專利名稱：用dna指紋判別家蠶雜交率的鑒定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及采用DNA指紋技術對家蠶(Bombyx mori L.)雜交率進行鑒定的方法。
家蠶雜交種是蠶繭生產(chǎn)高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的基本保證，雜交種的雜交率(蠶種中雜交種的比率)的高低，與蠶農(nóng)的經(jīng)濟效益關系密切。為了維護蠶農(nóng)的利益，蠶種的雜交率已作為蠶種質(zhì)量檢驗的法定項目，經(jīng)檢驗不合格的蠶種被限制使用。目前對雜交率的鑒定方法是采用直接飼養(yǎng)二匾蠶(約1000頭蠶)、以大蠶期蠶體的斑紋為依據(jù)進行親本和雜交種的判別，按樣本實際檢出的親本個體數(shù)為依據(jù)計算樣本雜交率，以樣本雜交率作為總體雜交率。這種鑒定方法存在以下五個問題1)由于日×中的雜交品種，其雜交種與日系親本的斑紋一樣，都為普通斑紋，所以依靠斑紋不可能作出正確判別。即現(xiàn)行的判別方法，只能對中×日的雜交種進行判別，不能對日×中的雜交種進行判別；2)由于原種生命力比雜交種虛弱，容易發(fā)生病小蠶，在養(yǎng)蠶期間已被淘汰，降低了原種在雜交種中的比率，所以使鑒定得到的雜交率數(shù)值偏高；3)按照數(shù)理統(tǒng)計的抽樣分布理論，親本在蠶種中的分布屬超幾何分布、二項分布、或普松分布，雖然親本在總體中的比率為一定值，但樣本中親本出現(xiàn)的個體數(shù)各種各樣，親本的比例按一定概率出現(xiàn)，并不永遠與總體中的比例相同，所以按樣本實際檢出的親本個體數(shù)，推斷總體雜交率，結(jié)果常常是不正確的；4)春制秋用種，由于制種結(jié)束至用種期的時間較短，在鑒定結(jié)果出來之前，蠶種已被發(fā)到農(nóng)村飼養(yǎng)，失去了檢驗的目的；5)為了對春用品種進行鑒別，需要在春蠶期以前，將蠶種空運到南方比較溫暖的省市提前催青飼養(yǎng)，使非南方省份的蠶區(qū)化費大量人力、物力。
利用PCR(Polymerase chain reaction，聚合酶鏈式反應)技術建立的DNA指紋親子判斷方法，是利用個體的DNA為模板，采用能夠擴增出特征DNA片斷的引物，根據(jù)DNA分子水平的異同點，進行親子鑒別。方法先進，結(jié)論正確。但為了獲取個體的DNA，常用的抽提方法都需要經(jīng)過多步反應，并用有機溶劑，如酚、氯仿、異戊醇等除去蛋白質(zhì)，方法繁瑣，時間較長，花費較大。
將DNA指紋親子判斷方法應用于家蠶雜交率的鑒定方面，能夠獲得全面、正確的鑒定結(jié)果。但由于家蠶雜交率鑒定需要檢測很多樣本，常規(guī)的DNA抽提方法不能適應需要。所以必須建立一種快速、經(jīng)濟的抽提DNA的方法。另外還需要用幾種能夠擴增出用于親子鑒別的特異性DNA片斷的引物。為了能夠由樣本的結(jié)果正確地推斷總體，需要應用數(shù)理統(tǒng)計的原理，制定適當?shù)某闃颖壤⒂蓸颖倦s交率推斷總體雜交率的方法。
本發(fā)明的目的是建立一種快速、合理、正確、實用、取材方便、適合于所有生產(chǎn)用家蠶品種的用DNA指紋判別家蠶雜交率的鑒定方法。
為了達到上述目的，本發(fā)明采用的技術方案是(1)DNA模板的提取第一步取1粒蠶卵或1條蟻蠶，加入10～100μl 0.1～1.0mol/LNaOH,0.5～2.5％ME緩沖液，冰浴研磨10～30min，加50～200μl 50～200mmol/LTris-HClpH6～9緩沖液，攪拌10min,10000～15000×g、4℃離心5～20min。
第二步取上清液10～100μl，加2.5倍99％酒精，-20℃中放置15～60min,10000～15000×g、4℃離心5～30min，用10～100μl無菌去離子水溶解，即得到PCR反應所需的DNA模板。
(2)PCR反應的引物如下隨機引物，可在目前生產(chǎn)用蠶品種的親本與雜交種之間形成特征性的譜帶，用于雜交率的鑒定。
(3)PCR反應條件PCR反應體系上述抽提得到的DNA模板液1～5μl；Taq DNA聚合酶0.2～5u；按總體積1/10的量加入10倍PCR反應緩沖液，組成成分100mM/LTris-HCl,100mM/L KCl,80mM/L(NH4)2SO4,20mM/L MgCl2,0.5％NP-40pH9.0；dNTP 0.15～0.25 mmol/L；加上述DNA合成引物，使終濃度為0.1～1.5μmol/L；加無菌去離子水，使總體積達到10～100μl；PCR反應條件94～95℃預熱4～5min；變性解鏈94℃ 0.5～2min；復性30～50℃ 0.5～2min；合成延伸70～75℃1～5min；循環(huán)30～45次；保存70～75℃,5～10min；4℃,0.5～12h；反應設備PCR反應儀；(4)DNA電泳采用0.8～1.5％瓊脂糖凝膠，電泳緩沖液用0.5～1％TAE或TBE。(5)樣本容量取100～1000粒蠶卵或蟻蠶作為樣本，供雜交率鑒定用，用樣本的結(jié)果推斷總體的結(jié)果，正確率可達到95～99％。
本發(fā)明具有的有益效果是1)用胚胎形成到蟻蠶孵化的任何時期的蠶卵或蟻蠶為材料，取材方便；2)用2步方法提取DNA模板，快速、簡單；3)所用DNA合成引物能在現(xiàn)行生產(chǎn)用蠶品種的親本與雜交種之間擴增特異性的DNA片斷，建立的每一品種的親本和雜交種的特征性DNA電泳參照圖譜，可作為雜交率鑒別的依據(jù)；4)按照數(shù)理統(tǒng)計的原理設定樣本數(shù)，按照抽樣分布的理論，計算出由樣本雜交率推斷總體雜交率的概率，設定的正確率為95～99％，正確性高。
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。
取上清液20μl，加50μl 99％酒精，-20℃中放置15min,15000×g、4℃離心15min，沉淀用20μl無菌去離子水溶解，作為PCR反應所需的DNA模板。
(2)PCR反應引物采用ZHD0020引物，序列為TAGGTCTTGGG。
(3)PCR反應條件設定PCR反應體系上述抽提得到的DNA模板液2μlTaq DNA聚合酶2.5u10×PCR反應緩沖液(成分組成100mM/L Tris-HCl,100mM/L KCl,80mM/L(NH4)2SO4,20mM/L MgCl2,0.5％NP-40 pH9.0)10μldNTP各0.2mmol/LZHD0020引物，使終濃度為0.5μmol/L加無菌去離子水，使總體積達到100μlPCR反應條件94℃預熱4min變性解鏈94℃ 1min復性37℃ 1min合成延伸72℃ 1.5min循環(huán)35次保存72℃,5min,4℃,5h。
(4)DNA電泳采用1％瓊脂糖凝膠，電泳緩沖液用1％TAE。
(5)結(jié)果PCR反應合成的DNA片斷，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，秋豐品種具有1、2、3和5共4條帶，白玉品種具有1、2和4共3條帶，秋豐×白玉、白玉×秋豐兩個雜交種都具有1、2、3、4和5共5條帶。兩個親本的DNA片斷在兩個雜交種中都存在，結(jié)果符合遺傳規(guī)律。親本與雜交種的DNA電泳圖譜的特征具有明顯差異，所以可用于雜交種的雜交率鑒定。10次實驗結(jié)果都相同，故確定這種電泳圖譜為秋豐、白玉及其雜交種的電泳參照圖譜。
實驗從浙江大學動物科學學院蠶蜂科學系遺傳育種教研組繁育的蠶種秋豐×白玉中抽取200粒蠶卵，按上述PCR反應獲得每一粒蠶卵的DNA片斷，經(jīng)瓊脂糖電泳發(fā)現(xiàn)，有4粒蠶卵的DNA電泳圖譜與秋豐品種的電泳圖譜相同，其他196粒蠶卵的DNA電泳圖譜與秋豐×白玉品種的電泳圖譜相同，按二項分布統(tǒng)計分析原理，推斷該批蠶種的雜交率在95％以上，并得知這一結(jié)論的正確率(概率值)在95％以上。
取上清液40μl，加100μl 99％酒精，-20℃中放置15min,15000×g、4℃離心20min，沉淀用20μl無菌去離子水溶解，作為PCR反應所需的DNA模板。
(2)PCR反應引物采用ZHD0029引物，序列為GCAGCACTGAC(3)PCR反應條件設定PCR反應體系上述抽提得到的DNA模板液2μlTaq DNA聚合酶5u10×PCR反應緩沖液(成分組成100 mM/L Tris-HCl,100mM/L KCl,80mM/L(NH4)2SO4,20mM/L MgCl2,0.5％NP-40 pH9.0)20μldNTP各0.22mmol/LZHD0029引物，使終濃度為0.8μmol/L加無菌去離子水，使總體積達到200μlPCR反應條件94℃預熱4min變性解鏈94℃ 1.5min復性40℃ 1min合成延伸72℃ 1.5min循環(huán)35次保存72℃,5min,4℃,4h。
(4)DNA電泳采用1％瓊脂糖凝膠，電泳緩沖液用1％TAE。
(5)結(jié)果PCR反應合成的DNA片斷，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，華秋品種具有1、3和4共3條帶，松白品種具有1、2和4共3條帶，華秋×松白、松白×華秋兩個雜交種都具有1、2、3和4共4條帶。兩個親本的DNA片斷在兩個雜交種中都存在，結(jié)果符合遺傳規(guī)律。親本與雜交種的DNA電泳圖譜的特征具有明顯差異，所以可用于雜交種的雜交率鑒定。50次實驗結(jié)果都相同，故確定這種電泳圖譜為華秋、松白及其雜交種的電泳參照圖譜。
實驗從浙江省湖州蠶?？茖W研究所繁育的蠶種華秋×松白中抽取100粒蠶卵，按上述PCR反應獲得每一粒蠶卵的DNA片斷，經(jīng)瓊脂糖電泳發(fā)現(xiàn)，有1粒蠶卵的DNA電泳圖譜與華秋品種的電泳圖譜相同，其他99粒蠶卵的DNA電泳圖譜與華秋×松白品種的電泳圖譜相同，按二項分布統(tǒng)計分析原理，推斷該批蠶種的雜交率在95％以上，并得知這一結(jié)論的正確率(概率值)在95％以上。
取上清液20μl，加50μl 99％酒精，-20℃中放置30min,10000×g、4℃離心18min，沉淀用20μl無菌去離子水溶解，作為PCR反應所需的DNA模板。
(2)PCR反應引物采用ZHD0013引物，序列為AGTGCCTAACC。
(3)PCR反應條件設定PCR反應體系上述抽提得到的DNA模板液2μlTaq DNA聚合酶2.5u10×PCR反應緩沖液(成分組成100mM/L Tris-HCl,100mM/L KCl,80mM/L(NH4)2SO4,20 mM/L MgCl2,0.5％NP-40 pH9.0)10μldNTP各0.18mmol/LZHD0013引物，使終濃度為0.7μmol/L加無菌去離子水，使總體積達到100μlPCR反應條件
94℃預熱4min變性解鏈94℃ 1min復性38℃ 1min合成延伸72℃ 1.5min循環(huán)35次保存72℃,5min,4℃,3h。
(4)DNA電泳采用1％瓊脂糖凝膠，電泳緩沖液用1％TAE。
(5)結(jié)果PCR反應合成的DNA片斷，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，華豐品種具有1、2和4共3條帶，雪松品種具有1、2和3共3條帶，華豐×雪松、雪松×華豐兩個雜交種都具有1、2、3和4共4條帶。兩個親本的DNA片斷在兩個雜交種中都存在，結(jié)果符合遺傳規(guī)律。親本與雜交種的DNA電泳圖譜的特征具有明顯差異，所以可用于雜交種的雜交率鑒定。20次實驗結(jié)果相同，故確定這種電泳圖譜為華豐、雪松及其雜交種的電泳參照圖譜。
實驗從浙江大學動物科學學院蠶蜂科學系遺傳育種教研組繁育的蠶種華豐×雪松中抽取300粒蠶卵，按上述PCR反應獲得每一粒蠶卵的DNA片斷，經(jīng)瓊脂糖電泳發(fā)現(xiàn)，有8粒蠶卵的DNA電泳圖譜與華豐品種的電泳圖譜相同，其他292粒蠶卵的DNA電泳圖譜與華豐×雪松品種的電泳圖譜相同，按二項分布統(tǒng)計分析原理，推斷該批蠶種的雜交率在95％以上，并得知這一結(jié)論的正確率(概率值)在95％以上。
取上清液30μl，加75μl99％酒精，-20℃中放置30min,12000×g、4℃離心20min，沉淀用20μl無菌去離子水溶解，作為PCR反應所需的DNA模板。
(2)PCR反應引物采用ZHD0004引物，序列為TGGATGAGACC。
(3)PCR反應條件設定PCR反應體系
上述抽提得到的DNA模板液1μlTaq DNA聚合酶2.3u10×PCR反應緩沖液(成分組成100mM/L Tris-HCl,100mM/L KCl,80mM/L(NH4)2SO4,20mM/L MgCl2,0.5％NP-40pH9.0)5μldNTP各0.17mmol/LZHD0004引物，使終濃度為0.4μmol/L加無菌去離子水，使總體積達到50μlPCR反應條件94℃預熱4min變性解鏈94℃ 1min復性39℃ 1.5min合成延伸72℃ 1.5min循環(huán)35次保存72℃,5min,4℃,1h。
(4)DNA電泳采用1％瓊脂糖凝膠，電泳緩沖液用1％TAE。
(5)結(jié)果PCR反應合成的DNA片斷，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，豐1品種具有1、2、4和5共4條帶，富日品種具有1、2、3和5共4條帶，豐1×富日、富日×豐1兩個雜交種都具有1、2、3、4和5共5條帶。兩個親本的DNA片斷在兩個雜交種中都存在，結(jié)果符合遺傳規(guī)律。親本與雜交種的DNA電泳圖譜的特征具有明顯差異，所以可用于雜交種的雜交率鑒定。100次實驗結(jié)果相同，故確定這種電泳圖譜為豐1、富日及其雜交種的電泳參照圖譜。
實驗從浙江省湖州蠶?？茖W研究所繁育的蠶種豐1×富日中抽取200粒蠶卵，按上述PCR反應獲得每一粒蠶卵的DNA片斷，經(jīng)瓊脂糖電泳發(fā)現(xiàn)，有3粒蠶卵的DNA電泳圖譜與豐1品種的電泳圖譜相同，其他197粒蠶卵的DNA電泳圖譜與豐1×富日品種的電泳圖譜相同，按二項分布統(tǒng)計分析原理，推斷該批蠶種的雜交率在96％以上，并得知這一結(jié)論的正確率(概率值)在95％以上。
權(quán)利要求
1．用DNA指紋判別家蠶雜交率的鑒定方法，其特征在于它的方法是(1)DNA模板的提取第一步取1粒蠶卵或1條蟻蠶，加入10～100μl 0.1～1.0mol/L NaOH,0.5～2.5％ME緩沖液，冰浴研磨10～30min，加50～200μl 50～200mmol/LTris-HCl pH6～9緩沖液，攪拌10min,10000～15000×g、4℃離心5～20min；第二步取上清液10～100μl，加2.5倍99％酒精，-20℃中放置15～60min,10000～15000×g、4℃離心5～30min，用10～100μl無菌去離子水溶解，即得到PCR反應所需的DNA模板；(2)PCR反應的引物如下隨機引物，可在目前生產(chǎn)用蠶品種的親本與雜交種之間形成特征性的譜帶，用于雜交率的鑒定
(3)PCR反應條件PCR反應體系上述抽提得到的DNA模板液1～5μl；Taq DNA聚合酶0.2～5u；按總體積1/10的量加入10倍PCR反應緩沖液，組成成分100mM/LTris-HCl,100mM/L KCl,80mM/L(NH4)2SO4,20mM/L MgCl2,0.5％NP-40pH9.0；dNTP各0.15～0.25mmol/L；加上述DNA合成引物，使終濃度為0.1～1.5μmol/L；加無菌去離子水，使總體積達到10～100μl；PCR反應條件94～95℃預熱4～5min；變性解鏈94℃ 0.5～2min；復性30～50℃ 0.5～2min；合成延伸70～75℃1～5min；循環(huán)30～45次；保存70～75℃,5～10min；4℃,0.5～12h；反應設備PCR反應儀；(4)DNA電泳采用0.8～1.5％瓊脂糖凝膠，電泳緩沖液用0.5～1％TAE或TBE；(5)樣本容量取100～1000粒蠶卵或蟻蠶作為樣本，供雜交率鑒定用，用樣本的結(jié)果推斷總體的結(jié)果，正確率可達到95～99％。
全文摘要
用DNA指紋判別家蠶雜交率的鑒定方法,是以蠶卵或蟻蠶為材料,以每一品種的親本和雜交種為一個組合,分別快速提取DNA模板,與適當?shù)腄NA合成引物構(gòu)成反應體系,擴增特異性的DNA片斷,建立每一品種的親本和雜交種的特征性DNA片段電泳參照圖譜,作為雜交率鑒別的依據(jù)。再抽取100～1000粒的蠶卵或蟻蠶構(gòu)成樣本,用上述方法建立每一個體的DNA片段電泳圖譜,并與參照圖譜比較,判斷是否是雜交種子,算出樣本的雜交率。用數(shù)理統(tǒng)計的原理算出由樣本雜交率推斷總體雜交率的正確性,并設定其為95～99%。
文檔編號C12Q1/68GK1311337SQ0110327
公開日2001年9月5日 申請日期2001年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月19日
發(fā)明者鐘伯雄, 丁農(nóng) 申請人:浙江大學, 浙江省湖州蠶桑科學研究所