專利名稱：利用aflp指紋技術(shù)鑒定家蠶和桑樹品種的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用AFLP指紋技術(shù)鑒定家蠶和桑樹品種的方法。
背景技術(shù)：
蠶業(yè)生產(chǎn)上，常常要進行家蠶和桑樹品種的鑒別。傳統(tǒng)的家蠶和桑樹品種鑒定是以形態(tài)學標記為依據(jù)的。但該鑒定方法存在著以下主要幾方面的缺點(一)大多數(shù)性狀易受環(huán)境條件的影響，地區(qū)間、年份間也會表現(xiàn)出一定程度的變化，對于基因型的準確鑒定較為困難，從而影響了品種遺傳性和品種間遺傳變異的描述和評價的準確性；(二)形態(tài)學性狀常常局限于某一生命時期，品種鑒定的時效性較差。近年來，DNA指紋技術(shù)的迅速發(fā)展為在DNA分子水平上鑒定家蠶和桑樹品種提供了嶄新的手段。其中AFLP(Amplified FragmentLength Polymorphism)技術(shù)為新發(fā)展起來的被認為是最有效的分子標記方法。AFLP分析的基本原理是選擇性擴增基因組DNA酶切片段。由于不同基因組DNA的酶切位點存在差異，因而產(chǎn)生了擴增片段長度的多態(tài)性。用AFLP方法得到的指紋圖譜具有穩(wěn)定可靠且多態(tài)性豐富等優(yōu)點，非常適合于品種鑒定等方面的應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用AFLP指紋技術(shù)鑒定家蠶和桑樹品種的方法。
為了達到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是(1)基因池DNA的來源從同一品種不同個體的家蠶或不同植株的桑樹的任何組織器官提取DNA，混合成品種的基因池；(2)AFLP接頭和二次擴增(預擴增、選擇性擴增)的引物AFLP分析所用的EcoRI和MseI接頭的核苷酸順序如下EcoRI接頭5′-CTCGTAGACTGCGTACCCTGACGCATGGTTAA-5′MseI接頭5′-GACGATGAGTCCTGAGTACTCAGGACTCAT-5′EcoRI和MseI預擴增引物分別為
5′-GACTGCGTACCAATTCA-3′5′-GATGAGTCCTGAGTAAC-3′EcoRI和MseI選擇性擴增引物為

(3)AFLP反應條件A.模板DNA的酶切每個反應總體積為25μl，其中包括DNA 250ng，EcoRI(TaKaRa)和MseI(BioLabs)各2.5U，BSA 2.5μg，1×RL Bufter(500mmol/LNaCl，100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，pH7.9)，20～50℃保溫20min～8h；B.DNA片段接頭的連接酶切后，每個DNA樣品中加入10μl的連接混合液EcoRI adaptor 5pmol，MseI adaptor 50pmol，T4DNA Ligase(TaKaRa)1.2U，1×T4DNA Ligase Buffer(66mmol/L Tris-HCl pH7.6，6.6mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，0.1mmol/L ATP)。10～40℃連接1～6h；C.DNA片段的預擴增取2.5μl連接后的DNA樣品，加入22.5μl的預擴增混合液EcoRI預擴增引物和MseI預擴增引物各35ng，dNTP Mixture各5mmol/L，Taq DNA Polymerase(TaKaRa)0.625U，1×PCR Buffer(10mmol/LTris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2)，混勻后，按如下PCR程序擴增94℃ 20～60sec，56℃ 0.5～2min，72℃ 0.5～2min，20～40個循環(huán)，預擴增產(chǎn)物稀釋20倍，-20℃保存?zhèn)溆?；D.選擇性AFLP擴增取5μl 20倍稀釋的預擴增混合液，加入20μl選擇性擴增混合液EcoRI選擇性擴增引物和MseI選擇性擴增引物各35ng，dNTPMixture各5mmol/L，Taq DNA polymerase(TaKaRa)1U，1×PCR Buffer(10mmol/LTris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2)，混勻后，按如下PCR程序擴增94℃ 20～60sec，65℃(每循環(huán)降低0.7℃)20～60sec，72℃ 0.5～2min，10～20個循環(huán)后變?yōu)?4℃ 20～60sec，56℃ 20～60sec，72℃ 0.5～2min，20～30個循環(huán)，反應結(jié)束后，向選擇性擴增產(chǎn)物中加入等體積的上樣緩沖液(98％甲酰胺，10mmol/L EDTA pH8.0，0.25％溴酚藍，0.25％二甲苯腈)，95℃變性5min，置于冰上冷卻，待用；E.擴增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺電泳分析經(jīng)預電泳(55w恒功率)20～50min后，取3μl上樣混合物在6％聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分析(50～100w恒功率)，電泳至二甲苯腈指示帶距離底部2厘米處終止電泳；F.銀染成像a.電泳結(jié)束后，取下膠板，放入2ml的固定/終止液(10％醋酸)中，輕搖10～30min或直到指示劑顏色消失為止；b.用雙蒸水漂洗凝膠3次，每次1～5min；c.將凝膠放入1L的染色液(1g AgNO3，1.5ml 37％甲醛)中，輕搖20～40min；d.從染色液中取出凝膠，放入雙蒸水中，稍作翻動，立即取出浸入預冷的1L顯色液(30g NaCO3，1.5ml 37％甲醛，200μl 10mg/ml NaS2O3)中；從凝膠放入水中到其完全浸入顯色液中的時間不能超過5～15sec，否則重復(c)步驟；e.凝膠浸入顯色液后，輕輕搖動，出現(xiàn)主帶后，將凝膠轉(zhuǎn)入另一顯色液中繼續(xù)顯色，直到出現(xiàn)全部清晰譜帶；
f.待凝膠完全顯色后，將固定/終止液倒入顯色液中，中止反應；g.用雙蒸水漂洗凝膠2次，每次1～5min；h.取出凝膠，室溫下自然晾干、拍片、保存；(4)標準DNA指紋圖譜的構(gòu)建以上述特定引物對家蠶和桑樹不同品種進行預擴增和選擇性擴增，以二次擴增結(jié)果為依據(jù)，構(gòu)建家蠶和桑樹品種的標準DNA指紋圖譜；(5)家蠶和桑樹品種的鑒定將待測家蠶和桑樹樣本的指紋圖譜與標準圖譜相比較，以鑒定待測樣本的品種真實性；以上述AFLP擴增結(jié)果為依據(jù)，構(gòu)建桑樹不同品種的標準DNA指紋圖譜。
本發(fā)明與背景技術(shù)相比，具有的有益的效果是它建立一種客觀、科學、準確的家蠶和桑樹品種鑒定技術(shù)體系，為保護桑樹育種產(chǎn)權(quán)、登錄新品種、鑒定和檢測苗木真實性和純度、仲裁苗木糾紛和規(guī)范苗木市場提供技術(shù)保障。


下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。
圖1是引物GACTGCGTACCAATTCAGG/GATGAGTCCTGAGTAACTT擴增的7個桑樹品種的AFLP指紋圖譜；圖2是引物GACTGCGTACCAATTCAGG/GATGAGTCCTGAGTAACAA擴增的7個桑樹品種的AFLP指紋圖譜；圖3是引物GACTGCGTACCAATTCACA/GATGAGTCCTGAGTAACTT擴增的7個桑樹品種的AFLP指紋圖譜；圖4是引物GACTGCGTACCAATTCAAC/GATGAGTCCTGAGTAACTT擴增的7個桑樹品種的AFLP指紋圖譜；圖5是引物GACTGCGTACCAATTCAAC/GATGAGTCCTGAGTAACAC擴增的7個桑樹品種的AFLP指紋圖譜；圖6是引物GACTGCGTACCAATTCAGG/GATGAGTCCTGAGTAACAA擴增的6個家蠶品種(包括正反交)的AFLP指紋圖譜。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。
實施例1(1)基因池DNA的制備分別從桐鄉(xiāng)青、荷葉白、湖桑197、盛東一號、農(nóng)桑8號、農(nóng)桑12號、農(nóng)桑14號6個桑樹品種的不同株的桑葉(以嫩葉為佳)提取DNA，混合成品種的基因池。桑葉DNA的提取和純化步驟如下A.稱取1g葉片組織(去除中脈)，加液氮冰凍研磨成干粉，轉(zhuǎn)入離心管后，加4ml抽提緩沖液(100mmol/L Tris-HCl pH8.0，50mmol/L EDTA pH8.0，500mmol/L NaCl，10mmol/L a-巰基乙醇)，混勻；B.加450μl 10％SDS，充分混勻，65℃保溫1h；C.加入445μl 5mol/L KAc，充分混勻，-20℃放置1h；D.4℃下12000r/min離心15min；E.上清液轉(zhuǎn)入新離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇，輕輕顛倒離心管數(shù)次，放置片刻；F.于4℃下8000r/min離心10min；G.上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中，加入2/3體積、-20℃預冷的異丙醇，混勻，-20℃放置1h；H.于4℃下8000r/min離心10min，去除上清液，用70％的乙醇洗滌沉淀2次，抽干；I.加入500μl TE緩沖液(10mmol/L Tris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0)溶解沉淀；J.加無DNase的RNase至終濃度100μg/ml，于37℃保溫1h；K.加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，放置幾分鐘后，10000r/min離心10min，吸取上清液，重復1次；L.加入1/5體積的3mol/L NaAc，混勻，加入2.5倍體積的無水乙醇，輕緩混勻，-20℃放置1h；M.4℃下10000r/min離心20～30min，去除上清液，用70％的乙醇洗滌沉淀2～3次，抽干；N.加入50μl TE或dH2O溶解DNA，備用；(2)AFLP接頭和二次擴增的引物AFLP分析所用的EcoRI和MseI接頭的核苷酸順序如下EcoRI接頭5′-CTCGTAGACTGCGTACCCTGACGCATGGTTAA-5′MseI接頭5′-GACGATGAGTCCTGAG
TACTCAGGACTCAT-5′EcoRI和MseI預擴增引物分別為5′-GACTGCGTACCAATTCA-3′5′-GATGAGTCCTGAGTAAC-3′EcoRI和MseI選擇性擴增引物為5′-GACTGCGTACCAATTCAGG/GATGAGTCCTGAGTAACTT-3′(3)AFLP反應條件A.模板DNA的酶切 每個反應總體積為25μl，其中包括DNA 250ng，EcoRI(TaKaRa)和MseI(BioLabs)各2.5U，BSA 2.5μg，1×RL Bufter(500mmol/LNaCl，100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，pH7.9)。37℃保溫8h；B.DNA片段接頭的連接酶切后，每個DNA樣品中加入10μl的連接混合液EcoRT adaptor 5pmol，MseI adaptor 50pmol，T4DNA Ligase(TaKaRa)1.2U，1×T4DNA Ligase Buffer(66mmol/L Tris-HCl pH7.6，6.6mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，0.1mmol/L ATP)。16℃連接16h；C.DNA片段的預擴增 取2.5μl連接后的DNA樣品，加入22.5μl的預擴增混合液EcoRI預擴增引物和MseI預擴增引物各35ng，dNTP Mixture各5mmol/L，Taq DNA Polymerase(TaKaRa)0.625 U，1×PCR Buffer(10mmol/LTris-HClpH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2)?；靹蚝螅慈缦翽CR程序擴增94℃ 30sec，56℃ 1min，72℃ 1min，30個循環(huán)。預擴增產(chǎn)物稀釋20倍，-20℃保存?zhèn)溆?；D.選擇性AFLP擴增 取5μl 20倍稀釋的預擴增混合液，加入20μl選擇性擴增混合液EcoRI選擇性擴增引物和MseI選擇性擴增引物各35ng，dNTPMixture各5mmol/L，Taq DNA polymerase(TaKaRa)1U，1×PCR Buffer(10mmol/LTris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2)，混勻后，按如下PCR程序擴增94℃ 30sec，65℃(每循環(huán)降低0.7℃)30sec，72℃ 1min，12個循環(huán)后變?yōu)?4℃ 30sec，56℃ 30sec，72℃ 1min，23個循環(huán)，反應結(jié)束后，向選擇性擴增產(chǎn)物中加入等體積的上樣緩沖液(98％甲酰胺，10mmol/L EDTA pH8.0，0.25％溴酚藍，0.25％二甲苯腈)，95℃變性5min，立即置于冰上冷卻，待用。
E.擴增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺電泳分析經(jīng)預電泳(55w恒功率)30min后，取3μl上樣混合物在6％聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分析(70w恒功率)，電泳至二甲苯腈指示帶距離底部2厘米處終止電泳；F.銀染成像a.電泳結(jié)束后，取下膠板，放入2ml的固定/終止液(10％醋酸)中，輕搖20min或直到指示劑顏色消失為止；b.用雙蒸水漂洗凝膠3次，每次2min；c.將凝膠放入1L的染色液(1g AgNO3，1.5ml 37％甲醛)中，輕搖30min。
d.從染色液中取出凝膠，放入雙蒸水中，稍作翻動，立即取出浸入預冷的1L顯色液(30g NaCO3，1.5ml 37％甲醛，200μl 10mg/ml NaS2O3)中，注意，從凝膠放入水中到其完全浸入顯色液中的時間不能超過10sec，否則重復(c)步驟；e.凝膠浸入顯色液后，輕輕搖動，出現(xiàn)主帶后，將凝膠轉(zhuǎn)入另一顯色液中繼續(xù)顯色，直到出現(xiàn)全部清晰譜帶；f.待凝膠完全顯色后，將固定/終止液倒入顯色液中，中止反應；g.用雙蒸水漂洗凝膠2次，每次2min；h.取出凝膠，室溫下自然晾干、拍片、保存；(4)標準DNA指紋圖譜的構(gòu)建應用引物GACTGCGTACCAATTCAGG/GATGAGTCCTGAGTAACTT構(gòu)建的7個桑樹品種的AFLP指紋圖譜如圖1所示，A～G代表桑樹品種，其中A為桐鄉(xiāng)青，B為荷葉白，C為湖桑197，D為盛東一號，E為農(nóng)桑8號，F(xiàn)為農(nóng)桑12號，G為農(nóng)桑14號.右列數(shù)字為多態(tài)性擴增帶的編號；(5)桑樹品種的鑒定將待測桑樹樣本的指紋圖譜與標準圖譜相比較，以鑒定待測樣本的品種真實性。
實施例2(1)基因池DNA的制備分別從桐鄉(xiāng)青、荷葉白、湖桑197、盛東一號、農(nóng)桑8號、農(nóng)桑12號、農(nóng)桑14號6個桑樹品種的不同株的桑葉(以嫩葉為佳)提取DNA，混合成品種的基因池。桑葉DNA的提取和純化步驟如下A.稱取1g葉片組織(去除中脈)，加液氮冰凍研磨成干粉，轉(zhuǎn)入離心管后，加4ml抽提緩沖液(100mmol/L Tris-HCl pH8.0，50mmol/L EDTA pH8.0，500mmol/L NaCl，10mmol/L a-巰基乙醇)，混勻；
B.加450μl 10％SDS，充分混勻，65℃保溫1h；C.加入445μl 5mol/L KAc，充分混勻，-20℃放置1h；D.4℃下12000r/min離心15min；E.上清液轉(zhuǎn)入新離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇，輕輕顛倒離心管數(shù)次，放置片刻；F.于4℃下8000r/min離心10min；G.上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中，加入2/3體積、-20℃預冷的異丙醇，混勻，-20℃放置1h；H.于4℃下8000r/min離心10min，去除上清液，用70％的乙醇洗滌沉淀2次，抽干；I.加入500μl TE緩沖液(10mmol/L Tris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0)溶解沉淀；J.加無DNase的RNase至終濃度100μg/ml，于37℃保溫1h；K.加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，放置幾分鐘后，10000r/min離心10min，吸取上清液，重復1次；L.加入1/5體積的3mol/L NaAc，混勻，加入2.5倍體積的無水乙醇，輕緩混勻，-20℃放置1h；M.4℃下10000r/min離心20～30min，去除上清液，用70％的乙醇洗滌沉淀2～3次，抽干；N.加入50μl TE或dH2O溶解DNA，備用；(2)AFLP接頭和二次擴增的引物AFLP分析所用的EcoRI和MseI接頭的核苷酸順序如下EcoRI接頭5′-CTCGTAGACTGCGTACCCTGACGCATGGTTAA-5′MseI接頭5′-GACGATGAGTCCTGAGTACTCAGGACTCAT-5′EcoRI和MseI預擴增引物分別為5′-GACTGCGTACCAATTCA-3′5′-GATGAGTCCTGAGTAAC-3′EcoRI和MseI選擇性擴增引物為5′-GACTGCGTACCAATTCAGG/GATGAGTCCTGAGTAACAA-3′
(3)AFLP反應條件A.模板DNA的酶切每個反應總體積為25μl，其中包括DNA 250ng，EcoRI(TaKaRa)和MseI(BioLabs)各2.5U，BSA 2.5μg，1×RL Bufter(500mmol/LNaCl，100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，pH7.9)，37℃保溫8h；B.DNA片段接頭的連接酶切后，每個DNA樣品中加入10μl的連接混合液EcoRI adaptor 5 pmol，MseI adaptor 50pmol，T4DNA Ligase(TaKaRa)1.2U，1×T4DNA Ligase Buffer(66mmol/L Tris-HCl pH7.6，6.6mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，0.1mmol/L ATP)。16℃連接16h；C.DNA片段的預擴增 取2.5μl連接后的DNA樣品，加入22.5μl的預擴增混合液EcoRI預擴增引物和MseI預擴增引物各35ng，dNTP Mixture各5mmol/L，Taq DNA Polymerase(TaKaRa)0.625 U，1×PCR Buffer(10mmol/LTris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，混勻后，按如下PCR程序擴增94℃ 30sec，56℃ 1min，72℃ 1min，30個循環(huán)，預擴增產(chǎn)物稀釋20倍，-20℃保存?zhèn)溆?；D.選擇性AFLP擴增 取5μl 20倍稀釋的預擴增混合液，加入20μl選擇性擴增混合液EcoRI選擇性擴增引物和MseI選擇性擴增引物各35ng，dNTPMixture各5mmol/L，Taq DNA polymerase(TaKaRa)1U，1×PCR Buffer(10mmol/LTris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2)?；靹蚝螅慈缦翽CR程序擴增94℃ 30sec，65℃(每循環(huán)降低0.7℃)30sec，72℃ 1min，12個循環(huán)后變?yōu)?4℃ 30sec，56℃ 30sec，72℃ 1min，23個循環(huán)。反應結(jié)束后，向選擇性擴增產(chǎn)物中加入等體積的上樣緩沖液(98％甲酰胺，10mmol/L EDTA pH8.0，0.25％溴酚藍，0.25％二甲苯腈)，95℃變性5min，立即置于冰上冷卻，待用；E.擴增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺電泳分析經(jīng)預電泳(55w恒功率)30min后，取3μl上樣混合物在6％聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分析(70w恒功率)，電泳至二甲苯腈指示帶距離底部2厘米處終止電泳；F.銀染成像a.電泳結(jié)束后，取下膠板，放入2ml的固定/終止液(10％醋酸)中，輕搖20min或直到指示劑顏色消失為止；b用雙蒸水漂洗凝膠3次，每次2min；c.將凝膠放入1L的染色液(1g AgNO3，1.5ml 37％甲醛)中，輕搖30min。
d.從染色液中取出凝膠，放入雙蒸水中，稍作翻動，立即取出浸入預冷的1L顯色液(30g NaCO3，1.5ml 37％甲醛，200μl 10mg/ml NaS2O3)中。注意，從凝膠放入水中到其完全浸入顯色液中的時間不能超過10sec，否則重復(c)步驟；e.凝膠浸入顯色液后，輕輕搖動，出現(xiàn)主帶后，將凝膠轉(zhuǎn)入另一顯色液中繼續(xù)顯色，直到出現(xiàn)全部清晰譜帶；f.待凝膠完全顯色后，將固定/終止液倒入顯色液中，中止反應；g.用雙蒸水漂洗凝膠2次，每次2min；h.取出凝膠，室溫下自然晾干、拍片、保存；(4)標準DNA指紋圖譜的構(gòu)建應用引物GACTGCGTACCAATTCAGG/GATGAGTCCTGAGTAACAA構(gòu)建的7個桑樹品種的AFLP指紋圖譜如圖2所示，A～G代表桑樹品種，其中A為桐鄉(xiāng)青，B為荷葉白，C為湖桑197，D為盛東一號，E為農(nóng)桑8號，F(xiàn)為農(nóng)桑12號，G為農(nóng)桑14號.右列數(shù)字為多態(tài)性擴增帶的編號；(5)桑樹品種的鑒定將待測桑樹樣本的指紋圖譜與標準圖譜相比較，以鑒定待測樣本的品種真實性。
實施例3(1)基因池DNA的制備分別從桐鄉(xiāng)青、荷葉白、湖桑197、盛東一號、農(nóng)桑8號、農(nóng)桑12號、農(nóng)桑14號6個桑樹品種的不同株的桑葉(以嫩葉為佳)提取DNA，混合成品種的基因池。桑葉DNA的提取和純化步驟如下A.稱取1g葉片組織(去除中脈)，加液氮冰凍研磨成干粉，轉(zhuǎn)入離心管后，加4ml抽提緩沖液(100mmol/L Tris-HCl pH8.0，50mmol/L EDTA pH8.0，500mmol/L NaCl，10mmol/L a-巰基乙醇)，混勻；B.加450μl 10％SDS，充分混勻，65℃保溫1h；C.加入445μl 5mol/L KAc，充分混勻，-20℃放置1h；D.4℃下12000r/min離心15min；E.上清液轉(zhuǎn)入新離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇，輕輕顛倒離心管數(shù)次，放置片刻；F.于4℃下8000r/min離心10min；
G.上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中，加入2/3體積、-20℃預冷的異丙醇，混勻，-20℃放置1h；H.于4℃下8000r/min離心10min，去除上清液，用70％的乙醇洗滌沉淀2次，抽干；I.加入500μl TE緩沖液(10mmol/L Tris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0)溶解沉淀；J.加無DNase的RNase至終濃度100μg/ml，于37℃保溫1h；K.加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，放置幾分鐘后，10000r/min離心10min，吸取上清液，重復1次；L.加入1/5體積的3mol/L NaAc，混勻，加入2.5倍體積的無水乙醇，輕緩混勻，-20℃放置1h；M.4℃下10000r/min離心20～30min，去除上清液，用70％的乙醇洗滌沉淀2～3次，抽干；N.加入50μl TE或dH2O溶解DNA，備用；(2)AFLP接頭和二次擴增的引物AFLP分析所用的EcoRI和MseI接頭的核苷酸順序如下EcoRI接頭5′-CTCGTAGACTGCGTACCCTGACGCATGGTTAA-5′MseI接頭5′-GACGATGAGTCCTGAGTACTCAGGACTCAT-5′EcoRI和MseI預擴增引物分別為5′-GACTGCGTACCAATTCA-3′5′-GATGAGTCCTGAGTAAC-3′EcoRI和MseI選擇性擴增引物為5′-GACTGCGTACCAATTCACA/GATGAGTCCTGAGTAACTT-3′(3)AFLP反應條件A.模板DNA的酶切 每個反應總體積為25μl，其中包括DNA 250ng，EcoRI(TaKaRa)和MseI(BioLabs)各2.5U，BSA 2.5μg，1×RL Bufter(500mmol/LNaCl，100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，pH7.9)，37℃保溫8h；B.DNA片段接頭的連接 酶切后，每個DNA樣品中加入10μl的連接混合液EcoRI adaptor 5pmol，MseI adaptor 50pmol，T4DNA Ligase(TaKaRa)1.2U，1×T4DNA Ligase Buffer(66mmol/L Tris-HCl pH7.6，6.6mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，0.1mmol/L ATP)。16℃連接16h；C.DNA片段的預擴增 取2.5μl連接后的DNA樣品，加入22.5μl的預擴增混合液EcoRI預擴增引物和MseI預擴增引物各35ng，dNTP Mixture各5mmol/L，Taq DNA Polymerase(TaKaRa)0.625 U，1×PCR Buffer(10mmol/LTris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2)，混勻后，按如下PCR程序擴增94℃ 30sec，56℃ 1min，72℃、1min，30個循環(huán)。預擴增產(chǎn)物稀釋20倍，-20℃保存?zhèn)溆?；D.選擇性AFLP擴增取5μl 20倍稀釋的預擴增混合液，加入20μl選擇性擴增混合液EcoRI選擇性擴增引物和MseI選擇性擴增引物各35ng，dNTPMixture各5mmol/L，Taq DNA polymerase(TaKaRa)1U，1×PCR Buffer(10mmol/LTris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2)?；靹蚝螅慈缦翽CR程序擴增94℃ 30sec，65℃(每循環(huán)降低0.7℃)30sec，72℃ 1min，12個循環(huán)后變?yōu)?4℃ 30sec，56℃ 30sec，72℃ 1min，23個循環(huán)。反應結(jié)束后，向選擇性擴增產(chǎn)物中加入等體積的上樣緩沖液(98％甲酰胺，10mmol/L EDTA pH8.0，0.25％溴酚藍，0.25％二甲苯腈)，95℃變性5min，立即置于冰上冷卻，待用；E.擴增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺電泳分析經(jīng)預電泳(55w恒功率)30min后，取3μl上樣混合物在6％聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分析(70w恒功率)，電泳至二甲苯腈指示帶距離底部2厘米處終止電泳；F.銀染成像a.電泳結(jié)束后，取下膠板，放入2ml的固定/終止液(10％醋酸)中，輕搖20min或直到指示劑顏色消失為止；b.用雙蒸水漂洗凝膠3次，每次2min；c.將凝膠放入1L的染色液(1g AgNO3，1.5ml 37％甲醛)中，輕搖30min。
d.從染色液中取出凝膠，放入雙蒸水中，稍作翻動，立即取出浸入預冷的1L顯色液(30g NaCO3，1.5ml 37％甲醛，200μl 10mg/ml NaS2O3)中，注意，從凝膠放入水中到其完全浸入顯色液中的時間不能超過10sec，否則重復(c)步驟；e.凝膠浸入顯色液后，輕輕搖動，出現(xiàn)主帶后，將凝膠轉(zhuǎn)入另一顯色液中繼續(xù)顯色，直到出現(xiàn)全部清晰譜帶；
f.待凝膠完全顯色后，將固定/終止液倒入顯色液中，中止反應；g.用雙蒸水漂洗凝膠2次，每次2min；h.取出凝膠，室溫下自然晾干、拍片、保存；(4)標準DNA指紋圖譜的構(gòu)建應用引物GACTGCGTACCAATTCACA/GATGAGTCCTGAGTAACTT構(gòu)建的7個桑樹品種的AFLP指紋圖譜如圖3所示，A～G代表桑樹品種，其中A為桐鄉(xiāng)青，B為荷葉白，C為湖桑197，D為盛東一號，E為農(nóng)桑8號，F(xiàn)為農(nóng)桑12號，G為農(nóng)桑14號.右列數(shù)字為多態(tài)性擴增帶的編號。
(5)桑樹品種的鑒定將待測桑樹樣本的指紋圖譜與標準圖譜相比較，以鑒定待測樣本的品種真實性。
實施例4(1)基因池DNA的制備分別從桐鄉(xiāng)青、荷葉白、湖桑197、盛東一號、農(nóng)桑8號、農(nóng)桑12號、農(nóng)桑14號6個桑樹品種的不同株的桑葉(以嫩葉為佳)提取DNA，混合成品種的基因池。桑葉DNA的提取和純化步驟如下A.稱取1g葉片組織(去除中脈)，加液氮冰凍研磨成干粉，轉(zhuǎn)入離心管后，加4ml抽提緩沖液(100mmol/L Tris-HCl pH8.0，50mmol/L EDTA pH8.0，500mmol/L NaCl，10mmol/L a-巰基乙醇)，混勻；B.加450μl 10％SDS，充分混勻，65℃保溫1h；C.加入445μl 5mol/L KAc，充分混勻，-20℃放置1h；D.4℃下12000r/min離心15min；E.上清液轉(zhuǎn)入新離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇，輕輕顛倒離心管數(shù)次，放置片刻；F.于4℃下8000r/min離心10min；G.上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中，加入2/3體積、-20℃預冷的異丙醇，混勻，-20℃放置1h；H.于4℃下8000r/min離心10min，去除上清液，用70％的乙醇洗滌沉淀2次，抽干；I.加入500μl TE緩沖液(10mmol/L Tris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0)溶解沉淀；
J.加無DNase的RNase至終濃度100μg/ml，于37℃保溫1h；K.加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，放置幾分鐘后，10000r/min離心10min，吸取上清液，重復1次；L.加入1/5體積的3mol/L NaAc，混勻，加入2.5倍體積的無水乙醇，輕緩混勻，-20℃放置1h。
M.4℃下10000r/min離心20～30min，去除上清液，用70％的乙醇洗滌沉淀2～3次，抽干；N.加入50μl TE或dH2O溶解DNA，備用；(2)AFLP接頭和二次擴增的引物AFLP分析所用的EcoRI和MseI接頭的核苷酸順序如下EcoR I接頭5′-CTCGTAGACTGCGTACCCTGACGCATGGTTAA-5′MseI接頭5′-GACGATGAGTCCTGAGTACTCAGGACTCAT-5′EcoRI和MseI預擴增引物分別為5′-GACTGCGTACCAATTCA-3′5′-GATGAGTCCTGAGTAAC-3′EcoRI和MseI選擇性擴增引物為5′-GACTGCGTACCAATTCAAC/GATGAGTCCTGAGTAACTT-3′(3)AFLP反應條件A.模板DNA的酶切每個反應總體積為25μl，其中包括DNA 250ng，EcoRI(TaKaRa)和MseI(BioLabs)各2.5U，BSA 2.5μg，1×RL Bufter(500mmol/LNaCl，100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，pH7.9)，37℃保溫8h；B.DNA片段接頭的連接酶切后，每個DNA樣品中加入10μl的連接混合液EcoRI adaptor 5pmol，MseI adaptor 50pmol，T4DNA Ligase(TaKaRa)1.2U，1×T4DNA Ligase Buffer(66mmol/L Tris-HCl pH7.6，6.6mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，0.1mmol/L ATP)。16℃連接16h；C.DNA片段的預擴增 取2.5μl連接后的DNA樣品，加入22.5μl的預擴增混合液EcoRI預擴增引物和MseI預擴增引物各35ng，dNTP Mixture各5mmol/L，Taq DNA Polymerase(TaKaRa)0.625 U，1×PCR Buffer(10mmol/LTris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2)?；靹蚝螅慈缦翽CR程序擴增94℃ 30sec，56℃ 1min，72℃ 1min，30個循環(huán)。預擴增產(chǎn)物稀釋20倍，-20℃保存?zhèn)溆?；D.選擇性AFLP擴增 取5μl 20倍稀釋的預擴增混合液，加入20μl選擇性擴增混合液EcoRI選擇性擴增引物和MseI選擇性擴增引物各35ng，dNTPMixture各5mmol/L，Taq DNA polymerase(TaKaRa)1U，1×PCR Buffer(10mmol/LTris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2)?；靹蚝?，按如下PCR程序擴增94℃ 30sec，65℃(每循環(huán)降低0.7℃)30sec，72℃ 1min，12個循環(huán)后變?yōu)?4℃ 30sec，56℃ 30sec，72℃ 1min，23個循環(huán)。反應結(jié)束后，向選擇性擴增產(chǎn)物中加入等體積的上樣緩沖液(98％甲酰胺，10mmol/L EDTA pH8.0，0.25％溴酚藍，0.25％二甲苯腈)，95℃變性5min，立即置于冰上冷卻，待用；E.擴增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺電泳分析經(jīng)預電泳(55w恒功率)30min后，取3μl上樣混合物在6％聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分析(70w恒功率)，電泳至二甲苯腈指示帶距離底部2厘米處終止電泳；F.銀染成像a.電泳結(jié)束后，取下膠板，放入2ml的固定/終止液(10％醋酸)中，輕搖20min或直到指示劑顏色消失為止；b.用雙蒸水漂洗凝膠3次，每次2min；c.將凝膠放入1L的染色液(1g AgNO3，1.5ml 37％甲醛)中，輕搖30min；d.從染色液中取出凝膠，放入雙蒸水中，稍作翻動，立即取出浸入預冷的1L顯色液(30g NaCO3，1.5ml 37％甲醛，200μl 10mg/ml NaS2O3)中。注意，從凝膠放入水中到其完全浸入顯色液中的時間不能超過10sec，否則重復(c)步驟；e.凝膠浸入顯色液后，輕輕搖動，出現(xiàn)主帶后，將凝膠轉(zhuǎn)入另一顯色液中繼續(xù)顯色，直到出現(xiàn)全部清晰譜帶；f.待凝膠完全顯色后，將固定/終止液倒入顯色液中，中止反應；g.用雙蒸水漂洗凝膠2次，每次2min；h.取出凝膠，室溫下自然晾干、拍片、保存；(4)標準DNA指紋圖譜的構(gòu)建應用引物GACTGCGTACCAATTCAAC/GATGAGTCCTGAGTAACTT構(gòu)建的7個桑樹品種的AFLP指紋圖譜如圖4所示，A～G代表桑樹品種，其中A為桐鄉(xiāng)青，B為荷葉白，C為湖桑197，D為盛東一號，E為農(nóng)桑8號，F(xiàn)為農(nóng)桑12號，G為農(nóng)桑14號.右列數(shù)字為多態(tài)性擴增帶的編號。
(5)桑樹品種的鑒定將待測桑樹樣本的指紋圖譜與標準圖譜相比較，以鑒定待測樣本的品種真實性。
實施例5(1)基因池DNA的制備分別從桐鄉(xiāng)青、荷葉白、湖桑197、盛東一號、農(nóng)桑8號、農(nóng)桑12號、農(nóng)桑14號6個桑樹品種的不同株的桑葉(以嫩葉為佳)提取DNA，混合成品種的基因池。桑葉DNA的提取和純化步驟如下A.稱取1g葉片組織(去除中脈)，加液氮冰凍研磨成干粉，轉(zhuǎn)入離心管后，加4ml抽提緩沖液(100mmol/L Tris-HCl pH8.0，50mmol/L EDTA pH8.0，500mmol/L NaCl，10mmol/L a-巰基乙醇)，混勻；B.加450μl 10％SDS，充分混勻，65℃保溫1h；C.加入445μl 5mol/L KAc，充分混勻，-20℃放置1h；D.4℃下12000r/min離心15min；E.上清液轉(zhuǎn)入新離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇，輕輕顛倒離心管數(shù)次，放置片刻；F.于4℃下8000r/min離心10min；G.上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中，加入2/3體積、-20℃預冷的異丙醇，混勻，-20℃放置1h；H.于4℃下8000r/min離心10min，去除上清液，用70％的乙醇洗滌沉淀2次，抽干；I.加入500μl TE緩沖液(10mmol/L Tris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0)溶解沉淀；J.加無DNase的RNase至終濃度100μg/ml，于37℃保溫1h；K.加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，放置幾分鐘后，10000r/min離心10min，吸取上清液，重復1次；L.加入1/5體積的3mol/L NaAc，混勻，加入2.5倍體積的無水乙醇，輕緩混勻，-20℃放置1h；M.4℃下10000r/min離心20～30min，去除上清液，用70％的乙醇洗滌沉淀2～3次，抽干。
N.加入50μl TE或dH2O溶解DNA，備用；(2)AFLP接頭和二次擴增的引物AFLP分析所用的EcoRI和MseI接頭的核苷酸順序如下EcoRI接頭5′-CTCGTAGACTGCGTACCCTGACGCATGGTTAA-5′MseI接頭5′-GACGATGAGTCCTGAGTACTCAGGACTCAT-5′EcoRI和MseI預擴增引物分別為5′-GACTGCGTACCAATTCA-3′5′-GATGAGTCCTGAGTAAC-3′EcoRI和MseI選擇性擴增引物為5′-GACTGCGTACCAATTCAAC/GATGAGTCCTGAGTAACAC-3′(3)AFLP反應條件A.模板DNA的酶切 每個反應總體積為25μl，其中包括DNA 250ng，EcoRI(TaKaRa)和MseI(BioLabs)各2.5U，BSA 2.5μg，1×RL Bufter(500mmol/LNaCl，100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，pH7.9)，37℃保溫8h；B.DNA片段接頭的連接 酶切后，每個DNA樣品中加入10μl的連接混合液EcoRI adalptor 5pmol，MseI adaptor 50pmol，T4DNA Ligase(TaKaRa)1.2U，1×T4DNA Ligase Buffer(66mmol/L Tris-HCl pH7.6，6.6mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，0.1mmol/L ATP)。16℃連接16h；C.DNA片段的預擴增 取2.5μl連接后的DNA樣品，加入22.5μl的預擴增混合液EcoRI預擴增引物和MseI預擴增引物各35ng，dNTP Mixture各5mmol/L，Taq DNA Polymerase(TaKaRa)0.625U，1×PCR Buffer(10mmol/LTris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2)，混勻后，按如下PCR程序擴增94℃ 30sec，56℃ 1min，72℃ 1min，30個循環(huán)。預擴增產(chǎn)物稀釋20倍，-20℃保存?zhèn)溆茫籇.選擇性AFLP擴增取5μl 20倍稀釋的預擴增混合液，加入20μl選擇性擴增混合液EcoRI選擇性擴增引物和MseI選擇性擴增引物各35ng，dNTPMixture各5mmol/L，Taq DNA polymerase(TaKaRa)1U，1×PCR Buffer(10mmol/LTris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2)?；靹蚝?，按如下PCR程序擴增94℃ 30sec，65℃(每循環(huán)降低0.7℃)30sec，72℃ 1min，12個循環(huán)后變?yōu)?4℃ 30sec，56℃ 30sec，72℃ 1min，23個循環(huán)，反應結(jié)束后，向選擇性擴增產(chǎn)物中加入等體積的上樣緩沖液(98％甲酰胺，10mmol/L EDTA pH8.0，0.25％溴酚藍，0.25％二甲苯腈)，95℃變性5min，立即置于冰上冷卻，待用；E.擴增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺電泳分析經(jīng)預電泳(55w恒功率)30min后，取3μl上樣混合物在6％聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分析(70w恒功率)，電泳至二甲苯腈指示帶距離底部2厘米處終止電泳；F.銀染成像a.電泳結(jié)束后，取下膠板，放入2ml的固定/終止液(10％醋酸)中，輕搖20min或直到指示劑顏色消失為止；b.用雙蒸水漂洗凝膠3次，每次2min；c.將凝膠放入1L的染色液(1g AgNO3，1.5ml 37％甲醛)中，輕搖30min。
d.從染色液中取出凝膠，放入雙蒸水中，稍作翻動，立即取出浸入預冷的1L顯色液(30g NaCO3，1.5ml 37％甲醛，200μl 10mg/ml NaS2O3)中，注意，從凝膠放入水中到其完全浸入顯色液中的時間不能超過10sec，否則重復(c)步驟；e.凝膠浸入顯色液后，輕輕搖動，出現(xiàn)主帶后，將凝膠轉(zhuǎn)入另一顯色液中繼續(xù)顯色，直到出現(xiàn)全部清晰譜帶；f.待凝膠完全顯色后，將固定/終止液倒入顯色液中，中止反應；g.用雙蒸水漂洗凝膠2次，每次2min；h.取出凝膠，室溫下自然晾干、拍片、保存；(4)標準DNA指紋圖譜的構(gòu)建應用引物GACTGCGTACCAATTCAAC/GATGAGTCCTGAGTAACAC構(gòu)建的7個桑樹品種的AFLP指紋圖譜如圖5所示，A～G代表桑樹品種，其中A為桐鄉(xiāng)青，B為荷葉白，C為湖桑197，D為盛東一號，E為農(nóng)桑8號，F(xiàn)為農(nóng)桑12號，G為農(nóng)桑14號.右列數(shù)字為多態(tài)性擴增帶的編號。
(5)桑樹品種的鑒定將待測桑樹樣本的指紋圖譜與標準圖譜相比較，以鑒定待測樣本的品種真實性。
實施例6(1)基因池DNA的制備稱取秋豐×白玉、豐一×54A、菁松×皓月、春·蕾×鎮(zhèn)·珠、薪杭×白云、夏7×夏6(包括正反交)的六個家蠶品種的蠶卵0.5g，加2ml DNA提取緩沖液(50mmol/L Tris-HCl pH8.0，100mmol/L NaCl，20mmol/L EDTA，100μg/mlProtease K)于冰浴中研磨，加200μl 10％SDS充分混勻，轉(zhuǎn)入離心管后于50℃保溫2h。于4℃下10000r/min離心10min，取上清，加等體積氯仿-異戊醇(24∶1)，輕輕顛倒離心管10min使成乳狀，于4℃下10000r/min離心10min，吸出水相，用氯仿-異戊醇重抽一次后加2～2.5倍體積-20℃預冷的無水乙醇和1/10體積的3mol/L NaAc，混勻，-20℃中放置1h。于4℃下10000r/min離心20～30min沉淀DNA，沉淀用70％乙醇洗2次，抽干并用1ml TE緩沖液(10mmol/LTris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0)溶解，加無DNase的RNase至終濃度100μg/ml，37℃保溫1h。按上述方法用氯仿-異戊醇抽提2次，乙醇沉淀DNA，沉淀用70％乙醇洗2次后抽干，加TE溶解；(2)AFLP接頭和二次擴增的引物AFLP分析所用的EcoRI和MseI接頭的核苷酸順序如下EcoRI接頭5′-CTCGTAGACTGCGTACCCTGACGCATGGTTAA-5′MseI接頭5′-GACGATGAGTCCTGAGTACTCAGGACTCAT-5′EcoRI和MseI預擴增引物分別為5′-GACTGCGTACCAATTCA-3′5′-GATGAGTCCTGAGTAAC-3′EcoRI和MseI選擇性擴增引物為5′-GACTGCGTACCAATTCAGG/GATGAGTCCTGAGTAACAA-3′(3)AFLP反應條件A.模板DNA的酶切 每個反應總體積為25μl，其中包括DNA 250ng，EcoRI(TaKaRa)和MseI(BioLabs)各2.5U，BSA 2.5μg，1×RL Bufter(500mmol/LNaCl，100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，pH7.9)，37℃保溫8h；B.DNA片段接頭的連接酶切后，每個DNA樣品中加入10μl的連接混合液EcoRI adaptor 5pmol，MseI adaptor 50pmol，T4DNA Ligase(TaKaRa)1.2U，1×T4DNA Ligase Buffer(66mmol/L Tris-HCl pH7.6，6.6mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，0.1mmol/L ATP)，16℃連接16h；C.DNA片段的預擴增 取2.5μl連接后的DNA樣品，加入22.5μl的預擴增混合液EcoRI預擴增引物和MseI預擴增引物各35ng，dNTP Mixture各5mmol/L，Taq DNA Polymerase(TaKaRa)0.625U，1×PCR Buffer(10mmol/LTris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2)，混勻后，按如下PCR程序擴增94℃ 30sec，56℃1min，72℃ 1min，30個循環(huán)，預擴增產(chǎn)物稀釋20倍，-20℃保存?zhèn)溆?；D.選擇性AFLP擴增取5μl 20倍稀釋的預擴增混合液，加入20μl選擇性擴增混合液EcoRI選擇性擴增引物和MseI選擇性擴增引物各35ng，dNTPMixture各5mmol/L，Taq DNA polymerase(TaKaRa)1U，1×PCR Buffer(10mmol/LTris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2)?；靹蚝螅慈缦翽CR程序擴增94℃ 30sec，65℃(每循環(huán)降低0.7℃)30sec，72℃ 1min，12個循環(huán)后變?yōu)?4℃ 30sec，56℃ 30sec，72℃ 1min，23個循環(huán)，反應結(jié)束后，向選擇性擴增產(chǎn)物中加入等體積的上樣緩沖液(98％甲酰胺，10mmol/L EDTA pH8.0，0.25％溴酚藍，0.25％二甲苯腈)，95℃變性5min，立即置于冰上冷卻，待用；E.擴增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺電泳分析經(jīng)預電泳(55w恒功率)30min后，取3μl上樣混合物在6％聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分析(70w恒功率)，電泳至二甲苯腈指示帶距離底部2厘米處終止電泳；F.銀染成像a.電泳結(jié)束后，取下膠板，放入2ml的固定/終止液(10％醋酸)中，輕搖20min或直到指示劑顏色消失為止；b.用雙蒸水漂洗凝膠3次，每次2min。
c.將凝膠放入1L的染色液(1g AgNO3，1.5ml 37％甲醛)中，輕搖30min。
d.從染色液中取出凝膠，放入雙蒸水中，稍作翻動，立即取出浸入預冷的1L顯色液(30g NaCO3，1.5ml 37％甲醛，200μl 10mg/ml NaS2O3)中，注意，從凝膠放入水中到其完全浸入顯色液中的時間不能超過10sec，否則重復(c)步驟；e.凝膠浸入顯色液后，輕輕搖動，出現(xiàn)主帶后，將凝膠轉(zhuǎn)入另一顯色液中繼續(xù)顯色，直到出現(xiàn)全部清晰譜帶；
f.待凝膠完全顯色后，將固定/終止液倒入顯色液中，中止反應；g.用雙蒸水漂洗凝膠2次，每次2min；h.取出凝膠，室溫下自然晾干、拍片、保存；(4)標準DNA指紋圖譜的構(gòu)建應用引物GACTGCGTACCAATTCAGG/GATGAGTCCTGAGTAACAA構(gòu)建的7個桑樹品種的AFLP指紋圖譜如圖6所示，A～L代表家蠶品種，其中A為秋豐×白玉，B為白玉×秋豐，C為豐一×54A，D為54A×豐一，E為菁松×皓月，F(xiàn)為皓月×菁松，G為春·蕾×鎮(zhèn)·珠，H為鎮(zhèn)·珠×春·蕾，I為薪杭×白云，J為白云×薪杭，K為夏7×夏6，L為夏6×夏7。
(5)家蠶品種的鑒定將待測家蠶樣本的指紋圖譜與標準圖譜相比較，以鑒定待測樣本的品種真實性。
權(quán)利要求
1.利用AFLP指紋技術(shù)鑒定家蠶和桑樹品種的方法，其特征在于其步驟如下(1)基因池DNA的來源從同一品種不同個體的家蠶或不同植株的桑樹的任何組織器官提取DNA，混合成品種的基因池；(2)AFLP接頭和二次擴增即預擴增、選擇性擴增的引物AFLP分析所用的EcoRI和MseI接頭的核苷酸順序如下EcoRI接頭5′-CTCGTAGACTGCGTACCCTGACGCATGGTTAA-5′MseI接頭5′-GACGATGAGTCCTGAGTACTCAGGACTCAT-5′EcoRI和MseI預擴增引物分別為5′-GACTGCGTACCAATTCA-3′5′-GATGAGTCCTGAGTAAC-3′EcoRI和MseI選擇性擴增引物為
(3)AFLP反應條件A.模板DNA的酶切每個反應總體積為25μl，其中包括DNA 250ng，EcoRI(TaKaRa)和MseI(BioLabs)各2.5U，BSA 2.5μg，1×RL Bufter(500mmol/LNaCl，100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，pH7.9)，20～50℃保溫20min～8h；B.DNA片段接頭的連接酶切后，每個DNA樣品中加入10μl的連接混合液EcoRI adaptor 5 pmol，MseI adaptor 50pmol，T4DNA Ligase(TaKaRa)1.2U，1×T4DNA Ligase Buffer(66mmol/L Tris-HCl pH7.6，6.6mmol/L MgCl2，10mmol/LDTT，0.1mmol/L ATP)，10～40℃連接1～16h；C.DNA片段的預擴增取2.5μl連接后的DNA樣品，加入22.5μl的預擴增混合液EcoRI預擴增引物和MseI預擴增引物各35ng，dNTP Mixture各5mmol/L，Taq DNA Polymerase(TaKaRa)0.625U，1×PCR Buffer(10mmol/LTris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2)，混勻后，按如下PCR程序擴增94℃ 20～60sec，56℃ 0.5～2min，72℃ 0.5～2min，20～40個循環(huán)，預擴增產(chǎn)物稀釋20倍，-20℃保存?zhèn)溆?；D.選擇性AFLP擴增取5μl 20倍稀釋的預擴增混合液，加入20μl選擇性擴增混合液EcoRI選擇性擴增引物和MseI選擇性擴增引物各35ng，dNTPMixture各5mmol/L，Taq DNA polymerase(TaKaRa)1U，1×PCR Buffer(10mmol/LTris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2)，混勻后，按如下PCR程序擴增94℃ 20～60sec，65℃(每循環(huán)降低0.7℃)20～60sec，72℃ 0.5～2min，10～20個循環(huán)后變?yōu)?4℃ 20～60sec，56℃ 20～60sec，72℃ 0.5～2min，20～30個循環(huán)，反應結(jié)束后，向選擇性擴增產(chǎn)物中加入等體積的上樣緩沖液(98％甲酰胺，10mmol/L EDTA pH8.0，0.25％溴酚藍，0.25％二甲苯腈)，95℃變性5min，置于冰上冷卻，待用；E.擴增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺電泳分析經(jīng)預電泳(55w恒功率)20～50min后，取3μl上樣混合物在6％聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分析(50～100w恒功率)，電泳至二甲苯腈指示帶距離底部2厘米處終止電泳；F.銀染成像a.電泳結(jié)束后，取下膠板，放入2ml的固定/終止液(10％醋酸)中，輕搖10～30min或直到指示劑顏色消失為止；b.用雙蒸水漂洗凝膠3次，每次1～5min；c.將凝膠放入1L的染色液(1g AgN03，1.5ml 37％甲醛)中，輕搖20～40min；d.從染色液中取出凝膠，放入雙蒸水中，稍作翻動，立即取出浸入預冷的1L顯色液(30gNaCO3，1.5ml 37％甲醛，200μl 10mg/ml NaS2O3)中；從凝膠放入水中到其完全浸入顯色液中的時間不能超過5～15sec，否則重復(c)步驟；e.凝膠浸入顯色液后，輕輕搖動，出現(xiàn)主帶后，將凝膠轉(zhuǎn)入另一顯色液中繼續(xù)顯色，直到出現(xiàn)全部清晰譜帶；f.待凝膠完全顯色后，將固定/終止液倒入顯色液中，中止反應；g.用雙蒸水漂洗凝膠2次，每次1～5min；h.取出凝膠，室溫下自然晾干、拍片、保存；(4)標準DNA指紋圖譜的構(gòu)建以上述特定引物對家蠶和桑樹不同品種進行預擴增和選擇性擴增，以二次擴增結(jié)果為依據(jù)，構(gòu)建家蠶和桑樹品種的標準DNA指紋圖譜；(5)家蠶和桑樹品種的鑒定將待測家蠶和桑樹樣本的指紋圖譜與標準圖譜相比較，以鑒定待測樣本的品種真實性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用AFLP指紋技術(shù)鑒定家蠶和桑樹品種的方法。是在AFLP指紋技術(shù)的基礎(chǔ)，以特定家蠶和桑樹不同品種的基因池DNA為模板，以限制性內(nèi)切酶EcoR I和Mse I酶解，然后酶切片段跟含有與其共同粘性末端的人工接頭連接，連接后的粘性末端順序和接頭順序就作為以后PCR反應的引物結(jié)合位點來設(shè)計引物，并以特定引物對家蠶和桑樹不同品種的預擴增、選擇性擴增共二次擴增結(jié)果為依據(jù)，構(gòu)建家蠶和桑樹品種的標準DNA指紋圖譜，將待測家蠶和桑樹樣本的指紋圖譜與標準圖譜相比較，以鑒定待測樣本的品種真實性。本發(fā)明為保護桑樹育種產(chǎn)權(quán)、登錄新品種、鑒定和檢測苗木真實性和純度、仲裁苗木糾紛和規(guī)范苗木市場提供技術(shù)保障。
文檔編號G01N33/00GK1553182SQ200310108380
公開日2004年12月8日 申請日期2003年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月30日
發(fā)明者鐘伯雄, 丁農(nóng), 張金衛(wèi) 申請人:浙江大學, 浙江省湖州蠶?？茖W研究所