否減少，通過(guò)測(cè)定與特異抗體結(jié)合來(lái)推測(cè)細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)某些蛋白質(zhì)表達(dá)量是否減少；通過(guò)與熒光蛋白連接的膜連蛋白來(lái)檢測(cè)細(xì)胞膜成分是否改變。流式細(xì)胞儀技術(shù)在Flow Cytometry(Ormerod，M.G.1994.Oxford，New York，N.Y)一書(shū)中有詳盡的描述。
LYG2表達(dá)量對(duì)細(xì)胞的影響亦可以通過(guò)檢測(cè)含有GFP或GFP-CD64融合蛋白編碼序列的細(xì)胞獲得。CD64或GFP-CD64在細(xì)胞表面表達(dá)，且通常與人IgG的保守區(qū)域或CD64抗體結(jié)合。使用結(jié)合有人IgG或CD64的磁珠可有效地把已轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞區(qū)分開(kāi)(DYNAL，Lake Success，N.Y.)。對(duì)于mRNA，則可使用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)進(jìn)行分離。編碼LYG2的mRNA及其它相關(guān)基因的表達(dá)可通過(guò)Northern雜交或基因芯片技術(shù)檢測(cè)。
實(shí)施例10.制備抗體通過(guò)PAGE凝膠電泳等方法純化的LYG2可以用于免疫兔子以產(chǎn)生抗體。用LASERGENE軟件分析得到的LYG2的氨基酸序列的高免疫原性位點(diǎn)，通過(guò)本領(lǐng)域的常規(guī)方法可合成相應(yīng)的寡聚肽并得到抗體。按常規(guī)方法可選擇適當(dāng)?shù)目乖瓫Q定部位，如C末端或親水區(qū)域。
通常，長(zhǎng)度為15個(gè)氨基酸的多肽可用ABI型43/A多肽合成儀合成，并可與KLH結(jié)合以增加免疫原性(通過(guò)與MBS反應(yīng)而結(jié)合)。多肽與KLH結(jié)合的復(fù)合物用完全福氏佐劑乳化后可免疫兔子。所得到的抗血清可用免疫血清反應(yīng)檢測(cè)，如把上述多肽與已用1％BSA封閉的塑料載體連接，再與兔子的抗血清混合進(jìn)行反應(yīng)，洗滌，然后再與用放射性碘標(biāo)記的抗兔血清的山羊抗體進(jìn)行反應(yīng)。
實(shí)施例11.用特異性的抗體純化天然LYG2
天然的或重組的LYG2都可以用免疫親和層析法純化。層析柱可以通過(guò)把抗LYG2的抗體與活性層析樹(shù)脂，如被CNBr激活的SEPHAROSE樹(shù)脂(Amersham PharmaciaBiotech)共價(jià)結(jié)合而構(gòu)建。共價(jià)結(jié)合后，樹(shù)脂可按使用手冊(cè)封閉并洗滌。
純化樣品時(shí)，將含有樣品的溶液緩慢加入層析柱。LYG2會(huì)結(jié)合到層析柱上。樣品過(guò)柱時(shí)要最大限度的保證LYG2與色譜柱的結(jié)合強(qiáng)度，如使用高離子強(qiáng)度的清潔劑為洗脫介質(zhì)。液體介質(zhì)洗脫完畢后需把結(jié)合于柱上的LYG2洗脫下來(lái)，這時(shí)要使用可解離LYG2與其抗體間結(jié)合力的試劑，如pH2.0-3.0的離液劑，高度濃縮的尿素或硫氰酸鹽離子等。
實(shí)施例12.鑒定與LYG2反應(yīng)的分子用125I標(biāo)記LYG2或其中的生物活性片段(Bolton et al.(1973)Biochem.J.133529-539.)，把候選分子按順序加入多孔板的樣孔中，然后加入標(biāo)記好的LYG2產(chǎn)物。經(jīng)洗滌后，凡結(jié)合有LYG2的樣孔都將被進(jìn)一步分析。采用不同濃度的LYG2所得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可用于推測(cè)候選分子的數(shù)量、親和性等特性。
應(yīng)理解，本發(fā)明列舉了許多實(shí)驗(yàn)方法的具體條件，這僅在于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明。對(duì)本發(fā)明中所涉及實(shí)驗(yàn)方法、實(shí)驗(yàn)體系的常規(guī)修飾或變異都應(yīng)在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍內(nèi)。
序列表(1)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度182個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(iii)序列描述SEQ ID NO1MLSSVVFGGL IALIGTSRSS YPFSHSMKPH LHPRLYHGCY GDIMTMKTSG 50ATCDPNSVMN CGIRGSEMFA EMDLRAIKPY QTLIKEVGQR HCVDPAVIAA 100IISRESHGGS VLQDGWDHRG LKFGLMQLDK QTYHPVGAWD SKEHLSQATG 150ILTERIKAIQ KKFPTWSVAQ HLKGRLYSEY FV 182(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度846bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID N02gtaaaaggtt gaagtgcagt ttgctgctga gtacagaaga cctttgcaaa cagagagggg 60agattttctc tgtaaggttg caaacaaggt cctggaagat aagattcccc gccatgttat 120cctccgtggt gtttggggga ctaattgccc tcattggcac ttccaggagc tcatacccct 180tcagtcactc aatgaagcct cacctacatc cacgcctgta ccacggctgc tatggggaca 240tcatgaccat gaagacctct ggggccactt gtgatccaaa cagtgtgatg aactgcggga 300tccgtggttc tgaaatgttt gctgagatgg atttgagggc cataaaacct taccagactc 360tgatcaaaga agtcgggcag agacattgcg tggaccctgc tgtcatcgca gccatcatct 420ccagggaaag ccatggcgga tctgtcctgc aagacggctg ggaccacagg ggacttaaat 480ttggcttgat gcagcttgat aaacaaacgt accaccctgt cggtgcctgg gatagcaaag 540agcacctttc acaggctact gggattctaa cagagagaat taaggcaatc cagaaaaaat 600tccccacgtg gagtgttgct cagcacctca aaggtaggct gtattctgag tactttgttt 660aaatgagcaa tgaatgagac cactgaagac cagtgtgacc cgagactccc tgggagcatt 720tccacggggt cagcagtggc cctgggagga gctgtctaga ggctgcattt gcattccctg 780aaccactgag ttactttgag aggtcctcca tcctcaacct ccatttcctc ttctgcagaa 840tgttgg 846(3)SEQ ID NO.3的信息
(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.3GTAAGGTTGC AAACAAGGTC CTG 23(4)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO4TCACACTGGT CTTCAGTGGT CTC 2權(quán)利要求
1.一種分離純化的多聚核苷酸，其特征在于，它編碼了包含SEQ ID No.1中的氨基酸序列的多肽。
2.一種分離純化的多聚核苷酸，其特征在于，它包含SEQ ID No.2中第1-846位或第114-662位的多聚核苷酸序列。
3.一種分離純化的多聚核苷酸，其特征在于，它與權(quán)利要求1中所述的多聚核苷酸互補(bǔ)。
4.一種表達(dá)載體，其特征在于，它包含權(quán)利要求1中所述多聚核苷酸。
5.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它包含權(quán)利要求4中所述的表達(dá)載體。
6.一種制備多肽的方法，該方法包含以下步驟(a)在適合此多肽表達(dá)的環(huán)境下培養(yǎng)權(quán)利要求5中所述的宿主細(xì)胞，以及(b)從宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物中提取該多肽。
7.一種從含有核酸的生物樣本中檢測(cè)多聚核苷酸的方法，該方法包含以下步驟(a)擴(kuò)增權(quán)利要求1中所述的多聚核苷酸(b)將權(quán)利要求1中所述的多聚核苷酸與該生物樣本中至少一條核酸雜交，以形成雜交復(fù)合物，以及(c)檢測(cè)此雜交復(fù)合物，其中此雜交復(fù)合物的存在與該生物樣本中編碼該多肽的多聚核苷酸的存在相關(guān)聯(lián)。
8.一種利用多聚核苷酸的篩選方法，其特征在于，它可在分子和復(fù)合物文庫(kù)中識(shí)別至少一種能在嚴(yán)緊條件下與該多聚核苷酸特異結(jié)合的分子或復(fù)合物，包含以下步驟(a)在特定環(huán)境中將權(quán)利要求1中所述的多聚核苷酸與分子或復(fù)合物結(jié)合，該環(huán)境應(yīng)能保證嚴(yán)緊條件下的特異結(jié)合。(b)檢測(cè)特異結(jié)合，從而確認(rèn)與該多聚核苷酸特異結(jié)合的分子或復(fù)合物。
9.一種探針，該探針包含SEQ ID No.2中10-846個(gè)連續(xù)核苷酸構(gòu)成的序列或其互補(bǔ)鏈序列。
10.一種抗體，其特征在于，它能與SEQ ID No.1中的氨基酸序列的多肽特異性結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的人類鵝型溶菌酶(LYG2)及識(shí)別和編碼LYG2的多聚核苷酸。本發(fā)明還提供了相應(yīng)的表達(dá)載體,宿主細(xì)胞,抗體,激動(dòng)劑和拮抗劑。本發(fā)明還提供了與LYG2表達(dá)有關(guān)的疾病的診斷、治療和預(yù)防的方法。
文檔編號(hào)C12N15/56GK1373211SQ0110552
公開(kāi)日2002年10月9日 申請(qǐng)日期2001年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月2日
發(fā)明者余龍, 趙勇, 胡培蓉, 唐麗莎, 趙壽元 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)