本發(fā)明涉及一種白僵蠶的人工制備方法。
背景技術(shù)：
白僵蠶為蠶蛾科動(dòng)物家蠶蛾的幼蟲感染白僵菌而僵死的全蟲。白僵蠶是一味藥用價(jià)值較高的中藥，其味咸、辛，性平，可治面上黑及礙容性疾病，白僵蠶含有氨基酸和活性絲光素，有營養(yǎng)皮膚和美容作用；含蛋白質(zhì)有刺激上皮脂腺，調(diào)節(jié)性激素分泌的作用；含維生素E，能清除自由基，抗脂質(zhì)氧化形成的老年斑；含活性絲光素能促使皮膚細(xì)胞新生，調(diào)節(jié)皮脂，改善皮膚微循環(huán)，可增白防曬。
過去白僵蠶均為自然死亡，后來進(jìn)行人工接種培養(yǎng)，在蠶4次蛻皮，接種后，蠶陸續(xù)發(fā)病死亡，及時(shí)揀出，另行攤放，保持同樣溫度，待其充分發(fā)僵變白后，置于通風(fēng)處，風(fēng)干或弱光下曬干。然而現(xiàn)有的人工生產(chǎn)的白僵蠶，仍然存在一些問題，如感染后的蠶體從死亡到僵化時(shí)間較長，白僵蠶的僵化率較低，僵化時(shí)間不整齊，質(zhì)量不穩(wěn)定，產(chǎn)量較低，成本也較高，不能達(dá)到產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
有鑒于此，本申請?zhí)峁┮环N白僵蠶的人工制備方法，其采用的球孢白僵菌孢子液經(jīng)過復(fù)壯，提高了攻毒活性，僵化率高，通過攻毒、蠶體培養(yǎng)、白僵蠶培養(yǎng)過程中溫度、濕度等條件的改進(jìn)，縮短了白僵蠶成品的制備周期，提高了白僵蠶的產(chǎn)量和質(zhì)量。
為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是一種白僵蠶的人工制備方法，所述制備方法包括以下步驟：
(1)球孢白僵菌孢子液的制備：用無菌水浸泡、清洗白僵蠶蠶體，過濾后取濾液，經(jīng)過一級斜面培養(yǎng)、二級種子培養(yǎng)、三級擴(kuò)大培養(yǎng)后得球孢白僵菌孢子液；
(2)病原攻毒：步驟(1)所述球孢白僵菌孢子液在制成后的45min內(nèi)，迅速噴施于5齡起蠶的蠶體，噴施完成后密閉蠶房1-1.5h；
(3)蠶體培養(yǎng)：打開步驟(2)所述蠶房，對蠶體喂食，每隔3-4h喂食一次，直至蠶體死亡；
(4)白僵蠶培養(yǎng)：將步驟(3)死亡后的蠶體轉(zhuǎn)移至蠶座上，在溫度為25-28℃，濕度為95-98％的條件下繼續(xù)培養(yǎng)至蠶體僵化，并長出白色菌絲分生孢子；
(5)白僵蠶成品制備：將步驟(4)長出白色菌絲分生孢子的白僵蠶收集后干燥至水分小于10％，即得白僵蠶成品。
優(yōu)選的，步驟(1)所述一級斜面培養(yǎng)的溫度為25-28℃，所述二級種子培養(yǎng)和三級擴(kuò)大培養(yǎng)的溫度為5-10℃。
優(yōu)選的，步驟(1)所述二級種子培養(yǎng)和三級擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其組分按重量百分比計(jì)包括：PDA培養(yǎng)基，補(bǔ)充10-20％馬鈴薯淀粉、5-20％蔗糖、10-15％蛋白胨、0.1-0.5％磷酸二氫鉀、0.01-0.05％硫酸鎂、5-15％蠶蛹粉、0.01-0.05％維生素B、0.01-0.05％維生素C、0.05-0.1％氯化鐵、0.05-0.1％氯化鈣。
更為優(yōu)選的，步驟(1)所述二級種子培養(yǎng)和三級擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其組分按重量百分比計(jì)包括：補(bǔ)充18％馬鈴薯淀粉、15％蔗糖、12％蛋白胨、0.3％磷酸二氫鉀、0.02％硫酸鎂、12％蠶蛹粉、0.03％維生素B、0.02％維生素C、0.08％氯化鐵、0.06％氯化鈣。
優(yōu)選的，步驟(2)所述病原攻毒的溫度為22-24℃，濕度為98％以上。
優(yōu)選的，所述步驟(2)噴施球孢白僵菌孢子液時(shí)，噴施的次數(shù)為3-4次，每次噴施的間隔時(shí)間為10-20min。
優(yōu)選的，步驟(2)所述的球孢白僵菌孢子液的濃度為4.8-5.8萬個(gè)/cm3。
優(yōu)選的，步驟(3)所述蠶體培養(yǎng)中，保持溫度在24-25℃，濕度為94-95％。
優(yōu)選的，步驟(3)所述喂食采用桑葉、蒲公英葉、柘樹葉、生菜葉中的任意一種。
優(yōu)選的，步驟(5)所述干燥的溫度為40-50℃，干燥時(shí)間為24-30h。
所述的PDA培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的簡稱，即Potato Dextrose Agar Medium。其做法是：稱取200g洗凈去皮的馬鈴薯切成小塊，加水煮爛(煮沸20—30min，能被玻璃棒戳破即可)，用八層紗布過濾，加熱，再根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要加1—10g瓊脂，繼續(xù)加熱攪拌混勻，待瓊脂溶解完后，加入葡萄糖，攪拌均勻，稍冷卻后再補(bǔ)足水分至1000毫升，分裝試管或者錐形瓶，加塞、包扎，115℃滅菌20分鐘后取出試管擺斜面或者搖勻，冷卻后即得。
在本申請技術(shù)方案中，所述人工制備方法包括了球孢白僵菌孢子液制備、病原攻毒、蠶體培養(yǎng)、白僵蠶培養(yǎng)、白僵蠶成品制備的步驟，直接將白僵蠶蠶體浸泡清洗過濾，得到的濾液中含有大量的球孢白僵菌孢子，通過一級斜面培養(yǎng)、二級種子培養(yǎng)、三級擴(kuò)大培養(yǎng)進(jìn)行復(fù)壯，得到的球孢白僵菌孢子液具有較高的活性，在進(jìn)行病原攻毒時(shí)毒性較強(qiáng)；其中，控制一級斜面培養(yǎng)的溫度在常溫條件，使菌體快速并大量繁殖，控制二級種子培養(yǎng)和三級擴(kuò)大培養(yǎng)在5-10℃的低溫條件下，可保證菌體的活性，同時(shí)減少雜菌率；此外，二級種子培養(yǎng)和三級擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其組分包括了菌體生長必須的碳源、氮源之外，還增加了磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鐵、氯化鈣，提供菌體生長所需元素，同時(shí)還增加了維生素B和維生素C，二者可以提高菌體生長速度，提高孢子量，以上復(fù)配，可以在保證球孢白僵菌活性的同時(shí)，大大減少培養(yǎng)的周期，提高生產(chǎn)效率。將球孢白僵菌孢子液在制成之后的45min內(nèi)噴施于家蠶的蠶體上，可保證在球孢白僵菌活性較高的情況下攻毒，提高病原攻毒的有效率；控制較常溫低的攻毒溫度和較高的攻毒濕度，保證蠶體此時(shí)最易被侵染；病原攻毒之后需要對蠶體進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3-4h喂食一次，喂食的食物采用桑葉、蒲公英葉、柘樹葉、生菜葉中的任意一種，能夠促進(jìn)蠶體在侵染之后繼續(xù)發(fā)育，提高白僵蠶成品的質(zhì)量；蠶體培養(yǎng)致死后，需要及時(shí)將其挑揀出，轉(zhuǎn)移至白僵菌生長適宜的條件下培養(yǎng)，控制溫度在25-28℃，并控制較高的濕度95-98％，使死亡蠶體上白僵菌迅速生長，加快蠶體僵化，以及分生孢子的生成；分生孢子生成之后需要將其干燥至水分小于10％，避免雜菌污染后的腐爛，另外，在干燥時(shí)需控制干燥的溫度在40-50℃之間，避免溫度過高，此外干燥時(shí)間應(yīng)控制在24-30h，同時(shí)避免熱風(fēng)干燥。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本申請技術(shù)方案所述的白僵蠶的人工制備方法，其采用的球孢白僵菌孢子液經(jīng)過復(fù)壯，提高了攻毒活性，僵化率高，通過攻毒、蠶體培養(yǎng)、白僵蠶培養(yǎng)過程中溫度、濕度等條件的改進(jìn)，縮短了白僵蠶成品的制備周期，提高了白僵蠶的產(chǎn)量和質(zhì)量。
具體實(shí)施方式
為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
實(shí)施例1
本實(shí)施例所述的一種白僵蠶的人工制備方法，包括以下步驟：
(1)球孢白僵菌孢子液的制備：用無菌水浸泡、清洗白僵蠶蠶體，過濾后取濾液，經(jīng)過一級斜面培養(yǎng)、二級種子培養(yǎng)、三級擴(kuò)大培養(yǎng)后得球孢白僵菌孢子液，所述一級斜面培養(yǎng)的溫度為26℃，所述二級種子培養(yǎng)和三級擴(kuò)大培養(yǎng)的溫度為6℃，所述二級種子培養(yǎng)和三級擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其組分按重量百分比計(jì)包括：PDA培養(yǎng)基，補(bǔ)充18％馬鈴薯淀粉、15％蔗糖、12％蛋白胨、0.3％磷酸二氫鉀、0.02％硫酸鎂、12％蠶蛹粉、0.03％維生素B、0.02％維生素C、0.08％氯化鐵、0.06％氯化鈣；
(2)病原攻毒：步驟(1)所述球孢白僵菌孢子液的濃度為5.5萬個(gè)/cm3，其在制成后的45min內(nèi)，迅速噴施于5齡起蠶的蠶體，噴施的次數(shù)為4次，每次噴施的間隔時(shí)間為15min，噴施完成后密閉蠶房1.5h，其中，病原攻毒的溫度為23℃，濕度為98％；
(3)蠶體培養(yǎng)：打開步驟(2)所述蠶房，保持溫度在25℃，濕度為94％，對蠶體喂食，每隔3.5h喂食一次，直至蠶體死亡，喂食采用桑葉；
(4)白僵蠶培養(yǎng)：將步驟(3)死亡后的蠶體轉(zhuǎn)移至蠶座上，在溫度為26℃，濕度為988％的條件下繼續(xù)培養(yǎng)至蠶體僵化，并長出白色菌絲分生孢子；
(5)白僵蠶成品制備：將步驟(4)長出白色菌絲分生孢子的白僵蠶收集后干燥，干燥的溫度為45℃，干燥時(shí)間為28h，即得白僵蠶成品。
本實(shí)施例中，病原攻毒后，蠶體死亡的時(shí)間為90-100h，僵化率為90％，產(chǎn)量為白僵蠶1.5kg/g蠶種，水分含量為8.5％，白僵蠶成品出現(xiàn)玻璃口，質(zhì)量好。
實(shí)施例2
本實(shí)施例所述的一種白僵蠶的人工制備方法，包括以下步驟：
(1)球孢白僵菌孢子液的制備：用無菌水浸泡、清洗白僵蠶蠶體，過濾后取濾液，經(jīng)過一級斜面培養(yǎng)、二級種子培養(yǎng)、三級擴(kuò)大培養(yǎng)后得球孢白僵菌孢子液，所述一級斜面培養(yǎng)的溫度為25℃，所述二級種子培養(yǎng)和三級擴(kuò)大培養(yǎng)的溫度為5℃，所述二級種子培養(yǎng)和三級擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其組分按重量百分比計(jì)包括：PDA培養(yǎng)基，補(bǔ)充10％馬鈴薯淀粉、5％蔗糖、10％蛋白胨、0.1％磷酸二氫鉀、0.01％硫酸鎂、5％蠶蛹粉、0.01％維生素B、0.01％維生素C、0.05％氯化鐵、0.05％氯化鈣；
(2)病原攻毒：步驟(1)所述球孢白僵菌孢子液的濃度為4.8萬個(gè)/cm3，其在制成后的45min內(nèi)，迅速噴施于5齡起蠶的蠶體，噴施的次數(shù)為3次，每次噴施的間隔時(shí)間為10min，噴施完成后密閉蠶房1h，其中，病原攻毒的溫度為22℃，濕度為98％；
(3)蠶體培養(yǎng)：打開步驟(2)所述蠶房，保持溫度在24℃，濕度為94％，對蠶體喂食，每隔3h喂食一次，直至蠶體死亡，喂食采用蒲公英葉；
(4)白僵蠶培養(yǎng)：將步驟(3)死亡后的蠶體轉(zhuǎn)移至蠶座上，在溫度為25℃，濕度為95％的條件下繼續(xù)培養(yǎng)至蠶體僵化，并長出白色菌絲分生孢子；
(5)白僵蠶成品制備：將步驟(4)長出白色菌絲分生孢子的白僵蠶收集后干燥，干燥的溫度為40℃，干燥時(shí)間為24h，即得白僵蠶成品。
本實(shí)施例中，病原攻毒后，蠶體死亡的時(shí)間為120-130h，僵化率為86％，產(chǎn)量為白僵蠶1.2kg/g蠶種，水分含量為8.9％，白僵蠶成品出現(xiàn)玻璃口，質(zhì)量好。
實(shí)施例3
本實(shí)施例所述的一種白僵蠶的人工制備方法，包括以下步驟：
(1)球孢白僵菌孢子液的制備：用無菌水浸泡、清洗白僵蠶蠶體，過濾后取濾液，經(jīng)過一級斜面培養(yǎng)、二級種子培養(yǎng)、三級擴(kuò)大培養(yǎng)后得球孢白僵菌孢子液，所述一級斜面培養(yǎng)的溫度為28℃，所述二級種子培養(yǎng)和三級擴(kuò)大培養(yǎng)的溫度為10℃，所述二級種子培養(yǎng)和三級擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其組分按重量百分比計(jì)包括：PDA培養(yǎng)基，補(bǔ)充20％馬鈴薯淀粉、20％蔗糖、15％蛋白胨、0.5％磷酸二氫鉀、0.05％硫酸鎂、15％蠶蛹粉、0.05％維生素B、0.05％維生素C、0.1％氯化鐵、0.1％氯化鈣；
(2)病原攻毒：步驟(1)所述球孢白僵菌孢子液的濃度為5.8萬個(gè)/cm3，其在制成后的45min內(nèi)，迅速噴施于5齡起蠶的蠶體，噴施的次數(shù)為4次，每次噴施的間隔時(shí)間為20min，噴施完成后密閉蠶房1.5h，其中，病原攻毒的溫度為24℃，濕度為98％；
(3)蠶體培養(yǎng)：打開步驟(2)所述蠶房，保持溫度在25℃，濕度為95％，對蠶體喂食，每隔4h喂食一次，直至蠶體死亡，喂食采用柘樹葉；
(4)白僵蠶培養(yǎng)：將步驟(3)死亡后的蠶體轉(zhuǎn)移至蠶座上，在溫度為28℃，濕度為98％的條件下繼續(xù)培養(yǎng)至蠶體僵化，并長出白色菌絲分生孢子；
(5)白僵蠶成品制備：將步驟(4)長出白色菌絲分生孢子的白僵蠶收集后干燥，干燥的溫度為50℃，干燥時(shí)間為30h，即得白僵蠶成品。
本實(shí)施例中，病原攻毒后，蠶體死亡的時(shí)間為90-95h，僵化率為90％，產(chǎn)量為白僵蠶1.4kg/g蠶種，水分含量為7.8％，白僵蠶成品出現(xiàn)玻璃口，質(zhì)量好。
實(shí)施例4
本實(shí)施例所述的一種白僵蠶的人工制備方法，包括以下步驟：
(1)球孢白僵菌孢子液的制備：用無菌水浸泡、清洗白僵蠶蠶體，過濾后取濾液，經(jīng)過一級斜面培養(yǎng)、二級種子培養(yǎng)、三級擴(kuò)大培養(yǎng)后得球孢白僵菌孢子液，所述一級斜面培養(yǎng)的溫度為28℃，所述二級種子培養(yǎng)和三級擴(kuò)大培養(yǎng)的溫度為10℃，所述二級種子培養(yǎng)和三級擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其組分按重量百分比計(jì)包括：PDA培養(yǎng)基，補(bǔ)充10％馬鈴薯淀粉、20％蔗糖、10％蛋白胨、0.5％磷酸二氫鉀、0.01％硫酸鎂、15％蠶蛹粉、0.01％維生素B、0.05％維生素C、0.05％氯化鐵、0.1％氯化鈣；
(2)病原攻毒：步驟(1)所述球孢白僵菌孢子液的濃度為4.5萬個(gè)/cm3，其在制成后的45min內(nèi)，迅速噴施于5齡起蠶的蠶體，噴施的次數(shù)為4次，每次噴施的間隔時(shí)間為10min，噴施完成后密閉蠶房1.2h，其中，病原攻毒的溫度為22℃，濕度為98％；
(3)蠶體培養(yǎng)：打開步驟(2)所述蠶房，保持溫度在25℃，濕度為95％，對蠶體喂食，每隔4h喂食一次，直至蠶體死亡，喂食采用生菜葉；
(4)白僵蠶培養(yǎng)：將步驟(3)死亡后的蠶體轉(zhuǎn)移至蠶座上，在溫度為28℃，濕度為98％的條件下繼續(xù)培養(yǎng)至蠶體僵化，并長出白色菌絲分生孢子；
(5)白僵蠶成品制備：將步驟(4)長出白色菌絲分生孢子的白僵蠶收集后干燥，干燥的溫度為50℃，干燥時(shí)間為30h，即得白僵蠶成品。
本實(shí)施例中，病原攻毒后，蠶體死亡的時(shí)間為95-110h，僵化率為91％，產(chǎn)量為白僵蠶1.4kg/g蠶種，水分含量為8.2％，白僵蠶成品出現(xiàn)玻璃口，質(zhì)量好。
實(shí)施例5
本實(shí)施例所述的一種白僵蠶的人工制備方法，包括以下步驟：
(1)球孢白僵菌孢子液的制備：用無菌水浸泡、清洗白僵蠶蠶體，過濾后取濾液，經(jīng)過一級斜面培養(yǎng)、二級種子培養(yǎng)、三級擴(kuò)大培養(yǎng)后得球孢白僵菌孢子液，所述一級斜面培養(yǎng)的溫度為28℃，所述二級種子培養(yǎng)和三級擴(kuò)大培養(yǎng)的溫度為5℃，所述二級種子培養(yǎng)和三級擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其組分按重量百分比計(jì)包括：PDA培養(yǎng)基，補(bǔ)充20％馬鈴薯淀粉、5％蔗糖、15％蛋白胨、0.1％磷酸二氫鉀、0.05％硫酸鎂、5％蠶蛹粉、0.05％維生素B、0.01％維生素C、0.1％氯化鐵、0.05％氯化鈣；
(2)病原攻毒：步驟(1)所述球孢白僵菌孢子液的濃度為4.5萬個(gè)/cm3，其在制成后的45min內(nèi)，迅速噴施于5齡起蠶的蠶體，噴施的次數(shù)為3次，每次噴施的間隔時(shí)間為10min，噴施完成后密閉蠶房1.5h，其中，病原攻毒的溫度為23℃，濕度為99％；
(3)蠶體培養(yǎng)：打開步驟(2)所述蠶房，保持溫度在25℃，濕度為95％，對蠶體喂食，每隔4h喂食一次，直至蠶體死亡，喂食采用桑葉；
(4)白僵蠶培養(yǎng)：將步驟(3)死亡后的蠶體轉(zhuǎn)移至蠶座上，在溫度為25℃，濕度為98％的條件下繼續(xù)培養(yǎng)至蠶體僵化，并長出白色菌絲分生孢子；
(5)白僵蠶成品制備：將步驟(4)長出白色菌絲分生孢子的白僵蠶收集后干燥，干燥的溫度為50℃，干燥時(shí)間為24h，即得白僵蠶成品。
本實(shí)施例中，病原攻毒后，蠶體死亡的時(shí)間為100-110h，僵化率為88％，產(chǎn)量為白僵蠶1.5kg/g蠶種，水分含量為8.5％，白僵蠶成品出現(xiàn)玻璃口，質(zhì)量好。
以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出的是，上述優(yōu)選實(shí)施方式不應(yīng)視為對本發(fā)明的限制，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)當(dāng)以權(quán)利要求所限定的范圍為準(zhǔn)。對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。